CN1065019A - 含多肽的药物组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是有关遗传物质操作，及具体地是介绍一 种使人们人工进行生产具有天然促血红细胞部分或 全部一级结构构象并且具有天然促血红细胞生成素 的一种或更多种的生物学性质的一种纯净的分离出 的多肽，这种多肽特征在于它是一个外源DNA疗列 的原核性或真核性表达的产物。

Description

本发明关系到遗传物质的操作，更具体地是介绍一种使人们有可能把天然形成的促血红细胞生成素多肽的部分或全部一级结构和/或这种多肽的一种或多种生物活性人工地进行生产的DNA重组操作步骤。

A遗传物质的操作

遗传物质可以广义地定义为这样一类化学物质、即它们可以编码细胞和病毒的组分，并且支配这些组分的制造过程，而且还可以指导细胞和病毒的应答。一种称作脱氧核糖核酸（DNA）的长链聚合物质，是除去某些由核糖核酸（RNA）所编码的病毒以外的包括所有的活细胞和病毒的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，每一个核苷酸单位都是嘌呤（腺嘌呤或乌嘌呤）或嘧啶（胸腺嘧啶或胞嘧啶）连到带有一个磷酸基团的脱氧核糖上边。核苷酸以线性方式聚合：一个核苷酸的5′磷酸与另一个核苷酸的3′羟基结合而相互衔接。功能性DNA是以单链核苷酸（称作寡聚脱氧核苷酸）结合成稳定的双链形式而存在的，这种结合是因为有嘌呤与嘧啶碱基之间的氢键而存在的（即在腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）之间或乌嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间存在的互补配对。按常规而言，核苷酸是以其嘌呤或嘧啶碱基成分的名称而称呼的，双链DNA中的核苷酸互补配对（即A-T和G-C）则被称为“碱基对”。核糖核酸是一个由腺嘌呤，乌嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶（U）（不含有胸腺嘧啶）与核糖及一个磷酸基相连接的多聚核苷酸。

概括地讲，DNA的编码功能是通过一个过程而起作用的，在该过程中，特殊的DNA核苷酸序列（基因）被“转录”到相应的不稳定的信使RNA（mRNA）中。然后，mRNA作为由各种氨基酸形成结构蛋白、调节蛋白及催化蛋的模板。在这个mRNA“翻译”过程中还有小的RNA链（tRNA）参加，tRNA转运氨基酸，并使一个个的氨基酸沿着mRNA链一一排列在一起形成具有正确氨基酸序列的多肽。由DNA衍生出来的mRNA“信息”以三联体“codon”密码子的形式存在，三联体是指有一定顺序的三核苷酸小组密码子指出需要什么样的tRNA以及为了“表达”一生成特定的多肽一应当搬运20种氨基酸中的哪一种氨基酸。换言之，蛋白质的形成是基因的核苷酸序列所编码的遗传信息的最终“表达”形式。

DNA“启动子”序列通常是处在DNA聚合物中的一个基因的“前边”并为mRNA的起始转录提供一个特殊的位点。DNA“调节”序列通常也是在给定的DNA聚合物的一个基因的“上边”（即前边），那些决定转录起始速度的蛋白质。结合到“调节”序列上。这个调节序列由合起来叫作“启动子/调节子”的部分，它处在一个功能性DNA聚合物中，通常也位于一个（或一系列）被选择的基因之前。这个部分的DNA序协同地决定着这一个（或这一系列的）基因的转录（及最终的表达）是否会发生。在DNA聚合物中的一个基因“后边”则还有一个对转录成mRNA的起到终止信号的DNA序列，它被称为转录“终止子”序列。

在过去十年里，微生物学进程的一个焦点是试图用生物体进行工业性制造药理上有显著作用的物质，这些生物既不是开始就在它们的DNA中具有关于所需产物的遗传密码信息，（在培养中的哺乳类细胞这种情况下，或者也不是原来就能在合适的水平上表达染色体基因）简言之，一个特定着所需多肽产物结构的基因，要么是从“供体”生物中分离出来的，要么就是化学合成的，并且后来稳定地诱导到另一个生物中，该生物是较好地能自我复制的单细胞生物，如细菌，酵母或组织培养的哺乳类细胞。当完成这一步后，存在于“转化的“或“转染的”微生物宿主细胞中的基因表达的这个新的机器部分，就进行操作制造出所需的产物：用外源DNA作为模板转录新的mRNA，接着，该mRNA再转化成氨基酸残基的连续序列。

有关“目的”遗传物质的分离、合成、提纯、放大及将其引入转化到选用的宿主细胞中的这一整套操作，被称为“重组DNA”方法。有关这一技术的专利及文献是很丰富的。例如Cohen等人的美国专利4237244，涉及到病毒DNA或环状质粒DNA杂交体对单细胞宿主生物的转化，这些杂交体DNA包含有所选择的的外源性DNA序列。Cohen等人的专利中的过程，首先介绍了用酶学方法切开病毒的或环状的质粒DNA以形成线状DNA链从而选出转化载体的操作。选择的外来（“外源的”或“异源的”）DNA链通常包括编码所需产物的序列，它们是用相似的酶经切割后制成线形的DNA片断。在有连接酶存在的条件下，切成线状的病毒或质粒DNA载体，与外来DNA片段一起进行温育，该连接酶能进行一个复原过程从而形成“杂交”hybrid载体：被选择的外源DNA片断“拼接”到病毒的或环状的DNA质粒中，于是形成了杂交载体。

用杂交载体与亲和的单细胞宿主生物进行转化的结果，是在宿主细胞群体中形成多拷贝、大量的外源性DNA片断。在某些实例中，仅希望对外来的DNA片断进行放大并且收获的“产物”是DNA。但更多的是，转化的目的是希望外源性DNA在宿主细胞中能进行表达，所谓表达，就是外源性DNA通过转录、翻译，最终编码出所需要的蛋白质。人们希望合成出某些商业上十分有价值的蛋白质，并且，希望它的合成量较大，使人们有可能通过分离技术而获得它。参见例如美国专利4264731号（Shine），4273875（Manis），4293652（Cohen），以及欧洲专利申请093619，于1983年11月9日公开。

将特异DNA序列拼接到DNA载体中这一步操作的进展，有着各种技术，至于究竟选用哪一种技术，则在很大程度上取决于“供体”对于所针对的宿主的“外源度”以及将要在宿主中表达的多肽的大小。冒昧地讲，考虑可以表述为人们可以根据情况选择采用以三种不同原理而设计的任一种方案：

（1）从供体的基因组DNA中“分离”出双链DNA;

（2）化学合成一个编码所要多肽的DNA序列的DNA片断;

（3）利用从供体细胞中分离的mRNA，通过“逆转录酶”的作用，在体外合成出双链DNA序列。最后述及的形成mRNA的“互补”DNA的方法，一般被称为“cDNA”方法。

当目的多肽产物的全部氨基酸残基序列为已知时，则常常选用制备（合成）或DNA序列的方法。例如，共有，共同待批的美国专利序号第483451，由埃尔顿（ALton）等人提交的申请（于1983年4月15日申请，相应PCTus83/00605，在1983年11月24日以wo83/04053号公开）中的DNA制造方法，提供了用于完成这样高度理想结果的优越的方法，包括：提供能表达同一种氨基酸的几个密码子中的一个密码子，这个密码子是在为表达而选择的宿主细胞中最能够被高度表达的（即提供酵母或大肠杆菌所“偏爱”的密码子）;避免存在有不能转译的“内含子”序列（常见于哺乳类基因组DNA序列及其mRNA转录体），在原核宿主细胞中并不具有该类序列;避免表达出非目的的“先导”多肽序列，这种先导多肽通常可由基因组DNA及CDNA序列编码，但它常常很不易被细菌或酵母宿主细胞从它们形成的目的多肽切去;使DNA能插入到具有启动子/调节子和终止子序列之间的可以很方便地进行表达的载体中;以及提供编码目的多肽或相似的所需多肽的基因序列。

当所要多肽的全部氨基酸残基序列还不知道的时候，直接合成DNA序列是不可能的，因此无法象上面考虑的那样去装配出在微生物中有高度表达水平的表达载体，在表达效率方面只能作一些让步。这样，用CDNA法分离编码多肽的DNA序列的方法就成了被选中的方案。在分离目的CDNA序列的标准过程中，即先由供体细胞中丰富的mRNA逆转录衍生出cDNA，再制备出负载着这些cDNA的质粒的“基因文库”Library，应当选用能对特定的基因作出高度表达的反应的细胞为供体细胞例如，可表达相当大量的生长激素产物的垂体细胞可以选来作为制备生长激素cDNA库的供体细胞。当只知道多肽的全部氨基酸序列中的重要部分时，先人工合成出与那部分已知的氨基酸序列相对应的DNA片段的单链DNA，推测这部分DNA存在于“靶子”cDNA中。再进行同位素标记。这种标记过的DNA被称为探针Probe。这种探针可以钓中所要的cDNA，即可以在已被变性成单链形式的cDNA拷贝进行克隆时，用于DNA/DNA的杂交步骤中;探针DNA可与cDNA中的某一个部分杂交，从而探查出cDNA中与相应的氨基酸序列有关的“靶”序列。〔参见由Weissman等人的美国专利第4394443提供的有关该技术的讨论及揭示，以及由Wallace等人最近所报道的使用长的寡聚核苷酸杂交探针的演示，见Nuc.Acids.Res.6，3543～3557页〔1979〕，以及Reyes等人P.N.A.S.〔U.S.A〕第79期，3270～3274页〔1982〕，和Jaye等人，Nuc.ACids  Res.，第11期，2325～2335页〔1983〕。还可参见Falkow等人的美国专利第4358535号，关于在有效诊断中的DNA/DNA杂交作用;欧洲公开专利第0070685和0070687论及在单链多聚核苷酸探针上的轻度放射性标记;Davis等人“遗传工程操作，高等细菌遗传学”，冷泉港实验室，冷泉港，纽约〔1980〕，第55～58页和174～176页，则介绍了菌落及噬菌斑杂交技术;新英格兰核（波士顿，马萨诸塞）“基因筛选”杂交转移膜材料的小册子，是一本关于DNA和RNA的杂交和转移的实验指导手册，目录号：NEF-972〕。

在筛选重组克隆的杂交操作中，近来的最为显著的进展是使用标记了的、混合的，人工合成的寡聚核苷酸探针，每一个探针都有可能去与待杂交的样品中的某一个特异性DNA部分进行完全的互补，这些样品就是有各种单链DNA或RNA的不均一的混合物。目前认为这些方法在检测一些特殊DNA，即对于目的多肽只产生极其微量的mRNA的样品衍生出的cDNA克隆时，特别地有用。简言之，使用指导旨在避免非特异性结合的严格控制的杂交条件，可以允许例如特异cDNA克隆的放射性自显影成象，这是基于靶标DNA在混合物中与其完全互补的单个探针杂交的结果。参见Wallace等人Nuc.Acids  Res.，第9期第879～897页（1981）;Suggs等人，P.N.A.S（U.S.A）第78期第6613～6617（1981）;Choo等人Nature，第229期第178-180页（1982）;Kurachi等人P.N.A.S.（U.S.A）第79期第6461-6464（1982）;Ohkubo等人，P.N.A.S（U.S.A.）第80期第2196～2200页（1983）;Kornblihtt等人，P.N.A.S.（U.S.A）第80期第3218～3222页（1983）。一般而言，上述Wallace等人（1981）的混合探针方法，已经被许多同行给以扩展了，即在可靠的结果这一点已经有了报导，结果得自cDNA克隆的分离，这种分离使用了一个均为16个碱基长（16聚体）的寡聚核苷酸探针的一个32员混合“库”。将各种的DNA序列与一个单独的11聚体放到一起，影响了存在于目的cDNA中的一个两个位点的“正”构型。参见Sinyer-Sam等人，P.N.A.S.（U.S.A.），第80期第802～806页（1983）。

使用基因组DNA分离物，在上述三种为产生重组过程中所用的特异性DNA序列的方法中，是很少见的。这一点在保证哺乳类多肽在微生物内表达的重组方法的领域中更是如此，因为哺乳类基因组DNA太复杂。而仍然有可靠的方法制备出由噬菌体负载着人或其他哺乳类基因组DNA的库。〔参见Lawn等人，Cell，第15期第1157～1174页（1978），文章介绍了产生人类基因组文库的方法，该文库通常叫作“Maniatis文库”;Karn等人，P.N.A.S.（U.S.A），第77期第5172～5176页（1980），的文章介绍了选用不同的限制性内切酶对同样的DNA分子产生不同的DNA片段的人类基因组文库的操作步骤;以及BLattner等人，Science第196期第161～169页（1977），描述了组建牛基因组文库的工作〕，在对氨基酸或DNA的序列了解甚少的情况下使用杂交过程分离基因组DNA的工作成功的很少。先有一个例子，见Fiddes等人，在《分子遗传学及应用遗传学杂志》（J.Mol.and  App.Generus）第一期第3～18页（1981），报导了从Maniatis文库中，通过使用“全长”的探针而成功地进行了分离编码人类垂体糖蛋白激素的α-亚基的基因的工作，该探针是包括予先分离的、α-亚基的cDNA序列的、一个完整的、有621个碱基对的片段。另一个例子是，Das等人，P.N.A.S（U.S.A）第80期第1531～1535页（1983），报导了使用人工合成的一个175碱基对的寡聚核苷酸，分离出人HLA-DR的人类基因组克隆。最后，Anderson等人，P.N.A.S.（U.S.A）第80期，第6838～6842页（1983）报导了分离出牛胰蛋白酶抑制子（BPTI）的基因组克隆的工作，该工作使用了一个长度为86个碱基对并且是按BPTI已知氨基酸序列而制造的单个探针。文章的作者们对于分离起始腮和肺组织中、适合于合成cDNA文库的mRNA的前景，作了悲观的定论，因为这种来源的mRNA含量水平显然是太低了，后来，他们还强调了用混合标记探针探查基因组文库的成功前景是有一定限制的，他们声明：“更一般地讲，混合序列的寡聚脱氧核苷酸探针已被用于从cDNA文库中分离那些不知其序列的蛋白质基因。这些探针是典型的8～32寡聚核苷酸的混合物。长度为14～17个核苷酸的片断代表着氨基酸序列的每一个小伸展（5～6个残基，这种小伸展结合着每个可能的密码子。在严格控制的杂交条件下，即对那些不能够正确进行碱基配对的探针加以区别对待时就能够在低度至中度复杂的克隆文库中通过使用这种混合探针而特异性基因序列进行定位。然而，由于这些探针的长度较短及不均一，所以混合的探针常常缺乏探查象哺乳类基因组那样复杂的序列所要求的特殊性。这样就使得这种方法在没有相应的mRNA时候去分离哺乳类蛋白质基因成为很不实际的事情”。

这样，在该领域中还仍然存在着改进方法的要求，即要在对所要编码的多肽的氨基酸序列几乎不知道，以及在还不能很容易地得到富含mRNA的那种生物组织，以建造cDNA文库的情况下，找出可以进行迅速有效率的cDNA克隆分离的办法。当人们要分离那些对于基因所编码的哺乳类蛋白质的的氨基酸序列所知甚少的哺乳类基因组克隆时，这样的一些改进方法则是特别地有用。

B.作为目的多肽的促血红细胞生成素（Erythropoietin）

促血红细胞生成素，是红血球细胞的产物，在人类一生寿命中连续地产生以克服细胞的毁损。促血红细胞的生成是精确地由生理机制控制的，以使血液中具有足够数量的红细胞用于正常的组织氧合作用，但也不能太多，以致这些细胞将阻碍循环。红细胞是在骨髓中生成的并且是在激素，即促血红细胞生成素的控制下进行的。

促血红细胞生成素，是一种酸性糖蛋白，分子量约为34000道尔顿，可有三种形式：α、β和asialo型。α型与β型的碳水化合物部分有微小的差别，但是它们具有相同的效能、生物学活性及分子量。asialo型就是α型或β型去掉了终端的碳水化合物（唾液酸）的蛋白质分子。当身体处于健康状态下，血浆中促血红细胞生成素的浓度很低。其中组织以所存在的红细胞中得到足够的氧合作用。这种正常的低浓度，就是以刺激取代那些在老年化日程中正常损失的红血细胞。

