CN106520603A - 一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法 - Google Patents

一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法；先利用消化后的麦醇溶蛋白处理细胞，在洗去残留的消化后的麦醇溶蛋白后加入一定量益生菌共孵育一定时间后洗去，以确定益生菌改善被消化麦醇溶蛋白破坏的细胞紧密连接的能力。本发明的体外实验模型能反映益生菌对麦醇溶蛋白已造成的肠上皮损伤的实际修复作用，所得结果符合益生菌对肠道内已形成的肠道屏障破坏的修复能力，从而在细胞水平为确定益生菌及其他微生物是否能够增强肠道细胞紧密连接提供了一个更为便捷准确的检测方法。

Description

一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌 的方法
技术领域
本发明涉及益生菌筛选技术领域，尤其是涉及一种在体外快速判断益生菌是否能增强肠道细胞紧密连接的方法。
背景技术
随着现代生活节奏的加快，越来越多的中国人也患有了过去在西方国家比较流行的炎症性肠病(IBD)，这种疾病包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。已有报道，肠道屏障的完整性是人类健康的保证，肠道细胞紧密连接(TJ)的破坏是引发炎症性肠病的重要因素，因此增强肠道细胞紧密连接也成为了保护人类抵御炎症性肠病的有效途径。
对于炎症性肠病的确切发病机理现仍不清晰，而传统的抗生素药物、免疫调节制剂等有较强的副作用，因此益生菌被更多的研究者提出用以作为一种长效无害的预防及治疗方式。目前，已在肉鸡和仔猪等动物实验研究中发现，当摄入足够多数量益生菌的时候，由于一些菌株能够直接影响紧密连接蛋白的表达而对肠道屏障起到保护作用，因此被广泛应用于饲料生产中。然而，动物模型实验周期长、费用高，不适合大规模筛选使用，且随着动物伦理要求的日益严格，未来使用实验动物将会更加困难。
因此发展一种可有效反映益生菌对紧密连接调节作用的体外研究方法，能够在短时间内快速判断其增强肠道细胞紧密连接的能力，有助于快速开发具有调节肠道健康的益生菌产品。运用本发明大规模快速筛选并结合动物实验验证后开发的益生菌及其相关食品工业产品，有利于帮助人类预防或者干预炎症性肠病等相关肠道紊乱疾病。
至今为止，所有使用消化后的麦醇溶蛋白进行益生菌缓解炎症性肠病的体外模拟实验中，采用的都是益生菌与消化后的麦醇溶蛋白同时加入细胞培养液再与细胞共同培养，由于有研究表明一些从发酵食品分离出的益生菌能够降解麦醇溶蛋白，因此这类常规的方法反映的结果与益生菌在肠道内缓解炎症性肠病的实际情况并不吻合，用此类方法得到益生菌对肠道细胞紧密连接的作用并不一定是益生菌本身对肠道紧密连接的增强作用，而可能是由于益生菌降解消化后的麦醇溶蛋白从而减少了麦醇溶蛋白对细胞紧密连接的破坏。
因此利用消化麦醇溶蛋白、益生菌及动物细胞共孵育的方法体外模拟益生菌对炎症性肠病的缓解作用已不能准确的反映益生菌在体内调节肠道屏障的功能，需要建立一种弥补传统方法缺陷的新方法，以满足在体外快速准确地筛选到具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的需求。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明公开一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法。本发明先利用消化后的麦醇溶蛋白处理细胞，在洗去残留的消化后的麦醇溶蛋白后加入一定量益生菌共孵育一定时间后洗去，以确定益生菌改善被消化麦醇溶蛋白破坏的细胞紧密连接的能力。
本发明的技术方案如下：
一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，包括下列步骤：
(1)用Roswell Park Memorial Institute 1640Glutamax medium(RPMI 1640)培养基对在体外可进行培养的人或动物肠道细胞进行培养至单层细胞；所述肠道细胞包括且不限于人结肠癌细胞HT-29、人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84；
(2)模拟消化道环境用胃蛋白酶结合胰蛋白酶消化处理麦醇溶蛋白即gliadin，灭活后真空冷冻干燥得到消化后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin；
(3)益生菌培养；
(4)用PT-gliadin及益生菌菌悬液先后分段对步骤(1)所得的单层肠道细胞进行孵育；
(5)细胞紧密连接指标检测。
步骤(2)的详细操作方法为：称取60mg的麦醇溶蛋白溶解于10mL pH＝4.0的50mM醋酸钠缓冲液，向溶液中加入3mg的胃蛋白酶后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活，并将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin粉末。
