CN106509339A - 多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
杜仲叶直接饲喂动物口感较差，长时间饲喂有可能造成畜禽等养殖动物采食量下降，杜仲叶各种有效成分由于细胞壁的包裹，在动物体内吸收较差。通过微生物发酵的方式可明显改善杜仲叶的口感，有效释放各种生物活性成分，提高其营养价值。本发明涉及一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，通过菌种制备、固态发酵、低温干燥三大步骤制备得到发酵杜仲叶最终产品，既改善了杜仲叶的口感，发酵的同时又产生了益生菌及其代谢产物。发酵后产品各组成成分为：总菌数≥5.0×108CFU/g，总黄酮≥1.5%，绿原酸≥0.4%，乳酸≥2%。
Description
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体为一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法。
背景技术
杜仲（Eucommiaulmoides） 是中国特有的名贵中药，属落叶乔木，广泛分布于陕西、甘肃、浙江、河南、湖北、四川、贵州、云南等地。树皮粗糙，单叶互生，卵圆形、叶渐尖，齿状边缘，长6~16cm，宽3.5~6.5cm，叶内所含杜仲胶可作为重要的鉴别特征。花单性，花期4~5月，雌雄异株，无花被，生于幼枝基部的苞叶内，与叶同放或先叶开放。
目前研究表明，杜仲含有112种成分，包括28种木质素类，24种环烯萜类，27种酚类，6种固醇，5种萜类，13种黄酮类和其它8种物质，同时被列入卫生部保健食品名录及农业部饲料原料目录。杜仲营养丰富，富含多种蛋白质、维生素和微量元素，同时具有增强免疫力、降压、抗炎、抗病毒、抗应激、健筋骨、利胆、抗疲劳和抗氧化等多种功能。
杜仲叶细胞壁中的纤维素、半纤维素及木质素相互交联，阻止了杜仲叶有效成分的释放。通过微生物发酵的方式对杜仲叶进行预处理，通过微生物在发酵过程中释放的多种酶的作用，可以使杜仲叶的细胞壁破裂，各种生物活性物质得到有效释放，同时微生物生长过程中产生多种有益代谢产物，明显提高杜仲叶中活性成分的含量，降低杜仲叶中毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，利用本发明生产的产品，绿色安全，适用于各种阶段的养殖动物，发酵后能明显改善杜仲叶苦涩异味等口感问题，同时有效释放杜仲叶中有效成分。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）、原料采集：采摘杜仲鲜叶；
（2）、杀青：采用沸腾干燥，温度控制70~80℃，烘干时间20~30min，控制叶片含水量在12%以下，冷却至室温；
（3）、原料的粉碎：将杜仲叶、豆粕、玉米、麸皮进行粉碎；
（4）、发酵菌种的制备：取枯草芽孢杆菌、黑曲霉和粪肠球菌冻干粉，经活化、逐级扩培制备菌种；
步骤（4）中，黑曲霉菌种制备方法如下：
菌种的活化：取黑曲霉冻干粉，接入黑曲霉液体试管中，25~30℃、160~220r/min振荡培养48h；
茄子瓶菌种制备：取试管菌种1mL加入到500mL茄子瓶斜面培养基中，涂布均匀，25~30℃静置培养48~72h；
固体扩培：取杜仲叶30~50%，麸皮30~50%，豆粕粉20~30%，加入0.3~0.5%的氯化钠和纯水混匀，料水比控制在1:0.35~0.5，挤压无水滴为宜，然后灭菌，冷却至35℃以下时，将茄子瓶孢子用无菌水冲洗，接入上述物料中，放入浅盘中，覆盖一层保鲜膜，发酵温度25~30℃，培养时间48~72h，每隔24h翻料通气，发酵好后，置于通风干燥处风干，密封保存，即得黑曲霉生产种子。
黑曲霉活化及斜面培养基组成成分包括：马铃薯200g/L，杜仲叶粉20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
步骤（4）中，枯草芽孢杆菌制备方法如下：
菌种活化：取枯草芽孢杆菌冻干粉，接入牛肉膏蛋白胨液体试管中，37℃、160~220r/min培养16~24h；
一级摇瓶种子：将活化好的菌液接入一级摇瓶，接种量1~3%，37℃、160~220r/min培养16~24h；
二级摇瓶种子：将一级摇瓶接入二级摇瓶中，接种量3~6%，37℃、160~220r/min培养16~18h；
