CN106526035A - 可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 - Google Patents

可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 Download PDF

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陈默
张巍伟
王守云
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Abstract

可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法,该试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成，标准物质包括：特征肽段及其内标肽段；反应试剂包括：碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸。通过将含马血清白蛋白样品与反应试剂按一定的体积比混合，温育振荡后，使之发生酶解反应，再将标准物质和/或最终酶解产物分别注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，根据母离子和子离子的质荷比（m/z）及特征肽段的保留时间（tR）进行定性鉴别，通过色谱峰面积变化测算出马血清白蛋白的绝对含量。

Description

可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法
技术领域
本发明涉及一种可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的检测试剂盒及测定方法，属于检验测定技术领域。
背景技术
血清白蛋白约占血浆总蛋白的40～60％，是血浆中主要载体，起维持渗透压、pH缓冲、载体和营养作用，许多水溶性差的物质可以通过与其结合而被运输，如，胆红素、长链脂肪酸、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子及药物等。有关检测血清白蛋白的检测方法有免疫双扩散法、免疫电泳法、双缩尿法、钨酸沉淀法和毛细管电泳法等。这些方法有易污染、背景值高的缺点，常使检测灵敏度降低，并且特异性较差；高压毛细管电泳法虽有较高准确度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干扰，使检测特异性、灵敏度降低，并且检测时间较长，不适合痕/微量羊血清白蛋白的检测。目前，关于检测马血清白蛋白的特异性方法报道较少。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种马血清白蛋白检测试剂盒，给出一种采用本试剂盒可以克服现有技术缺点的马血清白蛋白的鉴定和含量测定的方法。该试剂盒给出了检测马血清白蛋白的标准物质和对含血清白蛋白样品进行酶解反应的反应试剂。可将标准物质和/或酶解反应产物(或含内标物质)注入(超)高效液相色谱-质谱仪中进行马血清白蛋白含量测定。本发明提供了一种专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便，可在临床上用于样品中马血清白蛋白含量测定的一种检测试剂盒及检测方法。
技术方案：
一种可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：
标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：
选择方式如下：
(1)、所述标准物质特征肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合特征肽段使用；
(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；
(3)、所述标准物质特征肽段与其内标肽段配成的内标物质，可以是单一内标物质、双混合内标物质或多混合内标物质，使用其中的一种、两种或多种；
(4)、内标肽段与其他内标肽段配成两种或多种混合使用。
该试剂盒还包括反应试剂：
反应试剂，由以下成分组成
所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。
1)标准物质
①用以实现本发明试剂盒的标准物质是特征肽段，其是单一标准物质，或配成双混合标准物质或多混合标准物质，使用其中的一种或多种；
单一标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
单一标准物质II
特征肽段2 QSALAELVK
单一标准物质III
特征肽段3 ILLSSAK
单一标准物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
双混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质V
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质VI
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
三混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
多混合标准物质
②用以实现本发明试剂盒的内标肽段是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其中的一种、两种或多种；
单一内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标肽段II
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标肽段III
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标肽段IV
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
双混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段V
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段VI
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
三混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
多混合内标肽段
③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，是单一内标物质、双混合内标物质或多混合内标物质，使用其中的一种、两种或多种；
单一内标物质I
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标物质II
特征肽段2 QSALAELVK
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标物质III
特征肽段3 ILLSSAK
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
内标肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质V
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
单一内标物质VI
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
单一内标物质VII
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质VIII
单一内标物质IX
单一内标物质X
单一内标物质XI
双混合内标物质I
双混合内标物质II
双混合内标物质III
双混合内标物质IV
双混合内标物质V
双混合内标物质VI
双混合内标物质VII
双混合内标物质VIII
双混合内标物质IX
三混合内标物质I
三混合内标物质II
三混合内标物质III
三混合内标物质IV
三混合内标物质V
