CN106511323B - 广藿香醇在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及广藿香醇在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用。本发明所述应用中的药物由广藿香醇和医学上可接受的辅料组成。本发明所述药物中的广藿香醇可减少反映结肠炎症程度的髓过氧化物酶(MPO)活力，促进紧密蛋白(TJs)和黏蛋白的表达，具有保护肠上皮黏膜屏障的作用，防治溃疡性结肠炎的效果显著。

Description

广藿香醇在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及含有机有效成分的医药配制品，具体涉及含羟基化合物的药物，该药物可用于治疗溃疡性结肠炎。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因及发病机制均不明确的慢性结肠炎症。该病病程冗长，病变范围广泛，病变部位主要位于结肠的粘膜层，以溃疡为主，多累及直肠和乙状结肠，有时遍及整个结肠。溃疡性结肠炎具有急性暴发型病死率高、慢性持续型癌变率高、易反复发作等特点，临床表现为：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等症状，严重影响着人们的生活质量，且目前无特效药物，故被世界卫生组织列为现代难治病之一。本病在欧美国家发病率较高，大概为0.04％-0.1％。在国内未见精确的统计报告数据，但近年来呈明显增加的趋势。目前主要采用传统的治疗药物有以下5种：氨基水杨酸类(如柳氮磺胺吡啶)、皮质类固醇、免疫抑制剂(如硫唑嘌呤)、生物制剂(如TNF-α，即英夫利昔)以及益生菌。但还是存在疗效不理想，甚至导致严重副作用的问题。氨基水杨酸类可导致严重过敏和高热，糖皮质激素可导致水牛背及骨质疏松，硫唑嘌呤会导致严重肝损伤，英夫利昔可能引起大出血和感染。因此，寻找对溃疡性结肠炎具有良好治疗作用的中药，探明其作用机制，对于发现溃疡性结肠炎的新型治疗药物具有重要意义。

广藿香醇又名百秋李醇，虎尾草醇，是一种三环倍半萜类化合物，其化学名为[1R(1α，4β，4Aα，6β)]-八氢-4，8A，9，9-四甲基-1，6-亚甲基萘-1(2H)-醇，分子式为C15H26O，分子量为222.37，结构式如下结构式I所示，外观为六角偏方四分面像晶体，不溶于水，可溶于乙醇和乙醚和常用有机溶剂。广藿香醇在抗流感毒性、抗炎、抗真菌，并在神经保护、胃肠道保护、免疫调节上发挥了重要作用。

公开号为CN 104306362 A的发明专利申请公开了广藿香醇在制备防治胃肠动力障碍性疾病的药物中的应用，该应用公开了广藿香醇“既能抑制小鼠胃底平滑肌收缩，又能小鼠胃底抑制平滑肌的舒张”。由胃肠动力的概念可知，胃肠动力障碍是指胃肠部肌肉的收缩蠕动力不足，只是某种原因所产生的结果。现代医学研究结果显示，很多因素都可引起胃肠动力不足，如，胃肠疾病，甚至精神情绪变化和生活习惯都可引起胃肠动力足，因此即使是胃肠疾病引起的，服用含广藿香醇的药物后使胃肠动力恢复正常，也不能说明治愈了所引发的疾病，因为胃肠动力只能作为治疗某种胃肠疾病的一个评价指标，而且还不是主要的指标。比如，溃疡性结肠炎是否治愈的关键是结肠黏膜层和层黏膜下的炎症是否消失，结肠黏膜上的溃疡面是否缩小或治愈。可见，上述专利申请未公开广藿香醇具有防治溃疡性结肠炎的生物活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供广藿香醇的新用途，即在制药中的新用途。

上述新用途具体是，广藿香醇在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用。

上述应用中所述的药物由广藿香醇和医学上可接受的辅料组成。所述药物可以是常见的口服制剂，如口服液、片剂、胶囊，滴丸、颗粒剂或栓剂。

本发明的研究结果显示，广藿香醇具有防治溃疡性结肠炎的作用，其机制与其降低反映结肠炎症程度的髓过氧化物酶(MPO)活力，促进紧密蛋白(TJs)和黏蛋白的表达，从而保护肠上皮黏膜屏障有关。广藿香醇的这种作用可以用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，特别是以腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀为主要临床表现的溃疡性结肠炎。