步骤(3)所述益生菌包括且不仅限于：双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、片球菌属在内的细菌以及其他对人体及动物有益的细菌和真菌。
步骤(4)中孵育方式为：先用含有1-10mg/mL PT-gliadin且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液孵育肠道细胞1-5h，用磷酸盐缓冲液将细胞中残留的PT-gliadin冲洗干净，再用重悬有1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液与肠道细胞共孵育1-5h。
步骤(5)中细胞紧密连接检测包括：单层细胞跨膜电阻值检测、细胞连蛋白释放量检测以及细胞紧密连接蛋白表达量和定位检测；
其中，PT-gliadin孵育单层细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度超过20％视为细胞紧密连接受损，益生菌孵育后对受损肠道细胞的跨膜电阻恢复程度超过10％的为有效菌株；
PT-gliadin可以引起单层细胞联蛋白释放量显著提高，益生菌处理后相比于由PT-gliadin引起的连蛋白释放量能降低25％的为有效菌株；
PT-gliadin处理后会导致细胞紧密连接蛋白相对mRNA水平降低，益生菌孵育细胞后紧密连接蛋白相对mRNA水平等于或大于1的为有效菌株；
PT-gliadin处理后会导致紧密连接蛋白荧光量降低，益生菌孵育后如果有明显的荧光强度回复，即为有效菌株。
下面提供每一个步骤具体的操作方法和试验参数。
1、肠道细胞培养
人结肠癌细胞HT-29(或人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84)在RPMI1640培养基(包含10％胎牛血清，青霉素(100U/mL)，链霉素(100μg/mL))中生长，并在37℃、5％CO2细胞培养箱内培养至密度105个/cm2以上。本试验使用的细胞传代数控制在50代以内。
2、模拟消化环境处理麦醇溶蛋白(gliadin)和牛血清白蛋白(BSA)
①精确称取60mg麦醇溶蛋白(gliadin,G3375；Sigma-Aldrich)或者60mg牛血清白蛋白(BSA,A7030；Sigma-Aldrich)，溶解于10mL的50mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)；
②向溶液中加入3mg胃蛋白酶(64007137；Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd)后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h；
③再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠[Na2HPO4]，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶(64008860；Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd)，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h；
④将以上步骤所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活；
⑤将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白(PT-gliadin)粉末，置于-20℃冰箱保存备用。
3、益生菌培养
待筛选的益生菌菌株均保存于添加了30％甘油的deMan,Rogosa,and Sharpe(MRS)培养基中(难培养的如梭菌等肠道细菌可以保存在添加30％甘油的ReinforcedClostridial medium(RCA)培养基中，酵母类真菌可以保存在添加30％甘油的YeastExtract Peptone Dextrose Medium(YPD)培养基中，其他益生菌可以用含有30％甘油的本领域常用培养基保存)，保存温度为-80℃，菌株在实验之前先活化转接2次。菌株活化的方法是以2％(v/v)的接种量将冻存的菌接种到相应培养基中，在37℃条件下培养18h后再以同样的接种量转接一次至新鲜的培养基。
4、益生菌菌悬液的制备
菌株活化后，以2％(v/v)接种量接种于相应液体培养基中，37℃静置培养18h，7000rpm离心5min收集菌体，收集的菌体经pH 7.3的磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液中并调整菌数至不同的菌体密度，备用。
5、分段孵育肠道细胞