三混合内标物质VI
三混合内标物质VII
三混合内标物质VII
多混合内标物质
④标准物质是单剂、或是双剂或多剂，根据上述方法自由组合或选择其中的一种、两种或多种。
所述标准物质配成单剂、双剂或多剂。
所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。
所述反应试剂配成单剂。
利用上述的可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的马血清白蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：
(1)将样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。
(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测，检测后通过母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(tR)进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出马血清白蛋白的绝对含量。
温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围。
胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。
所述步骤(2)为：将特征肽段(一种或两种)和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性，色谱峰峰面积变化测算出马血清白蛋白的含量。
有益效果：本发明具有的有益效果为：本发明提供的检测试剂盒和检测方法能对样品中马血清白蛋白进行准确灵敏的定性和绝对定量，具有特异性强、灵敏度高、结果准确、操作简便等优点，可用于马肉及其制品中马血清白蛋白的检测。
本发明包括标准物质(由特征肽段及其内标肽段组成)和酶解反应试剂；采用(超)高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，这是一类采用高效液相色谱分离，串联质谱检测碎片离子的设备，能快速、精确、灵敏的对微/痕量的马血清白蛋白进行绝对定量。该方法具有操作简便、特异性强、灵敏度和准确度高的特点。
目前，尚未开发出测定马血清白蛋白含量的特征肽段及其内标肽段和酶解反应试剂的试剂盒。本发明成功的弥补了生物检测领域的不足，能准确地对含微/痕量马血清白蛋白的样品进行绝对定性鉴别及绝对定量，具有特异性强、操作简便、灵敏度和准确度高的优点。
附图说明
图1为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝477.6)
图2为特征肽段2的二级质谱图(m/z＝479.7)
图3为特征肽段3的二级质谱图(m/z＝366.2)
图4为特征肽段4的二级质谱图(m/z＝433.6)。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。
本发明包括马血清白蛋白检测试剂盒和含量测定方法两部分。
马血清白蛋白检测试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成：
1)标准物质
①用以实现本发明试剂盒的标准物质是特征肽段，可以是单一标准物质，或配成双混合标准物质或多混合标准物质，可使用其中的一种或多种。
单一标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
单一标准物质II
特征肽段2 QSALAELVK
单一标准物质III
特征肽段3 ILLSSAK
单一标准物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
双混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质V
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质VI
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
三混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
多混合标准物质
②用以实现本发明试剂盒的内标肽段(任一、二或多个氨基酸上的C、H、O或/和N被同位素标记)，可以是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，可使用其中的一种、两种或多种。
单一内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标肽段II
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标肽段III
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标肽段IV
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
双混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段V
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段VI
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
三混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
多混合内标肽段
③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，以下简称“内标物质”，更有利于马血清白蛋白的定性和定量检测。可以是单一内标物质、双混合内标物质或多混合内标物质，可使用其中的一种、两种或多种。
单一内标物质I
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标物质II
特征肽段2 QSALAELVK
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标物质III
特征肽段3 ILLSSAK
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
内标肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质V
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
单一内标物质VI
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
单一内标物质VII
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质VIII
单一内标物质IX
单一内标物质X
单一内标物质XI
其他组合方式的单一内标物质在这里不再赘述！
双混合内标物质I
双混合内标物质II
双混合内标物质III
双混合内标物质IV
双混合内标物质V
双混合内标物质VI
双混合内标物质VII
双混合内标物质VIII
双混合内标物质IX
其他组合方式的双混合内标物质在这里不再赘述！
三混合内标物质I
三混合内标物质II
三混合内标物质III
三混合内标物质IV
三混合内标物质V
三混合内标物质VI
三混合内标物质VII
三混合内标物质VII
多混合内标物质
④用以实现本发明方法的马血清白蛋白检测试剂盒中的标准物质可以是单剂、也可以是双剂或多剂，可根据上述方法自由组合或选择其中的一种、两种或多种。
(2)反应试剂，用以实现本发明方法的反应试剂是单剂，包括：
本发明测定马血清白蛋白含量的步骤如下：
(1)将样品加入碳酸氢铵，振荡混匀，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。
(2)将标准物质(或内标物质)和最终酶解产物(或含内标物质)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出样品中马血清白蛋白的含量。