此外，与现有的治疗溃疡性结肠炎的药物相比，广藿香醇保护肠道粘膜的机制有所不同。因此，本发明为溃疡性结肠炎提供了一种新的药物选择。另外，根据前期急性毒性实验结果显示，广藿香醇没有给药毒性和遗传毒性，安全性很高，因此，从安全角度广藿香醇的每日施用剂量不受严格的限制，应用时可根据实际情况进行调整，保证了广藿香醇的广泛应用，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠体重和DAI评分的影响(n＝10)的结果图，其中，A图为体重变化趋势的曲线图；B图为DAI评分的条形图，图中，##为与Control组比较P<0.01，**为与DSS组比较P<0.01

图2广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠变化的影响(n＝10)的结果图，其中，A图为小鼠结肠宏观变化的病理显微照片；B图为小鼠结肠组织长度差异的条形图，图中，##为与Control组比较P<0.01，**为与DSS组比较P<0.01。

图3广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠HE染色结肠组织和组织学病理损伤评分(n＝10)的结果图，其中A图为HE染色结肠组织的显微照片，B图为组织学病理损伤评分的条形图，图中，##为与Control组比较P<0.01，**为与DSS组比较P<0.01。

图4广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中髓过氧化酶(MPO)活力的影响(n＝10)的条形图，图中，##为与Control组比较P<0.01，**为与DSS组比较P<0.01。

图5广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中因子变化(n＝10)的条形图，其中，A图为TNF-α(A)，B图为IFN-γ(B)，C图为IL-1β(C)，D图为IL-6(D)，E图为IL-12(E),IL-17(F)，F图为IL-4(G)，G图为IL-10(H)；A图～G图中，##为与Control组比较P<0.01，**为与DSS组比较P<0.01。

图6广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中粘蛋白表达的影响(n＝10)结果图，其中，A图为mucin-1(A)，B图为mucin-2(B)；A图和B图中，##为与Control组比较P<0.01，*为与DSS组比较P<0.05，**为与DSS组比较P<0.01。

图7广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠结构相关紧密连接蛋白表达的影响(n＝10)结果图，其中，左边为小鼠结肠结构相关紧密蛋白表达的western blot图，右边为各紧密蛋白表达情况的条形图；右边的条形图中，a为claudin，b为occludin，c为ZO-1，d为ZO-2，a～d图中，##为与Control组比较P<0.01，*为与DSS组比较P<0.05，**为与DSS组比较P<0.01。

图8广藿香醇对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织凋亡相关蛋白表达的影响(n＝10)结果图，其中，左边为小鼠结肠组织凋亡相关蛋白表达的western blot图，右边为各凋亡相关蛋白表达情况的条形图；右边的条形图中，##为与Control组比较P<0.01，*为与DSS组比较P<0.05，**为与DSS组比较P<0.01。

具体实施方式

一、效果实验例

1.实验材料

1.1实验动物及药品

SPF级Balb/C小鼠，雄性，22-24g，购于广州中医药大学实验动物中心(合格证编号：44005800002727)。实验动物分笼饲养，适应性饲养7天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

1.2供试药品

来源：广藿香醇购买自广州菲博生物科技有限公司经色谱检验鉴定，其纯度大于98％；

配制：正常组(Control)和模型组(葡聚糖硫酸钠，DSS)，称取2.4g吐温-80，溶于120mL蒸馏水中；PA低、中、高剂量组(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)，分别对应称0.06g，0.12g，0.24g PA，先与其5倍量的Tween-80完全融合，再溶于60mL蒸馏水中，混匀；阳性对照药柳氮磺吡啶(SASP)组(200mg/kg)，称取1.2g SASP溶于60mL含1.2g吐温-80的蒸馏水即可；上述药物配制后，4℃冰箱保存备用。