实验组中先用添加了1-10mg/mL PT-gliadin且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液孵育人结肠癌细胞HT-29(或人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84)1-5h，之后用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，再加入重悬有1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养1-5h后去除混合培养液，以磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次；以单独加入1-10mg/mL PT-gliadin孵育1-5h后洗去再加入不含益生菌且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液再培养1-5h的细胞为模型对照组；以单独加入1-10mg/mLPT-BSA孵育1-5h后洗去再加入不含益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养1-5h的细胞为阴性对照组；以不加任何处理的肠道细胞为空白组。
6、细胞紧密连接检测项目
(1)检测细胞跨膜电阻值
将人结肠癌细胞HT-29(或人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84)平铺在通透性嵌套小室中(3640-Clear,Corining Corporate)，在内室加入400μL不加血清和抗生素RPMI 1640细胞培养液并在外室加入1mL不加血清和抗生素的细胞培养液培养直到单层细胞布满整个膜面；洗去培养液后，在小室内先加入含有1-10mg/mL PT-gliadin的400μL不加血清和抗生素RPMI 1640细胞培养液孵育细胞1-5h，再用磷酸盐缓冲液冲洗小室内的细胞3次后，向小室内加入400μL重悬有1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养1-5h，期间在外室一直保持1mL不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液；使用细胞电阻仪ERS-2volt-ohm meter(MilliporeCorporate)，每隔1h测定一次跨膜电阻值，时间段为0-10.5h，其中有0.5h的时间段为洗去前处理的细胞培养液，在益生菌处理细胞前以及洗去处理悬液后均需要测定单层细胞的跨膜电阻；
PT-gliadin处理单层细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度超过20％视为受损，益生菌孵育后对受损肠道细胞的跨膜电阻恢复程度超过10％的为合格菌。
(2)酶联免疫吸附测定连蛋白释放量
实验组0-10.5h，前3-5h除空白对照和阴性对照外都用含有1-10mg/mL PT-gliadin的不加血清和抗生素RPMI 1640细胞液培养，之后0.5h时间段内冲洗细胞，之后加入1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液再培养1-5h，后1-5h内各实验孔每隔1h各取50μL细胞培养液，按照人连蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒(SY-ELA7760,Shanghai win-win Biological Technology Co.,Ltd.)的操作步骤制备96微孔板，置于酶标仪上并在450nm波长下测定吸光度，计算得到细胞培养液中的连蛋白含量；
PT-gliadin可以引起单层细胞联蛋白释放量显著提高，益生菌处理后相比于由PT-gliadin引起的连蛋白释放量能降低25％的为有效菌株。
(3)细胞紧密连接相关蛋白基因相对表达量的变化
①通过分段孵育得到的细胞，用总RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据使用手册说明从每个孔的HT-29细胞中提取总RNA；
②用含有清除gDNA作用的反转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent Kit(Takara,Tokyo,Japan)，根据使用手册说明将RNA反转录成cDNA；
③用荧光染料SYBR Green super mix(Qiagen,Germany)混合样本，在实时荧光定量基因扩增仪器CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,CA)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以管家基因β-Actin为内参，所得结果用2-ΔΔCq的方法进行分析；
PT-gliadin处理后会导致细胞紧密连接蛋白相对mRNA水平降低，益生菌孵育细胞后紧密连接蛋白相对mRNA水平等于或大于1的可视为有效菌株。
(4)激光共聚焦显微镜检测紧密连接蛋白在细胞上的定位及其含量变化
