CN106488771A - 用于再生骨组织的个性化基因活化植入物的生成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学，特别是涉及生成对替换扩大的(大体积的)骨缺损有效的成骨材料。所开发的用于制造这些医学制品的方法包括使用生物可再吸收载体基质的3‑D打印技术并通过基因结构将其活化。通过所述方法产生的医学制品可以是骨自体移植的有效替代物。

Description

用于再生骨组织的个性化基因活化植入物的生成方法

现有技术

在创伤和骨科、上颌面和口腔手术的实践中，治疗骨缺损或骨萎缩患者的难题是高度迫切的[1-3]。存在多种骨替代物(成骨材料)用于治疗小尺寸骨缺损，这里存在通过与自体骨组织、富含血小板的血浆、富含生长因子的血浆等混合而优化它们的方法[1]。

然而，特别迫切和社会性重要的是与先天性畸形和发育异常、创伤、炎性疾病、肿瘤病理和它们手术治疗的第一阶段相关的大的骨缺损(超过1cm³)患者的有效治疗的未解决难题。在起到身体器官作用的骨受到相当程度的损伤或完全丧失的这些临床情况下，使用市售的骨替代物来重建骨连续性是不可能的，得到显著的成骨不全。只有自体骨，不论游离或血管化的，骨移植的“金标准”，在这些情况下才可能是有效的[4，5]。

使用自体移植物的骨移植与引起进一步的损伤，扩展或产生一个新的手术方法，手术时间、并发症发生率和供体部位发病率的显著增加是相关的。此外，使用微血管技术的自体骨移植仅可以由高度熟练的专业人员在具有必需设备的专业医疗机构的环境中进行，所述设备不仅实施这种操作，而且还能够用来控制血管吻合的兼容性和再现程序的及时实施。与此同时，即使不管存在各种困难，消耗的资源和资金，也还存在引起自体移植物损失的血栓形成和血管吻合失败的高可能性[6]。

即使在对于自体骨移植，移植物保留和其完全整合到接受部位的绝对适应症情况下，治疗的长期结果也并不总是成功的。首先，这可以通过移植材料的高度后续生物再吸收(高达40％和甚至更高)而解释。其次，当骨缺损或骨萎缩区域具有不规则形状时，不可能精确地模拟自体移植物(腓骨，肋骨，肩胛骨，颅骨)为待替代的缺损形状，即为了在植入材料的所有表面和骨缺损的壁(骨接受部位)之间的分离(diastasis)不超过1mm。这导致移植物在受体床区域的固定不充分以及还导致手术后骨变形，骨不连或自体移植物的过度生物再吸收的发生。

因此，尽管是骨替代物材料的“金标准”，但骨自体移植物是有限使用的，并不总是有效的，并且与高并发症发生率相关。它们应用的关键性缺点之一和它们效率不足的原因之一是它们不能精确地模拟骨缺损的形状和尺寸。与此同时，任何骨替代物在骨缺损或骨萎缩区域的整个表面的紧密接触和完全固定是骨移植的基本原理[1]。当自体骨移植是不完全或变为无效时，医生必须使用牵拉成骨术，修复术或放弃这种治疗，其极大地降低了患者的生活质量。

在这个方面，开发一种新的更有效的骨替代物是高度迫切的，所述骨替代物能够替代或至少在效率方面成为包括血管化骨自体移植物的骨自体移植物应用的替代。根据发明人研究的发现，这个难题可以通过构建基因活化的多孔生物相容性和生物降解性材料来解决，所述材料的特征在于与用于替代的骨缺损的形状和尺寸精确拟合，其中它们是使用任何有效的三维(3D)打印技术而制造的。

背景技术

众多的常规骨替代物是已知的，如来自各种加工技术(去矿物质的，脱蛋白的，等)的同种异体和异种骨基质、磷酸钙陶瓷、硅酸盐、有机酸聚合物以及骨基质材料有机和无机物质的合成的类似物或天然的组分。然而，它们都仅具有骨传导性作用，因为其中不含有生物活性成分。在这个方面，它们仅用于替代小尺寸骨缺损(小体积)，因为仅能够优化修复性骨形成而不能提供其诱导作用[7]。对于大的骨缺损修复的个性化块的形式的所述组的产品几乎不用于临床实践中。