当处于由于血细胞运输氧循环中氧的减少而造成的缺氧条件下，循环中的促血红细胞生成素的浓度就升高。由于大出血引起的大量失血、过量地受到辐射而造成红血细胞的毁坏，由于高海拔或拖久了的不省人事造成的摄氧量减少，以及各种的贫血症均可能引起缺氧。组织受到缺氧压力所作出的反应是，促血红细胞生成素增加红血细胞的产生。这种增加是通过刺激骨髓中的原始前体细胞转换为原红血细胞而实现的。这种原红血细胞随后会成熟，会合成血红蛋白，并能作为红血细胞释放到循环中，从而将提高血红细胞在血液循环中的含量。当循环中的红血细胞的数目大于正常组织氧份的需求量时，则循环中的促血红细胞生成素就降低。

参见Testa等人，（Exp、Hematol）第8期（Supp、8），第144～152页（1980）;Tong等人，（J、Biol、Chen、），第256（24）期，第12666～12672页（1981）;Goldwasser  J.Cell.Physiiol.，第110（Supp.1）期，第133～135页（1982）;Finch（Blood），第60（6）期，第1241～1246页（1982，）Sytowski等人，Expt.Hematol.，第8（Supp  8）期，第52～64页（1980），Naughton  Ann.  Clin  Lab.Sci.，第13（5）期，第432～438页（1983）;Weiss等人，Am.J.Vet.Res.，第44（10）期，第1832～1835页（1983）;Lappin等人，Exp.Hematol，第11（7）期，第661～666页（1983）;Baciu等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，第414期，、第66～72页（1983年）;Murphy等人，Acta、Haematologica.Japonica，第46（7）期，第1380～1396页（1983）;Dessypris等人，Brit.J.Haematol，第56期，第295～306页（1984）;以及Emmanouel等人，Am.J.Physiol.，247（（1  Pt2），F168～176（1984）。

因为促血红细胞生成素在血红细胞的形成过程中是必不可少的，所以该激素对于诊断或治疗病征为血红细胞的产生较低或不足的血液病具有潜在的用途。参见Pennathur-Das等人，Blood，第63（5）期，第1168～1171页（1984）和Haddy，Am.Jour.Ped.Hematol/Oncol.，第四期，第191～196页（1982），涉及到促血红细胞生成素可能可诊治镰刀状细胞的贫血病的，以及Eschbach等人，J.Clin.Invest.，第74（2）期，第434～441页（1984）对患尿毒症的绵羊输入一种富含促血红细胞生成素的血浆产生一定的体内反应。基于这样的情况，考虑治疗的效果，而建议对伴有慢性类型的贫血症的治疗剂量为10单位EPO/公斤·天，用药15～40天。参见Krane，Henry  Ford  Hosp·Med，J.，第31（3）期，第177～181页（1983）。

最近的估计是，仅在美国可获得的促血红细胞生成素的数量，每年就可以治疗1，600，000人的贫血。参见Morrison，“Bioprocessing  in  Space……an  Overview，”第557～571页，见于1984年世界生物技术报告，第2卷，美国，（1984年纽约洲，纽约印刷）。最近的研究已经提供了一种对促血红细胞生成素对各种疾病状态、障碍混乱及血液失调状态的治疗效力的基础预测：Vedovato等人，Acta，Haematol，第71期，第211～213页（1984）（β-地中海贫血）;Vichinsky等人，J.Pediatr.，第105（1）期，第15～21页（1984）（囊性纤维化Cystvc  fibrosis）;Cotes等人，Brit·J·Obstet·Gyneacol，第90（4）期，第304～311页（1983）（妊娠，月经紊乱）;Haga等人，Acta·Pediat  rScand.，第72期，第827～831页（1983）（早熟性的早期贫血）;Clauswalker等人，Arch，Phys，Med，Rehabil第65期，第370～374页（1984）（脊柱损伤）;Dunn等人，Eur·J·Appl·Physiol，，第52期，第178～182页（1984）（宇宙飞行）;Miller等人，Brit·J·H-aematol第52期，第545～590页（1982）（急性失血）;Udupa等人，J·Lab·Clin，Med.，第103（4）期，第574～580和581～588页（1984）;以及Lipschitz等人，BLood，第63（3）期，第502～509页（1983）（衰老）;Dainiak等人，Cancer，第51（6）期，第1101～1106页（1983），和Schwartz等人，Otolaryngol。第109期，第269～272页（1983）（伴有异常促血红细胞生成素的各种瘤性病态）。

以往的从血浆或尿中获取高产的促血红细胞生成素的尝试已被证明为不太成功。必需有复杂而尖端的实验技术，并且一般只收集到很少量的含有促血红细胞生成素的既不纯净又不稳定的提取物。

美国专利第3033753号描述了一种从绵羊血浆中部分地提纯促血红细胞生成素的方法，用这个方法得到产量很低的含有促血红细胞生成素的固体粗品。

初期的从尿中分离促血红细胞生成素的试验获得了不稳定的无生物活性这种激素的制剂。美国专利第3865801号介绍了一种从尿中获得含有性质稳定的促血红细胞生成素的粗产物的的方法。这种得到的粗制剂被声称为含有90%的促血红细胞生成素活性，而且这种活性是稳定的。

另一种从再生性贫血病者的尿中提纯人类促血红细胞生成素的方法是在Miyake等人，J.Biol.Chem.第252卷，第15号（1977年8月10日）第5558～5564页中描述的。这个有7个步骤的过程包括离子交换层析，乙醇沉淀，凝胶过滤和吸收色谱，得到了纯的促血红细胞生成素制剂，其效力为70400单位/毫克，蛋白质产量为21%。

Takezawa等人的美国专利第4397840号，描述了用弱碱性离子交换剂从健康人尿样品中制备一种“促血红细胞生成素产物”的一些方法，并且提出所获的低分子量的产物“对促血红细胞生成素没有抑制效应”。

1982年5月6日公布的Sugimoto等人的英国专利第2085887号，描述了一种从杂交的人类的成淋巴细胞瘤的细胞的生产方法，报导说生产的水平是3～420单位促血红细胞生成素/毫升细胞悬浮液在哺乳类宿主繁殖到高达10⁷个细胞/毫升，分布于组织培养的培养液中已经获得了断言为最高的生产水平，将组织培养的细胞从体内转移到体外培养基中之后，促血红细胞生成素的生产率，可计算约为40至4000单位/10⁶个细胞/48小时。（参见相应的美国专利第4377513号）。已有人提出了从组织来源中分离促血红细胞生成素的大量的建议，包括瘤性细胞（neoplastic cell），但是产量都相当低，参见Jelkman等人，Expt.Hematol.第11（7）期，第581～588页（1983）;Tambourin等人，P.N.A.S.（U.S.A），第80期，第6269～6273页（1983）;Katsuoka等人，Gann.第74期，第534～541页（1983）;Hagiwara等人，Blood，第63期（4）期，828～835页（1984）;以及Choppin等人，Blood，第64（2）期，第341～347页（1984）。

其他的用以获取纯净的促血红细胞生成素的分离技术包括免疫学方法。

一种多克隆的，血清衍生的指导抵抗促血红细胞生成素的抗体已经获得了，这是把人的促血红细胞生成素注射到动物体内产生的，动物以大鼠或兔为好。注射进去的人促血红细胞生成素，被动物体内的免疫系统识别为外来抗原性物质，并且引起产生抗体以抵抗该抗原。不同的可对抗原性物质刺激作出反应的细胞产生抗体并释放到循环中去，它们与由其他反应细胞所产生的抗体稍有不同。当从动物身上抽出血液时，血清中的抗体活性依然保留着。当未提纯的血清或抗体制剂作为一种免疫血清球蛋白G部分（IgG）被提纯，然后再把这种IgG制剂用于检测并分析是否同人类促血红细胞生成素相复合时，该类制剂因它有一种主要的缺陷而受到不良的评价。这种由

个体细胞所产生的由所有不同抗体组成的血清抗体、其本质为多克隆的，可与粗提取物中的各种成份相复合，而不是仅与促血红细胞生成素相复合。

本发明背景中有意义的是这样一种技术的最近进展，即对一种能够产生单种抗体的细胞进行组织培养，该抗体对于一个选定抗原的一个单个抗原性因子具有特异性的免疫活性。参见Chisholm，High  Technology.第3卷第一期，第57～63页（1983）。已经尝试了用细胞融合及杂交技术以选出对促血红细胞的“单克隆”的抗体，并把这样的抗体用于分离人类促血红细胞生成素以及定量检测人促红细胞生成素中去。例如，成功地制备出分泌人类促血红细胞生成素的单克隆抗体的小鼠-小鼠杂交瘤细胞株的报导，见于Lee-Huang的文摘，Fed.Proc，文摘第1463号，第41期，第520页（1982）。另外一个例子是，对于制备及使用单克隆，抗促血红细胞生成素抗体的详细描述见于Weiss等人，P.N.A.S.（U.S.A.），第79期，第5465～5469页（1982）。还可参见Sasaki，Biomed、Biochem.Acta.，42（11/12），S202～S206（1983）;Yanagawa等人，BLood，第64（2）期，第357～364页（1984）;Yanagawa等人，J.Biol.Chcm.第259（5）期，第2707～2710页（1984）;和美国专利第4465624号。

另外本发明的另一个有意义的背景是关于合成的肽的免疫学活性的报道，该合成肽基本上复制了天然蛋白质中氨基酸序列的重要的部分，糖蛋白及核蛋白的氨基酸序列。更为特殊的是，分子量相对较低的多肽显示出也已参加免疫反应，并且其在作用时间以及范围上与生理上重要的蛋白质如病毒抗原，多肽激素及类似物的免疫反应相类似。包括在这类多肽的免疫反应之中的是在免疫活性动物中特异抗体形成的激发作用。参见Lerner等人，Cell，第23期，第309～310页（1981）;Ross等人，Nature第294期，第654～656页（1981）;Walter等人，P.N.A.S.（U.S.A.），第77期，第5197～5200页（1980）Lerner等人，P.N.A.S.（U.S.A），第78期，第3403～3407页（1981）;Walter等人，P.N.A.S.（U.S.A.），第78期，第4882-4886页（1981）;Wong等人，P·N·A·S·（U·S·A）第78期，第7412～7416页（1981）;Green等人，Cell，第28期，第477～487页（1982）;Nigg等人，P.N.A.S.（U.S.A.），第79期，第5322～5326页（1982）;Baron等人，Cell，第28期，第395～404页（1982）;Dreesman等人，Nature，第295期，第158～160页（1982）;及Lerner，Scientific  American，第248期，第2号，第66～74页（1983）。还可参见Kaiser等人，Science，第223期，第249～255页（1984），这些文章介绍了合成肽的生物学及免疫学活性，该合成肽大约具有肽类激素的二级结构而不具有它们的一级结构构型。以上的研究当然是涉及蛋白质的氨基酸序列而不是涉及促血红细胞生成素的，目前，促血细胞生成素的重要部分由于氨基酸序列尚没有发表。在由J.Egrie于1983年2月4日提交，并于1984年8月22日作为欧洲专利第0116446号公开的美国专利第463724号共有的共同待批中，描述了一种小鼠-小鼠杂交瘤细胞株（A.T.C.C储存号为HB8209），它产生高度特异性的单克隆的、抗促血红细胞生成素的抗体，它对于下列的一个多肽有特异性免疫反应活性的，该多肽含有以下的氨基酸序列：

NH₂-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH。

多肽序列所指的是根据Miyake等人在《生化杂志》（J.Biol.Chern.），第252期，第5558～5564页（1977）上所述方法分离的成熟的人促血红细胞生成素的前20个氨基酸残基，对其氨基酸的分析是用气相顺序分析仪上（生物系统公司提供（Biosysteps.Inc.〕）是用Hewick.M.等人，J.Biol  Chem.第256期，第7990～7997页（1981）所述的方法进行的。还可参见Sue等人，Proc.Nat.Acad.Sci.（USA），第80期，第3651～3655页（1983），文章讨论了产生对于由不同氨基酸序列的、合成的26个氨基酸残基的形成的多肽的多克隆抗体，还见于Sytowski等人，J.Immunol.Methods。第69期，第181～186页（1984）。

上述的多克隆和单克隆抗体能够为用免疫化学的方法对促血红细胞生成素进行定性探查及含量分析提供高度有用的材料，并且能用亲和层析法提纯促血红细胞生成素，目前看起来还不象是可以从哺乳类源进行大规模的促血红细胞生成素的大量生产，使其足以进行进一步的分析，临床实验及在治疗中利用此物质潜在的，广泛的诊疗用途，例如慢性的肾病，其病变组织已无法继续生产促血红细胞生成素。在此领域中的最终设计是这样的最佳前景，即要有充分特征化的哺乳类促血红细胞生成素，并提供大量的这种物质，用于诊断及临床使用，包括成功地应用重组过程以有效地对这种化合物进行大规模的微生物合成。

虽然对于分离编码人类和其他哺乳类促血红细胞生成素的DNA序列已做了大量的尝试，但看来没有成功。这主要由于髓乏组织物来源，特别是人类富集专一性mRNA组织来源，尚不足。只有有足够的mRNA才能够建立cDNA文库，只有有了cDNA文库才可用常规的方便方法分离出编码促血红细胞生成素的DNA序列。再者，因对促血红细胞生成素的氨基酸残基的连续序列所知甚少，因此不可能组建一个长的多核苷酸探针，且如果有这类探针，那么该类探针能够可靠地用于DNA/DNA杂交，筛选出cDNA和特别的基因组DNA文库。显然，用以生产由A.T.C.C.HB8209提供的，被上述命名的20个氨基酸的单克隆抗体，并不能根据Anderson等人在Supra中所述的方法制造出一种确切的，由60个碱基组成的寡聚核苷酸探针。据估计，人类促血红细胞生成素基因，可能是在人基因组中作为“单拷贝基因”存在，并且在任何情况中，编码人类促血红细胞生成素的基因物质象是占有不到人类全部基因组DNA的0.00005%，该基因组DNA可以以基因组文库的形式而存在。

迄今为止，关于用有关重组方法提供适于用在微生物表达相当量的可分离的哺乳类促血红细胞生成素的DNA序列的最成功的尝试的报导，尚距目的很远。例如Farber等人，Exp  Hematol.第11期Supp.14，摘要101（1983），报导了从用苯肼处理的狒狒肾组织中提取mRNA，以及将mRNA注射进爪蟾（：Xenopus  laevis）卵母细胞中，得到了在体外生产“翻译产物”混合物中包括显示出促血红细胞生成素生物学活性的物质。更近一些，Farber等人，BLood，第62期第5号，Supp第1号，摘要392，在第122a页（1983）上，报导了在体外用蟾蜍卵母细胞翻译人类肾mRNA可得到混合的翻译产物。估计注射每毫克mRNA产生大约为220毫单位具有促血红细胞生成素活性的翻译产物。虽然这种水平的编码促血红细胞生成素的外源性mRNA的体外翻译被认为是低水平的（甚至与以前的将狒狒mRNA翻译到所求的产物中去的水平相比），但还是认为该结果确证了人类肾脏是一个促血红细胞生成素的表达位点，从而用人肾细胞可能建立富集人类肾cDNA的基因文库，人们所期望的基因也许就能从这种文库中分离出来。〔参见Farber，Clin.Res第31（4）期，第769A页（1983）〕。

自从提交了美国专利第5610.24和582185号以来，只有一篇关于被称为含有人类促血红细胞生成素的大肠杆菌（E.coli）的克隆及表达的报告，表达工作表明人促红细胞生成素的cDNA已处于克隆在大肠杆菌中。简言之，一定数量的cDNA克隆被插入到大肠杆菌质粒中，而且，β-内酰胺酶（β-Lactamase）融合产物被认为与一个单克隆抗体一起对人类促血红细胞生成素的非特异性“抗原决定部位”具有免疫活性。参见Lee-Huang，Proc.Nat.Acad.Sci.（U.S.A）第81期）第2708～2712页（1984）。