①将细胞传代于激光共聚焦显微镜专用15mm培养皿上，待细胞铺满平皿，经过上述PT-gliadin及益生菌分段处理，并用磷酸缓冲盐溶液清洗3次后，加入4％多聚甲醛固定细胞，室温放置20min，去除多聚甲醛，加入适量磷酸缓冲盐溶液；
②每个培养皿中加入1mL通透液于室温放置10min后用磷酸缓冲盐轻微振荡洗涤2次；所述通透液为0.1％曲拉通X-100；
③每个培养皿中加入1mL封闭液，室温放置30min；所述封闭液为含2％BSA的磷酸缓冲盐溶液；
④去除封闭液，加入200μL的1％浓度的一抗，所述一抗为兔抗ZO-1/TJP1(40-2200,Life Technology)或兔抗Occludin(71-1500,Life Technology)或兔抗Claudin-1(71-7800,Life Technology))，4℃孵育过夜；
⑤用PBST轻微振荡洗涤3次，再加入200μL的0.2％浓度溶于PBST的羊抗兔荧光二抗，在37℃条件下避光孵育50min；所述PBST为含0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液；
⑥用PBST轻微振荡洗涤3次，加入200μL细胞核染料DAPI，在室温下孵育10min；
⑦用PBST轻微振荡洗涤3次，保留1mL PBST于小皿内，用激光共聚焦显微镜观察结果；
PT-gliadin处理后会导致紧密连接蛋白荧光量降低，益生菌孵育后如果有明显的荧光强度回复，即可视为有效。
(5)小鼠实验
由于动物实验成本太高，周期太长，不利于快速筛选，因此需要建立体外快速筛选模型，然而要证明本发明提供的快速筛选模型的可靠性，需要将本发明的结果和动物实验结果相对比，从而印证体外筛选得到的结果能够反映待测益生菌在动物体内对肠道紧密连接的真实恢复作用。这是最准确的最可信的结果。
取5周龄健康雌性C57BL6/J小鼠48只，随机分为8组，每组含小鼠6只，置于24℃恒温室且每12h一个昼夜循环适应一周后进行实验，所有组均给予正常饮水与饲料；将益生菌重悬于3％蔗糖溶液中，制成浓度为1.0×109cfu/mL的悬液，从第二周开始每日给予除空白对照组和模型组外的所有益生菌干预组以该浓度菌悬液灌胃一次，灌胃量是0.2mL/10g体重，持续灌胃两周；空白对照组和模型组则以同样的频率灌胃0.2mL/10g体重的3％蔗糖溶液；从第三周开始，除空白对照组以外的实验组均在饮水中加入2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)，持续一周以诱导小鼠患急性炎症性肠病；第三周结束，麻醉处死小鼠，截取病变结肠1cm至2mL离心管中，加入1mL Trizol，根据试剂盒使用手册提取总RNA，并用实时荧光定量基因扩增的方法检测其紧密连接蛋白mRNA的转录水平。
本发明有益的技术效果在于：
本发明的体外实验模型能准确快速地反映益生菌对麦醇溶蛋白已造成的肠上皮损伤的实际修复作用，所得结果更符合益生菌对肠道内已形成的肠道屏障破坏的修复能力，从而在细胞水平为确定益生菌及其他微生物对是否能够增强肠道细胞紧密连接提供了一个更为便捷准确的检测方法。利用本发明可在较短的时间内批量测定益生菌及其他微生物对肠上皮细胞紧密连接的影响，能够更准确地反映菌体及其代谢产物在肠道内修复肠道屏障的真实作用，快速预测不同微生物对肠道屏障的影响，有利于寻找新的改善炎症性肠病的益生菌及方法。
本发明分段孵育法获得的结果比共孵育法获得结果更接近动物模型体内得到的数据，且使用共孵育法得到的假阳性结果在本发明的分段孵育法中不会出现。本专利将发明的新型分段孵育方法与传统的共孵育法在评价益生菌干预消化麦醇溶蛋白对细胞紧密连接蛋白相关基因表达的影响上作了比较，同时与益生菌干预由葡聚糖硫酸钠诱导急性炎症性肠病的小鼠实验结果进行对比，结果如图1、图2所示。实验结果表明，先用消化麦醇溶蛋白破坏细胞紧密连接并清除残留消化麦醇溶蛋白之后再用益生菌处理的分段孵育方法得到的具有增强紧密连接能力的益生菌结果，比消化麦醇溶蛋白、益生菌、动物细胞共孵育的方法得到的菌株结果更接近用动物模型得到的有益菌株结果，尤其在共孵育法中出现假阳性结果的发酵乳杆菌F1菌株，在分段孵育法结果以及动物实验结果中均表现为阴性结果，分段孵育所得结果更能反映益生菌在体内增强肠道细胞紧密连接、缓解炎症性肠病的功能强弱。
本发明实验结果准确、操作方便、便于大规模筛选使用，成本低、时间短。选用的细胞为常用的体外培养的人或哺乳动物肠道细胞，易于培养及检测，以此方法得到的结果与动物实验结果匹配程度高，从而可以避免使用动物模型进行初期的大规模筛选，每个样品仅需进行细胞水平上的检测，花费时间远低于体内实验所耗时间，节约了大量的时间及耗材成本，也更符合动物伦理的要求。
本发明实用性强。能够批量地对多株菌株同时进行测定，非常适用于种类繁多的益生菌以及其他微生物对紧密连接调节功能的比较研究。
本发明是一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，通过这种实验方法可快速、准确地对不同种属的益生菌及其他微生物调节肠道细胞紧密连接的功能进行研究，对研究益生菌及其他微生物通过调节肠道屏障干预炎症性肠病具有重要意义。
附图说明
图1为图1为本发明具体步骤与传统共孵育法的对照示意图；
