CN106474090A - 一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，提供了一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，包括：纳米介孔硅球MSNs，负载在所述纳米介孔硅球MSNs上的钌配合物RuNHC，以及包覆所述负载有钌配合物的纳米介孔硅球MSNs的生物素化壳聚糖CTS‑Biotin。本发明所述纳米颗粒RuNPs较现有技术中的RuNHC相比，实现了对RuNHC配合物的控释及靶向运输，同时具有pH响应性控释性能，不仅提高了其抗肿瘤活性，还提高了对肿瘤细胞的靶向性，降低了对正常组织细胞的毒副作用。

Description

一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒及其制备和应用。

背景技术

癌症，是目前对人类健康威胁最为严重的疾病之一。据癌症数据统计显示，中国每年约有四百万新发肿瘤病例和两百万癌症死亡病例。在中国，癌症已成为疾病死因之首，发病率和死亡率还在攀升，已成为非常重要的公共健康问题。癌症治疗常用的方法包括手术治疗、化疗和放疗，其中，化疗是治疗癌症最具开发潜力的手段和研究方向之一。随着有效化疗药物的增多、治疗策略上的进展，化疗在癌症综合治疗中的地位日益提高、比重日益增大。然而，目前临床上多数化疗药物缺少靶向性，同时还存在较大的毒副作用，对患者的身体健康造成了严重的影响。因此，如何将抗癌药物靶向输送到肿瘤部位，减少正常组织对药物的摄取，从而降低其副作用，提高药物的疗效，是当前化疗药物的研究重点和难点。

金属类抗癌药物，尤其是钌类药物，因其具有较高的抗肿瘤活性，且不易产生耐药性，受到了人们的广泛关注。其中，氮杂环卡宾-钌(RuNHC)类配合物一方面和金属离子之间存在较稳定的σ键；另一方面，易于修饰，可以很好的调控其理化性质，因此该类配合物在金属抗癌药物方面具有很大优势。

为此，中国专利文献CN104650155A公开了一种钌配合物及其制备方法和用途。该发明所述的钌配合物相较于顺铂毒副作用小，且具有药物吸收好、抗癌活性强、诱导肿瘤细胞凋亡能力强、与DNA键合能力强的优势，在肿瘤的治疗中表现出良好的功效。尽管上述钌类配合物抗癌活性高，但申请人在生物学实验研究中发现，其对正常细胞的毒性也很大，对肿瘤细胞的选择性较差。在杀死肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也造成很大损伤。因此，必须在确保钌类药物较高的抗肿瘤活性的同时，降低其毒副作用，才能保证其在临床上的应用。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是现有钌类配合物肿瘤靶向性差、毒副作用高的问题，进而提供一种肿瘤靶向性强、毒副作用小的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs及其制备和应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，包括：纳米介孔硅球MSNs，负载在所述纳米介孔硅球MSNs上的钌配合物RuNHC，以及包覆所述负载有钌配合物的纳米介孔硅球MSNs的生物素化壳聚糖CTS-Biotin；

其中，所述钌配合物的结构如I所示：

所述的纳米颗粒RuNPs，所述生物素化壳聚糖CTS-Biotin为所述壳聚糖CTS表面与聚乙二醇PEG一端连接，所述聚乙二醇PEG另一端与生物素Biotin连接。

所述的纳米颗粒RuNPs，所述纳米介孔硅球MSNs的钌配合物负载量为345-370μg/mg；所述纳米介孔硅球MSNs的粒径为85-95nm，孔径为2.5-3.0nm。

优选的，所述纳米介孔硅球MSNs的钌配合物负载量为357μg/mg；所述纳米介孔硅球MSNs的粒径为90nm，孔径为2.7nm。

本发明提供了一种制备所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs的方法，包括以下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs加入含所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温下避光搅拌至所述钌配合物RuNHC负载在纳米介孔硅球MSNs上，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取所述壳聚糖CTS悬浮于四氢呋喃中，搅拌下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS，室温下反应至所述生物素Biotin连接在所述壳聚糖表面上，然后离心、真空干燥，得到所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin，备用；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于醋酸溶液中，调节pH值到5.5-6.5，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs，室温下避光搅拌至所述CTS-Biotin包覆所述RuNHC@MSNs，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

