CN106525932A - 甲砜霉素分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲砜霉素分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用，采用水热一步法制备多孔石墨烯‑二硫化钼纳米花状复合物，并将其滴涂到L型玻碳电极表面。利用氨基化多壁碳纳米管及多孔Pt‑Pd纳米颗粒分散进一步提高电极的印迹表面积及加强修饰界面的稳定性，从而获得三维多孔的印迹基底。以甲砜霉素为模板分子，邻二苯胺为功能单体，循环伏安法制备印迹膜；以抗坏血酸为光电化学探针，构建检测甲砜霉素的电化学传感器。该传感器对甲砜霉素具有良好的响应，其线性范围为1.0×10^‑9‑3.5×10^‑6mol L^‑1，检测下限为5.0×10^‑9mol L^‑1。传感器可用于肉类样品及饲料样品甲砜霉素检测。

Description

甲砜霉素分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于分子印迹技术领域，具体地说，涉及一种甲砜霉素分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用。

背景技术

甲砜霉素是一种常用的抗生素，与氯霉素和氟苯尼考属于广谱抗生素，具有良好的抗菌效果，因此被广泛应用于人类疾病治疗和动物食品生产，并形成残留。同时，在氯霉素被中国、加拿大、美国和欧盟等国家在动物源食品生产中禁止使用后的背景下，其逐步成为氯霉素在动物源食品生产过程中的替代品。然而，过多的摄入会对人类健康造成很大影响。因此，美国、加拿大和中国等国家已经禁止其在动物源食品生产过程中的使用，并在食品安全管理系统里设置最大残留量。有鉴于此，构建电化学检测甲砜霉素的传感器，具有一定的具有现实意义的研究工作。

在分子印迹电化学传感器构建中，电聚合法是制备分子印迹聚合物(MIP)修饰电极的常用方法之一，其实现了MIP膜的制备和修饰同时完成，具有厚度可控、方便、简单和实用等特点。众所周知，印迹基底是决定这类电化学传感器的性能重要因素之一。同时，导电纳米材料修饰界面可提高印迹膜的印迹位点数目、导电性和催化性能，而三维印迹基底能将上述性能得以显著提高，对提高传感器的灵敏度非常有利，是电聚合原位制备MIP膜的基底的不错选择。同时，结合光电电流检测非电活性目标也是目前分子印迹电化学传感器的研究热点之一。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种甲砜霉素分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用，本发明采用多孔石墨烯(P-r-GO-MoS₂)纳米花复合物、氨基化多孔碳纳米管(NH₂-MWCNTs)和多孔Pt-Pd纳米颗粒(Pt-Pd NPs)构建了三维多孔印迹基底；然后，以邻苯二胺为为功能单体、循环伏安法印迹甲砜霉素，以抗坏血酸(AA)电化学探针产生的光电流为电信号，构建了检测电化学检测甲砜霉素的电化学传感器。据我们所知，采用电化学检测甲砜霉素的方法未见报道，且采用这种三维修饰电极用于分子印迹技术领域也未见报道。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备多孔Pt-Pd纳米颗粒；

步骤2、制备多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物；

步骤3、用多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物、氨基化多壁碳纳米管及多孔Pt-Pd纳米颗粒修饰L型玻碳电极；

步骤4、将修饰后的L型玻碳电极以邻苯二胺为功能单体和甲砜霉素为模板分子，循环伏安制备分子印迹修饰电极；再洗脱除去聚合膜中的模板分子，得到甲砜霉素分子印迹膜修饰电极。

进一步地，步骤1中多孔Pt-Pd纳米颗粒的制备具体如下：将十六烷基吡啶(HDPC)、Na₂PdCl₄和H₂PtCl₆按照体积比为3:1:1-8:1:1加入到一只圆底烧瓶中，使其形成均一的分散液；接着将新鲜配制的抗坏血酸(AA)溶液迅速加入上述溶液，AA溶液与HDPC的体积比为1:25-1:5，经过轻轻地震动，使其分散均匀，并将圆底烧瓶置于80-90℃油浴中反应2.5-3.5h；然后，将所得溶胶离心，并用水洗多次，获得树枝状的多孔Pt-Pd纳米颗粒；十六烷基吡啶、Na₂PdCl₄、H₂PtCl₆的浓度均为：10mol L^-1。