图2为不同株益生菌利用分段孵育法与共孵育法分别处理HT-29细胞后对细胞关键紧密连接蛋白mRNA转录的影响情况及与同株益生菌对由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎缓解作用的比较；
图3为通过PCA的方法分析两种不同处理方法得出的结果与实验动物所得结果的匹配程度；
图4为不同处理方式对HT-29细胞单层跨膜电阻值的影响；
图5为不同处理方式对HT-29细胞紧密连接中连蛋白释放量的影响；
图6为不同处理方式对HT-29细胞紧密连接蛋白在细胞上的定位以及含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：不同细胞处理方式的比较
首先将本发明提供的分段孵育方法与传统共孵育方法进行比较，如图1所示，图中A表示单独添加不含血清及抗生素的RPMI 1640细胞培养液与HT-29细胞共孵育3小时后洗去；B表示在不含血清及抗生素的RPMI 1640细胞培养液中添加PT-gliadin与HT-29细胞共孵育3小时后洗去；C表示在不含血清及抗生素的RPMI 1640细胞培养液中添加PT-BSA与HT-29细胞共孵育3小时后洗去；D表示在不含血清及抗生素的RPMI 1640细胞培养液中添加PT-gliadin并同时添加不同种益生菌与HT-29细胞共孵育3小时后洗去；E表示先用不含血清及抗生素但含有PT-gliadin的RPMI 1640细胞培养液与HT-29细胞共孵育3小时后清洗干净，再分别添加重悬不同种益生菌的不含血清及抗生素的RPMI 1640细胞培养液与HT-29细胞共孵育3小时后洗去。
①共孵育组：实验组中向不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养基中同时加入1×108CFU/mL益生菌和4mg/mL PT-gliadin，在37℃、5％CO2条件下共同孵育3h后洗去混合培养液；以单独加入4mg/mL PT-gliadin按上述步骤操作的细胞为模型对照组；以单独加入4mg/mL PT-BSA按上述步骤操作的细胞为阴性对照组，以不加任何处理的细胞为空白对照组；
②分段孵育组：实验组中先用添加了4mg/mL PT-gliadin且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液孵育细胞3h，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次后，加入重悬有1×108CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养3h后去除混合培养液，以磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次；以单独加入4mg/mL PT-gliadin按上述步骤操作并在洗去之后加入不含益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养3h的细胞为模型对照组；以单独加入4mg/mL PT-BSA按上述步骤操作并在洗去之后加入不含益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养3h的细胞为阴性对照组；以不加任何处理为空白组。
表1是表示实施例1所用的菌株。
表1实施例1所用菌株
表1中的菌株的制备方法为：实验所用益生菌株制备方法：称取MRS培养基，加一定量的水，灭菌后冷却至室温；无菌称取待分离的原料(液态1ml，固态1g)，放入盛有9mL无菌生理盐水的试管中。用漩涡振荡器混匀，取1mL悬液加入到9mL无菌生理盐水的试管中，梯度稀释到10-6。吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液0.1mL涂布，28℃-37℃倒置培养。挑取单一的肉眼观察菌落形态差异大的菌株在平板培养基上进行3次划线分离，所得的单菌落接种液体培养基中28℃-37℃培养。对所得菌株进行革兰氏染色观察以及16SrDNA鉴定。
实施例2：不同细胞处理方式得到的紧密连接蛋白表达水平与动物实验中紧密连接蛋白水平的比较
(1)细胞紧密连接相关蛋白基因相对表达量的变化：
①用总RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据使用手册从HT-29细胞中提取总RNA；
②用含有清除gDNA作用的反转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent Kit(Takara,Tokyo,Japan)，根据使用手册将RNA反转录成cDNA；
③用荧光染料SYBR Green super mix(Qiagen,Germany)混合样本，在实时荧光定量基因扩增仪器CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,CA)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以管家基因β-Actin为参照，所得结果用2-ΔΔCq的方法进行分析。