一级种子罐：培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐，发酵罐装液系数60%，接种量1%，转速150~200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间14~18h；
发酵罐培养：一级种子罐菌液按照5~10%比例接入发酵罐中，转速150~200r/min，0-6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间12~16h。
摇瓶种子培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0~7.2；
种子罐与发酵罐培养基组成成分包括：玉米粉15~20g/L，淀粉2~4g/L，豆粕20~30g/L，酵母膏2~4g/L，硫酸锰0.3~0.6g/L，碳酸钙0.05~0.2g/L，pH 7.0~7.2。
步骤（4）中，粪肠球菌发酵液制备方法如下：
菌种活化：取粪肠球菌冻干粉，液体活化试管，35~39℃静置培养22~24h；
三角瓶种子：将活化后种子接入三角瓶中，35~39℃培养22~24h，转速120r/min；
摇瓶种子制备：将三角瓶成熟菌种接入摇瓶中，接种量2~5%，35~39℃，转速120r/min，培养16~20小时；
一级种子罐：摇瓶种子接入一级种子罐，接种量1~2%，温度35~39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80~100r/min。
发酵罐培养：一级种子罐菌液接入发酵罐中，接种量5~10%，温度35~39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80~100r/min。
粪肠球菌活化及三角瓶培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8~7.2；
粪肠球菌摇瓶种子、一级种子罐及发酵罐培养基组成成分包括：蛋白胨20~40g/L，牛肉膏2~5g/L，氯化钠2~5g/L，葡萄糖20~40g/L，碳酸钙5~20g/L，pH 6.8~7.2。
（5）、固态发酵：
a、混合：将杜仲叶80~85%、豆粕粉5~10%、玉米粉5~10%按比例混合，高压蒸汽灭菌，温度121~123℃，时间20~30min。待物料冷却至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均匀，然后将枯草芽孢杆菌菌液加入到纯水中混匀，再与上述物料混匀，纯水添加量为物料干重的40~50%，然后将最终混合料送入发酵室；按发酵物料质量比例接种，黑曲霉接种量3~8%，枯草芽孢杆菌菌液3~8%；
b、好氧阶段：将混合好的物料转运到发酵室，发酵室温度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制发酵室相对湿度70~80%，发酵5~7d；
c、厌氧阶段：好氧发酵结束后，将发酵饲料打散，将粪肠球菌接入物料中，然后装入单向阀发酵袋中，发酵室温度控制在25~30℃，进行厌氧发酵，发酵时间24~36h；按发酵物料质量比例接种，粪肠球菌菌液5~10%；
（6）、低温烘干：将发酵好的物料转入沸腾干燥车间，控制沸腾干燥温度40~45℃，待物料水分达5~10%时，即可取样送检，检验合格后，按照规定要求分装和包装。
杜仲叶直接饲喂动物口感较差，长时间饲喂有可能造成畜禽等养殖动物采食量下降，杜仲叶各种有效成分由于细胞壁的包裹，在动物体内吸收较差。通过微生物发酵的方式可明显改善杜仲叶的口感，有效释放各种生物活性成分，提高其营养价值。本发明利用黑曲霉、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌对杜仲叶固态发酵，前期利用黑曲霉和枯草芽孢杆菌对杜仲叶进行好氧发酵，通过这两种菌产生的纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等对杜仲叶进行深度酶解，产生大量的多糖、氨基酸及小肽；后期，利用接入粪肠球菌，粪肠球菌利用杜仲叶的营养成分进行增殖，同时产生乳酸菌素、甘露聚糖肽、乳酸等多种代谢产物，极大提高了杜仲叶的营养价值。
利用本发明的方法生产发酵杜仲叶，通过两段式固态发酵（好氧与厌氧相结合），前期黑曲霉与枯草芽孢杆菌发酵过程中，产生的淀粉酶、糖化酶及蛋白酶，可以将原料中的玉米粉、豆粕粉分解为葡萄糖、小分子蛋白和氨基酸，为后期粪肠球菌的生长提供碳氮源；黑曲霉发酵过程中产生的纤维素酶，可有效提高杜仲叶中粗纤维的降解率，促进植物细胞壁的温和水解。最终所得产品总菌数≥5.0×108CFU/g，总黄酮≥1.5%，绿原酸≥0.4%，乳酸≥2%。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