进一步地，步骤2中制备多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物具体为：

步骤2.1、多孔氧化石墨烯的制备：

在磁力搅拌下，将KMnO₄加入氧化石墨烯(GO)分散液中，使其反应12h，其中，KMnO₄与GO分散液的质量比为8:1-15:1；然后，将HCl和H₂O₂加入到上述反应溶液中，继续反应3h，其中GO分散液与HCl与H₂O₂的体积比均为2:1-4:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55-60℃下干燥；制备得到多孔氧化石墨烯分散液；

步骤2.2、多孔石墨烯-二硫化钼纳米花复合物的制备：

将(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O和硫脲溶解到多孔石墨烯溶液中，再将上述混合液转移至反应釜中，210-230℃下反应12h；其中，(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O与多孔氧化石墨烯质量比为4:1-1:1；硫脲与多孔氧化石墨烯质量比为50:1-30:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55-65℃下干燥，制备得到多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物(P-r-GO-MoS₂)；HCl与H₂O₂的质量百分浓度分别为36％和30％。

进一步地，步骤3中的修饰采用以下步骤：将多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的DMF分散液滴涂到L型GCE电极表面，在80℃下烘干；然后，将含氨基化多壁碳纳米管(NH₂-MWCNTs)与多孔Pt-Pd纳米颗粒的DMF分散液滴涂上述电极表面，并继续在80℃下烘干；

所述多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的N,N-二甲基甲酰胺分散液的浓度为5mg mL^-1；含氨基化多壁碳纳米管与多孔Pt-Pd纳米颗粒的DMF分散液中氨基化多壁碳纳米管浓度为0.2mgμL^-1，多孔Pt-Pd纳米颗粒的浓度为5mgμL^-1，多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的N,N-二甲基甲酰胺分散液与含氨基化多壁碳纳米管与多孔Pt-Pd纳米颗粒的DMF分散液的体积比为1:1。

进一步地，步骤4中的将修饰后的L型玻碳电极以邻苯二胺为功能单体和甲砜霉素为模板分子，循环伏安制备分子印迹修饰电极；再洗脱除去聚合膜中的模板分子，得到甲砜霉素分子印迹膜修饰电极具体为：将修饰后的L型玻碳电极通过浸入含有模板分子和印迹单体的醋酸盐缓冲液中，其中，模板分子为甲砜霉素，功能单体为邻苯二胺，通过循环伏安法得到嵌有甲砜霉素的分子印迹修饰电极，所述循环伏安法的扫描电位为0mV-1.2mV，扫描圈数为10，扫速为100mV s^-1。

进一步地，醋酸缓冲液中的邻苯二胺与甲砜霉素的摩尔浓度比为2:1-8:1，该醋酸缓冲液的pH＝5.2，所述洗脱液为体积比9:1的甲醇/乙酸溶液，洗脱的时间为30分钟。

本发明还提供一种由上述的制备方法得到的甲砜霉素分子印迹电化学传感器。

本发明还提供一种上述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器在检测肉类样品及饲料样品中甲砜霉素的应用，所述应用按照以下检测步骤实施：将分子印迹膜修饰的L型玻碳电极浸入到含有甲砜霉素的样品中，进行识别，之后用水冲洗去非特异性吸附的分子；再以识别后的分子印迹膜修饰的L型玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，组成三电极系统，以2cm比色皿为光电检测池，浸入到含有0.1mol L^-1抗坏血酸(AA)的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中；将405nm激光照射工作电极表面，AA产生光电流，根据光电流的变化量与甲砜霉素的浓度成正比，得到工作曲线。

进一步地，含有甲砜霉素的样品通过以下方式制备得到：准确称取1.0000g的含有甲砜霉素的样品，加入20mL甲醇，高速漩涡混合器上漩涡15min；接着，将所得悬浊液在10000r/min离心10min，取出上清液，于40℃恒温水浴中进行浓缩。当甲醇完全挥发后，先用少量PBS(pH＝7.0)溶液溶解，再用0.45μm的有机膜过滤，滤液转移至10.0mL容量瓶，并进行定容。

进一步地，分子印迹电化学传感器对甲砜霉素的检测线性范围为1.0×10^-9-3.5×10^-6mol L^-1，回归方程为i_Δ(μA)＝0.4981C(μmol L^-1)+0.5012,(r²＝0.9912)，检测限为5.0×10^-9mol L^-1。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)该传感器对甲砜霉素具有良好的响应，其线性范围为1.0×10^-9-3.5×10^-6molL^-1，检测下限为5.0×10^-9mol L^-1。