所述的制备方法，包括以下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs 50-150重量份，加入到5-15体积份的含5-15mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌12-36h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取所述壳聚糖CTS 20-80重量份悬浮于5-15体积份的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 5-15重量份，室温反应12-36h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于体积浓度为5-15％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为1％-3％的混合物，取上述混合物15-25体积份，调节pH值为5.8-6.2，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs 50-100重量份，室温下避光搅拌12-36h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs；

所述重量份与体积份的关系为mg/mL的关系。

所述的制备方法，包括如下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs 100重量份，加入到10体积份的含10mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌24h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取壳聚糖CTS 50重量份悬浮于10体积份的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 10重量份，室温反应24h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于体积浓度为10％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为2％的混合物，取上述混合物20体积份，调节pH值为6，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs 70重量份，室温下避光搅拌24h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

所述的制备方法，还包括纳米介孔硅球MSNs的制备步骤，具体包括如下步骤：取十六烷三甲基溴化铵1000-3000重量份和三乙胺0.02-0.1体积份于10-30体积份的水中90-100℃下搅拌1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1-2体积份，继续搅拌0.5-1.5h，离心，将收集的固体产物在甲酸醇溶液中回流3-9h，离心，真空干燥，即得纳米介孔硅球MSNs。

本发明提供了一种药物组合物，其包括有效治疗量的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，以及药学上接受的辅料。

本发明所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs在制备抗肿瘤药物中的用途。

所述的用途，包括所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs在制备抗肺癌、抗宫颈癌、卵巢癌、抗前列腺癌、抗乳腺癌或抗食管癌药物中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，包括：纳米介孔硅球MSNs，负载在所述纳米介孔硅球MSNs上的钌配合物RuNHC，以及包覆所述负载有钌配合物的纳米介孔硅球MSNs的生物素化壳聚糖CTS-Biotin。经试验测试，本发明所述纳米颗粒RuNPs较现有技术中的RuNHC相比，实现了对RuNHC配合物的控释及靶向运输，同时具有pH响应性控释性能，不仅提高了其抗肿瘤活性，还提高了对肿瘤细胞的靶向性，降低了对正常组织细胞的毒副作用。

2.本发明所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs制备方法，通过在载药纳米颗粒表面修饰生物素，介导了其在癌细胞中较高的摄取量，使得纳米药物具有较高的抗癌活性，较低的细胞毒性，提高了RuNHC对肿瘤细胞的选择性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs合成示意图；

图2为MSNs与RuNPs纳米颗粒透射电镜图；

图3为MSNs与RuNPs纳米颗粒粒径分布及zeta电位图；其中，图3(a)为MSNs的粒径分布图；图3(b)为RuNPs的粒径分布图；图3(c)为MSNs与RuNPs的Zeta电位图；

图4为RuNPs、RuNHC和MSNs的红外光谱和紫外-可见吸收光谱图；其中，图4(a)为RuNPs、RuNHC和MSNs的红外光谱图；图4(b)为RuNPs、RuNHC和MSNs的紫外-可见吸收光谱图；

图5为不同pH值的PBS缓冲溶液中RuNPs的释放曲线；

图6为FITC标记的RuNPs在HeLa细胞中的荧光成像；其中，图6(a)为RuNPs在细胞中的摄取；图6(b)为生物素提前处理2h后，RuNPs在细胞中的摄取；

图7为RuNPs和RuNHC细胞摄取图；其中，图7(a)为RuNPs和RuNHC的细胞摄取；图7(b)为生物素提前处理2h后，RuNPs在HeLa细胞中的摄取；***P<0.001vs RuNHC组；

图8为RuNPs和RuNHC抗肿瘤活性示意图；图8(a)为RuNPs和RuNHC对癌细胞及正常细胞的毒性；图8(b)为RuNPs靶向作用机理示意图；图8(c)为RuNPs对A549细胞处理48h后的细胞形态图；图8(d)为RuNPs对HeLa细胞处理48h后的细胞形态；***P<0.001vs RuNHC组。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下述实施例中涉及到的试剂均为市售产品，不同厂家及型号的试剂对于结果并不会带来明显的差别，如生物素、壳聚糖CTS、异硫氰酸荧光素FITC均购自阿拉丁；钌配合物RuNHC为按照中国专利文献CN104650155A中的方法制备。