另一类是活化的骨替代物，其可以被分为含有生长因子(蛋白质)、活细胞或基因构建体(核酸)的材料组。

含有生长因子的骨替代物具有适度的骨诱导作用，其能够激活修复性骨形成。然而，由于生长因子是短活性和短距离的，并且已知在手术伤口的炎症条件下迅速被降解，因此产品的总效率似乎不足以替代大的骨缺损。在这种情况下，有不多的研究使用三维打印技术构建具有生长因子的一个预定尺寸和形状的骨替代物，并且在所有情况下均只生产远非最优功效的小尺寸(约1cm³)产品[8]。

另一种更有效方法的实例与个性化组织工程化骨移植物的发展相关。使用各种技术构建具有预定尺寸和形状的支架，研究人员已经制造了随后与活细胞组合的个性化基质。通过这种方式，预定尺寸和形状的支架获得一些成骨能力并且理论上能够提供明显的修复性成骨诱导。然而，形成个性化骨移植物的一部分活细胞的治疗潜力受到氧合需求的限制。换而言之，许多研究已经证明与常规材料相比，这种3D打印的小尺寸(最大为1cm³)组织工程化骨移植物的效率更高。然而，在大的骨缺损替代的情况下，即使在支架形状和尺寸对缺陷几何形状的理想模拟中也没有获得效果，因为细胞在没有足够的血液供应情况下不可避免的死亡。

所要求保护的本发明最接近的现有技术是由支架和核酸组成的基因活化骨替代物，所述核酸即编码生长因子的基因构建体[9]。

基因活化的骨替代物包括“支架-核酸”复合物，其组分通过各种技术被组合：化学键合[7]，使用佐剂(例如，凝胶生物聚合物)[11]，在其合成过程中核酸直接纳入到支架中，等。

这些产品具有骨诱导作用，不受氧合需求限制，因为其中不含有活细胞。然而，许多研究人员认为它们骨诱导作用的强度，以及作为结果，当用于替代骨缺损时它们的效率，是低于组织工程化骨移植物的。原因是基因构建体对受体位点细胞的转染效率较低，以及使用了仅由基因构建体编码的一个或两个因子以诱导修复过程的“治疗强度”，而组织工程化材料的细胞具有更广泛的作用机制。

由于上述提及的技术方法的低效性和缺点，许多研究小组已经采取了通过生产包含复合载体和生物活性组分组合的骨替代物而使产物复杂化的道路，所述生物活性组分为基因构建体和细胞、细胞和生长因子、生长因子和基因构建体、甚至在单个项目中的生长因子、基因构建体和细胞。然而，这类材料的生产过于昂贵，并且它们在替代大的骨缺损方面的效率仍然不足。

附图简述

图1示意性地显示了适用于替代兔颅骨骨缺损的个性化基因活化材料：A-俯视图；B-通过正面中心的横截面图。

图2显示了适用于替代兔颅骨骨缺损的构建的个性化基因活化材料。

图3显示了个性化基因活化材料替代骨缺损；在植入后6.5个月：1-植入物；2-新形成的骨组织；A-计算机断层扫描；3D重建；B-组织学图像(染色：苏木精、曙红)。

图4显示了未经由基因构建体活化的个性化材料替代骨缺损；在植入后6.5个月：1-植入物；2-新形成的骨组织。组织学图像(染色：苏木精、曙红)。

图5示意性地显示了具有定位固定物的个性化基因活化材料，其适合于替代兔胫骨的大缺损。

图6显示了个性化基因活化植入物用微型接骨板和微螺钉固定在骨缺损中。

图7显示了具有定位固定物的个性化基因活化材料替代骨缺损；在植入后3个月：1-植入物，2-新形成的骨组织。组织学图像(染色：苏木精、曙红)。

本发明的详细描述

考虑到其他研究者的经验和现有技术，由于上面提及的产品作用机制和在替代小的和中等尺寸的缺损中无法预测的效率方面，可以合乎逻辑地假设包括生长因子或细胞或基因构建体的常规和活化的材料都不能有效地修复大的骨缺损。