本发明首次提供了一种新颖的多肽产物的分离及提纯的方法。该多肽产物具有天然促血红细胞生成素，包括其等位的变种的一部分或全部的一级结构构象（即氨基酸残基的连续序列）和一种或多种生物学特性（例如免疫学性质和体内及体外生物学活性）。这些多肽是专一性外源DNA序列在原核或真核宿主细胞中（如细菌、酵母及哺乳类动物的组织培养细胞）基因表达的产物，因此具有独一无二的特性。而这种外源DNA序列或者从基因组DNA克隆中取得、或者从CDNA克隆中取得，或者由人工合成得到。把在微生物中产生的表达产物放到脊椎动物（如哺乳类和鸟类）细胞中，还可由于去掉在它的天燃的哺乳类细胞的环境中或细胞外液为血浆或尿中连系在人类蛋白质或其他与促血红细胞生成上的污染物而得到进一步的特征化。典型的酵母例如啤酒酵母〔Saccharomyces  cerevisiae〕）或原核细胞（例如大肠杆菌，〔E.Coli〕）的宿主细胞中的产物，是不伴随有任何哺乳类蛋白质的。因为所使用的宿主不同，本发明生成的多肽可能是被哺乳类或其他真核的碳水化合物糖基化的，也可能是非糖基化的。本发明的多肽也可能包括一个起始的蛋氨酸残基（在-1位上）。

本发明的新糖蛋白产物是一种具有那些经过充分复制与天然（例如人类）促血红细胞生成素为类似的一级结构构型，从而具有其一种或多种生物学性质，以及在平均碳水化合物组分上与天然（例如人类）促血红细胞生成素不同的糖蛋白。

本发明提供脊椎动物（例如COS-1和CHO.）细胞。包括第一次提供的细胞在内，这些细胞可以在体外连续地繁殖，就其在培养基上的生长而言，它们能够在48小时之内，每10⁶个细胞在其生长的培养基中产生100U（较好是500U以上，最好的是1，000到5，000U以上表示单位）以上的促血红细胞生成素，这产量是用放射免疫测定法确定的。

本发明提供的合成多肽是全部地或部分地复制了的促血红细胞生成素氨基酸残基的连续序列的合成多肽。这些多肽是在此第一次被阐明。这些序列，由于其本质上带有天然促血红细胞生成素的一级，二级或三级的结构的或构象的特征，所以它们可以具有与天然产物一样的生物学活性和/或免疫学性质，这样它们可以作生物学活性或免疫学上的促血红细胞生成素的取代物而用于诊治及免疫过程中。与此相应，提供出由标准方法产生的单克隆或多克隆的抗体，它们对于上述这种多肽有免疫活性，对于天然的促血红细胞生成素则有更好的免疫活性。

对本发明的解释是，猴或人的克隆的DNA序列和由此DNA序列而适宜地推断出的代表着猴或人遗传讯息的多肽，分别代表着来源于猴和人的促血红细胞生成素的一级结构构象。

本发明提供出可携带掺入本发明组建的、DNA序列有新生物学功能的病毒DNA载体和环状质粒DNA载体。以及提供出可以稳定地转化或转染这种载体的微生物（例如细菌，酵母和哺乳类细胞）的宿主生物。相应于本发明，还提供了生产有用的多肽的新方法，其包括在对外源性好，载体所携带的DNA序列易于进行大规模表达的条件下，组织培养这样转化或转染的微生物宿主、从生长培养基中细胞溶胞物或细胞膜部分分离出所期望的多肽。的等等方法。

本发明所提供的分离及提纯微生物表达的多肽的方法，可以是常规的方法，包括例如制备性层析分离和包含单克隆和/或多克隆抗体制备的免疫学分离方法。

在描述了促血红细胞生成素的氨基酸残基序列之后，本发明提供了人工合成编码促血红细胞生成素的DNA的全部序列和/或部分序列的方法，提供的方法具有这样的一些优越性的特征，如在编码同一个氨基酸的可能的几个密码子中，选用哪个为已入选的非哺乳类宿主“优先愿意”表达的密码子来组成DNA序列，提供限制性核酸内切酶的切点，提供外加的起始DNA序列，终止DNA序列及中间部分DNA序列，这些部分便于组建一个易于表达的载体。相应地，本发明提供了制造及产生的cDNA和基因组DNA上的特异性诱变位点;由微生物表达的、编码促血红细胞生成素的衍生物或多肽类似物的DNA序列的方法，这些衍生物或类似物与天然多肽在一个或多个氨基酸残基的定位或氨基酸本身上是不同的（即缺失类似物：含有不完全的对EPO特异性的残基和/或取代类似物：其中一个或多个特异性的残基被其他的残基所取代和/或添加类似物：一个或多个氨基酸残基加在多肽的终端或中间部分）;而上述被改变位置的或被替换的氨基酸残基正是承担着天然多肽的全部或部分活性的重要部分。

本发明的新的DNA序列，包括所有的那些对多肽产物在原核或真核宿主细胞进行安全表达有用的序列。该多肽产物带有至少一部分促血红细胞生成素的一级结构构象，并且有一种或多种生物学活性，关于这些可以通过以下四方面而得到理解：（a）在表Ⅴ和表Ⅵ中给出的DNA序列或它们的互补链，（b）与（a）所限定的DNA序列杂交的DNA序列或其片段（在如这里所描述的杂交条件或在更严紧控制的条件之下进行杂交）;以及（c）可以与上面指出的a），b）所限定的DNA序列杂交的，但是相应于遗传密码兼并性（degeneracy）的DNA序列。由（b）部分得到的特殊理解是，编码等位变种的基因组DNA序列产生猴或人促血红细胞生成素和/或编码其他哺乳类的促血红细胞生成素。由（c）部分得到的特殊理解是，制造编码EPO、EPO片段及EPO类似物的那些DNA序列中可能掺有易于在非脊椎动物宿主中翻译mRNA的密码子。

本发明包括这一系列要编码的多肽，是由部分DNA互补于表Ⅵ中列出的人类基因组DNA序列的上面一条链而形成的，即“互补的颠转蛋白质”，正如由Tramontano等人在Nucleic  Acids  Research，第12期，第5049～5059页（1984）所描述的一样。

本发明还包括药物学用组分：包含作为药物本发明的多肽产物应有的有效剂量、适宜的稀释剂、辅剂和/或载体，这种促血红细胞生成素药物可用来治疗疾病，特别适用于贫血病的治疗以及最为适于治疗慢性肾病引起的贫血症。

本发明的多肽产物可以通过共价结合一个可探查的标记物而被“标记（例如用¹²⁵I放射性标记），从而就为检定及定量测定固体组织及液体样品（如血液或尿）中的促血红细胞生成素提供出一个非常有用的试剂。本发明的DNA产物也可以用可探查的标记物（例如放射性同位素及非同位素的标记，如生物素）进行标记，将它用于DNA的杂交过程以确定促血红细胞生成素基因的位置和/或任何相关的基因家族在人类，猴及其他哺乳动物染色体图谱中的的位置。它们还可以用来鉴定DNA水平上的促血红细胞生成素基因的紊乱，而且也可以作为一种基因标记物用于鉴定邻近基因及它们的紊乱。

通过如此详细地描述后可以看到，本发明在方法学上提出了一些进一步的极为重要的改进，它大大地改进了探查方法。即可以在不均一的细胞或病毒样品中对一个已知序列的专一性单链多核苷酸，以及多个单链多核苷酸进行探查，其中：

（a）制备一种标记的单链多核苷酸探针的混合物，其具有均匀变化的碱基序列，每一个所述的探针都有可能特异性地与另一个碱基序列互补、该碱基序列对于所要探查的多核苷酸假定为是独一无二的。

（b）样品是固定在一种固体基质上的，

（c）对固定有样品的固体基质进行处理，以碱弱多核苷酸在其上的进一步结合，但这种减弱不包括上述的样品中的多核苷酸序列与探针的结合。

（d）固定有样品并经处理过的基质在仅仅易于在整个互补多核苷酸之间进行杂交的条件下短暂地与所述的标记的探针的混合物相接触，并且

（e）探查专一性多核苷酸序列，是通过监测存在于这种特异性多核苷酸序列与上述标记探针混合物中的完全互补探针之间的杂交反应而大致的。标记探针与基质也有一定程度的非专一性结合，而探针与附着在基质上的专一性多核苷酸的互补结合，使放射性物质聚集在专一性多核苷酸上，这里的放射性密度远比前者高，由此，可以证明已探到了专一性多核苷酸序列。

这种操作步骤在使用64、128、256，512，1024或更多个的具有17至20碱基的混合多核苷酸探针，进行DNA/DNA或RNA/RNA或DNA/RNA杂交的情况下特别有效。

如下面所述，上面提及的改进方法已经阐明可以在由贫血症的猴肾细胞mRNA制备的基因文库内鉴定出编码起源于猴的促血红细胞生成素的cDNA克隆。具体地说，将用人类促血红细胞生成素序列部分的讯息而制备得到的128种均质的不同的20聚体的探针混合物，用在菌落杂交（即定位杂交）步骤中。用这个办法在200，000个克隆中鉴定出7个“阳性”促血红细胞生成素cDNA克隆。更为显著的是，应用本发明的改进方法，能够在组成人类基因组文库的1，500，000噬菌体的噬菌斑中进行筛选，迅速地分离出3个阳性克隆。这项工作的完成是经过进一步改良而完成的：将上述提及的，28个20聚体探针混合物以及由人类促血红细胞生成素的不同连续序列的氨基酸分析而制备得到的第二套128个17聚体探针一起使用而完成的。

上述说明的过程组成了第一个为人所知的实例：使用多重混合的寡聚核苷酸探针DNA/DNA杂交中。于是，可以直接地分离出哺乳类的基因组克隆。上述过程还组成了另一个首次为人所知的实例：在分离cDNA克隆中使用了长于32个寡聚核苷酸的探针的混合物的实例。

当阅读了后面的详细介绍后，专业人员们将会清晰地看到本发明在技艺上涉及许多方面并有极多的优点。以下的详细说明解释了在目前的最佳实例中实践本发明的情况。

根据本发明，已经分离出并定性了编码部分或全部人和猴的促血红细胞生成素（此外有时称为EPO）多肽序列的DNA序列。进而言之，由人类或猴的中分离得到DNA已被作为真核或原核表达的主题，该表达提供可分离量的多肽，该多肽展示出天然EPO的生物学（例如免疫学）性质以及在体内和体外的EPO生物学活性。

猴的DNA片断是从用mRNA建立的cDNA文库中分离出来的，该mRNA是从经化学诱导形成的贫血症猴肾组织中得到的。而且，患有这种贫血症的猴的血清用免疫学分析后，确定被认为是包含有相对于正常猴血清而言是高水平的EPO。含有EPO编码DNA的所期望的cDNA克隆的分离，是通过使用DNA/DNA克隆杂交而完成的，其中使用了一个128个混合的、放射性标记的，20个聚体的寡聚核苷酸探针库，并且迅速地筛选了200，000个克隆群体。寡聚核苷酸探针的设计，是把人EPO小量样品先用酶切出片段，至后测定其氨基酸序列。所最后再根据得出的氨基酸序列讯息而制备出探针。

人DNA片断是从人类基因组DNA文库中分离出来的。对含有EPO编码DNA的克隆的分离，是通过DNA/DNA噬菌斑的杂交完成的，工作使用了上述的一组128个混合的20聚体的寡聚核苷酸探针库以及另一组128个放射性标记的17聚体探针库，探针的核苷酸序列是根据从人EPO不同酶解片段中所获的氨基酸序列的讯息而建立的。

阳性克隆菌落及噬菌斑用克隆DNA的二脱氧序列分析法（dideoxy  Sequencing）去检验。先用在20聚体探针的库中的16个序列的亚组去杂交，再对经杂交选出的克隆进行核苷酸序列分析，最后再将这个结果选择推论出它所编码的EPO多肽的一级结构构象。所推断出的多肽序列显示出了相互之间有高度同源性。而且，这种多肽与由人EPO片段氨基酸的部分序列之间的也有着高度同源性。

一个选出的阳性的猴cDNA克隆以及一个选出的阳性的人基因组克隆，分别被插入到一个“穿梭”DNA载体中，并在大肠杆菌（E.Coli）中放大，再用来转染组织培养的哺乳类细胞。转染了的宿主细胞在组织培养条件下生长。最后，测定组织培养的培养基上清液制剂，估计产量为每毫升培养液体中含有约3000毫单位EPO。

以下的例子是用于说明本发明的，特别是用来致力于说明在编码猴EPOcDNA克隆和人EPO基因组克隆的鉴定之前所用方法，结果为这样的鉴定方法、序列分析法，表达系统的建立的方法以及在这样的系统中的EPO表达的免疫学检验的方法等。

具体地说，实施例Ⅰ是关于人EPO片段的氨基酸序列分析以及在此序列结果的基础上建立放射性标记探针的混合物。实施例2一般地介绍在鉴定阳性猴cDNA克隆中所涉及的过程，而且从而提供有关动物治疗及动物血清放射性免疫测定（RIA）的讯息。实施例3介绍了关于制备cDNA文库、菌落杂交筛选，阳性克隆的鉴定、阳性cDNA克隆的DNA序列分析和产生猴EPO多肽一级结构构象（氨基酸序列）等方面方法的讯息。实施例4介绍指出在鉴定阳性人基因组克隆中涉及的过程、与此相关的关于基因组文库的来源的一定的讯息、噬菌斑杂交的过程及其阳性克隆的确认方法等等。实施例5指导人们对阳性基因组克隆进行序列分析、给出生产人EPO多肽氨基酸序列的情报、人EPO与猴EPO序列比较的讯息。实施例6介绍了组建一种载体的方法。从阳性猴cDNA克隆切出的，编码EPO的DNA片断，可以插入到这种载体中。也介绍了这种载体转染COS-1细胞及转染细胞的组织培养生长的具体作法。实施例7介绍了组建另一种载体的方法。该载体可以允许从阳性人基因组克隆中切出的编码EPO的DNA片段插入。并且介绍了用该载体转染COS-1细胞，以及转染细胞的组织培养生长过程。实施例8是关于对从核实施例6和7组织培养所得的转染细胞在生长培养上清液进行免疫测定的方法。实施例9是关于实施例6和7经微生物表达产生的EPO，在体外invitro及体内in  vivo的生物学活性。

实施例10是关于建于对于猴EPO  cDNA和人基因组DNA，包括中华仓鼠卵巢细胞在内的（CHO），在哺乳类宿主中的表达系统，关于这些表达系统的产物的免疫学及生物学活性以及对这些产物的特性的描述。实施例11是关于所制造的编码人类EPO及EPO类似物的基因的制造方法，该基因包含一些对在大肠杆菌（E.Coli）以及酵母宿主细胞中表达是较好的密码子，以及在其上建立的表达系统。实施例12是关于实施例11系统所表达的产物的免疫学和生物学活性的轮廓。

实施例Ⅰ

A.人类EPO片段的氨基酸序列化

人类EPO是从尿中分离出来的，并经胰蛋白酶酶解，结果是产生并分离出约为100～150微微摩尔的17个分离碎片。

碎片用指定的数目编号并且一一地用气相顺序仪（生物系统公司提供）进行序列分析，从而得出它们的氨基酸序列，所提供的有关序列的讯息列于下面的表1之中，其中使用了单个字符，而且用“X”表示还不能非常明确确定的残基。

见表Ⅰ

表  1

碎片号  顺序分析结果

T4a  A-P-D-R

T4b  G-K-L-K

T9  A-L-G-A-Q-K

T13  V-L-E-R

T16  A-V-S-G-L-R

T18  L-F-R

T21  K-L-F-R

T25  Y-L-L-E-A-K

T26a  L-I-C-D-S-R

T26b  L-Y-T-G-E-A-C-R

T27  T-I-T-A-D-T-F-R

T28  E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R

T30  E-A-E-X-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-L-

N-E-X-I-T-V-P

T31  V-Y-S-N-F-L-R

T33  S-L-T-T-L-L-R

T35  V-N-F-Y-A-W-K

T38  G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-W-

E-P-L-Q-L-H-V-D-K

B.寡聚核苷酸探针混合物的设计和制造

表1中所列的氨基酸序列被用遗传密码的兼并性的上下关系进行了复核，目的是要确定混合探针的方法是否能用于在cDNA和/或基因组DNA文库上的DNA/DNA杂交过程中。这个分析揭示了在T35号碎片内存在着一系列具有7个氨基酸残基的序列（Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys），这可能是一种特征。即由具有20个碱基对的、与128种探针互补的、可能的DNA序列中的一种序列所编码的产物所独有的一种的特征。第一套128个20单体寡聚核苷酸是用标准磷酸酰胺方法合成的。（见例如Beaucage等人，Tetrahedron  Letters，第20期，第1859～1862（1981））稍具体一些说，则是按表2中所列出的序列，在固体支持物上合成的。