实施例1
一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）、原料采集：采用1芽1叶、1芽2叶或1芽3叶同等嫩度的杜仲鲜叶。
（2）、杀青：采用沸腾干燥，温度控制70℃，烘干时间20min，控制叶片含水量在12%以下，冷却至室温，开始粉碎。
（3）、原料的粉碎：将杜仲叶、豆粕、玉米、麸皮进行粉碎，过30目筛。
（4）、发酵菌种的制备：
1）、黑曲霉菌种的制备：
a.菌种的活化：取黑曲霉冻干粉，接入黑曲霉液体试管中，25℃、160r/min，振荡培养48h。
b.茄子瓶菌种制备：取试管菌种1mL加入到500mL茄子瓶斜面培养基中，涂布均匀，25℃静置培养48h。
c.固体扩培：取杜仲叶35%，麸皮35%，豆粕粉30%，加入0.3~0.5%的氯化钠和纯水混匀，料水比控制在1:0.35，用手挤压无水滴为宜，然后灭菌，冷却至35℃以下时，将茄子瓶孢子用无菌水冲洗，接入上述物料中，放入浅盘中，覆盖一层保鲜膜，发酵温度25~30℃，培养时间48~72h，每隔24h翻料通气，发酵好后，至于通风干燥处风干，密封保存，即得黑曲霉生产种子。
所述黑曲霉活化及斜面培养基组成成分包括：马铃薯（去皮）200g/L，杜仲叶粉20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
2）、枯草芽孢杆菌菌种的制备：
a.菌种活化：取枯草芽孢杆菌冻干粉，接入牛肉膏蛋白胨液体试管中，试管装液量10mL，37℃、160r/min培养16h。
b.一级三角瓶种子：将活化好的菌液接入一级三角瓶（500mL），摇瓶装液量200mL，接种量1%，37℃、160r/min培养16h。
c.二级摇瓶种子：将一级摇瓶接入二级摇瓶中（5L），二级摇瓶装液量2L，接种量3%，37℃、160r/min培养16h。
d.一级种子罐：培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐（100L），发酵罐装液系数60%，接种量1%，转速150r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间14~18h。
e.发酵罐培养：一级种子罐菌液按照5%比例接入发酵罐（1000L）中，转速150~200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间12h。
摇瓶种子培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0~7.2。
种子罐与发酵罐培养基组成成分包括：玉米粉15g/L，淀粉2g/L，豆粕20g/L，酵母膏2g/L，硫酸锰0.3g/L，碳酸钙0.05g/L，pH 7.0。
3）、粪肠球菌菌液制备：
a.菌种活化：取粪肠球菌冻干粉，液体活化试管（装液量9mL），35℃静置培养22h。
b.三角瓶种子：将活化后种子接入三角瓶中（250mL三角瓶装液量150mL），35℃培养22h，转速120r/min。
c.摇瓶种子制备：将三角瓶成熟菌种接入摇瓶中（5L摇瓶装液量3L)，接种量2%，35℃培养16h，转速120r/min。
d.一级种子罐：摇瓶种子接入一级种子罐，接种量1%，温度35℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80r/min。
e.发酵罐菌液：一级种子罐菌液接入发酵罐中，接种量5%，温度35℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80r/min。
所述粪肠球菌活化及三角瓶培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8。
所述粪肠球菌摇瓶种子、一级种子罐及发酵罐培养基组成成分包括：蛋白胨20g/L，牛肉膏2g/L，氯化钠2g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙5g/L，pH 6.8。
（5）、固态发酵：