实施例1

本实施例提供一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs合成方法，如图1所示，包括如下步骤：

S1、纳米介孔硅球MSNs的制备：取十六烷三甲基溴化铵2.0g和三乙胺50μL于20mL的水中95℃下回流反应1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1.5mL，继续回流反应1h，抽滤，水洗，将得到的固体产物在甲酸醇溶液中回流6h，离心，真空干燥，即得纳米介孔硅球MSNs。

S2、取步骤S1所述纳米介孔硅球MSNs 100mg加入到10mL的含10mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌24h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，备用；

S3、取所述壳聚糖CTS 50mg悬浮于10mL的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 10mg，室温反应24h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin，备用；

S4、取步骤S3所述的CTS-Biotin溶于体积浓度为10％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为2％的混合物，取上述混合物20mL，用1M NaOH溶液调节pH值为6，然后加入步骤S2制备的所述RuNHC@MSNs 70mg，室温下避光搅拌24h，然后离心，水洗3次，随后真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

实施例2

本实施例提供一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs合成方法，如图1所述，包括如下步骤：

S1、纳米介孔硅球MSNs的制备：取十六烷三甲基溴化铵1.0g和三乙胺20μL于10mL的水中90℃下回流反应1.5h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1.0mL，继续回流反应0.5h，抽滤，水洗1次，将收集的固体产物在甲酸醇溶液中回流3h，离心，真空干燥，即得纳米介孔硅球MSNs。

S2、取步骤S1所述纳米介孔硅球MSNs 150mg加入到15mL的含15mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌36h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，备用；

S3、取所述壳聚糖CTS 80mg悬浮于15mL的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 15mg，室温反应36h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin，备用；

S4、取步骤S3所述的CTS-Biotin溶于体积浓度为15％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为3％的混合物，取上述混合物25mL，用1M NaOH溶液调节pH值为6.2，然后加入步骤S2制备的所述RuNHC@MSNs 50mg，室温下避光搅拌12h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

实施例3

本实施例提供一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs合成方法，如图1所述，包括如下步骤：

S1、纳米介孔硅球MSNs的制备：取十六烷三甲基溴化铵3.0g和三乙胺100μL于30mL的水中100℃下下回流反应1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯2.0mL，回流反应1.5h，抽滤，水洗2次，将得到的固体产物在甲酸醇溶液中回流9h，离心，真空干燥，即得纳米介孔硅球MSNs。

S2、取步骤S1所述纳米介孔硅球MSNs 50mg加入到5mL的含5mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌12h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，备用；

S3、取所述壳聚糖CTS 20mg悬浮于5mL的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 5mg，室温反应12h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin，备用；

S4、取步骤S3所述的CTS-Biotin溶于体积浓度为5％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为1％的混合物，取上述混合物15mL，用1M NaOH溶液调节pH值为5.8，然后加入步骤S2制备的所述RuNHC@MSNs 100mg，室温下避光搅拌36h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

实验例

为验证本发明所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs的效果，采用实施例1中合成的MSNs和RuNPs以及按照中国专利文献CN104650155A中的方法制备的钌配合物RuNHC进行以下实验：

测试例1RuNPs的粒径分布及Zeta电位

通过透射电镜(TEM)、Zeta电位及粒径分析MSNs和RuNPs纳米粒子粒径分布及Zeta电位(粒径分布及Zeta电位的测定参见ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,9078-9087，马尔文公司NanoSight NS300)，结果如图2和图3所示。

从图2结果可知，MSNs纳米颗粒呈现较高的单分散性，颗粒粒径集中分布于85nm，与图3(a)所示粒径分析结果相同。同时，图2与图3(b)所示的RuNPs粒径分布约为90nm，表明介孔纳米硅球载药前后，纳米粒子的粒径变化不大。

Zeta电位分析表明，如图3(c)，纳米介孔硅球负载钌配合物即RuNHC@MSNs的电位为-8.2mV，而修饰生物素化壳聚糖CTS-Biotin后，RuNPs的Zeta电位为12.0mV。Zeta电位的变化，是因为修饰生物素化壳聚糖CTS-Biotin后，壳聚糖表面含有大量未反应的氨基，使得纳米粒子呈正电性。