进一步的分析揭示出在T38号碎片内，存在着一系列6个氨基酸残基（Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu），基于这个讯息，人们有可能按表3中所列出氨基酸序列，制备出一套有128个混合寡聚核苷酸17单体的探针库。

寡聚核苷酸探针在T4多核苷酸激酶（NEN）催化下于5′端用r-³²P-ATP，（7500-8000居/毫摩尔）（ICN）进行标记。

实施例2

A.猴的处理过程和放射性免疫测定（RIA）分析

雌性Cynomolgus猴（Macaca  fascicu  larias）（25～3公斤，1.5～2岁）用pH7.0的盐酸苯肼溶液在第1、3和5日进行。皮下处理，所用剂量为125毫克/公斤。在每次注射前均要测定血细胞比容。在第7日或当血细胞比容水平降到起始水平的25%以下的任何时候，按25毫克/公斤的剂量注射氯胺酮盐酸盐（Kete  mine  hydrochloride），然后收获血浆和肾。将收获物立即用液氮冰冻并保存于-70℃。

B.EPO的放射性免疫测定

用于定量探查样品中EPO的放射性免疫测定是按下述的过程进行的：

一种标准的或未知的促血红细胞生成素样品与抗血清一起在37℃保温2小时。在2小时的保温之后，将样品管放在冰上冷却，加入用¹²⁵I标记的促血红细胞生成素，并且使管子在0℃在放置至少15小时。每个分析管中有500微升的反应混合物，反应混合物的组成为：50微升稀释的免疫血清，10000 cpm¹²⁵I标记的促血红细胞生成素，5微升抑肽酶（trasylol）和0～250微升的标准EPO或未知EPO样品，以及加入含有0.1%牛血清;蛋白（BSA）的磷酸缓冲溶液（PBS）将反应体积补充到都是500微升。所用的抗血清是从已用及1%纯人尿促血红细胞生成素制剂免疫了的兔子第二次放出血中分离到的血清。用于分析的最初抗血清稀释液是经过这样调整的：即与抗体相连的¹²⁵I标记的EPO不超过总加入物的10～20%。一般而言，这就相当于1∶50000至1∶100000的最终抗血清稀释液。

与抗血清相连的¹²⁵I标记的促血红细胞生成素是用加入150微升Staph A沉淀的，在40分钟培养后，对样品进行离心，离心沉淀出来的小球再用0.75毫升含有0.15摩尔Nacl，2毫摩尔乙二胺四乙酸（EDTA）以及0.05%三硝基甲苯（Triton）X-100的pH8.2的Tris-Hcl洗两次。清洗后的小球在r（珈玛）计数器中计数，以确定结合了¹²⁵I-的促血红细胞生成素的百分数。要从计数总值中减去免疫前结合到血清上的计数以核正，除去那些非特异性的沉淀造成的放射性计数，未知样品的促血红细胞生成素的含量通过把测出数据与标准曲线相比较而确定。

以上过程用于以上述A中所获的猴血清上，同样也可用在未处理的猴血清上。正常的血清水平经分析一般含有大约为36毫单位/毫升，而处理过的猴血清含有1000至1700毫单位/毫升。

实例3

A.猴cDNA文库的建立

信使RNA是从正常的和贫血症的猴肾中分离出来的，用的是Chirgwin等人，Biochemistry，第18期，第5294页（1979）的硫氰胍的方法，并且多聚腺苷酸（A）⁺mRNA是用两次寡聚（dT）一纤维素层析分离出来的，正如Maniatis等人在“分子克隆，实验室手册一书中（“Molecular Cloning，ALaboratory Manual”）〔冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982，（Cold Springs Harbor Laboratory，Cold Springs，Harbor，N.Y.，1982）〕第197～198页所描述的那样。cDNA文库是根据对Okayama等人，在分子及细胞生物学（mol and Cell Biol，）第2期，第161～170页（1982）上介绍的修改过的一般过程的方法而建立起来的。现在最优过程的关键特性为下：（1）puc 8被用作为唯一的载体，用PstI酶进行剪切，然后接上一个长度为60-80碱基的寡聚dT尾端;（2）使用HincⅡ酶解，将寡聚dT尾自载体的一端切去;（3）第一条链的合成以及连接寡聚dG的尾端是按照已发表的过程进行的一端去掉;（4）用Bam HI酶解从该载体的一端去除寡聚dG尾;以及（5）用DNA取代RNA链是在两种连接子（GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC和ACGGTCTTTA）的含量过量三倍于那些带有寡聚dG尾部的载体的情况下进行的。

B.筛选猴cDNA文库的克隆菌落的杂交过程，

将转化了的大肠杆菌（E.Coli）涂布于密度为每10×10厘米上有9000个菌落的培养基平板上，该平板是由含有50微克氨苄青霉素/毫升营养物的琼脂培养铺成的。基因筛选滤膜（New  England  Nuclear  Catalog  No.NEF-972）预先于BHI-CAM板（Bacto脑心浸出液37克/升，酪蛋白氨基酸（Casamino  acid）2克/升和琼脂15克/升，含有500微克氯霉素/毫升）上润湿，然后被用来将菌落自平板上取下。菌落先在同样的培养基中再继续生长12小时或更长时间以扩增质粒的数量。然后扩增了的菌落（菌落上边）再用一系列放在两张Whatman  3毫米滤纸上的滤膜进行处理，纸是用下述每一种溶液一一浸透过的：

（1）50毫摩尔葡萄糖-25毫摩尔Tris-Hcl（pH8.0）-10毫摩尔乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）5分钟;

（2）0.5摩尔NaoH，10分钟;以及

（3）1.0摩尔Tris-Hcl（pH7.6）三分钟。

然后把滤膜放在真空干燥器中，于80℃烘烤2小时进行干燥。

然后，滤膜再用蛋白酶K（Proteinase  K）消化，以去除菌落中的蛋白质。这个消化过程是在缓冲液K中进行的浓度为50微克/毫升的蛋白酶（Pro  tease  enzyme溶液在0.1摩尔Tris-Hcl（pH8.0）-0.15摩尔Nacl-10毫摩尔EDTA（pH8.2）-0.2%SDS中。应特别注意：向每个滤膜上加入5毫升的溶液，使酶解在55℃进行30分钟，酶解之后除掉溶液。

然后，滤膜用4毫升预杂交缓冲液（5×SSPE-0.5%SDS-100微克SS大肠杆菌DNA/毫升）进行杂交的前处理。杂交前的处理在55℃进行，一般为4小时或更长，此后除去掉预杂交的缓冲液。

杂交过程按以下方式进行：向每一个滤膜上加入3毫升杂交缓冲液（5×SSPE-0.5%SDS-100微克酵母tRNA/毫升），128份上述缓冲液，其中每一份含有表2中的128个探针的一种的序列，探针在上述缓冲液中的含量为0.025微微摩尔（全部的混合物被定名为EPV混合物），然后将滤膜放在48℃保持20小时。这个温度是比任何一种探针被确定的计算出的最低解离温度（Td）还低2℃。

在杂交之后，滤膜在振荡恒温水浴，用6×SSC-0.1%SDS在室温下洗3次，每次10分钟，并且再在杂交温度（48℃）下，用6×SSC-1%SDS洗2至3次。

将滤膜进行放射性自显影，放射自显影的结果指出在被筛选的200，000个菌落中有7个阳性菌落。为了进一步核实、对把二方面找到的推认为含有猴cDNA的7个阳性菌落中的一个（定名为克隆83）进行起始序列分析采用Wallace等人，Gene，第16期、第21～26页（1981）的改良法。简言之，以猴cDNA克隆83中得到的杂交质粒DNA用EcoRI酶解而成为线性分子，再在沸水浴中加热解离成为分开的两条单链再用Sanger等人发表在P.N.A.S.（U.S.A.）第74期，第5463～5467页（1977）的二脱氧方法分析确定起始序列的核苷酸顺序使用由16个序列组成的探针的EPV混合物中的一个亚组（SUbset）作为序列反应的引子。

C.猴EPOcDNA的序列分析

克隆83的核苷酸序列分析是用Messing，Methoel in Enzymology，第101期，第20～78页（1983）的方法进行的。表Ⅳ中给出的是克隆83的大约1600碱基对的EcoRI/HindⅢ克隆的碎片的初步限制性内切酶解分析图谱。估计限制性核酸内切酶的识别位点所在的区域是从某些碎片3′碱基到5′末端的ECORI位点。cDNA的核苷酸的序列分析是通过对相互重叠的限制性内切酶酶解片段分别一一进行碎片的序列分析而完成的。例如，通过对定义为C₁₁₃（Sau3A在～111/SmaI在～324），的片断进行分析，并且对一个定名为C₇₃（ALuI在～424/BstEⅡ在～203）的碎片进行逆向序的序列分析，再综合以上两个结果，得出了关于一个重叠的核苷酸序列的序列分析讯息。

表  Ⅳ

限制性内切酶的认别位点  估计的位置

EcoRⅠ  1

Sau3A  111

SmaⅠ  180

BstEⅡ  203

SmaⅠ  324

KpnⅠ  371

RsaⅠ  372

AluⅠ  424

PstⅠ  426

AluⅠ  430

HpaⅠ  466

AluⅠ  546

PstⅠ  601

PvuⅡ  604

AluⅠ  605

AluⅠ  782

AluⅠ  788

RseⅠ  792

PstⅠ  807

AluⅠ  841

AluⅠ  927

NcoⅠ  946

Sau3A  1014

续上表

限制性内切酶的认别位点  估计的位置

AluⅠ  1072

AluⅠ  1115

AluⅠ  1223

PstⅠ  1301

RsaⅠ  1343

AluⅠ  1384

HindⅢ  1449

AluⅠ  1450

HindⅢ  1585

对大约有1342个碱基对的序列（在Sau  3A的3′位点至E  oRI位点及HindⅢ位点之内）进行序列分析以及对所有可能的解读框架的分析，已能够将DNA和氨基酸序列的讯息列于表Ⅴ中。在表Ⅴ中，把成熟EPO的氨基终端的认定的起始氨基酸（由其与前面所述的20个氨基终端残基之序列分析的相互关系而确定）的位置定为+1处，专一于甲硫氨酸的ATG密码子（-27）。位于起始的氨基酸末端丙氨酸残基的“上方”，作为成熟蛋白质的氨基酸序列的确定的第1个残基，它的存在表明可能有这样一种情况，即EPO一开始在细胞质中表达为一种前体形式，包括一个27氨基酸“先导”区，这个先导肽部分在EPO成熟时，成熟EPO进入循环之前被剪切下来。在多肽中，潜在的糖基化位点由星号所指明。估计翻译区的分子量为21117道尔顿，而组成猴成熟的EPO多肽的165个残基的分子量为18236道尔顿。

见表Ⅴ

表Ⅴ的多肽序列可以很容易地被用来分析为潜在的高度致免疫区域有高度亲水区及/和有二级构象特征区。所用的方法是，例如Hopp等人的，P.N.A.S（U.S.A），第78期，第3824～3828页（1981），Kyte等人，J，Mol.Biol.，第157期，第105～132页（1982）和/或Chou等人，Biochem，第13期，第222～245页（1974）以及AdVances  in  Ensymology，第47期，第45～47页（1978）。根据Hopp等人方法的计算机辅助分析是可用的，使用了一个指定为PEP第67参考部分（Reference  Secton）的程序，它是由加利福尼亚，Palo，Alto，大学街124号，Intelligenetcs，Inc，提供的。

实施例4

A.人类基因组文库

根据Lawn等人，Cell，第18期，第533～543页（1979）的方法已经获得了制备的携带有人类胎儿肝基因组的噬菌体Ch4A基因文库，并且保存着以用于噬菌斑杂交分析。

B.为筛选人类基因组文库的噬菌斑杂交步骤。

溶液噬菌体颗粒如果没有用于基因筛选的Gene Screen Plus（New England NuclearCatolog No NEF-976）和NZYAM板（Nacl5克;Mgcl₂-6H₂O2克;NZ-胺A（NZ-Amine）10克;酵母浸出物，5克;酪蛋白水解物Casamino acids，2克;麦芽糖，2克;琼脂15克/每升）。根据Woo，Methool In Encymolegy，第68期第389～395页（1979）的办法，将一些DNA固定在滤膜上，（每个滤膜上有50000个噬菌斑）

在空气中干燥的滤膜再于80℃烘烤1小时，然后按实施例3，B部分所述的办法用蛋白酶K（PsoteinaseK）进行酶解。杂交前处理（即予处理，下同）是用1摩尔Nacl，1%SDS缓冲液在55℃进行4小时或更长时间，然后去除缓冲液。杂交及杂交后的情况按实施例3B部分所述的步骤进行。被定名为EPV的128个20单体探针的混合物和（被定名为EPQ混合物）表Ⅲ的128个17单体探针混合物均用来进行杂交。用EPV探针混合物杂交在48℃进行的。用EPO探针混合物的杂交是在46℃进行，这个温度是比EPQ混合物中各成员Td的最低计算值还低4度的温度。为了再次进行杂交可保存杂交过的探针，下一次将它放在1×SSC-0.1%SDS中沸腾2分钟即可以再次使用。滤膜的放射性自显影揭示了在1，500，000个筛选的噬菌体噬菌斑中，有3个阳性克隆（与两种探针混合物都反应）。对编码EPO的阳性克隆的证明，是通过对实施例3的猴cDNA的在电子显微观察到有不均一的双链结构的以及进行DNA序列分析而获得的。这一过程还给出了在基因组DNA序列中有多重内含子的证据。

实施例5

对一个阳性克隆（定名为λhEⅠ）进行了核苷酸序列分析，目前所获的结果列于表Ⅵ。

见表Ⅵ

在表Ⅵ中，开始的、连续DNA序列表明了一个620碱基的顶部单链部分，是一个紧靠在人EPO基因的翻译区之前的一个显然是不被翻译的序列。具体地讲，该序列出现，组成基因的5′末端，这段序列导致形成一种由四个氨基酸（-27至-24）组成的先导肽（“Presequeuce”前序列）的可翻译的DNA区，在编码引导于始端之前的序列中的4个碱基对还未被准确无误地确定，因而用“X”来代表。然后接着一个约639个碱基对的内含于（其439个碱基对已测出核苷酸序列了，剩下的200个碱基对被称为“I.S.”），它刚好在一个谷氨酰胺的密码子之前，这个谷氨酰胺被认为是译出的多肽的-23残基。紧接着有第一个外显子，它被认为是从一个丙氨酸残基（指定为成熟的人EPO的氨基酸序列的+I残基）密码子到在专一于+26位上苏氨酸密码子这一段序列，后面再接上由256个碱基组成的第二内含子。在第二内含子后，有2个外显子，它编码第27-第55个氨基酸残基。随后，又有一个由612个碱基对组成的第三内含子。第三内含子之后的第三外显子编码人EPO的从56到115的氨基酸残基。接着又开始了一个含有134个碱基对的第四个内含子。接着在第四内含子之后的，是一个编码116至166号氨基酸残基的第四外显子以及一个“停止”密码子（TGA）。最后，表Ⅵ指出了一个568个碱基对的序列，显示为这段序列是在人EPO基因不翻译的3′区，它（“X”）的两个碱基对还未被准确无误地确定是什么核苷酸。

这样，表Ⅵ指出了包括有166个专一性氨基酸残基在内的成熟的人HPO的一级结构构象（氨基酸顺序）（估计其分子量为18399）。在该表中还揭示了一个DNA序列，它一个带有5′和3′DNA序列的编码一个27个氨基酸残基的先导序列，这段序列对于人基因的操纵子中的起动子/调节子的功能可能是很重要的。成熟的人EPO多肽的可能的糖基化位置，在表中由星号指明。值得注意的是，表Ⅵ中的专一性氨基酸序列，与组成人促血红细胞生成素的天然等位形式很相似。支持这一点的事实，是从坚持不懈地对尿中分离出的人促血红细胞生成素进行序列分析的结果中发现的，人们发现其中有很大数量的促血红细胞生成素的分子都在第126号残基位置处有一个甲硫氨酸，正如表中所述的与丝氨酸相对。