(2)模型小鼠肠道细胞紧密连接相关蛋白基因相对表达量的变化：
取5周龄健康雌性C57BL6/J小鼠48只，随机分为8组，每组含小鼠6只，置于24℃恒温室且每12h一个昼夜循环适应一周后进行实验，所有组均给予正常饮水与饲料。将益生菌重悬于3％蔗糖溶液中，制成浓度为1.0×109cfu/mL的悬液，从第二周开始每日给予除空白对照组和模型组外的益生菌干预组以该浓度菌悬液灌胃一次，灌胃量是0.2mL/10g体重，持续灌胃两周。空白对照组和模型组则以同样的频率灌胃0.2mL/10g体重的3％蔗糖溶液。从第三周开始，除空白对照组以外的实验组均在饮水中加入2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)，持续一周以诱导小鼠患急性炎症性肠病。第三周结束，麻醉处死小鼠，截取病变结肠1cm至2mL离心管中，加入1mL Trizol，根据试剂盒使用手册提取总RNA，并用以上实时荧光定量基因扩增的方法检测其紧密连接蛋白mRNA的转录水平。
表2实时荧光定量基因扩增所用引物
图2为实时荧光定量基因扩增测定紧密连接蛋白相关基因的mRNA相对含量。图中A列表示使用共孵育法得到的益生菌对HT-29细胞紧密连接蛋白mRNA相对含量的影响；B列表示使用分段孵育法得到的益生菌对HT-29细胞紧密连接蛋白mRNA相对含量的影响；C列表示益生菌对由2.5％葡聚糖硫酸钠诱导的患急性炎症性肠病小鼠结肠部位关键紧密连接蛋白mRNA相对含量的影响。不同的字母表示显著相关p<0.05。
从图2可以看出，PT-gliadin处理后会导致细胞紧密连接蛋白相对mRNA水平降低35％以上，总体看来，B列各菌对紧密连接蛋白mRNA的调节趋势与动物模型所得的实验结果趋势更相近，特别值得注意的是发酵乳杆菌F1，在A列该菌能够缓解PT-gliadin对细胞紧密连接相关蛋白基因转录的持续下调作用，而B列中，该菌则没有类似作用，说明F1对于紧密连接的恢复没有直接的作用。在动物实验中也得出发酵乳杆菌F1对炎症性肠病小鼠结肠紧密连接蛋白mRNA水平无调节作用。而其它益生菌LGG、C1、P1、P2、P3孵育细胞后紧密连接蛋白相对mRNA水平大于1，故可将其视为有效菌株。
图3为三种实验模型基于紧密连接蛋白相对mRNA的主成分分析。从图3中可看出，总体上分段孵育法所得结果在主成分分析中比共孵育法更加接近小鼠模型的实验结论。虽然在基于Occludin的相对mRNA水平的PCA分析中，共孵育法结果更接近小鼠模型的结果，但是分段孵育法和共孵育法的得分均落在第一主成分PC1的正向区间内。且从基于ZO-1、ZO-2、Claudin-1和Claudin-3的相对mRNA水平的PCA分析中三种模型得分的分布情况可以得出，分段孵育法与小鼠模型的得分差距小于共孵育法与小鼠模型的得分差距。以上充分说明了分段孵育法得到的结果比共孵育法得到的结果更加符合小鼠模型得到的结论，本专利提供的分段孵育实验方法更能反映乳酸菌在体内修复肠道屏障的真实作用。
实施例3：不同处理方式对不同肠上皮细胞跨膜电阻值的影响
将HT-29细胞平铺在通透性嵌套小室中(3640-Clear,Corining Corporate)，在内室加入400μL不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液并在外室加入1mL不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液培养直到单层细胞布满整个膜面。洗去培养液后，在共孵育组的小室内加入同时含有4mg/mL PT-gliadin和1×108CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液400μL，外室仍加入1mL不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液继续培养3h；而在分段孵育组的小室内先加入含有4mg/mL PT-gliadin的400μL不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液孵育细胞3h，再用磷酸盐缓冲液冲洗小室内的细胞3次后，向小室内加入400μL重悬有1×108CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养3h，期间在外室一直保持1mL不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液。使用细胞电阻仪ERS-2volt-ohm meter(Millipore Corporate)，在共孵育组中每隔0.5h测定一次跨膜电阻值(时间段为0-3h)，在分段孵育组中每隔1h测定一次跨膜电阻值(时间段为0-6.5h，其中3-3.5h的时间段为洗去前处理的细胞培养液)，在乳酸菌处理细胞前以及洗去处理悬液后均需要测定单层细胞的跨膜电阻。
图4为不同处理方式对HT-29细胞单层跨膜电阻值的影响。图中，A部分表示用共孵育法得到的乳酸菌对HT-29细胞单层的跨膜电阻值的影响；B部分表示用分段孵育法得到的乳酸菌对HT-29细胞单层的跨膜电阻值的影响。