2)本发明采用MoS₂、NH₂-MWCNTs和多孔Pt-Pd NPs构建了三维多孔的印迹基底，结合MIP技术和光电传感技术制备了检测甲砜霉素的电化学传感。三维多孔的印迹基底具有较大比表面和较快的传质速度，这对提高传感器的灵敏度非常有利，而MIP了提高传感器的选择性。

3)该传感器可用于实际样品中甲砜霉素的检测，尤其是肉类样品及饲料样品甲砜霉素检测，拓宽了其检测的渠道，具有一定的实际意义。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明传感器制备的技术流程图。其中，A为印迹传感器的制备流程，B为传感器的电化学检测装置；

图2是本发明本发明微观材料的表征图；其中，A代表多孔石墨烯-二硫化钼投射电镜图；B代表多孔石墨烯的高倍投射电镜图；C代表二硫化钼的高倍投射电镜图；D代表多孔Pt-Pd纳米颗粒的投射电镜图；

图3是本发明电极修饰过程中扫描电镜的微观表征图；其中，A代表多孔石墨烯-二硫化钼修饰的L-玻碳电极(L-GCE)的扫描电镜图，B代表多孔Pt-Pd-氨基化多壁碳纳米管修饰界面；C代表修饰界面上聚合分子印迹聚合物后的扫描电镜图；

图4是本发明印迹传感器和非印迹传感含有0.1mol L^-1抗坏血酸(AA).的磷酸盐缓冲液中(PBS,pH＝7.0)产生的光电流的比较；a和b分别代表印迹电极和非印迹电极未识别甲砜霉素(浓度)时，AA产生的光电流；a′和b′分别代表印迹电极和非印迹电极识别甲砜霉素(1.75×10^-6mol L^-1)后，AA产生的光电流；

图5是本发明不同印迹传感器在含有0.1mol L^-1抗坏血酸(AA)的磷酸盐缓冲液中(PBS,pH＝7.0)产生的光电流的比较。a、b、c和d分别代裸L型玻碳电极的印迹传感器、多孔石墨烯、多孔石墨烯-二硫化钼和氨基化多壁碳纳米管-多孔石墨烯-二硫化钼修饰电极制备印迹传感器在含有0.1mol L^-1抗坏血酸(AA)的磷酸盐缓冲液中(PBS,pH＝7.0)产生的光电流；a′、b′、c′和d′分别代表裸L型玻碳电极的印迹传感器、多孔石墨烯、多孔石墨烯-二硫化钼和氨基化多壁碳纳米管-多孔石墨烯-二硫化钼修饰电极制备印迹传感器在富集1.75×10^-6mol L^-1甲砜霉素后，在含有0.1mol L^-1抗坏血酸(AA)和的磷酸盐缓冲液中(PBS,pH＝7.0)产生的光电流；

图6是本发明功能单体与模板分子的比例与传感器的响应电流关系图；

图7是本发明聚合时间与传感器的响应电流关系图；

图8是本发明富集时间与传感器的响应电流关系图；

图9是本发明传感线性响应图；甲砜霉素的浓度为：1.0×10^-9-3.5×10^-6mol L^-1，内置图为校正曲线，误差棒代表标准偏差(n＝3)；

图10是本发明的传感器的干扰图；其中，a代表传感对1.75×10^-6mol L^-1甲砜霉素的光电流响应值；b、c分别代表传感器对1.75×10^-6mol L^-1+3.5×10^-5mol L^-1氯霉素和1.75×10^-6mol L^-1+3.5×10^-5mol L^-1氟苯尼考的光电流响应值。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1

(1)多孔Pt-Pd NPs的制备：将5.0mL十六烷基吡啶(HDPC)(4.0mg mL^-1)、0.40mLNa₂PdCl₄(10mmol L^-1)和0.40mL H₂PtCl₆(10mmol L^-1)加入到一只圆底烧瓶中，使其形成均一的分散液；接着将0.60mL新鲜配制的AA溶液迅速加入上述溶液，经过轻轻地震动，使其分散均匀，并将圆底烧瓶置于85℃油浴中反应3h；然后，将所得溶胶离心，并用水洗多次，获得树枝状的Pt-Pd NPs；