通常步骤(1)温育温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100，涡旋时间控制在2～10min。
所述步骤(2)将特征肽段和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，或将内标物质和最终酶解产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z及tR进行定性鉴别，通过色谱峰峰面积变化，采用内标法或外标法测算出样品中马血清白蛋白的含量。
实施例1：
样品：鲜马肉
双混合内标物质I
双混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
(1)样品的制备：取马肉0.2g，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入双混合内标肽段I，加100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，60℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振荡(1000rmp)30min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液400μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
(2)将双混合内标物质I和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测。特征肽段1的检出限为1ng，特征肽段2的检出限为2ng，相对标准偏差小于2.26％，回收率为94.3％～97.6％(n＝6)。
实施例2：
样品：马肉干
单一内标物质I
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标肽段I：
内标肽段1 TYEATLEK
1)样品的制备：取马肉干0.1mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入内标肽段I，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1200rmp)2min，加入150mmol/L二硫苏糖醇溶液300μL，60℃温育振荡(1200rmp)30min，放置至室温后，加入40mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1200rmp)40min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，55℃振荡(1500rmp)温育45min，放置至室温后，加入20％甲酸水溶液150μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将单一内标物质I和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，检出限为1ng，相对标准偏差小于3.14％，回收率为95.3％～99.8％(n＝6)。
实施例3：
样品：马血
双混合标准物质V
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
1)样品的制备：取马血0.2ml，加入1ml细胞裂解液，超声处理5min，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入100mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(1000rmp)5min，加入150mmol/L二硫苏糖醇溶液100μL，50℃温育振荡(1200rmp)25min，放置至室温后，加入400mmol/L碘代乙酰胺溶液100μL，35℃温育振荡(1000rmp)2h，加入3mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃温育振荡(1500rmp)4h，放置至室温后，加入20％甲酸水溶液150μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将双混合标准物质和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段2为1ng，特征肽段4的检出限3ng，相对标准偏差小于1.14％，回收率为95.1％～98.4％(n＝6)。
实施例4：
样品：马肉香肠
三混合内标物质VII
三混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
1)样品的制备：取0.2g马肉香肠，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入三混合内标肽段IV，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(800rmp)10min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液300μL，50℃温育振荡(1500rmp)3h，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，25℃温育振荡(2500rmp)30min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液400μL，55℃振荡(1500rmp)温育180min，放置至室温后，加入5％甲酸水溶液600μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将三混合内标物质和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段2、3和4的检出限均为2ng，相对标准偏差小于4.21％，回收率为93.8～96.7％(n＝6)，特征肽段1为佐证肽段。
实施例5：
样品：马肉火腿
单一标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
单一标准物质II
特征肽段2 QSALAELVK
单一标准物质III
特征肽段3 ILLSSAK
单一标准物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
1)样品的制备：取马肉火腿0.2g，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入三混合内标肽段II，加入150mmol/L碳酸氢铵溶液700μL，涡旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液500μL，55℃温育振荡(1200rmp)30min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1000rmp)50min，加入3mg/ml胰蛋白酶溶液350μL，35℃温育振荡(1800rmp)10h，放置至室温后，加入5％甲酸水溶液800μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将单一标准物质I、II、III、IV与三混合内标肽段II混合后，与最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段1、2检出限为1ng，特征肽段4检出限为2ng，相对标准偏差小于1.23％，回收率为95.5％～97.6％(n＝6)，特征肽段3作为佐证肽段。
实施例6：
样品：马血清
双混合内标物质IX
双混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