共孵育法的结果(图4A)显示PT-gliadin处理单层细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度超过20％，而所有实验菌株都对PT-gliadin处理的HT-29细胞的TER有相似程度的恢复。共孵育法的结果显示所有的菌对PT-gliadin造成的细胞跨膜电阻降低均有恢复作用，但是无法判断是益生菌降解了PT-gliadin从而缓解了细胞跨膜电阻受损，还是益生菌直接恢复了紧密连接从而恢复了细胞跨膜电阻。分段孵育法的结果(图4B)显示除发酵乳杆菌F1以外的益生菌孵育后对受损肠道细胞的跨膜电阻恢复程度超过10％，而发酵乳杆菌F1基本没有恢复作用，因此可以判定发酵乳杆菌F1不具备直接的紧密连接恢复作用。这一结果也与图2和图3中所得到的结论相对应，表明分段孵育法的到的结果更接近动物模型得到的结论。
利用上述方法将Caco-2细胞平铺在通透性嵌套小室中，并按相同的培养和处理方式，进行益生菌筛选。结果显示PT-gliadin处理Caco-2细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度在20％以上，而益生菌株LGG、C1、P1、P2、P3在分段孵育后对受损Caco-2细胞的跨膜电阻恢复程度均超过10％，说明其均为对紧密连接修复有效的菌株。在共孵育中对PT-gliadin导致的细胞跨膜电阻值降低表现出10％恢复率的发酵乳杆菌F1，在分段孵育中，对受损Caco-2细胞的跨膜电阻几乎没有恢复作用，说明该株菌在直接恢复Caco-2细胞的紧密连接上也没有直接效果。
实施例4：不同处理方式对肠上皮细胞连蛋白释放量的影响
在共孵育组(0-3h除空白对照和阴性对照外都用同时含有4mg/mL PT-gliadin和1×108CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液孵育细胞)各实验孔每隔1h各取50μL细胞培养液；而在分段孵育组(0-6.5h，前3h除空白对照和阴性对照外都用含有4mg/mL PT-gliadin不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞液培养，3-3.5h时间段内冲洗细胞，之后加入1×108CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液再培养3h)，后3.5-6.5h内各实验孔每隔1h各取50μL细胞培养液，按照人连蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒(SY-ELA7760,Shanghai win-win Biological Technology Co.,Ltd.)的操作步骤制备96微孔板，置于酶标仪上并在450nm波长下测定吸光度，计算得到细胞培养液中的连蛋白含量。
图5为不同处理方式对HT-29细胞紧密连接中连蛋白释放量的影响。图中，A部分表示用共孵育法得到的乳酸菌对HT-29细胞释放的连蛋白量的影响；B部分表示用分段孵育法得到的乳酸菌对HT-29细胞释放的连蛋白量的影响。
益生菌与PT-gliadin共孵育HT-29单层细胞时，绝大部分菌株均能降低连蛋白的释放量。值得注意的是，在共孵育法(图5A)中能够明显降低HT-29细胞连蛋白释放量的发酵乳杆菌F1在分段孵育法组(图5B)中无法改善由PT-gliadin导致的细胞连蛋白释放程度，而益生菌LGG、C1、P1、P2、P3处理后相比于由PT-gliadin引起的连蛋白释放量能降低25％，说明均为有效菌株。这一结果也与图2、图3和图4中所得到的结论相对应，表明分段孵育法的到的结果更接近动物模型得到的结论。
实施例5：免疫荧光显微技术呈现紧密连接蛋白在细胞上的定位以及荧光强度比较
①将细胞传代于激光共聚焦显微镜专用15mm培养皿上，待细胞铺满平皿，经过上述PT-gliadin及益生菌分段处理过的HT-29细胞单层，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次后，加入4％多聚甲醛固定细胞，室温放置20min，倒掉多聚甲醛，加入适量磷酸缓冲盐溶液；
②每个培养皿中加入1mL通透液即0.1％曲拉通X-100，于室温放置10min后用磷酸缓冲盐轻微振荡洗涤2次；
③每个培养皿中加入1mL封闭液即2％BSA(添加牛血清白蛋白到磷酸缓冲盐溶液中)，室温放置30min；
倒掉封闭液，加入200μL体积的1％浓度的一抗(本实验中使用兔抗-ZO-1/TJP1(40-2200,Life Technology)或者兔抗-Occludin(71-1500,Life Technology)或者兔抗-Claudin-1(71-7800,Life Technology))，4℃孵育过夜；
用PBST(含0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)轻微振荡洗涤3次，再加入200μL体积的0.2％浓度的羊抗兔荧光二抗，在37℃条件下避光孵育50min；