下面的表Ⅶ，说明了人的EPO多肽序列与猴的EPO多肽序列的同源性程度。在表中上部的连续线中，单个字母是用来推断出的代表从27残基开始的人EPO的翻译多肽的序列，下部的连续线表明推断的从27残基开始的猴EPO多肽的序列。用星号代表重要的同源性序列。应当注意的是，推论出来的人和猴的EPO序列的比较，揭露出了在116位（人类）上有一个“额外的”赖氨酸（K）残基。同表Ⅵ互相参照指明，该残基是处在基因组中推认的编码MRNA的序列中有待于剪接结合处（SPlice  junction）的边缘上。在人多肽序列中存在着一个赖氨酸残基，又通过对一个人CDNA克隆的序列分析而进一步证实，该克隆是用从对下述实施例7中的人基因组DNA进行转化了的COS-I细胞中分离出的MRNA制备出来的。

见表7

实施例6

选来用于开始尝试由微生物合成实施例3的过程所提供的猴CDNA编码的有可分离量的EPO多肽物质的表达系统，是一种关系到哺乳类宿主细胞（即COS-I细胞，美国培养物样板收集中心〔A.T.C.C〕第CRL-1650号）的表达系统。该细胞采用能够在大肠杆菌宿主中（由存在着PBR322-衍生DNA）和哺乳类宿主（由存在着SV40病毒衍生DNA）自动复制的“穿梭”载体进行转染。

具体地讲，这种表达载体按下述过程制备。实施例3提供的克隆83质粒在大肠杆菌（E.Coli）中被放大，而且经由ECORI和HindⅢ酶解，分离到大约为1.4Kb的猴EPO编码DNA。此外还分离到大约为4.0Kb的PBR322的HindⅢ/SalI碎片。从M13mp  10RFDNA（P和L实验室）中分离出大约为30bp的ECORI/SalI“连接子”（LinKer）碎片。这个连接子包括，按顺序说，一个ECORI粘性末端，接着是SstI，SmaI，BamHI和XbaI识别位点以及一个SalI粘性末端。将上述3个碎片连接起来，得到一个大约为5.4Kb的质粒中间体（“PERS”），其中的EPODNA的一侧靠着一个有用的限制性核酸内切酶识别位点“库”。然后用HindⅢ和SalI对pERS进行酶解，得到EPO  DNA以及以ECORI到SalI（M13mP10）的连接子。将1.4Kb的碎片去与PBR322的大约40Kb的BamHI/SalI的序列以及另一个也含有约30bP的M13mP10HindⅢ/BamHI的复制型（RF）片段连接子相互连接。M13连接子片段的特点是有一个HindⅢ粘性末端。接着有PstI，SalI，XbaI识别位点和一个BamHI粘性末端。这个连接的产物再度是一个有用的质粒中间体（“pBR-EPO”）：在EPO  DNA的两侧都有限制性位点库的。

选择用来在COS-1细胞中进行EPO  DNA表达的载体（“pDSVLI”）已经预先建成，它可以在大肠杆菌（E.COli）中进行自动复制和人工选择。这些特征是由于有复制起点和有pBR322的从2448位到4362位核苷酸区域中存在的氨苄青霉素抗性基因DNA序列所提供的。这个序列由于插入了一个连接子而结构上受到修饰，该连接子提供了一个在它合并到载体之前就已有的、紧邻着2448位核苷酸的HindⅢ识别位点。在所选择的载体的还有一个有用性质，即是在COS-I细胞中有自动复制的能力，以及它在哺乳类的细胞中存在着一个病毒的启动序列的功能。这些特征是由于有DNA的复制起点以及有病毒的晚期基因（Late  gene”）的启动子序列才能具备的。这个启动子是动物病毒SV40基因组的跨越5171至270核苷酸（Spanning  nucleo  tide  numbers5171through270）的342个SP的DNA序列。在载体中有一个唯一的限制性位点（BbmHI），而且通过使用一个商业上可得到的连接子序列。（Collaboratwe  Research）紧跟在一个病毒启动子序列旁边。在载体中还插入了一个237个碱基对的序列（由SV40的由核苷酸序号为2553到2770的一般序列到衍生而来），这段序列含有编码病毒晚期基因的MRNA的多聚脲苷酸信号（通常被认为是转录终止子）。这个碎片通过独特的BamHI位点以正对着病毒“晚期基因”启动子的正确方位定位于载体中。在载体中，在病毒的启动子和终止序列之间，还存在着另一个哺乳类基因，它的位置对于在唯一的BamHI位点上插入的基因的潜在转录不是至关重要的〔哺乳类基因还包括从质粒pMG-I中分离出来的大约有2500碱基对的小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）的小基因，如Gasser等人，P.N.A.S.（U.S.A）第79期，第6522～6526页（1982）。〕再者，质粒pDSVLI的主要有效组分包括与核苷酸5171到270（342个碱基对）一起的pBR322的从2448到4362核苷酸和SV40DNA的从2553到2770（237bp）的核苷酸。

以下的过程，例如在Maniatis等人，SuPra的文章中，描述了EPO-编码DNA，以BamHI碎片从质粒pBR-EPO中分离出来，并且连接到用BamHI切开的pDSVLI质粒中。使用了限制性酶谱分析，确定了EPO基因在两个杂交了的克隆的载体（复制性载体H和L）中是以正确的方向插入的。参见说明pDSVL-MKE质粒的图2。在错误方向带有错误插入方向的EPO基因的载体被保留起来，用作为转染实验中的负对照，设计这种实验是为了测定带有正确方向的EPO  DNA的载体转化后在宿主中的EPO表达水平。

将载体H，L，F，X和G载体（Carrier）DNA（小鼠肝或脾的DNA）结合，并用磷酸钙微沉淀方法转染60毫米的复印平板。60毫米复印板也用载体DNA转染，这是转化作用的，“模似的”负对照组。五天以后，对所有的培养物进行测定，检出培养物中存在着具有天然EPO免疫学活性的多肽。

实施例7

A、包括COS-I细胞的EPO的起始表达体系

为起始而选择的微生物合成出有可分离量的、由人基因组DNA  EPO克隆所编码出来的人EPO多肽物质的体系，也包括在哺乳类宿主细胞即（COS-I细胞，美国培养物样本收集中心〔A.T.C.C.〕CRL-1650号）中的表达。人类EPO基因第一次地被亚克隆（Sub-Cloned）“穿梭”载体中。该载体是即能在大肠杆菌（E.Coli）宿主中（由于存在着pBR322的DNA）也能在哺乳类细胞株COS-I中（由于存在着SV40病毒衍生DNA）进行自动复制。接着含有EPO基因的穿梭载体，被转染到COS-I细胞中。在转染的细胞中产生EPO多肽物质，并且分泌到细胞培养液中。

具体地讲，表达载体是按照以下的过程制造的。从λ克隆λhE1中分离出DNA，λhE1含有人类基因组的EPO基因，用BamHI和HindⅢ限制性核酸内切酶进行酶解，分离出含有已知整体EPO基因的5.6Kb的DNA碎片。这个碎片与细菌质粒PU  C8（Bethesda  Research  Laboratoris，Inc.）相混合并连接，该PU  C8质粒已同样地进行酶解，两者相连接于是就形成了一个质粒中间体“PUC8-HuE”。这个质粒中间体为上面那个限制性碎片提供了方便的来源。

选择用来在COS-I细胞中表达EPO  DNA的载体（pSV4SEt）已预先制成。pSV4SEt质粒含有能在大肠杆菌（E.Coli）中自动复制和被人工选择的DNA序列。这些特征是因为有复制起点以及有跨在PBR322质粒的2448-4362核苷酸上的抗氨苄青霉素基因的DNA序列。这个序列由于加入一个连接子而在结构上被修饰了，该连接子提供了一个紧邻着核苷酸～2448的HindⅢ识别位点。质粒pSV4SEt也能在COS-1细胞中自动复制。这个特征是因为有一个含有SV40病毒DNA的复制起点的342个碱基对的片段（核苷酸数目5171经过270）。这个碎片由于加入了一个提供出相邻于核苷酸270的一个ECOR1识别位点的连接子和一个在核苷酸5171相邻处提供了一个Sal1识别位点的连接子而被修饰了。在这个载体中还存在着一个SV40（1061bp的片段）（核苷酸第1711到2772号加上一个在邻近第2772号核苷酸处提供了一个Sal1的识别位点的连接子）。在这个碎片之内，有一个唯一的BamH1识别序列。总之，质粒pSV4SEt含有一个唯一的BamHI和HindⅢ的识别位点，使人EPO基因可以插入，并可以通过这个质粒而大肠杆菌中进行复制和选择以及在COS-1细胞中进行复制。

为了将EPO基因插入到pSV4SEt中，将质粒pUC8-HuE用BamHI和HindⅢ限制性核酸内切酶进行酶解，并且分离出了5.6Kb的编码EPO的DNA片段。对pSV4SEt也用BamH1和HindⅢ进行酶解，并且，分离出了主要的2513bp碎片（保护了所有必要的功能）。将分离出的这两种碎片混合并且进行连接反应，制出了最终载体“PSVgHUEPO”（见图3）这个载体在大肠杆菌中繁殖，并且可以将载体DNA分离出来。使用限制性酶进行酶谱分析以确证EPO基因的插入。

质粒pSV_gH_uEPO被用于在COS-1细胞中表达人EPO多肽物质。具体地讲，pSV_gH_uEPO DNA与载体DNA相结合，并且转染到一式三份的有COS-1细胞的60毫米培养平板中。作为对照，将载体DNA单独转染到COS-1细胞中。细胞培养基在5天和7天后取样，以检验是否具有天然人类EPO免疫学性质的多肽存在。

B、包括COS-1细胞的第2种EPO表达体系，

为了提供人类EPO多肽物质的改进生产方法，还设计了另一个体系，这些物质是由在COS-1细胞中的人基因组DNA  EPO克隆所编码而产生的（A.T.C.C.NO·CRL-1650）。

在前边的那个体系中，EPO是用它自身的在5.6KbBamHI到HindⅢ限制性碎片中的启动子在COS-1细胞中表达的。在以下的制造中，变换了EPO基因，因此它是用SV40晚期启动子表达的。

具体地讲，克隆了的5.6Kb  BamHI到HindⅢ人EPO基因组的限制性碎片是用以下的过程进行修饰。如上所述，质粒pUC8-HuE用BamHI和BStEⅡ限制性核酸内切酶剪切。在5.6Kb的EPO基因内，BStEⅡ是在这样的位置进行剪切的：即在5′方向距离编码多肽前体的起始ATG为44个碱基对处和在pUC8-H_μE用BamHI和BstEⅡ限制性核酸内切酶剪切。在5.6Kb的EPO基因内，BstEⅡ是在这样的位置进行剪切的：即在5’方向距离编码多肽前体的起始ATG为44个碱基对处和在3’距HindⅢ限制性位点大约680个碱基对处。分离到大约4900碱基对的碎片。一个人工合成性的含有SalI和BstEⅡ粘性末端和一个内部BamHⅠ识别位点的连接子DNA碎片，已被合成并且提纯了。将这两种碎片混合并与一个已被SalI和BamHI剪切产生出质粒中间体pBRgHE的pBR322质粒相连接。人基因组EPO基因可以从其中分离出来，作为一种4900碱基对的BamHⅠ酶解碎片，这个碎片带着一个有ATG44碱基对。由3’贴近到氨基终端编码区域的BamHⅠ位点上的完整的结构基因。

这个碎片作为一个BamHI碎片被分离出来并且插入到BamHI剪切的表达载体质粒pDSVLI中（如实施例6所述）。结果获得了质粒pSVLgHuEPO，如图4所示，这个质粒被用来从COS-I细胞中表达EPO多肽物质，如实施例6和7A所述。

实施例8

实施例6的6种转染的COS-1细胞生长的培养物用放射性自显影按照实施例2的B部分的程序进行分析。每种样品用250，152，50和25微升的等分水平进行测定。先制备用带有以不正确方向插入的EPO基因的载体转染或模拟转染的生长细胞中来的上清液，把这类上清液对EPO的免疫活性定为阴性。再制备用带有以正确方向插入的EPODNA的载体（H和L）所转染的COS-Ⅰ生长细胞得出的两种上清液，在每种的样品中，结合到抗体上的¹²⁵I-EPO的抑制作用的百分数（%）范围是72～88%，它将全部的数值都定在标准曲线的顶部。培养物上清液中EPO的确切含量不能够可靠地测定出来。然而，从最大的一份样品（250微升）计算出的数值所做的相当保守的估计是300毫单位。

对根据实施例6配备的一种有代表性的培养液以及根据实施例7A获取的5天和7天培养液，分别用放射性免疫测定法（RIA）进行了检测，将重组的猴EPO物质和重组的人的EPO物质与标准天然人类EPO的活性进行比较，结果以图的形式列于图1。简言之，揭示出的结果正如所期望地那样：重组的猴的EPO物质显著地与抗人EPO的抗体竞争，尽管在测试条件下它还不能完全地对结合进行抑制。然而，对于重组人EPO的最大抑制百分值与人EPO的标准值已非常接近。剂量反应曲线互相平行的性质暗示出常见序列（抗源决定部位epitopes）的免疫学性质是相同的。早先对组织培养液中猴EPO的测定，在这些较高稀释水平下又一次进行估评，发现其范围是2.91到3.12μ/ml（单位/毫升）。再估计的人EPO的生产水平，在5天生长的样品中为392毫单位/毫升，而7天生长样品为567毫单位/毫升。在实施例7B的表达体系中，估计出的猴的EPO的生产水平是同一数量级或更高一些。

实施例9

根据实施例6和7制备的培养液，对EPO活性按照GOldwasser等人，Endocrinology，第97，2期，第315～323页（1975）的方法，进行体外分析。受试培养液的猴的EPO估计值的范围是由3.2至4.3单位/毫升。在这个体外分析中，人的EPO培养液也是有活性的，进一步，这个活性可以用抗EPO的抗体使之中和。又对根据实施例6制备的重组的猴的EPO培养液，进行了体内生物学活性测试，所依据的方法是COtes等人，Nature第191期，第1065～1067页（1961）和Hammond等人，Ann.N.Y.ACad.SCi。第149期，第516～527页（1968）的一般方法，其活性水平的范围是在0.94至1.24单位/毫升之间。

实施例10

在前面的实施例中，重组的猴的或人的EPO物质，是从用于转染COS-1细胞的载体中生产的。这些载体在COS-1细胞中复制，因为在细胞中存在着SV40T抗原，以及在载体上有SV40的复制起点。虽然这些载体在COS-1细胞中能产生出有使用价值数量的EPO，但这种表达还只是暂时的（7至14天），因为载体最后还是损失了。此外，用载体转染的COS-1后，只有很少百分数的COS-1变为生产性的细胞。本实施例描述了使用中华仓鼠卵巢（CHO）DHFR细胞和可选择的标记物：DHFR的表达体系。（对于相关的表达体系的讨论，参见美国专利4399216号和欧洲专利申请117058，117059和117060号，全在1984年8月29日公开。）

Urlaub等人在Proc.Nat.ACad.SCi（U.S.A.），第77卷，第4461页（1980），上指出，CHO的DHFR细胞（DuX-B11）CHOK1细胞缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR），由于结构基因发生了这种突变，因此在培养基中要加入甘氨酸，次黄嘌呤，以及胸腺嘧啶。质粒pDSVL-MKE（实施例6）或pDSVL-gHuEPO（实施例7B）与载体DNA一起被转染到CHO  DHFR-细胞中，该细胞生长于含有次黄嘌呤，胸腺嘧啶，以及甘氨酸的60毫米培养平板上。又将质粒pSVgHuEPO（实施例7A）与质粒PMG2相混合，质粒PMG2含有已克隆在细菌质粒载体pBR322中的一个小鼠二氢叶酸还原酶基因（根据Gasser等人，上述）。这种质粒混合物和载体DNA一起被转染到CHO  DHFR-细胞中。（已获取了一个质粒的那些细胞一般还要获取第二个质粒。）三天之后，将细胞用胰酶消化再散布到数个100毫米的缺少次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养平板上，在这种培养基中，只有那些被DHFR基因，接着被EPO基因稳定转化了的细胞可以存活下来。在7到21天之后，存活下来的细胞菌落变为明显。这些转化的菌落在被胰酶消化分散后，仍就可以在缺乏次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中繁殖，制造出新的细胞系（例如CHOpDSVL-MKEPO，CHOpSV_gH_u-EPO，CHO-pDSVL_gH_uEPO）。