然而，尽管在开发中有共同的看法和趋势(针对生产更复杂的和多组分的成骨材料)，我们的研究团队已经采取了不同的方式结合手术和生物医学方法以获得最佳的结果。

本发明中所提出的产品及其制造方法的要点是构建生物相容性和生物可再吸收材料的个性化基质，并且将其与生物活性成分组合，所述生物活性成分是基因构建体。本发明区分其与最接近的现有技术[9]的一个关键方面是使用3D打印方法以生产完全适合于接受部位的形状和尺寸的个性化产品，所述接受部位即骨缺损或骨萎缩的区域。换而言之，产品的生产方式是在植入到接受区域之后，材料和对应骨壁之间的分离不超过1mm。3D打印方法被用于实现个性化参数以及尺寸和形状的精确对应。附加的产品部件可以是在制造植入物的一些阶段结合到材料中的固定结构(重建板、螺钉、微型接骨板、微螺钉、线、销，等)。如果具有不足机械特性的生物可再吸收材料被选择作为基因构建体的支架，其阻碍了使用任意标准技术(金属结构，等)在接受部位的可靠固定，则该部件的存在是强制性的。

用于构建个性化基因活化材料的推荐方法包括下列步骤，其顺序可以改变：

1.确定骨缺损或骨萎缩区域的确切形状和尺寸。为此，可以使用标准的放射学方法如计算机断层扫描、X-射线检测、射线照相术等。

2.使用包括立体平版印刷、光聚合等的任何3D打印方法，从生物可再吸收材料中生产预定形状和尺寸的个性化支架。

3.在生产个性化支架的任何阶段或在生产之后将支架与基因构建体组合。

第一个步骤涉及规划所要制造的产品的形态测量参数，并且需要在手术干预规划中通常使用的那些相同的研究方法。最优选的选择是计算机断层扫描，其是提供用于骨修复程序规划数据的骨骼病理学诊断的一个必要部分。可以使用专门配置的软件(例如，从美国NHI获得的“3D切片机”)，在标准的计算机断层扫描过程中获得的信息被用于模拟骨缺损的形状和尺寸，和相应的个性化基因活化植入物的形状和尺寸。

基于所获得的形态测量信息，形成用于3D-打印机或能够从所需的生物可再吸收材料中产生具有预定参数的三维植入物的任何其它装置的主文件。考虑到骨组织的形态和功能组织以及再生，用于构建支架的最优选材料可以包括磷酸钙、羟基磷灰石、胶原蛋白、生物活性玻璃陶瓷、有机酸聚合物和包括它们组合的其它材料。选择用于构建个性化基因活化植入物的生物可再吸收材料可以具有仅影响特定3D打印方法的选择的任何聚集状态和物理性质。

支架的3D打印可以通过两种完全不同的方法实现。第一种是从所选择的材料直接打印支架。第二种方法涉及成形元件、引导件(从适当的材料)的打印，以及随后将它们作为模具用于“铸造，，(合成)预定形状和尺寸的支架。

生产个性化基因活化材料的一个关键步骤是组合支架和基因构建体(例如，质粒DNA)。该方法的这一部分还可以通过多种方法实施，所述方法部分地可以经由选择用于生产支架的生物可再吸收材料的性质所限定。如果载体是由液体材料(凝胶、溶胶、溶液)或暂时处于液相的材料所制备，则基因构建体可以在3D打印之前或期间被导入到其中。如果使用固体材料(例如，颗粒化的)，则基因构建体可以在3D打印之前或期间被添加到液体溶液中或作为包含它们的任何凝胶材料的一部分。在大多数情况下最简单和最可行的方法是在3D打印之后组合所产生的个性化支架和基因构建体。为此目的，可以在不同条件(温度、暴露时间、机械冲击)下将以溶液或作为凝胶一部分的形式的各种浓度的基因构建体与“打印的”支架进行温育。

如果基因构建体在3D打印之前或期间与支架组合，优选的是在无菌条件下进行3D打印，即在A或B类洁净室中。然而，如果基因构建体在其已经产生之后与支架组合，则3D打印可以在任何类别的房间中进行，所获得的与基因构建体组合的个性化支架随后在无菌条件下灭菌。

已经令人惊讶地发现，在我们的研究中在实施例中部分描述了，甚至在大的骨缺损修复情况下，也可以使用经由3D打印方法产生的个性化基因活化材料以实现优选的结果。换而言之，恰恰是基因活化材料与受体部位所有表面的一致性和紧密粘附才使得实现其效率。与此同时，没有基因构建体的相同的个性化支架是完全没有效率的，并且由相同材料制备和具有标准尺寸和形状的非个性化基因活化植入物是没有足够效率的。