1)样品的制备：取马血清0.1ml，加入1ml细胞裂解液，超声处理5min，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入双混合内标肽段I，加入90mmol/L碳酸氢铵溶液500μL，涡旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液300μL，55℃温育振荡(1200rmp)30min，放置至室温后，加入500mmol/L碘代乙酰胺溶液20μL，30℃温育振荡(1000rmp)50min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，55℃温育振荡(1800rmp)3.5h，放置至室温后，加入5％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将双混合内标物质IX与最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段1和2检出限为1ng，相对标准偏差小于3.68％，回收率为94.3％～98.2％(n＝6)，特征肽段3和4作为佐证肽段。
实施例6：
样品：马奶
单一标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
单一标准物质II
特征肽段2 QSALAELVK
单一标准物质III
特征肽段3 ILLSSAK
单一标准物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
1)样品的制备：取0.5ml马奶，加入1ml细胞裂解液，超声处理5min，精密吸取800μL匀浆液，加入3.2ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入100mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(800rmp)5min，加入800mmol/L二硫苏糖醇溶液50μL，60℃温育振荡(2000rmp)3h，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，35℃温育振荡(2500rmp)30min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，55℃振荡(1500rmp)温育240min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将单一标准物质I、II、III和IV混合后，与最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段1、2和3的检出限均为2ng，特征肽段4的检出限均为1ng，相对标准偏差小于4.10％，回收率为96.4～99.1％(n＝6)。
实施例7：
样品：马酸奶
双混合内标物质III
单一内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标肽段IV
内标肽段4 ADFAEVSK
2)样品的制备：取马酸奶0.5ml，加入1ml细胞裂解液，超声处理5min，精密吸取1000μL匀浆液，加入4ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段I和IV，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，55℃温育振荡(1200rmp)30min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振荡(1000rmp)50min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液90μL，55℃温育振荡(1800rmp)1.5h，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。
2)将双混合内标物质III与最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，特征肽段1和4检出限为1ng，相对标准偏差小于2.68％，回收率为96.1％～99.2％(n＝6)。
以上实施例中：标准物质特征肽段单独使用或与其他特征肽段配成两种、多种混合标准物质使用。
标准物质特征肽段与其内标肽段配成的内标物质，可以是单一内标物质、双混合内标物质或三混合内标物质，可使用其中的一种、两种或多种。
标准物质配成单剂、双剂或多剂。
所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。上述替换的实施例在这里不做赘述。
总之，实验证明，采用本发明的检测试剂盒完全可以对样品中马血清白蛋白进行鉴定，并得出所需的绝对含量测定结果，并且灵敏度高、特异性好、精密度高、不受内、外源物质的污染。
本发明的检测试剂盒及检测方法具有专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便等优点，可用于样品中马血清白蛋白含量测定。
蛋白序列
马血清白蛋白
MKWVTFVSLLFLFSSAYSRGVLRRDTHKSEIAHRFNDLGEKHFKGLVLVAFSQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKKCAADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRATYGELADCCEKQEPERNECFLTHKDDHPNLPKLKPEPDAQCAAFQEDPDKFLGKYLYEVARRHPYFYGPELLFHAEEYKADFTECCPADDKLACLIPKLDALKERILLSSAKERLKCSSFQNFGERAVKAWSVARLSQKFPKADFAEVSKIVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICEHQDSISGKLKACCDKPLLQKSHCIAEVKEDDLPSDLPALAADFAEDKEICKHYKDAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRIAKTYEATLEKCCAEADPPACYRTVFDQFTPLVEEPKSLVKKNCDLFEEVGEYDFQNALIVRYTKKAPQVSTPTLVEIGRTLGKVGSRCCKLPESERLPCSENHLALALNRLCVLHEKTPVSEKITKCCTDSLAERRPCFSALELDEGYVPKEFKAETFTFHADICTLPEDEKQIKKQSALAELVKHKPKATKEQLKTVLGNFSAFVAKCCGREDKEACFAEEGPKLVASSQLALA
马血清白蛋白
MKWVTFVSLLFLFSSAYSRGVLRRDTHKSEIAHRFNDLGEKHFKGLVLVAFSQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKKCAADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRATYGELADCCEKQEPERNECFLTHKDDHPNLPKLKPEPDAQCAAFQEDPDKFLGKYLYEVARRHPYFYGPELLFHAEEYKADFTECCPADDKLACLIPKLDALKERILLSSAKERLKCSSFQNFGERAVKAWSVARLSQKFPKADFAEVSKIVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICEHQDSISGKLKACCDKPLLQKSHCIAEVKEDDLPSDLPALAADFAEDKEICKHYKDAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRIAKTYEATLEKCCAEADPPACYRTVFDQFTPLVEEPKSLVKKNCDLFEEVGEYDFQNALIVRYTKKAPQVSTPTLVEIGRTLGKVGSRCCKLPESERLPCSENHLALALNRLCVLHEKTPVSEKITKCCTDSLAERRPCFSALELDEGYVPKEFKAETFTFHADICTLPEDEKQIKKQSALAELVKHKPKATKEQLKTVLGNFSAFVAKCCGREDKEACFAEEGPKLVASSQLALA

Claims (9)

1.一种可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：
标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：
选择方式如下：