(2)多孔氧化石墨烯的制备：在磁力搅拌下，将0.5g KMnO₄加入100mL 0.5mg mL^{- 1}GO分散液中，使其反应12h。然后，将30mL HCl(36％,wt％)和30mL H₂O₂(30％,wt％)加入到上述反应溶液中，继续反应3h。反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在60℃下干燥；制备得到多孔氧化石墨烯分散液；

(3)多孔石墨烯-二硫化钼的纳米花状复合物(P-r-GO-MoS₂)的制备：将1mmol(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O)和30mmol硫脲溶解到50mL氧化石墨烯分散液中，再将上述混合液转移至50mL反应釜中，220℃下反应12h。反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在60℃下干燥。

(4)如图1-A，用氨基化多壁碳纳米管、多孔Pt-Pd纳米颗粒及多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物修饰L型玻碳电极：将5mg mL^-1的P-r-GO-MoS₂的DMF分散液滴涂到上述修饰电极表面，并且继续在80℃下烘干；然后，将5μL NH₂-MWC NTs与Pt-Pd NTs的DMF分散液(含有1mg NH₂-MWCNTs和25mg Pt-Pd NTs)滴涂上述电极表面，并继续在80℃下烘干，得到印迹基底。

(5)将上述修饰所得电极浸入含有0.8mmol L^-1邻苯二胺和0.2mmol L^-1甲砜霉素的醋酸盐缓冲液(pH＝5.2)，于0mV-1.2mV电位，以100mV s^-1的速度进行CV印迹聚合。当聚合圈数达10圈后，将所得电极置于室温晾干，并用甲醇/乙酸溶液(9/1,V/V)洗脱模板分子30min，得到分子印迹聚合物MIP/Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE，即为甲砜霉素分子印迹电化学传感器。

实施例2

(1)多孔Pt-Pd NPs的制备：将十六烷基吡啶(HDPC,10molL^-1)、Na₂PdCl₄(10molL^-1)和H₂PtCl₆(10molL^-1)按照体积比为3:1:1加入到一只圆底烧瓶中，使其形成均一的分散液；接着将新鲜配制的抗坏血酸(AA)溶液迅速加入上述溶液，AA溶液与HDPC的体积比为1:25，经过轻轻地震动，使其分散均匀，并将圆底烧瓶置于80℃油浴中反应2.5h；然后，将所得溶胶离心，并用水洗多次，获得树枝状的Pt-Pd NPs；

(2)多孔氧化石墨烯的制备：

在磁力搅拌下，将KMnO₄加入GO分散液中，使其反应6h，其中，KMnO₄与GO分散液的质量比为8：1；然后，将HCl(36％,wt％)和H₂O₂(30％,wt％)加入到上述反应溶液中，继续反应3h，其中GO分散液与HCl与H₂O₂的体积比均为2:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55℃下干燥；制备得到多孔氧化石墨烯分散液；

(3)多孔石墨烯-二硫化钼的纳米花状复合物(P-r-GO-MoS₂)的制备：将(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O和硫脲溶解到多孔氧化石墨烯分散液中，再将上述混合液转移至50mL反应釜中，210℃下反应12h；其中，NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O与P-r-GO质量4:1；硫脲与多孔氧化石墨烯质量比为50:1。反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55℃下干燥；

(4)用氨基化多壁碳纳米管、多孔Pt-Pd纳米颗粒及多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物修饰L型玻碳电极：将5mg mL^-1的P-r-GO-MoS₂的DMF分散液滴涂到上述修饰电极表面，并且继续在80℃下烘干；然后，将5μL NH₂-MWCNTs与Pt-Pd的DMF分散液(含有1mg NH₂-MWCNTs和25mg Pt-Pd)滴涂上述电极表面，并继续在80℃下烘干，得到印迹基底。

(5)将上述修饰所得电极浸入含有0.8mmol L^-1邻苯二胺和0.2mmol L^-1甲砜霉素的醋酸盐缓冲液(pH＝5.2)，于0mV-1.2mV电位，以100mV s^-1的速度进行CV印迹聚合。当聚合圈数达10圈后，将所得电极置于室温晾干，并用甲醇/乙酸溶液(9/1,V/V)洗脱模板分子30min，得到MIP/Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE，即为甲砜霉素分子印迹电化学传感器。