用PBST轻微振荡洗涤3次，加入200μL细胞核染料DAPI，在室温下反应10min；
用PBST轻微振荡洗涤3次，保留1mL PBST于小皿内，用激光共聚焦显微镜观察结果。
用PBST(含0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液)轻微振荡洗涤3次，再加入200μL体积的0.2％浓度的荧光二抗，在37℃条件下避光孵育50min；
用PBST轻微振荡洗涤3次，加入200μL细胞核染料DAPI，在室温下反应10min；
用PBST轻微振荡洗涤3次，保留1mL PBST于小皿内，用激光共聚焦显微镜观察结果。
图6为紧密连接蛋白在HT-29细胞上的定位及含量。图为使用分段孵育法利用PT-gliadin和益生菌处理HT-29细胞后，用激光共聚焦显微镜观察得到ZO-1、Occludin以及Claudin-1在HT-29细胞上的定位及含量情况。
从图6可发现PT-gliadin处理后，HT-29细胞上的ZO-1、Occludin以及Claudin-1含量均降低。在ZO-1以及Claudin-1的图中可知，植物乳杆菌P1、P2对其降低具有较强的恢复功能，同时鼠李糖乳杆菌LGG比干酪乳杆菌C1的整体调节作用也更强。特别值得注意的是，发酵乳杆菌F1对三种紧密连接蛋白表达量的下降均没有明显的恢复作用，印证了图2和图3在mRNA转录水平上的结果，同时也符合小鼠模型实验中得出的发酵乳杆菌F1不具备调节紧密连接蛋白表达的结论。

Claims (5)

1.一种在细胞水平筛选具有增强肠道细胞紧密连接功能益生菌的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)用Roswell Park Memorial Institute 1640Glutamax medium(RPMI 1640)培养基对在体外可进行培养的人或动物肠道细胞进行培养至单层细胞；所述肠道细胞包括且不限于人结肠癌细胞HT-29、人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞T84；
(2)模拟消化道环境用胃蛋白酶结合胰蛋白酶消化处理麦醇溶蛋白即gliadin，灭活后真空冷冻干燥得到消化后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin；
(3)益生菌培养；
(4)用PT-gliadin及益生菌菌悬液先后分段对步骤(1)所得的单层肠道细胞进行孵育；
(5)细胞紧密连接指标检测。
2.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(2)的详细操作方法为：称取60mg的麦醇溶蛋白溶解于10mL pH＝4.0的50mM醋酸钠缓冲液，向溶液中加入3mg的胃蛋白酶后，置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，再向溶液中加入71mg无水磷酸氢二钠，并用氢氧化钠快速调节pH至7.0，之后加入3mg胰蛋白酶，并将混合溶液置于37℃恒温培养箱中以200rpm震荡孵育2h，所得反应混合液置于95℃水浴锅内10min将酶灭活，并将灭活后的混合液进行真空冷冻干燥后获得消化处理后的麦醇溶蛋白即PT-gliadin粉末。
3.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(3)所述益生菌包括且不仅限于：双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、片球菌属在内的细菌以及其他对人体及动物有益的细菌和真菌。
4.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(4)中孵育方式为：先用含有1-10mg/mL PT-gliadin且不加血清和抗生素的RPMI 1640细胞培养液孵育肠道细胞1-5h，用磷酸盐缓冲液将细胞中残留的PT-gliadin冲洗干净，再用重悬有1×105～1×1011CFU/mL益生菌且不加血清和抗生素的RPMI1640细胞培养液与肠道细胞共孵育1-5h。
5.根据权利要求1所述的筛选益生菌的方法，其特征在于：步骤(5)中细胞紧密连接检测包括：单层细胞跨膜电阻值检测、细胞连蛋白释放量检测以及细胞紧密连接蛋白表达量和定位检测；
其中，PT-gliadin孵育单层细胞后，细胞跨膜电阻值降低程度超过20％视为细胞紧密连接受损，益生菌孵育后对受损肠道细胞的跨膜电阻恢复程度超过10％的为有效菌株；
PT-gliadin可以引起单层细胞联蛋白释放量显著提高，益生菌处理后相比于由PT-gliadin引起的连蛋白释放量能降低25％的为有效菌株；
PT-gliadin处理后会导致细胞紧密连接蛋白相对mRNA水平降低，益生菌孵育细胞后紧密连接蛋白相对mRNA水平等于或大于1的为有效菌株；
PT-gliadin处理后会导致紧密连接蛋白荧光量降低，益生菌孵育后如果有明显的荧光强度回复，即为有效菌株。
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