2实验方法

2.1动物分组及模型建立

实验开始前取各小鼠，称重，按体重随机分组：正常组(Control)，模型组(DSS)，广藿香醇低、中、高剂量组(PAL、PAM、PAH，对应剂量为10，20，40mg/kg)，柳氮磺胺吡啶组(SASP，200mg/kg)，每组20只小鼠。分组后，标号，再称量各小鼠体重，记录并计算相应给药体积(0.1mL/10g)。蒸馏水配制3％DSS水溶液，供与除正常组(给予蒸馏水)之外的各组小鼠自由饮用7天以诱导急性溃疡性结肠炎模型。模型建立的同时，各组小鼠给予相应的药物进行治疗，其中Control组，DSS组给予治疗药物的相应溶剂(2％Tween-80水溶液)，每日一次，持续给药7天。

2.2疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分

实验过程中，每天记录小鼠体重、活动状况、粪便性状、便血情况。DAI评分按以下标准进行，体重变化评分：体重未变化，记为0分；体重下降1-5％，记为1分；5-10％，记为2分；10-20％，记为3分；体重变化大于20％，记为4分。大便性状评分：正常，0分；粪便较软，1分；粪便湿软2分；半稀便，3分；稀便，4分。便潜血评分：无血便，0分；便血检测阳性，2分；明显血便，4分。评分后计算3部分评分并求得平均值。DAI评分的范围为0分(健康状态)-4分(严重结肠炎)。此外，实验第8天，剖取结肠后，立即观察结肠有无水肿、粘连、溃疡、坏死等。

2.3结肠取材及结肠组织病理学观察、组织损伤评分

实验结束后用颈脱臼法全部处死，并马上剖取结肠组织，测量结肠长度并拍照比较。每组随机取6只小鼠结肠等分为2份，一份放入4％多聚甲醛中固定，用于H&E染色，一份放入EP管中，用于后续Western Block测定；另每组随机6只小鼠结肠，一部分放入EP管中保存于液氮，取材结束后置于-80℃冰箱中保存，用于后续MPO活性测定，一部分加入Trizol，用于PCR测定相应基因表达；剩余小鼠结肠(7-8只)收取用于Elisa测定。收好材后，放入-80℃冰箱保存，以使用于后继实验。

参照文献进行结肠炎症和损伤程度组织学病理评分(Histological score)：

a.炎症程度—0分：无炎症；1分：浅显炎症；2分：轻微溃疡；3分：明显溃疡；

b.隐窝损伤程度—0分：形态正常；1分：少量隐窝变形；2分：中等水平隐窝变形；3分：高水平隐窝变形；4分：明显的隐窝缺失；

c.炎症浸润面积—0分：无炎症细胞浸润；1分：10％视野呈低水平炎症细胞浸润；2分：10-25％视野呈中等水平炎症细胞浸润；3分：25-50％视野呈高水平炎症细胞浸润；4分：明显炎症细胞浸润；

d.肠壁炎症深度—0分：无炎症；1分：炎症限于黏膜层；2分：炎症逐步深入黏膜下层：3分：炎症深入固有层。总分为0分(正常)—14分(严重肠炎)不等。

2.4结肠组织中MPO及炎症因子的测定

2.4.1匀浆液制备

于冰上称取结肠组织，置于4mL EP管中，冰上剪碎，立即加入9倍量的组织匀浆液，于4℃，3500rpm离心15min，取上清，分装，用于后续匀浆蛋白测定(Thermo公司BCA蛋白分析试剂盒说明书)及ELISA测定结肠匀浆中TNF-α，IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12、IL-6、IL-17、IL-1β的变化。

2.4.2 MPO测定

参照试剂盒说明书，制备组织匀浆液，准确称定组织重量，以试剂盒配备的试剂二为匀浆介质，按重量体积比为1：19加入匀浆介质制备成5％的组织匀浆，无需离心。严格按照试剂盒说明书操作，最后用紫外分光光度计在460nm处，1cm光径，双蒸水调零，测定各管的吸光度值。按以下公式计算MPO活力(U/g组织湿重)＝(测定管OD值-对照管OD值)/11.3*取样量(g)

2.4.3 Elisa测定炎症因子

Step1，按说明书所示，用包被液配制捕捉抗体(Capture antibody)随后于96孔板内加入100μL/well的抗体，4℃孵育过夜；

Step2，弃除孔内液体，并用洗液(大于250μL/wel)清洗3次，每次清洗保持洗液在板孔中浸润1min，且最后一次洗涤时，将板倒扣于滤纸，吸去孔内多余的液体；