a.物料混合：将按照杜仲叶85%，玉米粉10%，豆粕粉5%比例将物料进行混合，高压蒸汽灭菌(温度121~123℃，时间20~30 min）。待物料冷却至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均匀，然后将枯草芽孢杆菌菌液加入到纯水中混匀，再与上述物料混匀，纯水添加量为物料干重的45%，然后将最终混合料送入发酵室（10万级净化）。
b.好氧发酵阶段：将混合好的物料转运到发酵室，发酵室温度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制发酵室相对湿度70~80%，发酵5d。
c.厌氧发酵阶段：好氧发酵结束后，将发酵饲料打散，将粪肠球菌菌液接入物料中，然后装入单向阀发酵袋中，发酵室温度控制在25~30℃，进行厌氧发酵，发酵时间24h。
(6)低温烘干：将发酵好的物料转入沸腾干燥车间，控制沸腾干燥温度40~45℃，待物料水分达5~10%时，即可取样送检，检验合格后，按照规定要求分装和包装。
实施例2
一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）、原料采集：采用1芽1叶、1芽2叶或1芽3叶同等嫩度的杜仲鲜叶。
（2）、杀青：采用沸腾干燥，温度控制80℃，烘干时间30min，控制叶片含水量在12%以下，冷却至室温，开始粉碎。
（3）、原料的粉碎：将杜仲叶、豆粕、玉米、麸皮进行粉碎，过30目筛。
（4）、发酵菌种的制备：
1）、黑曲霉菌种的制备：
a.菌种的活化：取黑曲霉冻干粉，接入黑曲霉液体试管中，30℃、220r/min，振荡培养48h。
b.茄子瓶菌种制备：取试管菌种1mL加入到500mL茄子瓶斜面培养基中，涂布均匀，30℃静置培养72h。
c.固体扩培：取杜仲叶粉40%，麸皮40%，豆粉粉20%，加入0.5%的氯化钠和纯水混匀，料水比控制在1:0.5，用手挤压无水滴为宜，然后灭菌，冷却至35℃以下时，将茄子瓶孢子用无菌水冲洗，接入上述物料中，放入浅盘中，覆盖一层保鲜膜，发酵温度30℃，培养时间72h，每隔24h翻料通气，发酵好后，置于通风干燥处风干，密封保存，即得黑曲霉生产种子。
所述黑曲霉活化及斜面培养基组成成分包括：马铃薯（去皮）200g/L，杜仲叶粉20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
2）、枯草芽孢杆菌菌种的制备：
a.菌种活化：取枯草芽孢杆菌冻干粉，接入牛肉膏蛋白胨液体试管中，试管装液量10ml，37℃、220r/min培养24h。
b.一级三角瓶种子：将活化好的菌液接入一级三角瓶（500mL），摇瓶装液量200ml，接种量3%，37℃、220r/min培养24h。
c.二级摇瓶种子：将一级摇瓶接入二级摇瓶中（5L），二级摇瓶装液量2L，接种量6%，37℃、220r/min培养18h。
d.一级种子罐：培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐（100L），发酵罐装液系数60%，接种量1%，转速200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间18h。
e.发酵罐培养：一级种子罐菌液按照10%比例接入发酵罐（1000L）中，转速200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间16h。
摇瓶种子培养基组成成分包括：牛肉膏5g，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2。
种子罐与发酵罐培养基组成成分包括：玉米粉20g/L，淀粉4g/L，豆粕30g/L，酵母膏4g/L，硫酸锰0.6g/L，碳酸钙0.2g/L，pH 7.2。
3）、粪肠球菌菌液制备：
a.菌种活化：取粪肠球菌冻干粉，液体活化试管（装液量9mL），39℃静置培养24h。
b.三角瓶种子：将活化后种子接入三角瓶中（250mL三角瓶装液量150mL），39℃培养24h，转速120r/min。
c.摇瓶种子制备：将三角瓶成熟菌种接入摇瓶中（5L摇瓶装液量3L)，接种量5%，39℃培养20h，转速120r/min。
d.一级种子罐：摇瓶种子接入一级种子罐，接种量2%，温度39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速100r/min。
e.发酵罐菌液：一级种子罐菌液接入发酵罐中，接种量10%，温度39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速100r/min。