实施例3

(1)多孔Pt-Pd NPs的制备：将十六烷基吡啶(HDPC,10molL^-1)、Na₂PdCl₄(10molL^-1)和H₂PtCl₆(10molL^-1)按照体积比为8:1:1加入到一只圆底烧瓶中，使其形成均一的分散液；接着将新鲜配制的抗坏血酸(AA)溶液迅速加入上述溶液，AA溶液与HDPC的体积比为1:5，经过轻轻地震动，使其分散均匀，并将圆底烧瓶置于90℃油浴中反应3.5h；然后，将所得溶胶离心，并用水洗多次，获得树枝状的Pt-Pd NPs；

(2)多孔氧化石墨烯的制备：

在磁力搅拌下，将KMnO₄加入GO分散液中，使其反应12h，其中，KMnO₄与GO分散液的质量比为15：1；然后，将HCl(36％,wt％)和H₂O₂(30％,wt％)加入到上述反应溶液中，继续反应3h，其中GO分散液与HCl与H₂O₂的体积比均为4:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在60℃下干燥；制备得到多孔氧化石墨烯分散液；

(3)多孔石墨烯-二硫化钼的纳米花状复合物(P-r-GO-MoS₂)的制备：将(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O和硫脲溶解到多孔石墨烯分散液中，再将上述混合液转移至50mL反应釜中，210-230℃下反应12h；其中，NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O与P-r-GO质量1:1；硫脲与多孔氧化石墨烯质量比为30:1。反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在65℃下干燥；

(4)用氨基化多壁碳纳米管、多孔Pt-Pd纳米颗粒及多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物修饰L型玻碳电极：将5mg mL^-1的P-r-GO-MoS₂的DMF分散液滴涂到上述修饰电极表面，并且继续在80℃下烘干；然后，将5μL NH₂-MWCNTs与Pt-Pd的DMF分散液(含有1mg NH₂-MWCNTs和25mg Pt-Pd)滴涂上述电极表面，并继续在80℃下烘干，得到印迹基底。

(5)将上述修饰所得电极浸入含有0.8mmol L^-1邻苯二胺和0.2mmol L^-1甲砜霉素的醋酸盐缓冲液(pH＝5.2)，于0mV-1.2mV电位，以100mV s^-1的速度进行CV印迹聚合。当聚合圈数达10圈后，将所得电极置于室温晾干，并用甲醇/乙酸溶液(9/1,V/V)洗脱模板分子30min，得到MIP/Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE，即为甲砜霉素分子印迹电化学传感器。

实施例4对比例：

非印迹电极NIP/Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE的制备：除了聚合液体中不含模板分子，其余条件与MIP传感器的条件保持一致。

MIP/L-GCE、MIP/P-r-GO-MoS₂/L-GCE、MIP/NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE和MIP/Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs/P-r-GO-MoS₂/L-GCE的制备：同上；

实施例5

采用实施例1制备得到的甲砜霉素分子印迹电化学传感器检测甲砜霉素，包括以下步骤：

将甲砜霉素分子印迹电化学传感器进入含有一定浓度的甲砜霉素的PBS缓冲液中(pH＝7)，在温柔地搅拌下捕获目标分子。在180s后，取出上述印迹电极，用水冲洗非特异性吸附的分子，并将传感器组装成三电极体系(印迹电极为工作电极，饱和甘共电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，在含有0.1mol L-1AA的5mL PBS(pH＝7)中，当电位为0mV，进行电流-时间(i-t)实验，打开蓝紫光激光发射器，产生光电流信号。

甲砜霉素分子印迹电化学传感器的电化学检测装置如图1-B，其设计的关键是L-GCE电极，其表面能够很好地被蓝紫光照射，且较目常用的ITO相比，较为容易修饰、更新及稳定。

下面结合具体的实验过程来说明本发明的技术效果：

1、仪器及试剂

扫描电子显微镜(SEM)图在Zeiss(德国)进行的，测定电压为10kV。透射电子显微镜(TEM)及EDS测试在JEM-2100(日本)上进行，电压为200kV。电化学实验在电化学工作站CHI660D上进行，且甘汞电极为参比电极、Pt丝电极为对电极和修饰后的L-玻碳电极(L-GCE)为工作电极。光电流检测装置实验室自制。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氯钯酸钠(Na₂PdCl₄)和氯铂酸(H₂PtCl₆.6H₂O)、氯化十六烷基吡啶(HDPC)、甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考、抗坏血酸(AA)和3-丙氨基-1-乙基咪唑氯均购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。多孔石墨烯(r-GO)按照文献进行制备。氨基化的多壁碳纳米管(NH₂-MWCNTs)购自南京先丰纳米材料科技有限公司(南京，中国)。饲料样品均购自本地超市。其他未提及试剂均为分析纯。实验测定所用支持电解质为0.1mol L^-1磷酸盐缓冲液(PBS,pH＝7.0)，由NaH₂PO₄和Na₂HPO₄配制所得。