Step3，用去离子水稀释5x测定原液至1x，于板内加入200μL 1x测定原液，封闭96孔板，室温孵育1hour；

Step4，参照step2，洗板至少1次；

Step5，稀释标准品与加样，首先，按照说明书要求配置最高浓度的标准品，随后，依次2倍稀释标准品(配足8个点)，再按要求在相应的孔内加入100μL/well的标准品或者样品，室温孵育2hour；

Step6，参照step2，洗板3-5次；

Step7，按说明书要求以测定试剂(Assay diluent)配制检测抗体(Detectionantibody)，并且孔内加入100μL/well Detection antibody，室温孵育1hour；

Step8，参照step2，洗板3-5次；

Step9，每孔加入100μL的HRP标记的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，室温，避光孵育30min；

Step10，参照step2，洗板5-7次；

Step11，每孔加入100μL的底物溶液(TMB Solution)，盖住板，室温，避光孵育15min；

Step12，每孔加入50μL的终止液(1M H3PO4)，于酶标仪测定450nm和570nm处的吸光度值。

最后，以标准品OD450nm-OD570nm所得值OD值为横坐标，对应的标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线并建立对应方程，再计算各样品的因子水平。

2.5 Q-PCR检测相关基因mRNA表达

2.5.1 RNA提取

匀质：液氮研磨结肠组织样本，加入500μL含4％β-巯基乙醇的CTAB提取液，65℃水浴30min；加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，混匀后10000g离心10min；加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，10000g离心10min，弃上清。

相分离：加入1000μL Trizol重悬沉淀，然后加入200μL氯仿，用手剧烈振荡15秒，室温静置5min；4℃下，10000g离心3min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，吸取500μL转移水相至另一个新的RNA-free EP管；

沉淀RNA：加入等体积500μL体积异丙醇，涡旋充分混匀。4℃下，12000g离心10min，离心后，管底出现RNA沉淀，去上清；

RNA洗涤：加入1mL 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，去上清；室温晾干或真空干燥，加入60μL DEPC水溶解沉淀。

2.5.2去基因组

使用RNA-free的DNA I，按以下体系配置反应液[60μL RNA，20μL DNA I，20μL 10xbuffer，100μL H2O(RNA free)]，37℃消化30min，65℃灭活10min。随后，加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10000rpm，离心5min，取上清；加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10000rpm，离心10min，取上清；加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；4℃下，10000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，置于超净台中风干；加入10μL DEPC水溶解沉淀。

2.5.3纯度检测

取2μLRNA样品60倍稀释，在微量分光光度计k2800(北京凯奥)上测定OD值，OD260nm/OD280nm的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

2.5.4逆转录

在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，总量12μL。具体如下表：

表2加样指南

70℃保温10min,然后迅速在冰上冷却2min,离心；

再者，在该PCR管中加入下列试剂，

表3加样方案

将上述20μL反应溶液42℃保温60min；72℃保温15min反转录；-20℃保存备用。

2.5.5检测

首先，针对以下目的基因，设计相应的引物。

表4引物序列

再按以下反应体系：cDNA稀释3倍

表5反应体系

使用ViiA7software，95℃30Seconds；95℃30Seconds，60℃34Seconds(收集荧光信号)；35个循环，并测定达到荧光阈值使的最小循环次数(Ct)。完成后进行融解曲线分析：温度60℃-95℃，每分钟读1次。以GAPDH为内参基因，计算相对表达量2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct GAPDH)处理组-(Ct目的基因-Ct GAPDH)正常组。

2.5免疫印迹分析

样本处理：取结肠组织30mg加入1mL RIPA[强裂解液，主要成分为50mMTris(pH7.4)，150mMNaCl，1％TritonX-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS，以及10mMNaF，5mMEDTA，1mM Na3VO4，用前按1:100的比例加入蛋白酶体抑制剂(1片溶于1ml)]。将组织剪成细小碎片，电动匀浆器匀浆处理。冰上孵育30分钟，使组织充分裂解。14000rpm离心10分钟，吸取上清分装保存，并测定蛋白浓度，测定蛋白浓度使用BCA法。将100μL BCA Reagent与2μLCu²⁺Reagent混合均匀后加入5μL所提取的蛋白质，室温放置过夜，使用分光亮度计测量A540定量。利用标准曲线计算出各样品浓度。根据所测蛋白浓度，将样品用裂解液稀释到相同浓度，并后室温放置准备点样。电泳时总上样量为10μg总蛋白。