粪肠球菌活化及三角瓶培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 7.2。
粪肠球菌摇瓶种子、一级种子罐及发酵罐培养基组成成分包括：蛋白胨40g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖40g/L，碳酸钙20g/L，pH 7.2。
（5）、固态发酵：
a.物料混合：将按照杜仲叶粉80%，玉米粉10%，豆粕10%比例将物料进行混合，高压蒸汽灭菌（温度121~123℃，时间20~30 min）。待物料冷却至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均匀，然后将枯草芽孢杆菌菌液加入到纯水中混匀，再与上述物料混匀，纯水添加量为物料干重的40%，然后将最终混合料送入发酵室（10万级净化）。
b.好氧发酵阶段：将混合好的物料转运到发酵室，发酵室温度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制发酵室相对湿度70~80%，发酵7d。
c.厌氧发酵阶段：好氧发酵结束后，将发酵饲料打散，将粪肠球菌菌液接入物料中，然后装入单向阀发酵袋中，发酵室温度控制在25~30℃，进行厌氧发酵，发酵时间36h。
（6）、低温烘干：将发酵好的物料转入沸腾干燥车间，控制沸腾干燥温度40~45℃，待物料水分达5~10%时，即可取样送检，检验合格后，按照规定要求分装和包装。
实施例3
一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）、原料采集：采用1芽1叶、1芽2叶或1芽3叶同等嫩度的杜仲鲜叶。
（2）、杀青：采用沸腾干燥，温度控制70~80℃，烘干时间20~30min，控制叶片含水量在12%以下，冷却至室温，开始粉碎。
（3）、原料的粉碎：将杜仲叶、豆粕、玉米、麸皮进行粉碎，过30目筛。
（4）、发酵菌种的制备：
1）、黑曲霉菌种的制备：
a.菌种的活化：取黑曲霉冻干粉，接入黑曲霉液体试管中，28℃、190r/min，振荡培养48h。
b.茄子瓶菌种制备：取试管菌种1mL加入到500mL茄子瓶斜面培养基中，涂布均匀，28℃，静置培养56h。
c.固体扩培：取杜仲叶45%，麸皮30%，豆粕粉25%，加入0.35%的氯化钠和纯水混匀，料水比控制在1:0.4，用手挤压无水滴为宜，然后灭菌，冷却至35℃以下时，将茄子瓶孢子用无菌水冲洗，接入上述物料中，放入浅盘中，覆盖一层保鲜膜，发酵温度28℃，培养时间60h，每隔24h，翻料通气，发酵好后，置于通风干燥处风干，密封保存，即得黑曲霉生产种子。
黑曲霉活化及斜面培养基组成成分包括：马铃薯（去皮）200g/L，杜仲叶粉20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
2）、枯草芽孢杆菌菌种的制备：
a.菌种活化：取枯草芽孢杆菌冻干粉，接入牛肉膏蛋白胨液体试管中，试管装液量10mL，37℃、200r/min培养20h。
b.一级三角瓶种子：将活化好的菌液接入一级三角瓶（500mL），摇瓶装液量200mL，接种量2%，37℃、200r/min培养18h。
c.二级摇瓶种子：将一级摇瓶接入二级摇瓶（5L），二级摇瓶装液量2L，接种量4%，37℃、200r/min培养17h。
d.一级种子罐：培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐（100L），发酵罐装液系数60%，接种量1%，转速200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间15h。
e.发酵罐培养：一级种子罐菌液按照8%比例接入发酵罐（1000L）中，转速180r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间14h。
摇瓶种子培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2。
种子罐与发酵罐培养基组成成分包括：玉米粉18g/L，淀粉3g/L，豆粕25g/L，酵母膏2.5g/L，硫酸锰0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，pH 7.0-7.2。
3）、粪肠球菌菌液制备：
a.菌种活化：取粪肠球菌冻干粉，液体活化试管（装液量9mL），37℃静置培养23h。