2、检测甲砜霉素的电化学传感器的制备：同实施例1。

3、结果与讨论

3.1传感器制备过程中的电极界面变化

首先，利用TEM表征了多孔石墨烯-MoS₂的微观形貌。从图2A孔可以看出两者成花瓣状，且从其高分辨的图2B中可以看出复合物具有两种结构，层间距较宽的为MoS₂，弯曲褶皱为石墨烯(r-GO)，说明两种具有较好的复合结构。同时，图2C表明石墨烯具有多孔的结构，其孔径约为10-20nm。再者，图2D表明MoS₂的层间距约为0.63nm，其晶格约为0.21nm。

其次，从图2E中可以看出，Pt-Pd纳米颗粒呈球形多孔状，其直径约为80-90nm，并且它们具有高度一致的孔道，孔的直径约1nm，枝的直径约为1-2nm，与文献报道一致。从图2-B中可以看出，P-r-GO具有三维多孔的结构，且孔径约为20-30nm。

其次，采用SEM表征传感器的制备过程。当L-GCE电极表面修饰MoS₂-P-r-GO后，修饰电极呈现出三维多孔的结构(图3-A)。然而，当Pt-Pd NPs-NH₂-MWCNTs修饰，可以得到三维多孔的结构，并且Pt-Pd NPs分散均匀(图3-B)，这可能是氨基与Pt-Pd NPs的之间的作用力所致。当电聚合印迹发生之后，修饰电极表面可以观察到一层薄薄的MIP层(图3-C)。

3.2不同电极光电流响应

首先，采用光电流的变化比较了印迹效果。从图4中可知，MIP传感器在未识别模板分子之前，光电响应较大，而其捕获模板分子之后，响应电流明显减小，这是由于模板分子的识别，使其聚合膜对AA的光电氧化降低。类似地，NIP传感器的光电流变化较小(图5)。由此推测，MIP的印迹效果比较明显，能够识别更多的模板分子，而对于NIP传感器电流响应的减小，可能是少部分的非特异性识别所致。

其次，采用光电流的变化比较了不同修饰电极的响应。从图5中，可以看出P-r-GO修饰电极的光电流变化明显大于GCE电极，可能的原因是P-r-GO提高MIP膜面积及光电子的传导。类似地，当在P-r-GO-MoS₂滴涂到电极表面后，其光电响应变化大于MIP/P-r-GO/GCE，原因是MoS₂具有良好的光电催化效果。当在MoS₂表面修饰NH₂-MWCNTs后，NH₂-MWCNTs的三维网状结构增大了印迹面积和加快了传质速率，进而使光电流增大。然而，NH₂-MWCNTs网中固定了多孔Pt-Pd NPs，进一步增大印迹膜的表面积和电子传递能力，使所得MIP传感器的响应增大。

3.3条件优化

3.3.1模板分子与功能单体的比例

实验考察了聚合时间对MIP传感器光电流的影响。如图6所示，传感器的响应电流的变化先随着模板分子的比例的减小而增大，且当两者比例为1:4时，响应电流变化最大；之后，响应电流又逐渐减小。这可能是两者比例与MIP膜中印迹位点数目变化相关。当两者比例较大时，能固定的模板分子较少，使得印迹位点数目减小；反之，过多的功能单体造成印迹位点包埋,使光电流减小。因此，实验采用当两者比例为1:4时，制备传感器。

3.3.2聚合时间的影响

实验记录了当聚合时间从6圈到13圈变化时，传感器光电流的变化(图7)。结果表明，当聚合时间为10圈时，所得传感器的光电流的变化最大。当聚合时间小于10圈时，印迹位点数目较少，而当聚合时间大于10圈后，过厚的MIP阻碍光电流的传导和印迹位点包埋，致使响应电流减小。据此，实验采用当聚合时间为10圈时，制备MIP膜层。