由本发明人所获得的有益效果是很可能通过这样的事实所解释，一旦植入到大的骨缺损区域中，标准形状和尺寸的非个性化基因活化材料的基因构建体不直接接触受体床细胞并且不能到达靶细胞。此外，在骨壁和基因活化材料之间大于1mm的分离使得大多数释放的基因构建体经由充斥该空间的血凝块酶和炎性液体而被破坏和快速消除。与此同时，由于在产品表面和骨缺损壁之间的显著空间，驻留细胞迁移到植入物中是没有足够活性的。因此，考虑到低转染效率，特别是在质粒DNA的情况下，核酸已经没有以足够的数量进入到细胞中而能够提供治疗效应。

与此相反，个性化基因活化材料紧密地附着到具有小于1mm长度“游离空间”的受体床的所有表面。这一方面促进了细胞更快和更大规模地迁移到产物结构中，另一方面，缩短了在到达靶细胞的路径中基因构建体必须覆盖的距离。由于在基因活化材料和骨缺损壁之间空间不足，这种距离的缩短提供了更多的基因构建体的保留，这对于实现治疗效果是极其重要的。

因此，在基因活化材料的情况下，产品的形状和尺寸与受体床参数之间精确的完全一致性对于实现产品的治疗效果是至关重要的。发现这个事实已经成为一种发现，其允许我们能够开发用于大的(大于1CM³)骨缺损修复有效的骨替代物。然而，精确的个性化基因活化材料发现效率的详细机制需要进一步的研究和阐述。

已经部分解决了在生物医学方法方面中大的骨缺损替代难题，我们面临着另一个难题，外科手术。该难题是实现其骨诱导作用的基因活化材料不仅在植入后立即紧密地粘附于所有受体床表面，而且在所有时候保持在这样的位置直到与周围的骨组织完全整合。换而言之，个性化骨移植物必须被牢固地固定在接受部位中，否则其将不可避免的移动并且在植入物和受体区域之间将形成空间，其可能损害生物活性，导致运动性和甚至脱落。在支架是由允许标准固定物(螺钉、微螺钉、微型螺钉、销、针)的机械强度高的材料组成的情况下-在手术期间任何固定物可以被直接拧入或插入其中而没有损坏植入物，这个难题是很容易解决的。然而，正如它在我们进行的一些研究中，支架材料经常是易碎的和不够坚固的。例如，在尝试钻孔固定时，磷酸钙的多孔基质是很容易破裂的。在手术期间直接固定这类材料是极其困难的或者根本不可能的。

对于这一点，我们开发了缺乏机械强度的支架制备的个性化基因活化材料的额外的处理步骤和变体。该解决方案是将固定元件定位在可以以两种方式实施的支架制造步骤内的个性化基因活化的骨移植物中。第一种在于将由金属或坚固的生物可再吸收材料制成的特殊核心引入至可以具有用于固定元件(螺钉、微螺钉、微型螺钉、销、针等)的孔的内部支架结构中。通向核心(或核心中的孔)的通道将在植入物表面处形成，所述产品应该在该处固定。第二种选择是将外部固定系统(例如，具有微螺钉的微型接骨板)安装在预定位置和制造已经具有固定元件的预定形状和尺寸的支架。因此，个性化基因活化材料可以包括内部的(核心)或外部的固定物。

重要的是，基于医生提出的手术方案，固定元件必须在个性化基因活化植入物生产的第一步骤已经被选择。对于这一点，可以首先生产具有缺陷、萎缩或病理部位的区域的3D-骨模型，所述区域的校正需要骨缺损的形成。这个模型必须对计划手术的医生是可获得的。医生将重现计划的操作(骨片段的切除，骨缺损壁的研磨，等)，并且在模型上定位固定元件(由金属或坚固的生物可再吸收材料制成的结构)用于固定骨片段和个性化基因活化植入物。在其上正确位置处具有定位固定物的模型被用于计算个性化基因活化植入物制造的形态测量参数。

实施例

实施例1

没有“嵌入式”固定元件的个性化基因活化材料

在通过本文提出的方法制造没有固定物的个性化基因活化材料的变体之一之前，必须限定具有关键尺寸的骨缺损的适当生物模型。我们在选择研究模型时遵循以下标准：1)骨缺损必须具有最大尺寸；2)允许块在植入区域不使用任何金属结构而被可靠地固定。考虑到上述标准，我们开发了一种具有20mm直径的兔颅骨骨缺损的实验模型。用钻头实施颅骨截骨以形成骨缺损，其没有损伤大脑的硬脑膜并且保留1mm宽的内部皮质板的碎片，在1、5、7和11点钟方向投影处向缺损中心突出1mm。这些骨碎片段在所述位置作为支撑点与骨缺损尺寸的组合的保留已经成为该模型的独特特征。这种模型允许将个性化基因活化植入物固定在骨缺损区域而无需使用额外的固定技术。