b.三角瓶种子：将活化后种子接入三角瓶中（250mL三角瓶装液量150mL），37℃培养23h，转速120r/min。
c.摇瓶种子制备：将三角瓶成熟菌种接入摇瓶中（5L摇瓶装液量3L)，接种量3%，37℃培养18h，转速120r/min。
d.一级种子罐：摇瓶种子接入一级种子罐，接种量1.5%，温度37℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速85r/min。
e.发酵罐菌液：一级种子罐菌液接入发酵罐中，接种量8%，温度37℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速85r/min。
粪肠球菌活化及三角瓶培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8~7.2。
粪肠球菌摇瓶种子、一级种子罐及发酵罐培养基组成成分包括：蛋白胨25g/L，牛肉膏4g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖25g/L，碳酸钙15g/L，pH 6.8-7.2。
（5）、固态发酵：
a.物料混合：将按照杜仲叶82%，玉米粉8%，豆粕粉10%比例将物料进行混合，高压蒸汽灭菌（温度121~123℃，时间20~30 min）。待物料冷却至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均匀，然后将枯草芽孢杆菌菌液加入到纯水中混匀，再与上述物料混匀，纯水添加量为物料干重的50%，然后将最终混合料送入发酵室（10万级净化）。
b.好氧发酵阶段：将混合好的物料转运到发酵室，发酵室温度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制发酵室相对湿度70~80%，发酵7d。
c.厌氧发酵阶段：好氧发酵结束后，将发酵饲料打散，将粪肠球菌菌液接入物料中，然后装入单向阀发酵袋中，发酵室温度控制在25~30℃，进行厌氧发酵，发酵时间30h。
（6）、低温烘干：将发酵好的物料转入沸腾干燥车间，控制沸腾干燥温度40~45℃，待物料水分达5~10%时，即可取样送检，检验合格后，按照规定要求分装和包装。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖权利要求保护范围中。
Claims (10)
1.一种多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、原料采集：采摘杜仲鲜叶；
（2）、杀青：采用沸腾干燥，控制叶片含水量在12%以下，冷却至室温；
（3）、原料的粉碎：将杜仲叶、豆粕、玉米、麸皮进行粉碎；
（4）、发酵菌种的制备：取枯草芽孢杆菌、黑曲霉和粪肠球菌冻干粉，经活化、逐级扩培制备菌种；
（5）、固态发酵：
a、混合：将杜仲叶、豆粕粉、玉米粉按比例混合，高压蒸汽灭菌，待物料冷却至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均匀，然后将枯草芽孢杆菌菌液加入到纯水中混匀，再与上述物料混匀，纯水添加量为物料干重的40~50%，然后将最终混合料送入发酵室；
b、好氧阶段：将混合好的物料转运到发酵室，发酵室温度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制发酵室相对湿度70~80%，发酵5~7d；
c、厌氧阶段：好氧发酵结束后，将发酵饲料打散，将粪肠球菌接入物料中，然后装入单向阀发酵袋中，发酵室温度控制在25~30℃，进行厌氧发酵，发酵时间24~36h；
（6）、低温烘干：将发酵好的物料转入沸腾干燥车间，控制沸腾干燥温度40~45℃，待物料水分达5~10%时，即可。
2.根据权利要求1所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（2）中，沸腾干燥条件为，温度控制70~80℃，烘干时间20~30min。
3.根据权利要求1所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（5）中，步骤a，发酵物料的混合组分比例为，杜仲叶80~85%，玉米粉5~10%，豆粕5~10%；发酵物料的灭菌条件为，温度121~123℃，时间20~30min。
4.根据权利要求3所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：按发酵物料质量比例接种，黑曲霉接种量3~8%，枯草芽孢杆菌菌液3~8%，粪肠球菌菌液5~10%。
