CN106520612A - 一株铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其应用，属于食品生物技术领域。本发明所述铜绿假单胞菌CCTCC NO:M 2016533是从奶牛场采集了大量土样，通过高通量筛选获得的可水解牛乳蛋白的蛋白酶分泌菌株。该菌株的发酵上清液能有效降解αS1‑酪蛋白、β‑乳球蛋白，因而可用于去除牛乳中的过敏原、制备奶制品，包括配方奶粉，降低婴儿、成人食用奶制品过敏的风险。

Description

一株铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株铜绿假单胞菌及其应用，属于食品生物技术领域。
背景技术
作为工业化的微生物细胞工厂，铜绿假单胞菌已广泛应用于食品，发酵等领域，但目前在乳制品领域的应用相对较少。乳制品是婴幼儿食品的重要组成部分，但婴幼儿乳制品目前存在的主要问题为蛋白过敏。全世界儿童牛乳过敏的发生率为0.3％-7.5％，乳蛋白过敏主要是由特异性IgE抗体介导的I型超敏反应，可引起呼吸道、消化道、皮肤或全身过敏，主要表现为呕吐、腹痛和腹泻等胃肠道不适。特别对于婴儿，牛乳中主要含有的酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等作为异种蛋白，有可能成为过敏原。牛乳蛋白主要分为乳清蛋白(whey)和凝乳蛋白(curd)两部分，凝乳蛋白占乳蛋白总量的80％，αS1-酪蛋白是凝乳蛋白中最主要的一个过敏原，同时乳清蛋白的主要组成是β-乳球蛋白。
在保留乳蛋白营养价值和风味的同时有效的降低其抗原性和过敏原性依旧是一个难题，而蛋白酶水解法在有效降低和消除过敏原的同时不会影响产物的营养价值，相比于其他几种脱敏方法，如加热处理、糖基化反应和乳酸菌发酵法等，不仅可以水解部分过敏源，还可生产出具有调节免疫功能、抗凝血、降血压等其他生理功能的多肽。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasartuginosa)S8，其于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2016533，地址：中国，武汉，武汉大学。
所述铜绿假单胞菌CCTCC NO:M 2016533是从奶牛场采集了大量土样，通过高通量筛选获得的可水解牛乳蛋白的蛋白酶分泌菌株。该菌株的发酵上清液能有效降解αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白，因而可用于去除牛乳蛋白中的过敏原、制备奶制品，包括配方奶粉，降低婴儿、成人食用奶制品过敏的风险。
“牛乳蛋白”的表述被理解为指的是至少包含一种乳清蛋白组分或一种酪蛋白组分的含水培养基。作为牛奶底物的非限制的例子，可以是提及的牛奶、牛奶浓缩物、乳制食品基质、乳酸基质等等。
生物材料保藏
铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8，已于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2016533。
具体实施方式
脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉10g.L-1。
LB培养基：胰蛋白胨10.0g.L-1，酵母提取物5g.L-1，氯化钠10g.L-1。
CSN1S8酶联反应试剂盒，购自上海岚派生物科技有限公司。
BLG酶联反应试剂盒，购自上海岚派生物科技有限公司。
实施例1铜绿假单胞菌(CCTCC NO:M 2016533)的筛选方法
称取1.0g混匀土样与5mL无菌水于10mL离心管中混合，震荡混匀后，分别使用无菌水10,100,1000倍稀释后涂布脱脂奶粉平板培养基，然后于恒温培养箱内30℃静置培养24h。
挑选有水解圈产生的菌落转接到新的脱脂奶粉平板培养基，然后于恒温培养箱内30℃静置培养24h。而后观察水解圈大小及菌落形态，将筛选到水解圈最大的的单菌落S8转接于LB培养基中活化8小时后，再转接于含20％甘油的LB培养基中，保藏于-80℃。
该菌株S8的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1，菌株鉴定结果表明是铜绿假单胞菌。
实施例2铜绿假单胞菌S8(CCTCC NO:M 2016533)发酵液的αS1-酪蛋白去除效率
将保藏于-80℃甘油管中的出发菌株铜绿假单胞菌(CCTCC NO:M 2016533)以2％的接种量接入LB培养基，在30℃，220rpm，培养12h。
以2％的接种量分别取活化好的铜绿假单胞菌转接到新鲜的LB培养基中，在30℃，220rpm，培养12h后收集发酵液，8000rpm离心收集发酵液上清。
将发酵液上清与αS1-酪蛋白标准品按1：1混合后，再30℃下反应1h。以αS1-酪蛋白标准品为对照，使用CSN1S8酶联反应试剂盒，分别检测样品的αS1-酪蛋白含量。
将将50μl样品分别加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定在加终止液后15分钟以内进行。
表1.铜绿假单胞菌S8(CCTCC NO:M 2016533)发酵液的αS1-酪蛋白去除效率
实施例3铜绿假单胞菌S8(CCTCC NO:M 2016533)发酵液的β-乳球蛋白去除效率
将保藏于-80℃甘油管中的出发菌株铜绿假单胞菌(CCTCC NO:M 2016533)以2％的接种量接入LB培养基，在30℃，220rpm，培养12h。
以2％的接种量分别取活化好的铜绿假单胞菌转接到新鲜的LB培养基中，在30℃，220rpm，培养12h后收集发酵液，8000rpm离心收集发酵液上清。
将发酵液上清与β-乳球蛋白标准品按1：1混合后，再30℃下反应1h。以β-乳球蛋白标准品为对照，使用CSN1S8酶联反应试剂盒，分别检测样品的αS1-酪蛋白含量。
将将50μl样品分别加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定在加终止液后15分钟以内进行。
表2.铜绿假单胞菌(CCTCC NO:M 2016533)发酵液的β-乳球蛋白去除效率
β-乳球蛋白标准品 反应液 去除效率
β-乳球蛋白浓度(ng/mL) 4.032 3.357 16.76％
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株铜绿假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 1
cattgcggca gtctacacat gcaagtcgag cggatgaagg gagcttgctc ctggattcag 60
cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa cgtccggaaa 120
cgggcgctaa taccgcatac gtcctgaggg agaaagtggg ggatcttcgg acctcacgct 180
atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga 240
tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg 360
cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcagtaag 420
ttaatacctt gctgttttga cgttaccaac agaataagca ccggctaact tcgtgccagc 480
agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt 540
aggtggttca gcaagttgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa 600
ctactgagct agagtacggt agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt 720
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
cgactagccg ttgggatcct tgagatctta gtggcgcagc taacgcgata agtcgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt gacatgctga 960
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt 1080
agttaccagc acctcgggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg 1200
tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc 1260
cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga 1320
atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380
gttgctccag aagtagctag tctaaccgca agggggacgt taccacggag gttttcattt 1440
t 1441

Claims (7)

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8，其特征在于，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016533，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在奶粉生产中的应用。
3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在生产蛋白酶中的的应用。
4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在去除奶粉过敏原中的应用。
5.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在去除αS1-酪蛋白中的应用。
6.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在去除β-乳球蛋白中的应用。
7.权利要求1所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas artuginosa)S8在生产奶制品中的应用。
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CN105861373A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种产角蛋白酶的铜绿假单胞菌及其应用

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