上样检测：取煮沸后的样品。用微量加样器把变性后的蛋白样品滴加到凝胶孔内，开启电泳电源，浓缩胶电压是100v，电泳时间为30分钟，待样品溴酚蓝跑成一条直线的时候，换电泳的电压至120V，电泳时间为1小时。电泳溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。参照分子量Marker将胶取下，浸入转膜液备用。PVDF膜预先浸泡甲醇数秒。随后，采用的半干转法进行转膜操作。将跑完电泳的胶按海绵－滤纸－胶－PVDF膜－滤纸－海绵的顺序转入转膜夹内，膜靠正极侧，胶靠负极侧。取出配好的转膜缓冲液，按照150mA，90min条件在低温下转膜。转膜结束后，将膜取出，放入1xTBST配的浓度为5％的脱脂奶粉里面，常温摇床孵育封闭1小时。封闭结束后，用TBST洗膜，5分钟每次，洗膜3次。分别加入一抗(Claudin-1,ZO-1,ZO-2,occludin,Bcl-2,Bax)，4℃孵育过夜，一抗稀释比例1:1000且用TBST含5％的BSA做为稀释液。摇床振荡孵育。内参抗体GAPDH(Cell Signaling Technology)1:1000稀释。1h反应。一抗孵育结束后，TBST洗膜3次，每次间隔10分钟，加入HRP标记的二抗，博士德公司1:5000稀释，常温孵育1h，振荡孵育，孵育结束后用TBST洗膜3次，每次间隔10分钟，再用TBS洗2次，每次间隔5min。用ECL发光液(MILLIPORE)1mL。孵育膜2分钟，将膜拿至暗房进行孵育反应。加入胶片柯达感光胶片，压片2分钟，显影3分钟，定影10分钟。条带分析，使用Image J软件分析目的条带灰度值，比较各组蛋白表达差异。

2.6统计学分析

各数据以均数±标准差(x±SD)表示，应用Graphpad Prism 5软件制图，SPSS17.0软件进行统计学分析，各组间差异比较，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时，组间两两多重比较采用LSD法；方差不齐时，组间两两多重比较采Dunnett’sT3法，以P<0.05为标准，表示有显著性差异。此外与Control组比较，#P<0.05，##P<0.01；与DSS组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3实验结果

3.1广藿香醇对溃疡性结肠炎模型小鼠一般症状的影响

研究证实DSS诱导的小鼠肠炎模型与人类溃疡性结肠炎的临床特征相似，如体重减轻、腹泻、便血等。本文研究发现，正常小鼠体重保持上升趋势；而造模后，小鼠前4天体重增长稳定，第5天后，DSS组小鼠体重明显下降且呈持续下降状态；给药各组体重呈增长趋势，其中PA(10mg/kg)组小鼠体重增长明显，PA(20，40mg/kg)组及SASP组体重增长趋势相似。各组体重变化如图1-A所示。

同时，在造模期间发现，DSS组小鼠便血情况严重，而给药后明显缓解血便的症状。上述观察到的现象，结合小鼠体重变化及排便症状进行疾病活动指数评分，得出结果如图4所示，DSS组小鼠较Control组DAI评分明显要高(P<0.01)，而给药后，PA(40mg/kg)组和SASP组DAI评分明显降低(均有显著性差异，P<0.01)。DAI评分如图1-B所示。

此外，如图2所示，造模后，小鼠结肠显著缩短(与Control组相比，P<0.01)；而给药治疗后情况有所恢复，且给药各组小鼠结肠长度均较DSS组显著增长。综上，可知PA，尤其是40mg/kg，可改善DSS诱导的IBD模型小鼠的宏观表现，具有抗溃疡性结肠炎的作用。