(1)、所述标准物质特征肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合特征肽段使用；
(2)、内标肽段单独使用，或与其他特征肽段配成两种或多种混合内标物质使用；
(3)、所述标准物质特征肽段与其内标肽段配成的内标物质，可以是单一内标物质、双混合内标物质或多混合内标物质，使用其中的一种、两种或多种；
(4)、内标肽段与其他内标肽段配成两种或多种混合使用。
2.根据权利要求1所述的可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括反应试剂：
反应试剂，由以下成分组成
3.根据权利要求1所述可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质的内标肽段是特征肽段中任一、二或多个氨基酸上的C、H、O、N被同位素标记后的肽段，其中，一个氨基酸上的C、H、O、N四个元素可同时被标记，或任意1～3个元素被标记。
4.根据权利要求1所述可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：1)标准物质
①用以实现本发明试剂盒的标准物质是特征肽段，其是单一标准物质，或配成双混合标准物质或多混合标准物质，使用其中的一种或多种；
单一标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
单一标准物质II
特征肽段2 QSALAELVK
单一标准物质III
特征肽段3 ILLSSAK
单一标准物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
双混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
双混合标准物质V
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
双混合标准物质VI
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质I
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
三混合标准物质II
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质III
特征肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
三混合标准物质IV
特征肽段2 QSALAELVK
特征肽段3 ILLSSAK
特征肽段4 ADFAEVSK
多混合标准物质
②用以实现本发明试剂盒的内标肽段是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其中的一种、两种或多种；
单一内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标肽段II
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标肽段III
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标肽段IV
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
双混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
双混合内标肽段V
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
双混合内标肽段VI
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段I
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
三混合内标肽段II
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段III
内标肽段1 TYEATLEK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
三混合内标肽段IV
内标肽段2 QSALAELVK
内标肽段3 ILLSSAK
内标肽段4 ADFAEVSK
多混合内标肽段
③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，是单一内标物质、双混合内标物质或多混合内标物质，使用其中的一种、两种或多种；
单一内标物质I
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
单一内标物质II
特征肽段2 QSALAELVK
内标肽段2 QSALAELVK
单一内标物质III
特征肽段3 ILLSSAK
内标肽段3 ILLSSAK
单一内标物质IV
特征肽段4 ADFAEVSK
内标肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质V
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段2 QSALAELVK
单一内标物质VI
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段3 ILLSSAK
单一内标物质VII
特征肽段1 TYEATLEK
内标肽段1 TYEATLEK
特征肽段4 ADFAEVSK
单一内标物质VIII
单一内标物质IX
单一内标物质X
单一内标物质XI
双混合内标物质I
双混合内标物质II
双混合内标物质III
双混合内标物质IV
双混合内标物质V
双混合内标物质VI
双混合内标物质VII
双混合内标物质VIII
双混合内标物质IX
三混合内标物质I
三混合内标物质II
三混合内标物质III
三混合内标物质IV
三混合内标物质V
三混合内标物质VI
三混合内标物质VII
三混合内标物质VII
多混合内标物质
④标准物质是单剂、或是双剂或多剂，根据上述方法自由组合或选择其中的一种、两种或多种。
5.根据权利要求1所述可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述标准物质配成单剂、双剂或多剂。
6.根据权利要求1所述可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。
7.根据权利要求2所述可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：所述反应试剂配成单剂。
8.利用权利要求1所述的可实现马血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的马血清白蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：
(1)将样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。
(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测，检测后通过母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(tR)进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出马血清白蛋白的绝对含量。
温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围。
胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。
9.根据权利要求8所述马血清白蛋白含量测定方法，其特征在于：所述步骤(2)为：将特征肽段(一种或两种)和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，或将内标物质和(1)步骤中最终酶解产物(含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和tR进行定性，色谱峰峰面积变化测算出马血清白蛋白的含量。
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