5.根据权利要求1所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（4）中，黑曲霉菌种制备方法如下：
菌种的活化：取黑曲霉冻干粉，接入黑曲霉液体试管中，25~30℃、160~220r/min，振荡培养48h；
茄子瓶菌种制备：取试管菌种1mL加入到500mL茄子瓶斜面培养基中，涂布均匀，25~30℃静置培养48~72h；
固体扩培：取杜仲叶30~50%，麸皮30~50%，豆粕粉20~30%，加入0.3~0.5%的氯化钠和纯水混匀，料水比控制在1:0.35~0.5，挤压无水滴为宜，然后灭菌，冷却至35℃以下时，将茄子瓶孢子用无菌水冲洗，接入上述物料中，放入浅盘中，覆盖一层保鲜膜，发酵温度25~30℃，培养时间48~72h，每隔24h翻料通气，发酵好后，置于通风干燥处风干，密封保存，即得黑曲霉生产种子。
6.根据权利要求5所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：黑曲霉活化及斜面培养基组成成分包括：马铃薯200g/L，杜仲叶粉20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
7.根据权利要求1所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（4）中，枯草芽孢杆菌制备方法如下：
菌种活化：取枯草芽孢杆菌冻干粉，接入牛肉膏蛋白胨液体试管中，37℃、160~220r/min培养16~24h；
一级摇瓶种子：将活化好的菌液接入一级摇瓶，接种量1~3%，37℃、160~220r/min培养16~24h；
二级摇瓶种子：将一级摇瓶接入二级摇瓶中，接种量3~6%，37℃、160~220r/min培养16~18h；
一级种子罐：培养好的二级摇瓶种子接入一级种子罐，发酵罐装液系数60%，接种量1%，转速150~200r/min，0~6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间14~18h；
发酵罐培养：一级种子罐菌液按照5~10%比例接入发酵罐中，转速150~200r/min，0-6h，通风比1:0.5，6h后通风比1:0.8，培养时间12~16h。
8.根据权利要求7所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：摇瓶种子培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0~7.2；
种子罐与发酵罐培养基组成成分包括：玉米粉15~20g/L，淀粉2~4g/L，豆粕20~30g/L，酵母膏2~4g/L，硫酸锰0.3~0.6g/L，碳酸钙0.05~0.2g/L，pH 7.0~7.2。
9.根据权利要求1所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（4）中，粪肠球菌发酵液制备方法如下：
菌种活化：取粪肠球菌冻干粉，液体活化试管，35~39℃静置培养22~24h；
三角瓶种子：将活化后种子接入三角瓶中，35~39℃培养22~24h，转速120r/min；
摇瓶种子制备：将三角瓶成熟菌种接入摇瓶中，接种量2~5%，35~39℃培养16~20h，转速120r/min；
一级种子罐：摇瓶种子接入一级种子罐，接种量1~2%，温度35~39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80~100r/min；
发酵罐培养：一级种子罐菌液接入发酵罐中，接种量5~10%，温度35~39℃，通风比与转速：0~2h，不通风不搅拌，之后通风比 1:0.2，搅拌转速80~100r/min。
10.根据权利要求9所述的多菌种固态发酵生产杜仲叶生物饲料添加剂的方法，其特征在于：粪肠球菌活化及三角瓶培养基组成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8~7.2；
粪肠球菌摇瓶种子、一级种子罐及发酵罐培养基组成成分包括：蛋白胨20~40g/L，牛肉膏2~5g/L，氯化钠2~5g/L，葡萄糖20~40g/L，碳酸钙5~20g/L，pH 6.8~7.2。
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