自上述细胞系中来的培养液用放射性自显影测定法检查重组的猴或人的EPO的存在。CHOPDSVL-MKEPO系的培养基含有EPO，该EPO的免疫学性质与从用质粒pDSVL-MKEPO转染的COS-1细胞中所获的免疫学性质相同。一个有代表性的，65小时的组织培养液所含的猴的EPO浓度为0.60单位/毫升。

从CHOpSV_gH_uEPO和CHOpDSVL-gH_uEPO来的培养液，含有重组的人的EPO，该EPO的免疫学性质与从用质粒pSV_gH_uEPO或pDSVL-_gH_uEPO转染的COS-1细胞中所获的免疫学性质相同。用放射性自显影测定，一种有代表性的由CHOpSV_gH_uEPO来的3天的组织培养液中含有的人的EPO的浓度为2.99单位/毫升，而从CHOpDSVL-_gH_uEPO来的5.5天的样品所含的人的EPO则为18.2单位/毫升。由上述细胞系所生产的EPO的量，可以通过基因放大作用而提高，得到具有更大生产能力的新细胞系。二氢叶酸还原酶（DHFR）是由DHFR基因编码的，它可以被氨甲蝶呤药物（MTX）抑制。具体地说，在缺乏次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中繁殖的细胞，可以被MTX抑制或杀死。在适宜的条件下（例如MTX为很小量时）能够获得在MTX中生长并对MTX有抗性的细胞。发现的这些对MTX有抗性的细胞，因为它们的一些DHFR基因发生了放大作用，结果就提高了DHFR酶的产生量。然后，再对存活的细胞用更高浓度的MTX处理，其结果是在细胞系中含有更大数量的DHFR基因。也经常发现那些有DHFR基因的表达载体上的带着的一些“过客基因”（“Passen-gergenes”）或者被DHFR基因转化的载体上带着的一些“过客基因”的基因拷贝数有增多的现象。

作为实践这个放大体系的实施例，细胞系CHOpDSVL-MKE是受到升高MTX浓度（OnM，30_nM，和100_nM）的良好实验对象。从放大作用的每一步中所取出的有代表性的65小时培养物样品，受到放射性免疫测定法的检测，其含量分别被确定是060，2.45和6.10单位/毫升。细胞系CHOpDSVL-_gH_uEPO经一系列升高浓度的MTX溶液处理，即浓度为30_nM，50_nM，100_nM，200_nM，1_μM和5_μM，MTX。从100nMMTX这一步所取的有代表性的三天培养物样品，用放射性免疫测定法判定它含有的人的EPO为3089±129单位/毫升。从100nm和1umMTX步骤中所取出的有代表性的48小时培养物样品，用放射性免疫测定法测定，它们各自所含的人的EPO量为466和1352单位/毫升（一式三份的平均值）。在这些过程中，将1×10⁶个细胞放到60毫米培养盘上的5毫升培养液中。24小时之后，去除培养基，并用5毫升不含血清的培养基代替（高浓度葡萄糖DMEM，补充以0.1毫摩尔非必须氨基酸和L-谷酰胺）。使EPO在不含血清的培养基中积累48小时。收集培养物以进行放射性免疫测定分析，细胞经胰酶消化并计数。生长在100nm和1μMMTX中的样品的放射免疫测定的平均值，分别为467单位/毫升和1352单位/毫升，提供的实际产量为2335单位/板和6750单位/板。每板的平均细胞个数分别为1.94×10⁶和3.12×10⁶。这些培养条件的有效生产率即是1264和2167单位/10⁶个细胞/48小时。

在上面刚刚描述过的培养基中的细胞，是遗传上不均一的群体。在为了分离出最高生产能力的遗传上均一的菌落的尝试中，使用了标准的筛选过程。参见“对考虑用于生产生物制品的细胞株的特征化时的要点”一文，第2部分，A节，（“POintsto  Considerinthe  Characterizationof  CellLines  Used  toProduce  Biologies”）1984年6月1日，生物研究评论办公室，药物及生物制品中心，美国粮食和药物管理委员会。

上述的CHO细胞株的生产EPO的能力可以采用适当的组织培养技术而加以改进。哺乳类细胞在培养基中的繁殖，一般要求在生长培养基中含有血清。又有一种方法，它可以用那些在从不含有血清的培养基中的生长的CHO细胞来生产促血红细胞生成素。用这种方法，很容易从培养物中提纯促血红细胞生成素。下面将要介绍的是能够很经济地采用不含血清的培养基来生产促血红细胞生成素的方法，用这种方法形成的促红细胞生成素的产量较大，大到足以进行生产。

CHOpDSVL-_gH_uEPO品系的细胞，在标准的细胞培养条件下生长，再用来接种到旋转细胞培养烧瓶中。该细胞以细胞悬浮液的形式在旋转细胞培养瓶中繁殖，其中的培养基为含有50～50的高浓度葡萄糖DMEM和Ham′SF12的混合物并补充了5%牛胎儿血清，L-谷氨酰胺，青霉素和链霉素，0.05毫摩尔非必需氨基酸和适当浓度的氨甲蝶呤。悬浮细胞培养物能使产生EPO的CHO细胞很容易地扩展成为更大的体积。在悬浮液中生长的CHO细胞可用来在旋转的摇瓶中接种，在含有200毫升培养基的摇瓶中，起始的接种浓度为每850平方厘米上有1.5×10⁷个细胞。细胞生长三天之后，汇集成粘在一起的细胞株，在这个生长阶段所用的培养基与在悬浮液生长中所用的相同。在三天的生长期的末尾，去除含血清的培养基，用100毫升不含血清的培养基进行取代;50～50的高浓度葡萄糖DMEM和补充有0.05毫摩尔的非必需氨基酸和L谷氨酰胺的Ham’s F12的混合物。将旋转摇瓶放回到摇瓶保温器中再旋转摇动1至3小时，并再次去除培养基，再以100毫升的新鲜的不含血清的培养基取代。用不含血清的培养基进行这1至3小时的保温，减少了污染性血清蛋白质的浓度。将摇瓶放回到摇动保温器中再培养7天，在此期间内，在上述不含血清的培养基中不断地积累促血红细胞生成素。在7天的生产期末尾，去除改善过的上述培养基，并再用新鲜的不含血清的培养基取代之以进行生产的第二次循环。作为实践以上这种生产体系的，作为有代表性的不含血清培养基的一个实施例子，对此例于7天后的样品，用放射性免疫测定法检测，测出所含的人类促血红细胞生成素为3892±409单位/毫升。基于所估计的细胞浓度为0.9-1.8×10⁵个细胞/平方厘米，则每个底面积为850平方厘米的摇瓶中含有0.75～1.5×10⁸个细胞，这样，生长7天后，EPO在与100毫升培养基中的生产率为750-1470单位/10⁶个细胞/48小时。

对于在10_nMMTX中，CHOpDSVL-MK EPO细胞系来的培养液，应当采用放射性免疫测定法检测EPO在体外和体内的生物活性。经放射性免疫测定法测定，改善了的培养基样品含有41.2±1.4单位/毫升的MKEPO，用体外生物学活性检测法测出的活性为41.2±0.064单位/毫升，用体内生物学活性检测法测出的生物学活性为425±5单位/毫升。对多肽产物进行的氨基酸序列分析揭示了存在有EPO产物，但在靠近推定的氨基末端的丙氨酸处带着一个有三个氨基酸残基的“先导”序列。关于这个特点，目还不清楚究竟它是先由于CHO₄细胞中的膜对于多肽的不正确的加工所致或是反映出了人的EPO相比与猴的EPO在氨基末端结构上的差异。

对从CHO pDSVL-_gHu EPO细胞系的培养液进行了三种检测。对于一个5.5天的样品，用放射性免疫测定法检测。第一种对培养基中所含的重组人EPO进行检测，其水平是18.2单位/毫升;第二种在体外进行检测，其结果为15.8±4.6单位/毫升;第三种是在体内进行检测，其结果为16.8±3.0单位/毫升。

对于逐步加入100nM MTX而放大，从而制备的CHO pDSVL-_gH_uEPO细胞中所获的培养液，也进行了三种检测。用放射性免疫法对一个30天的样品进行测定，培养液所含的重组人类EPO的水平为3089±129单位/毫升，体外检测为2589±71.5单位/毫升，体内检测为2040±160单位/毫升。对这个产物的氨基酸进行序列分析，测得了一个相应于表Ⅵ中所设计的氨基酸末端。

把在10_nM MTX中被质粒_pDSVL-MKE转染了的CHO细胞中而来的改善了的细胞培养基收集到一起来，并且经几天的时间将MTX透析出去，结果在培养基中EPO的活性为221±5.1单位/毫升（EPO-CCM）。为了确定在正常Balb/c小鼠中EPO-CCM对血细胞比容的体内效应、进行了以下的实验。从未被转染的CHO细胞（CCM）和从EPO-CCM中来的改善了的细胞培养基，被用PBS调整。CCM用于对照组（3只小鼠），而对实验组（2只小鼠/组），使用了2种剂量水平的EPO-CCM，即每次注射4单位和每次注射44单位。在历时5周的期间内，对7只小鼠进行腹膜内注射、每周3次。在第8次注射后，对照组的平均血细胞比容被确定为50.4%;对于4单位组，为55.1%;对于44单位组，为67.9%。

哺乳类细胞的实质上已纯化了的表达产物可以很容易地从组织培养的培养基中用高效液相层析HPLC（C₄）获得。层析中使用了梯度浓度的乙醇溶液，并以在pH值等于7时为较好。

对不同来源的EPO来源所产生的重组糖蛋白产物，使用Westevn杂交印迹分析法及SDS-PAGE电泳法进行分析，以便对比并初步确定它们的特性。已经对人EPO基因在COS-1细胞及CHO细胞中表达的改良过的培养基中产生的重组糖蛋白产物及人尿中分离到的EPO进行了比较。这些研究指明，CHO产生的EPO物质，比cos-1的表达产物的分子量高一些，而后者又比从收集人尿中到的提取物的分子量要大一些。所有的物质都有些不均一性。用唾液酸苷酶处理，去除上述糖蛋白中的唾液酸残基，结果是cos-1和CHO的重组产物具有相等的分子量，显然它们都比所获的asialo人尿提取物的分子量大。用糖苷内切酶F（EC3、2、1）处理重组CHO产物和人尿提取产物（以从两者中完全去除碳水化合物），结果得到了分子量特性基本相同的实质上均一的产物。

对纯净的人尿EPO和根据本发明由CHO细胞生产的重组EPO进行了碳水化物分析、所依据的方法是Ledeen等人在Methed in Enzymology，第83期（D部分），第139～191页（1982）上的方法作为，Nesser等人，Anal Biochem.，第142期，第58～67页（1984）的水解过程的修改方案进行分析。对尿分离物进行的实验性测定碳水化合物的组分值（以产物中碳水化合物的分子比率表示）的结果如下所示：己糖，1.73;N-乙酰葡糖胺，1;N-乙酰神经氨酸，0.93;岩藻糖，0;N-乙酰半乳糖胺，0。而相应的重组产物：（由CHO pDSVL-g_Hu，EPO细胞株生长三天的培养物中在100毫摩尔MTX中形成的产物）的数值则如下所示：己糖，15.09，N-乙酰葡萄糖胺，1;N-乙酰神经氨酸0.998;岩藻糖，0;N-乙酰半乳糖胺，0。这些发现与上述的Western印迹分析和SDS-PAGE分析相一致。

本发明所提供的糖蛋白产物，可以理解为这样的一种综合的产物，它所具有的蛋白质的一级结构构象就象是天然促血细胞生成素的一级结构构象的复本，因而使产物也能够具有一种或更多种的生物学活性，但是它又具有一种平均起来说与天然促血红细胞生成素的碳水化合物组分不同的组成。

实施例11

本实施例介绍由核苷酸经人工的全合成过程，制备出两种EPO介绍编码出结构基因的方法。合成的基因是编码在表Ⅵ中的人EPO蛋白质产物的结构基因。合成时根据EPO的氨基酸序列选择基因表达所在的生物（指大肠杆菌或啤酒酵母S·Cerevisiae）对编码多个氨基酸所偏爱的密码子来构成两种EPO结构基因。另外，还介绍了建造编码人EPO类似物的基因的过程。简言之，所用的方案是在前边Alton等人（Wo83/04053）所提到的申请中所列举的。所设计的基因是为了把开始时形成的寡聚核苷酸部件装配成为多个双螺旋，然后再把它们组装成三个分离的部分、这些部分的设计是准备放大作用的，并且当从放大体系中取出时，它们能够按顺序地装配或通过一个多片段，的连接而成为一个适合的表达载体。

以下的表Ⅷ到表ⅩⅣ，解释了一种人造基因的设计和装配。该基因编码一种人类EPO的翻译产物，该产物设有先导序列或前序列（Preseqμence），但是在1位上有一个起始甲硫氨酸残基。然而，该基因掺入到大肠杆菌所偏爱的密码子的实质性部分，因而，该建造被称为“ECEPO”基因。

见表Ⅷ到表ⅪⅤ

更具体的讲，表Ⅷ说明的被用来生产编码人类多肽氨基终端残基的ECEPO基因的第1部分寡聚核苷酸。寡聚核苷酸被装配成双螺旋（1和2，3和4等等），然后将双螺旋连接起来，得到如表Ⅸ中的ECEPO第1部分。应当注意，装配成的部分，包括各自终端性的EcoRI和BamHI粘性末端，在EcoRI粘性末端的“下方”是一个XbaI限内酶识别位点;而在BamHI粘性未端的“上方”是一个KpnI限内的识别位点。用M13噬菌体载体可以很容易地将第1部分放大，以证明该部分的序列。当对该部分在大肠杆菌中所产生的复制型RFDNA的XbaI/KpnI碎片进行分离时，遇到了一些困难，这可能由于宿主中KpnI识别位点碱基被甲基化了。因此分离了单链噬菌体DNA，并且用引物延长使其在体外复制变为双链形式，然后就可以很容易地分离出所期望的双链碎片了。

ECEPO基因的第2和第3部分C（表Ⅺ和ⅩⅢ），是分别由表Ⅹ和Ⅻ的寡聚核苷酸以相类似的方式制造的。每个部分均是在可用作证实其序列的M13载体中被放大，并从噬菌体DNA中分离出来。正如表Ⅺ所示，ECEPO的第2部分是用ECoRI和BamHI粘性未端制造的，并且可以作为KpnI/BglⅡ碎片而分离出来。与其相类似，ECEPO的第3部分，是以BamHI和SalI粘性未端制备的，并且可以作为BglⅡ/SalⅠ碎片从噬菌体RFDNA中分离出来。这样制备成的3个部分可以很容易地装配成一个连续的DNA序列（表ⅫⅤ）它编码整个人类EPO多肽。该多肽带有一个氨基未端的甲硫氨酸密码子（ATG）这个密码子是大肠杆菌翻译起始所必需的。还应注意的是，在起始的ATG的“上方”是一系列的碱基对它们实质上复制大肠杆菌的高度表达的OMP-f基因的核糖体结合位点的序列。

任何适宜的表达载体都可以用来携带ECEPO。为表达ECEPO基因所特别选择的载体。是“温度敏感性”的质粒PCFM536，它是质粒PCFM414（美国培养物样本收集中心、40076）的一个衍生物，如同Charles  F·Morris在1984年8月6日提交的共同待批美国专利申请序列号63  727中所描述的那样。更具体的讲，PCFM536是有XbaI和HindIII的作用位点的酶解，分离出大的碎片，用于与ECEPO基因的两部分连接。第Ⅰ部分（XbaI/KpnI），第2部分（KpnI/BglⅡ）和第3部分BglⅡ/SalI）已在先前正确的次序装配在M13中，而且从中分离出的EPO基因是一单个XbaI/HindⅢ碎片。这个碎片包括一个在M13mp9中的跨越SalI到HindⅢ位点的多聚连接器PolyLinker。在最终的表达质粒P536中表达的控制，是通过采用的是λ唾菌体的PL启动子，这个PL启动子本身则可能受C1857阻遇基因（如由大肠杆菌品系K12△Htrp菌株所提供的）的控制。