在手术前进行兔子颅骨的多层螺旋计算机断层扫描。使用3D切片机软件(NHI，USA)，我们手动分割了所计划的骨缺损，其中心位于与额顶骨和顶枕的缝合等距的矢状缝合突出部。考虑到计划的骨缺损计算的形态测量参数，实施磷酸八钙块状物的3D打印。该块状物被成型为厚度1.3mm，直径20mm的凸盘形式，并且在颅骨替代后提供用于脑减压术的17个穿孔(图1，图2)。

根据基于化学连接核酸至支架钙的在先定义的实验室规程，将通过3D打印生成的支架与基因构建体(具有编码血管内皮生长因子(VEGF)基因的质粒DNA)相组合：

1)洗涤支架(在5-ml体积的0.5M磷酸盐缓冲液中在37℃下持续振荡12小时温育)；

2)平衡(在5-ml体积的10mM磷酸盐缓冲液中在37℃下持续振荡处理，处理3次，每次10分钟)；

3)干燥支架(在37℃下温育直到完全干燥3小时)；

4)应用基因构建体(用在10mM磷酸盐缓冲液中以1μg/μL的浓度的质粒DNA溶液在37℃下持续振荡12小时而温育)；

5)从产品上洗掉未结合的质粒DNA(用5-ml体积的5mM磷酸盐溶液处理3次)；

6)干燥(在37℃下温育直到完全干燥3小时)。

在用个性化基因活化替代物骨移植6.5个月之后，兔子颅骨的完整性已经被完全修复。植入物没有再吸收，但是其周边区域与周围的骨组织已经完全整合。此外，沿着个性化基因活化移植物的内部和外部表面形成了一个3-6mm长的新形成的骨组织。根据计算机断层扫描和组织学研究，检测到新形成的骨组织紧密地粘附到植入物上并且没有形成任何结缔组织夹层或密闭空间(图3)。

在基因活化构建体缺乏的情况下，新形成的骨组织体积是显著较少的并且来自周边的骨进展不超过1-2mm(图4)。

实施例2

具有“嵌入式”固定元件的个性化基因活化材料

为了研究个性化基因活化材料的这个变体，我们开发了另一个模型：具有阶梯式边缘的近端和远端骨片段的36mm长的兔子胫骨缺损。

使用本发明的方法创建个性化基因活化植入物(图5)。

在第一个步骤中，实施3D打印以制造形态元件，其中将意欲固定植入物的微型接骨板和微螺钉定位。使用所得的模具，从磷酸三钙中合成完全匹配模型参数和包含固定元件的支架。根据上述方案，将植入物与基因构建体(具有vegf和sdf基因的质粒DNA(编码基质细胞生长因子))组合。具有“嵌入式”固定系统的所得的个性化基因活化替代物被植入到完全匹配植入物参数的兔子胫骨缺损中(图6)。

3个月后，肢体的支撑能力得到完全恢复。植入物在这个时间结束时没有被再吸收，但是其周边区域与骨碎片段完全整合(图7)。

因此，我们开发的用于构建个性化基因活化材料及其变体的方法，使制造对于包括大的骨缺损替代物的骨缺损替代物有效的医疗产品成为可能。

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Claims (4)

1.一种构建在哺乳动物中用于骨缺损替代的个性化基因活化植入物的方法，包括骨移植区域的计算机断层扫描，基于计算机断层扫描数据模拟骨缺损或骨接收部位，三维打印生物相容性支架或用于制造生物相容性支架的模具，其特征在于所述生物相容性支架被核酸活化以产生个性化基因活化植入物。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于在所述生物相容性支架的制造期间，将元件结合到其中以用于随后在植入区域中产品的固定，所述元件为接骨板、微型接骨板、螺钉、微螺钉、销、针、杆和它们的金属和生物可再吸收材料的类似物。

3.一种用于替代在哺乳动物中骨缺损的个性化基因活化植入物，其通过根据权利要求1的方法而生产。

4.一种用于治疗哺乳动物中骨缺损或骨组织萎缩的方法，包括将根据权利要求3的个性化基因活化植入物植入到骨接受部位。