测试例2RuNPs、RuNHC和MSNs的红外和紫外-可见吸收光谱

通过紫外-可见分光光度法(UV-vis)和红外光谱(FT-IR)表征(红外和紫外-可见吸收光谱的测定参见Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，TENSOR27,Bruker)，结果如图4所示。

与MSNs红外光谱相比，RuNPs红外光谱中1667cm^-1处的峰可归属为CTS-Biotin中的C＝O振动峰，如图4(a)。2966cm^-1，1560cm^-1和1480cm^-1归属为RuNHC中苯环的C-H及C＝C振动峰，表明纳米药物合成成功。同时，RuNPs的紫外吸收光谱中220nm处的RuNHC的吸收峰，也说明纳米药物合成成功，如图4(b)。

测试例3RuNPs对肿瘤微环境的响应

大量研究表明，肿瘤部位呈现酸性环境，因此测试了在不同pH条件下负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs的释放情况。

取5mg RuNPs悬浮于pH值分别为7.4、6.0、5.5、5.0和4.0的20mL PBS缓冲液中，37℃下避光搅拌。分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h的时间点，取0.5mL上清液，用UV-vis检测配合物释放量(测定方法参见Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，PE/Lambda 25)。

如图5所示，酸性条件下(pH＝5.0)，RuNPs的药物释放速度较快，12h后，药物释放量为28.55％；120h后，最终的药物释放量约为59.71％。但是，中性条件下(pH＝7.4)，仅有8.57％的RuNHC从RuNPs纳米药物颗粒中释放。这是由于RuNPs纳米颗粒外层包裹了CTS导致的。中性条件下，CTS比较稳定，可以有效的封堵介孔硅的孔道，防止药物释放；而酸性条件下，CTS表面的氨基被质子化，使得分子间氢键减弱，进而导致CTS分子构象转变，不能有效的封堵孔道，药物释放量明显增加。因此，RuNPs纳米颗粒可以通过调节pH值控制药物的释放。所有的结果表明，RuNPs可以在酸性条件下控释RuNHC，由于肿瘤部位微环境为酸性条件，因此，RuNPs可以控制药物在肿瘤部位释放。同时，RuNPs还可以缓释药物，使其具有较长的血液循环时间，从而有更高的活性。

测试例4FITC标记的RuNPs在HeLa细胞中的荧光成像

为了定性的说明RuNPs在细胞中的摄取，我们利用FITC标记纳米药物RuNPs，通过其在HeLa(宫颈癌)细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供)中的荧光成像，直观的观察药物在细胞中的摄取。具体过程如下：

取实施例3中步骤S3所述的CTS-Biotin溶于体积浓度为5％的醋酸溶液中取上述混合物15mL，用1M NaOH溶液调节pH值为7.4，使得CTS-Biotin的最终浓度为2mg/mL，然后加入0.75mL 1mg/mL FITC(异硫氰酸荧光素)的DMSO溶液，避光室温下，反应4h，然后加入步骤S2制备的所述RuNHC@MSNs 100mg，室温下避光搅拌36h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的FITC标记的纳米药物颗粒RuNPs，FITC标记率为34.94μg/mg。

将HeLa细胞接种于5cm玻璃底的培养皿中，接种数目为10⁵个细胞，加入1mL培养基(MEM培养基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。然后用上述FITC标记的RuNPs处理4h，FITC最终浓度为50ng/mL。弃掉上清液，PBS洗涤三次后，用Hoechst 33258染液染色15min，以突出显示细胞核。弃掉上清，PBS洗涤三次后，荧光显微镜(OLYMPUS，日本)观察药物摄取情况。