上面所制造的ECEPO基因可以进行不同的修饰，以编码出各种促血红细胞生成素的类似物，如下面所述的（Asn²，des-Pro²到Ile⁶）hEPo以及〔His⁷〕hEPO

A、〔Asn²，des-Pro²到Ile⁶〕hEPO

质粒536有从XbaI位点到HindⅢ位点插入的，表中的ECEPO人造基因，将质粒536用HindⅢ和XhoI酶解。后一种核酸内切酶切在ECEPO基因上的一个独特的6个碱基对的识别位点上，它跨越了从编码ASP⁸，的密码子的最后一个碱基到编码Arg¹⁰的密码子的第二个碱基。制造了一个有XbaI/XhoI位点的“连接器”Linker序列，此连接器的序列如下：

XbaI/XhoI连接器和XhoI/HindⅢECEPO基因序列的片段被插入到一个大的片段中该大片段来自用XbaI和HineⅢ酶解的质粒PCFM526，它是质粒PCFM414的一个衍生物（A·T·C·C、40076），如由CharlesF·Morris于1984年8月6日提交的共同待批美国专利申请序列号636727中所描述的那样，以产生一个携带特定的DNA序列的质粒。这个特定的序列可以编码出所期望的促红细胞生成素的类似物的，有Met^-1形成式的、大肠杆菌的表达产物。

B、〔HS⁷〕hEPO

如上述A部分一样，用HindⅢ和XhoI酶酶解质粒536。制造出一个XbaI/XhoI连接器，它具有以下序列：

然后将此连接器和XhoI/HindⅢECEPO序列碎片插入到PCFM 526中，以生产一种携带特定DNA序列编码所需要的类似物的Met^-1形式的大肠杆菌表达产物。

建立一个掺入酶母所偏爱的密码子的、人造基因（“SCEPO”）如下表ⅩⅤ至表ⅩⅩⅠ所述的那样。同对ECEPO基因的情况相同，其全部组建工作，包括先形成3套寡聚核苷酸（表ⅩⅤ，ⅩⅦ，和ⅪⅩ，它们再把这三套寡聚核苷酸组成双螺旋产物并装配到各部分上）

（表ⅩⅥ、ⅩⅧ和ⅩⅩ）。应注意的是，这个合成由于使用了一些在SCEPO和ECEPO的组建中都是次级适度的密码子而在某种程度上受到促进。即两种基因的第一部分的7-12寡聚核苷酸是相同的，E如两个基因中第2部分的1-8寡聚核苷酸也相同一样。

见表ⅩⅤ～ⅩⅪ

装配成的SCEPO各部分可置于M13中，再进行序列分析，从M13噬菌体中分离出来的部分1，2，3为HindⅢ/KpnI，KpnI/BglⅡ，和BglⅡ/SalI碎片。

目前较好的SCEPO基因产物的表达体系是与啤酒酵母（S·Cere-visiae）α-因子分泌有关的一个分泌体系，如在GrantA.Bitter于1983年4月22日提交的共同待批美国专利中请序列号487753，并作为欧洲专利申请第0123294号于1984年10月31日公开的申请中所描述的那样。简言之，该体系包括这样的一种组建，即其中编码啤酒酵母α-因子基因产物的是前导序列的DNA，位于5′端紧贴着所要表达的外源基因的编码区中。其结果是，翻译的基因产物包括有一个先导序列或一个信号序列，它们这个信号序列在分泌上述翻译产物的其余部分的过程之中由于一种内源的酵母酶的切削而被“加工除去”。由于这个建造过程使用α-因子翻译的起始（ATG）密码子，所以就不需要在SCEPO基因的1位上提供一个这样的密码子。如从表XⅪ中可以注意到的，丙氨酸（+1）编号序列之前有一个连接器序列、从而可以直接插入到一个质粒中去，该质粒包括接在α-因子启动子之后的α-因子先导序列的第一个80残基的DNA。对于SCEPO基因表达的特别优良的组建过程，包括一个有四个部分的连接作用，其中包括上述的SCEPO部分的碎片，和对质粒用PaC3酶解得到的HindⅢ/SalI大碎片。对所获的质粒PaC3/SCEPO，再用BamHI酶解，分离出α-因子的启动子、先导序列和SCEPO基因。并且连接到用BamHI酶解了的质粒PYE上，以形成表达质粒PYE/SCEPO。

实施例12

本实施例涉及在实施例11的表达体系内，人造的ECEPO和SCEPO基因的重组产物进行的表达。

在使用为应用大肠杆菌宿主细胞而设计的表达体系时，将实施例11的质粒P536转化到大肠杆菌AM7（AM7E·coli）细胞中，该细胞已予先用一个带有C1857基因的适宜的质粒PMW1转化过了。将这些细胞在LB肉汁（氨苄青霉素50微克/毫升、卡那霉素5微克/毫升，最好再有10毫摩尔的MgSO₄）中进行培养，温度保持在28℃，当细胞在培养基中生长到O.D.600＝0.1时则将培养温度升高到42℃而诱导产生EPD的表达。当细胞生长至40O.D.时，EPO的生产量（用凝胶估计）约为5毫克/OD升。

收获细胞、溶胞，用法国压榨器破碎（10000PSi），并用溶菌酶和NP-40去污剂处理。经24000Xg离心所获的水球，再用盐酸胍溶解，并进步再经过一步提纯，用的是C₄（Vydac）反相高效液层板Reverse Phase Hplc（乙醇，0～80%，50毫摩尔NH₄Ac.pH4.5）。蛋白质的序列分析揭示了产物的纯度大于95%，所获的产物揭示了2种不同的氨基末端，A-P-P-R…和P-P-R…，它们相对量的比例为3∶1。对hEPO和〔des Ala〕hEPO产物的这后一种观察，指出了在宿主细胞内氨基终端的“加工”是切除末端的甲硫氨酸以及在某些情况下去除起始的丙氨酸。对分离物的活性用放射免疫法测定，其活性水平为150000至160000单位/毫克;体外测定的活性水平为30000至62000单位/毫克;体内测定的活性范围是120至720单位/毫克、（参看在每一种测定中，人尿分离物的标准，70000单位/毫克。）在体内测定重组产物的课题特性曲线与人尿EPO标准特性曲线明显地不同。

在实施例11的A部分和B部分所生成的EPO类似物的质粒，被分别地转化到PMW1-转化过的AM7大肠杆菌细胞中，并且将细胞按上述方法进行培养。再用放射免疫测定法和体外测定法对纯的分离物进行测定。对〔ASn²，des-Pro²到Ile⁶〕hEPO表达产物的放射性免疫测定及体外测定的值分别大约是11000单位/毫克和6000单位/毫克蛋白质，而对于〔His⁷〕hEPO的测定值分别为大约41000单位/毫克和14000单位/毫克蛋白质，这就指出测定中，促红细胞生成物类似物的产物的“活性”是其“亲代”表达产物的 1/4 - 1/10 。

在使用那个为了选用啤酒酵母（S·cerevisiae）为宿主细胞而设计的表达体系时，质粒PYE/SCEPO被转化到两种不同的品系的酵母中，即YSDP4（基因型αpep4-3trp1）和RK81（基因型ααPeP4-3trp1）中。转化的YSDP4宿主在SD培养基中生长（酵母遗传学方法，冷泉港实验室，冷泉港、纽约，第62页1983）并补充以酪蛋白氨基酸0.5%，PH6.5，30℃。当细胞已生长到360、D、时，收获培养基，所含EPO产物的水平大约是244单位/毫升（97微克/O.D.升，由RIA测定）。转化的RK81细胞当生长至6.50.D或60O.D.时，所得到的培养基中的EPO产物的含量约为80～90单位/毫升（34微克/OD升，由RIA测定）。初步的分析揭示了，在表达体系中生长的产物中，有很显著的不均一性，这好像是因为表达的蛋白质的糖基化情况的不同，以及在相连的碳水化合物中含有相当高的甘露糖所致。

在大肠杆菌（E.coli）HB101细胞中的质粒PαC3和PYE，已根据1984年9月27日美国专利局实施细则，储藏于美国培养物样板收集中心，12301ParKlawnDrive，Rockville，Maryland，储藏号分为别为A、T、C、C、39881和A、T、C、C、39882。在AM7细胞中的质粒PCFM526，在JM103细胞中的质粒PCFM536，以及在JM103细胞中的质粒PMW1也于1984年11月21日同样储存在美国培养物样板收集中心、储存号为别为A、T、C、C.33932，33934和33933。酵母（Saccharom-yces Cerevisiae）品系YSPD₄和RK81也于1984年11月21日储存于美国培养物样板收集中心，储存号分别是A、T、C、C、20734和20733。

考虑上述的说明实施例，就可以很容易地，明显地看出，本发明在它的很多方面，提供了大量特殊优越的有价值的产物和方法。

本发明所提供的多肽，毫无疑问地是有用的物质，而不论它们是微生物表达的产物或是合成的产物都是如此。并且本发明首次使人们了解到促红细胞生成素的一级、二级和三级结构构象。

正如在前边所指出的那样，本发明的重组生产的产物或合成的产物，都在不同的程度上具有天然EPO的体外生物学活性。而且后来可以使用它，以取代那些在组织培养促红细胞生长的培养液中分离出的EPO物质。同样，本发明的多肽产物在相当的程度上具有天然EPO分离物的体内活性，而且毫无疑问，它们适用于包括人类在内的哺乳动物的促血红细胞生成素的诊治过程。使用它能够得到诊治之前的在体内的因EPO产生的任何的或全部的效果，例如，刺激网织红血球细胞的反应，产生亚铁化合物动力学（fer-rokinetic）效应（例如血浆铁转换效应和骨髓转换时间效应），红细胞团的改变，刺激血红蛋白C的合成（参见Eschbach等人，同上），以及如同实例10所指出的，提高哺乳动物的血细胞比容的水平。可用本发明的产物治疗的人们包括，一般需要输血的病人、包括外伤患者，手术病人、肾疾病患者，包括渗析患者，以及各种血液成分紊乱变异的病人，例如血友病，镰刀细胞病，生理性贫血等等。通过使用EPO疗法，可以使对输血治疗的要求降到最小量、结果是传染性物质的输入也被降低。本发明的产物，由于它们的、用重组方法生产这一本质，因而不具有热源，天然抑制物质以及类似物等，并且由于这样，很可能就可以提供出相对天然界衍生物而言，在诊疗过程中更为强化的全面的效力。使用本发明的产物的促血红细胞生成素进行治疗，也被期望于有用于在铁氧环境条件下提高个体的携氧能力，而且可能提供有益的于心血管的效应。

施用本发明多肽产物的一个较好的方法，是用非肠胃道（例如、静脉内、肌肉、皮下和腹膜内注射）的长规途径，所施用的组合物，按常规应当含有治疗的有效剂量的产物并有与之可以相容的一定量的稀释剂，以及还有一定量的载体和/或辅剂与它配伍。初步的药理动力学研究指明，当用猴EPO产物进行肌肉注射时，此药物在体内的半衰期比用静脉注射的更长些，因此有效的剂量根据处理的条件而有所不同。但是，治疗剂量在目前被认为是这样一个范围，即0.1（～7单位）到100（～7000单位微克/每公斤体重活性物质。标准的稀释剂，如人类血清白蛋白，是本发明的药用组合物所期望的，而作为标准的载体，例如盐水。

对本发明的组合物所适用的辅助物质，包括对促血红细胞的刺激性效应而另外提及的化合物，例如，睾酮，子代细胞刺激质，类胰岛素生长因子，前列腺素、血清素，环AMP，催乳激素和三碘甲状腺氨酸，而治疗再生障碍贫血中所用的试剂包括甲基诺龙〔1-甲雄稀醇酮methenolene〕（睾丸酮、双氢睾酮Stanozolol）和（诺龙，苯甲酸诺龙nandrolone）〔参见Resegotti等人，PanminervaMedica，第23期，第243～248页（1981），MCGOnigle等人，Kidney  Int，第25（2）期，第437-444页（1984）;Pavlovic-Kantera等人，EXPt·Hematol，第8（Supp8）期，第283～291页（1980）;和Kurtz，FEBSLetters，第14a（1）期，第105～108页（1982）〕。另外对辅剂而言，是所报导的那些可以提高或协调促血红细胞生成素或asialo-EPO效应的物质，例如，肾上腺素能的促效剂，甲状腺激素，雄激素和BPA（参见Dunn，“Current  Concepts  in  Ery-thropoiesis”，John  Wiley  and  Sons〔Chichester，England，1983〕;Weiland等人，Blut，第44（3）期，第173～175（1982）;Kalmanti，Kidney  Ind，第22期第383～391页（1982）;Shahidi，New·EngJ·Med，第289期，第72～80页（1973）;Fisher等人、Steroids，第30（6）期，第833～845页（1977）;Urabe等人，J·Exp·Med，第149期，第1314～1325页（1979）;以及Billat等人，Expt·Hematol，第10（1）期，第133-140页（1982）〕，另外还有这样一类的化合物，称作“肝促血红细胞生成的因子”〔参见，Naughton等人，Acta，Haemat，第69期，第171～179页（1983）〕和“红细胞调理素”（erythrotropins）〔如Congote等人描述于in  Abstract  364，Proceedings  Tth  Internati-onal  Congress  of  Endocrinology（Quebec  City，Quebec，1984年7月1至7日），Congote，Biochem·Biophys·Res，Comm.，第115（2）期，第447～483页（1983）和Congote，Anal·Biochem.，第140期，第428～433页（1984）〕和“erythrogenins”〔如Rothman等人描述于J·Sury·Oncol，第20期，第105～108页（1982）〕。设计了初步的筛选，以测定过分缺氧的红细胞增多的小鼠的促血红细胞生成素的反应，该小鼠预先用5-α-2氢睾酮或诺龙（苯甲酸诺龙nandrolone）处理过，并且于后给以本发明的促血红细胞生成素，所产生出的结果是含糊的。

本发明的多肽在诊断方面也同样具有广泛的用途，其中包括使用标记或未标记的形式，可以用于不同的免疫测定技术中，包括R1A、EL1SA以及类似方法，同样也可以用于体外和体内活性测定。参见例如、Dunn等人，Expt·Hematol，第11（7）期，第590～600页（1983）;Gibson等人，Path-ology，第16期，第155～156页（1984）;Krystal，Expt·Hematol，第11（7）期，第649～660页（1983）;Saito等人，Jap·J·Med，第23（1）期，第16～21页（1984）;Nathan等人，New··Eng·J·Med，第308（9）期，第520～522页（1982）;以及其中引述的各种有关测定的参考文献。本发明的多肽，包括按照在此首次揭示出的EPO的残基序列合成的合成多肽，也可以为生产多克隆抗体和单克隆抗体“库”提供出很有用的纯净物质，该单克隆抗体专门用于区别EPO的连续或不连续的抗原决定基。作为一个例子，根据Hopp等人，P·N·A·S·（U·S·A·）第78期，第3824～3828页（1981）对水疗性的内容，对表Ⅵ的氨基酸序列进行的初步分析，以及根据Chou等人，Ann·Rev·Biochiem·第47期，第251页（1978）对二级结构的初步分析，揭示了合成的复制，跨越所包括的41～51，116～118，以及144～166位氨基酸残基的连续序列的人工合成多肽，很可能产生出高度的抗原性反应，而且人工合成性的多肽肽和完全蛋白质两者，都可以产生出有用的，有免疫活性的单克隆和多克隆抗体。这样的抗体，有希望在探查及亲和性提纯EPO或EPO的相关类似物的工作中是有用处的。

为了进行说明，制备了以下三种合成的多肽：

使用上述多肽进行初步免疫作用研究，其结果已揭示出对hEPO  41～57有较弱的阳性反应，对hEPO116-128没有可看到的反应，对hEPO144-166有强的阳性反应，以上结果是通过用免血清抗体与125I标记的人尿EPO分离物的免疫沉淀能力的测量而得出的。对这三种合成多肽的体内活性的初步研究揭示了它们单独式结合起来都没有显著的活性。