3.2广藿香醇对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织结构的保护作用

由结肠组织病理切片H&E染色结果(图3)可见，Control组小鼠结肠组织结构完整，黏膜层、黏膜下层、肌肉层、外膜4层结构层次清晰，黏膜上层杯状细胞排列整齐，形态完整；黏膜下层无水肿，未见炎性细胞浸润；肠外膜无损伤，间皮细胞排列整齐。

DSS组肠壁结构完整性被破坏，黏膜上层细胞坏死脱落，杯状细胞排列紊乱且明显减少；固有层中肠腺扭曲甚至消失；黏膜及下层发现明显的炎性细胞浸润，肌层细胞排列错乱。其组织病理学评分(Histological score，HS)，显著高于Control组(P<0.01)。

药物治疗后，PA各剂量组较DSS组情况有所好转，黏膜上皮脱落减少；固有层腺窝排列均相对整齐，此外黏膜层及下层炎症细胞减少；肌层及浆膜较完整，且PA修复肠组织的能力呈剂量依赖性。此外，经SASP治疗后，结肠组织结构完整，各层结构清晰可见，炎症细胞少量浸润于黏膜上层，肌层和外膜细胞排列有序，无损伤。再者，给药各组病理学评分较DSS组明显降低，且有统计学差异(P<0.01)。结合病理结构变化和病理学评分差异结果可知PA和SASP能有效改善DSS所致的结肠组织损伤，以进一步缓解溃疡性结肠炎发病。

3.3广藿香醇对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织中MPO及各细胞因子的影响

本发明研究结果如图4所示，DSS-treated小鼠结肠MPO活性显著增加，而PA和SASP治疗7天后，MPO活性显著降低(P<0.01vs.DSS组)。与组织学结果一样，表明PA和SASP均可通过抗炎作用而体现抗溃疡性结肠炎活性。

如图5A-D所示，DSS组小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6)均显著升高(P<0.01vs.Control)。PA各剂量治疗后，上述4种细胞因子浓度显著下降(P<0.01vs.DSS)，且PA高剂量组(40mg/kg)效果最强。与此同时，造模小鼠给予SASP治疗后，较DSS小鼠而言，TNF-α和IL-1β浓度显著下降(P<0.01)；而IFN-γ、IL-6等因子只有下降趋势，无显著性差异。此外，如图5E-F所示，DSS诱导的模型小鼠促炎因子(IL-12和IL-17)浓度较Control组上升，并且PA的3个剂量治疗组均降低了模型小鼠结肠组织中IL-12和IL-17浓度，但是上述结果均无统计学差异，再者，SASP对上述两种因子浓度几乎无影响。如图5G-H所示，DSS组IL-4和IL-10的表达水平明显高于Control组。而PA和SASP治疗后，IL-4和IL-10水平较DSS组显著下降(P<0.01)。上述结果表明DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠结肠出现明显的炎症症状，而PA能有效减轻炎症症状，且效果较SASP更好，表明其具有抗溃疡性结肠炎的作用。

3.4广藿香醇对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织肠屏障功能的保护作用

研究表明，肠上皮细胞分泌的粘蛋白(Mucin，主要包括mucin-1和mucin-2)组成了肠上皮黏液层，对肠道具有润滑以及保护其免受微生物侵害的作用。粘蛋白的表达异常意味着肠组织受损，进而影响肠道的屏障功能。如图6所示，溃疡性结肠炎模型小鼠肠组织中粘蛋白mucin-1和mucin-2表达水平较Control组小鼠显著下降；而给药治疗后，PA三个剂量和SASP均能显著增加mucin-1的表达，PA低、高剂量(10，40mg/kg)相对中剂量(20mg/kg)和SASP可显著提高mucin-2的表达水平。表明造模后，小鼠肠组织黏液层明显受损，而经药物治疗后减轻了损伤程度，可见药物通过修复小鼠肠组织体现抗溃疡性结肠炎作用。