3.3.3富集时间的影响

实验优化了模板分子的富集时间。如图8所示，光电流变化随着富集时间的增长而先增大，之后保持不变，表明电极表面的模板分子达到饱和状态。然而，对于较大浓度的甲砜霉素(1.75×10^-6mol L^-1)，MIP传感器达到吸附平衡的时间短与较低浓度(2.0×10^-7molL^-1)。因此，为了使更低浓度的甲砜霉素达到平衡，实验将富集时间延迟至180s。

3.4传感器的响应性能

在优化的条件后，实验记录了传感器的光电流响应曲线。如图9所示，MIP传感器的响应电流随着甲砜霉素的浓度的增大而逐步减小，且两者具有良好的线性关系，其范围为1.0×10^-9-3.5×10^-6mol L^-1，线性关系为i_Δ(μA)＝0.4981C(μmol L^-1)+0.5012,(r²＝0.9912),检测下限为5.0×10^-9mol L^-1。

3.5干扰实验

首先，实验考察了100倍的头孢曲松、头孢噻肟和阿莫斯林对1.75×10^-6mol L^-1测定的影响。结果表明，上述抗生素对其测定不受干扰。其次，实验考察了20倍的氯霉素和氟苯尼考对其测定的影响，结果表明类似物基本上不受影响(图10)，表明传感器具有良好的选择性。

3.6传感器的重现性及稳定性

将所得MIP传感器1.75×10^-6mol L-1的甲砜霉素的进行5次平行测定，其光电流响应值的相对标准偏差(RSD)为0.34％。接着，将MIP传感器连续10次对1.75×10^-6mol L^-1的甲砜霉素进行测定，其响应其保持初始值的96.3％，15天再次测定同样浓度的甲砜霉素，其光电流响应值保持起始值的95.2％(RSD＝1.21％,n＝3)，说明传感器具有良好的稳定性。然后，为考察传感器的重现性，实验平行制作5根电极，所得光电流响应值的RSD值为3.23％(n＝5)，说明传感器具有良好的重现性。

3.7实际样品的测定

实验采用回收率的方法考察了传感器的性能。如表-1所示，其回收率在90％-98％，说明传感器具有应用于实际样品中的甲砜霉素的检测。为进一步考察传感器的实用性，将其用于实际样品饲料中甲砜霉素的检测。首先，准确称取1.0000g的样品，加入20mL甲醇，高速漩涡混合器上漩涡15min；接着，将所得悬浊液在10000r/min离心10min，取出上清液，于40℃恒温水浴中进行浓缩。当甲醇完全挥发后，先用少量PBS(pH＝7.0)溶液溶解，再用0.45μm的有机膜过滤，滤液转移至10.0mL容量瓶，并进行定容。最后，每次测定时，移取1mL上述定溶液，加入到4.0mL的PBS中，再将传感器进行富集，进行测定。结果表明传感器的标准加入法的回收率在90％-95％之间(如表-2)，表明传感器可以用于具有实际样品中甲砜霉素的测定。

表1甲砜霉素的回收率测定表

表2饲料样品中的甲砜霉素的回收率测定表

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备多孔Pt-Pd纳米颗粒；

步骤2、制备多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物；

步骤3、用多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物、氨基化多壁碳纳米管及多孔Pt-Pd纳米颗粒修饰L型玻碳电极；

步骤4、将修饰后的L型玻碳电极以邻苯二胺为功能单体和甲砜霉素为模板分子，循环伏安制备分子印迹修饰电极；再洗脱除去聚合膜中的模板分子，得到甲砜霉素分子印迹膜修饰电极。

2.根据权利要求1所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤1中多孔Pt-Pd纳米颗粒的制备具体如下：将十六烷基吡啶、Na₂PdCl₄和H₂PtCl₆按照体积比为3:1:1-8:1:1加入到一只圆底烧瓶中，使其形成均一的分散液；接着将新鲜配制的抗坏血酸溶液迅速加入上述溶液，抗坏血酸溶液与十六烷基吡啶溶液的体积比为1:25-1:5，经过轻轻地震动，使其分散均匀，并将圆底烧瓶置于80-90℃油浴中反应2.5-3.5h；然后，将所得溶胶离心，并用水洗多次，获得树枝状的多孔Pt-Pd纳米颗粒；十六烷基吡啶、Na₂PdCl₄、H₂PtCl₆的浓度均为：10mol L^-1。

3.根据权利要求1所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤2中制备多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物，具体为：