虽然由说明性实施例所提供的哺乳类EPO氨基酸残基的指定序列已基本上确定了成熟EPO的一级结构构象，但应该这样理解，即在表Ⅴ中猴EPO的165个氨基酸残基的特异性序列和在表Ⅵ中人类EPO的166个残基的特异性序列，并不限制本发明所提供的有用的多肽的使用范围。本发明还包括有各种天然EPO的等位形式的物质，在以往对哺乳类多肽，如人类γ干扰素的生物活性的研究，已指出了它们可能是存在着的。（比较、例如，在欧州专利局公开的申请第0077670号中报导了人类免疫干扰素在其第140位上有一个精氨酸残基。并且Gray等人，Natuxe，第295期，第503～508页（1982）也报导了该种干扰素在第140位上有谷氨酰胺。这两种都以组成“成熟”人类γ干扰素序列为特征。成熟EPO多肽的各种等位形式、可在其多肽序列的长度上和/或其序列中的氨基酸缺失、取代插入或外加相互之间或与表Ⅴ以及Ⅵ中的序列相比有所不同，而其后果则是在糖基化的能力潜伏着的不同的能力。如前所述，一种推定的人类EPO的等位形式，被认为是包括在126位上有一个甲硫酸残基。正如所期望的，编码EPO的DNA基因组和CDNA序列也可能会有天然等位形式。它们编码上述类型的等位多肽、或简单的使用不同的密码子合成出所指定的同样的多肽。

除了成熟EPO的天然等位形式以外，本发明还包括其他的“EPO产物”，例如EPO的多肽类似物以及“成熟”EPO的碎片。遵循上述Alton等人公开申请（WO/83/04053）的过程，人们可以很容易地设计和制造基因，该基因编码在微生物中表达的具有一定的多肽，这种多肽的一级结构构象与在此所述的用于成熟EPO的一级构象相比较，它们在多肽中有一个或多个不同的氨基酸残基，或者它们的某一个以上的氨基酸残基在多肽中的位置不同，例如，有取代作用或在末端和中间部分有外加作用的和缺失作用。另外，CDNA和EPO基因组，可以很容易的由所周知的定位诱变技术而受到修饰，并且用于产生EPO的类似物和衍生物。这样的EPO产物，将至少带有EPO的一种生物学性质，但在其他性质方面则会有不同。例如，本发明所设计的EPO产物，包括那些预先去掉了一部分DNO序列，而产生的缩短了的EPO产物，例如缺失〔Asn²，des-Pro²至Ile⁶hEPO，〔des-Thr¹⁶³至Arg¹⁶⁶〕hEPO和“△27-55hEPO”而缩短的EPO产物，而后者具有缺失了全部外显子的DNA序列所编码的氨基酸残基序列;或者那些对水解更为稳定的EPO产物（并且因而具有比天然EPO更为显著或历时更长的效力）;或者那些被除了一个或多个可进行糖基化作用的潜在位点的EPO产物这可能使得酵母生产的产物有更高的活性）;或者那些一个或者多个半胱氨酸残基被除或被例如组氨酸或丝氨酸残基取代的EPO产物（例如〔His⁷〕hEPO类似物）和那些能以活性形式从微生物体系中很容易地分离出来的EPO产物;或者那些有一个或多个酪氨酸残基被苯丙氨酸所取代的EPO产物（例如〔Phe¹⁵〕hEPO，〔Phe⁴⁹〕hEPO，和〔Phe¹⁴⁵〕hEPO类似物）以及那些或多或少地可容易的结合到靶细胞上的EPO受体上的EPO产物。还包括只是成熟EPO内的部分连续氨基酸序列或二级构象复本的多肽碎片，该碎片可具有EPO的一种活性（例如与受体结合）而缺乏其他的活性（例如促血红细胞生成的活性。在这一方面上特别重要的是那些可能的EPO碎片，在考虑表Ⅵ的人类基因组DNA序列时，它们就被阐明了，即，整个连续EPO序列的个个“碎片”、内含子序列勾画出了它们的轮廓，他们可能组成独特的生物学活性“区域”。值得提及的是，本发明的EPO产物缺少任何一种或多种体内活性这一点，并不能全面地排除它在治疗上的可用性参见Weiland等人，同上）或其在其他领域的可用性，例如在EPO的测定或EPO拮抗作用中的使用。促血红细胞生成素的拮抗作用在治疗红细胞增多症或EPO的生产过盛的症状时可能是很有用的，〔参见，例如Adam-son，HOSP·Practice、第18（12）期，第49～57页（1983），以及Hellmann等人，Clin·Lab·Haemat，第五期，第335～342页（1983）〕。

根据本发明的另一方面，在此处所揭述的编码人和猴EPO多肽的克隆了的DNA序列、对于提供情报来说是有着引人注目的价值，即它们提供了关于哺类促血红细胞生成素氨基酸序列的讯息，而这些讯息是尽管对天然产物的分离物做了数十年的分析性处理，至本发明之前还是无法得到的，这些DNA序列本身也是很有用的产物，在由各种重组技术进行大规模微生物合成促血红细胞生成素时，也同样具有引人注目的价值。从再一个方面来看，本发明所提供的DNA序列在以下的生长中是有用的，即生长新的和有用的病毒或环形质粒DNA载体。新的和有用的转化过或转染过的微生物原核的及真核的宿主细胞（包括细菌和酵母细胞以及组织培养中的哺乳类细胞），及对这样的能够表达EPO和EPO产物的微生物宿主细胞进行生长培养的新的和有用的方法等方面都是很有用的，本发明的DNA序列，对于作为标记的探针使用于分离EPO以及相关的编码哺乳类CDNA基因组DNA序列来说，也同样是引人注目的适宜的材料，所说的哺乳类是指出了在此处专门说明的人类和猴类以外的种类，本发明的DNA序列，在不同的蛋白质合成方法（例如在昆虫细胞中）或在人类和其他哺乳类的遗传学治疗中的使用范围，目前还没有计算出来。本发明的DNA序列被期望在发展出基因转入frausgenic的哺乳类的研究工作中是有用的，这种基因转入的哺乳类细胞有可能成为真核性的“宿主”而生产大量的促血红细胞生成素以及促血红细胞生成素的产物。参见Palmiter等人，Science，第222（4625）期，第809～814页（1983）。

因而，根据这个观点，各个说明性实施例所做的特性描述，明显的不是为了限制本发明的范围，对本专业的技术人员来讲，将会看到大量的修改和其变动。例如，只要本发明的说明实施例提供了DNA序列，就包括了有CDNA和基因组DNA序列，因为本申请提供了供制造DNA序列的氨基酸序列的基本讯息，本发明还包括根据EPO氨基酸序列的知识而建立的人工制造的DNA序列。它们可以编码EPO（如实施例12）以及EPO碎片和EPO多肽类似物即“EPO产物”，而它们又具有天然EPO的一种或多种生物学性质，但不具有或具有不同程度的其他EPO的生物学性质。

本发明所提供的DNA序列，依这样看来，就包括所有原核或真核宿主细胞中适用于保有把握可以表述的DNA序列，所表达的多肽产物带有至少一部分促血红细胞生成素的一级结构构象和其一种或多种生物学性质，并且是自以下的九种序列中选出：（a）在表Ⅴ和表Ⅵ中给出的DNA序列;（b）那个与在（a）中所确定的DNA序列相杂交的DNA序列及其碎片;（c）倘若某序列没有遗传密码的兼并性，与在（a）和（b）中已确定了的DNA序列杂交的这个某DNA序列。在这方面值得提出的是，例如，我们希望存在着的等位的猴和人类EPO基因序列以及其他哺乳类的基因序列与表Ⅴ和表Ⅵ的序列或它们的碎片相杂交。进一步而言，要是没有遗传密码的兼并性，则SCEPO和ECEPO基因，人工制造的或诱变的CDNA，或编码各种EPO碎片和类似物的基因组DNA序列，也都将与上面所提及的DNA序列杂交。如果希望降低杂交作用中非DNA物质引起的背景，可以遵照开始分离猴和人类EPO编码DNA时的杂交条件或采用更严格的条件，在这样的一些杂交条件下，可以顺利的进行上面提到的杂交作用。

与此相类似，当上述实施说明了EPO产物用微生物表达的方案在哺乳类细胞表达插入到细菌质粒和病毒基因组来源的杂交载体中的DNA从而说明微生物表达EPO产物时，则大量的各种的表达体系都已包括在本发明的仔细推论的计划之中了。所包括的引人注目的是这样一些表达体系，即包括将来自同源的用于各种不同的细菌、酵母以及在组织培养中的哺乳类细胞中的载体的表达体系，同样也还包括不含有载体的表达体系（例如细胞的磷酸钙转染）。在这一点上，将应该理解的是，对例如猴来源的DNA在猴宿主细胞组织培养中和培养中的人宿主细胞所进行的表达，实际上已构成了“外源的”DNA表达实例，因为被探求获得高水平表达的EPODNA，在其宿主的基因组中具有其自身的起源。本发明的表达体系还进一步计划了这样的一些实践，其结果是EPO产物的细胞质形成作用，和在宿主的细胞质或膜中（例如积累细菌外周腔中，积累糖基化的和非糖基化的EPO产物或如上所说明的那积累于组织培养基的上清液中，或者是积累在相当少见的体系中，例如P.aeYuginosa表达体系（Gray等人在Biotechnology，第2期，第161～165页（1984）中所述。

本发明改进的杂交方法，很明显的可用于上述的DNA杂交筛选中，同样也可以用于RNA/RNA和RNA/DNA筛选。如在此所说明的混合探针技术，一般性地组成了杂交过程中的一些改进，以使多核苷酸的分离更为迅速和可靠，这许多方法上的改进包括，菌落的转移和保持的方法;用尼龙基质的滤膜，例如基因筛（Gene  Screen）和基因筛正型（GeneScreen  Plus）可以使用一个滤膜重新与探针再杂交，并且这个滤膜可以反复使用新的蛋酶处理〔与例如Taub等人，Anat、Biochem，第126期，第222～230页（1982）相比较〕;使混合数量大例如（超过32种）的至而每单种的浓度很低（约为0.025微微摩尔）的混合探针;在严格的温度条件下进行杂交和杂交后的各步骤，该温度是接近于（即只在4℃之内，更好的是只在2℃内）所使用的混合探针内的任何一种的最低解离温度的计算值。将这些改进之处都结合起来，可能得在使用它们时所未曾预料的结果。这一点可由这样的事实充分地给以解释，即使用了相当于以前报导过的曾被成功的使用过的探针量的四倍量的混合探针在CDNA对富集度报低的UMNA的探授工作中已成比地在1500000个噬菌体的噬菌斑基因组文库中筛选，分离出独一的序列基因。这项工作的成功完成，基本上与上面Anderson等人发表的所考虑的想法同时发生，而他们却认为混合探针的筛选方法是“在相应的RNA不可能获得的时候，分离哺乳类蛋白质的想法是不切实际的”。

在上述说明书中所披露的各种特征，在以下的给出的要求和/或附图中，无论是以单独或者以任何结合的方式，都可能是成为从各种形式实现本发明的重要材料。

本申请涉及的11个培养物已于1991年6月26日补充保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），培养物的名称及其ATCC和CCTCC对应的保藏号列出于下：

质粒pCFM526  ATCC  No.39932  CCTCC  No.M91076

质粒pMW1  ATCC  No.39933  CCTCC  No.M91077

质粒pCFM536  ATCC  No.39934  CCTCC  No.M91078

S.cere  YSPD4  ATCC  No.20734  CCTCC  No.M91073

S.cere  RK81  ATCC  No.20733  CCTCC  No.M91072

质粒  pα  C3  ATCC  No.39881  CCTCC  No.M91074

质粒  pα  YE  ATCC  No.39882  CCTCC  No.M91075

λ噬菌体λ  HEI  ATCC  No.40381  CCTCC  No.M91080

质粒pMKE83  ATCC  No.67545  CCTCC  No.M91082

质粒  pCFM414  ATCC  No.40076  CCTCC  No.M91079

杂种瘤5  F12  AD3  ATCC  No.HB8209  CCTCC  No.C91013

Claims (27)

1、含多肽的药物组合物的制备方法，该方法包括将有效量的多肽与药物上可接受的稀释剂、辅助剂或载体相混合，其特征在于所述多肽具有天然促血红细胞生成素的部分或全部一级结构构象和一种或多种生物学性质。

2、按权利要求1的方法，其中制备所述多肽的方法包括：在适宜的营养条件下，培养由含下列DNA顺序的DNA载体转化或转染的原核宿主细胞或真核宿主细胞和分离出表达所述载体中DNA顺序所需的多肽产物，所述DNA顺序选自：

（a）下列的DNA顺序以及它们的互补链：

猴EPO  cDNA的顺序

（b）与（a）中定义的DNA顺序或其片段杂交的DNA顺序;

（c）如果没有遗传密码简并，则与（a）和（b）中定义的DNA顺序杂交的DNA顺序。

3、按权利要求2的方法，其中分离出的多肽不与任何哺乳动物蛋白相结合。

4、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序是cDNA顺序。

5、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序是人工合成的DNA顺序。

6、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序是基因组DNA顺序。

7、按权利要求2的方法，其中载体是自主复制的环状DNA质粒或病毒载体。

8、按权利要求2或3的方法，其中分离出的多肽具有如权利要求2（a）的λhEl核苷酸顺序或其任何天然的等位基因变体的人促血红细胞生成素的部分或全部一级结构构象。

9、按权利要求2或3的方法，其中分离出的多肽具有如权利要求2（a）的猴EPO  cDNA顺序或其任何天然等位基因变体的猴促血红细胞生成素的部分或全部一级结构构象。

10、按权利要求2或3的方法，其中分离出的多肽具有天然促血红细胞生成素的免疫学性质。

11、按权利要求2或3的方法，其中分离出的多肽具有天然促血红细胞生成素的体内生物活性。

12、按权利要求2或3的方法，其中分离出的多肽具有天然促血红细胞生成素的体外生物活性。

13、按权利要求2或3的方法，进一步包括分离出的多肽与可检测的标记物质共价结合的步骤。

14、按权利要求12的方法，其中所述可检测的标记是放射性标记。

15、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序包括一个或多个能在大肠杆菌细胞中最佳表达的密码子。

16、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序包括一个或多个能在酵母细胞中最佳表达的密码子。

17、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序编码表达人促血红细胞生成素。

18、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序包括下列ECEPO基因的蛋白编码区：

19、按权利要求2或3的方法，其中DNA顺序包括下列SCEPO基因的蛋白编码区：

20、按权利要求1或2的方法，其中DNA顺序编码[Phe¹⁵]hEPO，[Phe⁴⁹]hEPO，[Phe¹⁴⁵]hEPO，[His⁷]hEPO，[Asn²去-Pro²至Ile⁶]hEPO，[去-Thr¹⁶³至Arg¹⁶⁶]hEPO，或[△27-55]hEPO。

21、按权利要求2或3的方法，进一步包括产生糖蛋白产物的步骤，该糖蛋白具有充分复制天然促血红细胞生成素的一级结构构象，从而具有其一种或多种生物学性质并且还具有不同于天然促血红细胞生成素的平均碳水化合物组份。

22、按权利要求21的方法，其中糖蛋白产物具有充分复制天然人促血红细胞生成素一级结构构象，从而具有其一种或多种生物学性质，并且还具有不同于天然人促血红细胞生成素的平均碳水化合物组份。

23、按权利要求2的方法，其中宿主细胞是在体外能连续繁殖的脊椎动物细胞，并用放射免疫测定法测定，其经培养生长，在48小时内，在其生长的培养基中，每10⁶个细胞产生100单位以上的促血红细胞生成素。

24、按权利要求23的方法，其中脊椎动物细胞在48小时内，每10⁶个细胞能产生500单位以上的促血红细胞生成素。

25、按权利要求24的方法，其中脊椎动物细胞在48小时内，每10⁶个细胞能产生1000单位以上的促血红细胞生成素。

26、按权利要求23至25之任一项所述的方法，其中脊椎动物细胞是哺乳动物细胞或鸟类动物细胞。

27、按权利要求26的方法，其中脊椎动物细胞是COS-1细胞或CHO细胞。

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