如图7所示，本发明免疫印迹法检测发现研究发现，DSS组小鼠肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2，Occludin和Claudin-1蛋白表达水平下降(P<0.01vs.Control)，揭示紧密连接结构破坏；而广藿香醇则能上调上述4种蛋白，提示具有保护肠黏膜作用，且调节作用优于SASP。由图7A-B所示，只有PAH(40mg/kg)能够显著提升occludin和claudin-1蛋白的表达水平(P<0.05vs.DSS)；由图7C-D可知，广藿香醇可呈剂量依赖性地显著提升紧密连接蛋白ZO-1和ZO-2的表达(P<0.01vs.DSS)；总结上述结果可知，广藿香醇(尤其是高剂量组)可通过上调肠黏膜结构相关的紧密连接蛋白保护肠黏膜免受伤害，进而体现抗溃疡性结肠炎作用。

同时，研究发现DSS组导致结肠组织中凋亡蛋白Bax表达增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，表明小鼠肠黏膜细胞凋亡，一定程度上影响肠屏障功能。而阳性药SASP和广藿香醇PA预处理缓解了DSS引起的肠上皮屏障功能损害，表现为肠组织细胞抗凋亡蛋白表达增多，肠凋亡蛋白的表达减少。其中由图8可知，PA治疗后，呈剂量依赖性，显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；高剂量(40mg/kg)显著升高凋亡蛋白Bax的表达。表明PA一定程度上可以减少肠粘膜细胞的凋亡，进而修复肠屏障。

最后，总的来说，广藿香醇可能通过抑制结肠黏膜细胞凋亡，保护肠黏膜完整性从而减轻结肠炎症，体现出抗溃疡性结肠炎活性。

本发明的优点是：(1)本发明发现中药单体广藿香醇有显著的抗溃疡性结肠炎的活性，其特征是广藿香醇灌胃给药后明显改善模型小鼠体重变化，增加结肠长度，降低疾病活动指数(DAI)，明显改变结肠炎症水平，减少反映结肠炎症程度的MPO活力，同时通过促进紧密蛋白和黏蛋白的表达保护肠上皮黏膜屏障，并且调节相关凋亡蛋白的表达，开拓了广藿香醇在治疗炎症性肠病上新的应用领域。(2)本发明的中药单体广藿香醇来源于我国常见的传统中药材广藿香，临床上常用于胃肠道疾病的治疗，安全无毒，本发明中广藿香醇可较好改善结肠炎症状，可用于制备治溃疡性结肠炎的药物。(3)本发明基于溃疡性结肠炎维持肠黏膜屏障结构和功能的完整性，以及减轻肠道炎症这两个角度展开，阐明广藿香的药效物质基础，为溃疡性结肠炎的治疗提供新的选择。(4)本发明的中药单体广藿香醇，可制成口服液，胶囊，片剂，颗粒剂，栓剂等。

二、药物的制备例

例1(片剂)

取广藿香醇400g，加入乳糖480g、淀粉754g混合均匀，用7％的淀粉浆350g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混匀，压制成每片含广藿香醇40mg的片剂10000片，每片净重0.2g。口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

例2(胶囊剂)

取广藿香醇400g，加入乳糖980g、淀粉1254g混合均匀，用7％的淀粉浆350g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混匀，填充至1号胶囊制成10000粒，每粒胶囊内含广藿香醇40mg，每粒净重0.3g。口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

例3(滴丸)

取广藿香醇300g，加入适量PEG4000作为基质，适量液体石蜡为冷却剂；滴制法制成含有每丸含广藿香醇6mg的滴丸，每丸净重30mg。口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

例4(颗粒剂)

取100g广藿香醇，加入适量蔗糖粉，混合均匀，逐渐加入乙醇和水，制成颗粒，进行分装。规格为每包含广藿香醇40mg的颗粒剂，每包净重7g。开水冲服，口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、腹胀。

例5(口服液)

称取100g广藿香醇，加入增溶剂普罗莎姆，和一定比例的乙醇，充分搅匀；然后加入适宜附加剂(如矫味剂、抑菌剂、抗氧化剂、着色剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含广藿香醇40mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

例6(栓剂)

取广藿香醇100g，加入可可豆脂等辅料，配制成含广藿香醇30mg的栓剂。直肠给药，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

Claims (3)

1.广藿香醇作为唯一活性成分在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由广藿香醇和医学上可接受的辅料组成。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物是口服液、片剂、胶囊剂，滴丸、颗粒剂或栓剂。