步骤2.1、多孔氧化石墨烯的制备：

在磁力搅拌下，将KMnO₄加入氧化石墨烯分散液中，使其反应12h，其中，KMnO₄与氧化石墨烯分散液的质量比为8：1-15:1；然后，将HCl和H₂O₂加入到上述反应溶液中，继续反应3h，其中氧化石墨烯分散液与HCl与H₂O₂的体积比均为2:1-4:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55-60℃下干燥；制备得到多孔氧化石墨烯分散液；

步骤2.2、多孔石墨烯-二硫化钼纳米花复合物的制备：

将(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O和硫脲溶解到多孔氧化石墨烯分散液中，再将上述混合液转移至反应釜中，210-230℃下反应12h；其中，(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O与多孔氧化石墨烯质量比为4:1-1:1；硫脲与多孔氧化石墨烯质量比为50:1-30:1；反应结束后，将所得产物离心分离、水洗，置于真空干燥器在55-65℃下干燥，制备得到多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物；HCl与H₂O₂的质量百分浓度分别为36％和30％。

4.根据权利要求1所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤3中的修饰采用以下步骤：将多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的N,N-二甲基甲酰胺分散液滴涂到L型玻碳电极表面，在80℃下烘干；然后，将含氨基化多壁碳纳米管与多孔Pt-Pd纳米颗粒的N,N-二甲基甲酰胺分散液滴涂上述电极表面，并继续在80℃下烘干；

所述多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的N,N-二甲基甲酰胺分散液的浓度为5mgmL^-1；含氨基化多壁碳纳米管与多孔Pt-Pd纳米颗粒的DMF分散液中氨基化多壁碳纳米管浓度为0.2mgμL^-1，多孔Pt-Pd纳米颗粒的浓度为5mgμL^-1，多孔石墨烯-二硫化钼纳米花状复合物的N,N-二甲基甲酰胺分散液与含氨基化多壁碳纳米管与多孔Pt-Pd纳米颗粒的N,N-二甲基甲酰胺分散液的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的将修饰后的L型玻碳电极以邻苯二胺为功能单体和甲砜霉素为模板分子，循环伏安制备分子印迹修饰电极；再洗脱除去聚合膜中的模板分子，得到甲砜霉素分子印迹膜修饰电极，具体为：将修饰后的L型玻碳电极通过浸入含有模板分子和功能单体的醋酸盐缓冲液中，其中，模板分子为甲砜霉素，功能单体为邻苯二胺，通过循环伏安法得到嵌有甲砜霉素的分子印迹修饰电极，所述循环伏安法的扫描电位为0mV-1.2mV，扫描圈数为10，扫速为100mV s^-1。

6.根据权利要求5所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述醋酸缓冲液的邻苯二胺与甲砜霉素的摩尔浓度比为2:1-8:1，该醋酸缓冲液的pH＝5.2，所述洗脱液为体积比9:1的甲醇/乙酸溶液，洗脱的时间为30分钟。

7.一种由权利要求1-6任一权利要求所述的制备方法得到的甲砜霉素分子印迹电化学传感器。

8.权利要求7所述的甲砜霉素分子印迹电化学传感器在检测肉类样品及饲料样品中甲砜霉素的应用，其特征在于，所述应用按照以下检测步骤实施：将分子印迹膜修饰的L型玻碳电极浸入到含有甲砜霉素的样品中，进行识别，之后用水冲洗去非特异性吸附的分子；再以识别后的分子印迹膜修饰的L型玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，组成三电极系统，以2cm比色皿为光电检测池，浸入到含有0.1mol L^-1抗坏血酸的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中；将405nm激光照射工作电极表面，AA产生光电流，根据光电流的变化量与甲砜霉素的浓度成正比，得到工作曲线。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含有甲砜霉素的样品通过以下方式制备得到：准确称取1.0000g的含有甲砜霉素的样品，加入20mL甲醇，高速漩涡混合器上漩涡15min；接着，将所得悬浊液在10000r/min离心10min，取出上清液，于40℃恒温水浴中进行浓缩。当甲醇完全挥发后，先用少量pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液溶解，再用0.45μm的有机膜过滤，滤液转移至10.0mL容量瓶，并进行定容。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述分子印迹电化学传感器对甲砜霉素的检测线性范围为1.0×10^-9-3.5×10^-6mol L^-1，回归方程为i_Δ(μA)＝0.4981C(μmol L^-1)+0.5012,(r²＝0.9912)，检测限为5.0×10^-9mol L^-1。