生物素抑制实验，同上述实验步骤，不同之处在于，在上述FITC标记的RuNPs处理前，先用生物素处理2h。

如图6所示，其中第一列图片为白光下的细胞形态；Hoechst列为Hoechst染色细胞后的荧光，以便于定位细胞核；FITC列为细胞摄取标记药物后，FITC在细胞内的荧光；Merge列为三张图片叠加；图中箭头表示摄取标记RuNPs的细胞。由图中比较可知，FITC标记的RuNPs处理4h后，细胞中FITC荧光较为明显，这表明药物已经进入了细胞；而提前加入生物素抑制后，细胞中的FITC荧光明显减弱，这表明生物素可以明显的抑制RuNPs在癌细胞中的摄取。

测试例5RuNPs和RuNHC的细胞摄取以及生物素抑制实验

细胞摄取量是影响药物活性的重要因素之一，为了说明本发明的优势，测试RuNPs和RuNHC在A549(肺癌细胞)，HeLa(宫颈癌细胞)，L02(正常细胞)中的摄取，其中A549(肺癌细胞)，HeLa(宫颈癌细胞)，L02(正常细胞)，上述细胞均由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。药物摄取量通过ICP-MS测定Ru含量来表示，具体过程如下：

将A549，HeLa和L02细胞接种于10cm的培养皿中，接种数目为10⁶个细胞，加入10mL培养基(MEM培养基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。然后分别用RuNHC和RuNPs处理4h，药物最终浓度为10μM。收集细胞，180℃下王水处理2h，离心，取上清液。ICP-MS测定溶液中Ru的含量，(测定方法参见Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,12532–12536，安捷伦7700x)。

生物素抑制实验，同上述摄取实验步骤，不同之处在于，在药物处理前，先用生物素处理2h。

结果如图7(a)所示，4h后，RuNPs在A549及HeLa中的摄取量分别为0.16μg/10⁶和0.17μg/10⁶细胞，而在L02细胞中的摄取量为0.019μg/10⁶细胞。RuNHC在两种癌细胞中的摄取量分别为0.044μg/10⁶和0.035μg/10⁶细胞，约纳米颗粒的1/3；而在正常细胞L02中，RuNHC的摄取量为0.038μg/10⁶细胞，约为纳米颗粒的两倍。这表明，纳米药物RuNPs在癌细胞中有相对较高的摄取量，而在正常细胞中摄取量较低，即增加了对癌细胞的选择性。为了证明RuNPs的靶向性，我们开展了生物素竞争结合实验。如图7(b)所示，生物素明显的抑制了RuNPs在癌细胞中的摄取。这说明，RuNPs对癌细胞的高选择性是由生物素介导的。

测试例6RuNPs和RuNHC的抗肿瘤活性

RuNPs和RuNHC的抗肿瘤活性测试采用MTT法进行试验(MTT法参见Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，多功能酶标仪-PerkinElmer)。

结果表明(图8(a))，与RuNHC相比，RuNPs对癌细胞具有较高的活性，两者对A549细胞的IC₅₀值分别为6.88±0.49μM和2.08±0.19μM；对HeLa细胞的IC₅₀值分别为9.72±1.21μM和1.88±0.19μM。RuNPs对正常细胞的毒性较RuNHC明显降低，IC₅₀值分别为19.35±0.96μM和7.60±0.53μM。这表明，RuNPs对癌细胞具有较高的抗癌活性，对正常细胞具有较低的细胞毒性。

根据现有技术，尽管RuNHC具有较高的抗癌活性，但它就像一个缺少靶标的炸弹，杀死癌细胞的同时，也杀死了正常细胞(图8(b))。而RuNPs一方面可以控制药物在肿瘤部位释放；另一方面，其在肿瘤细胞中具有较高的摄取量，其就像靶标明确的导弹，仅对癌细胞有杀伤作用。所有结果表明，RuNPs提高了RuNHC的抗癌活性及对癌细胞的选择性。图8(c)为RuNPs对A549细胞处理48h后的细胞形态图；图8(d)为RuNPs对HeLa细胞处理48h后的细胞形态图。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，其特征在于，包括：纳米介孔硅球MSNs，负载在所述纳米介孔硅球MSNs上的钌配合物RuNHC，以及包覆所述负载有钌配合物的纳米介孔硅球MSNs的生物素化壳聚糖CTS-Biotin；

其中，所述钌配合物的结构如I所示：

2.根据权利要求1所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，其特征在于，所述生物素化壳聚糖CTS-Biotin为所述壳聚糖CTS表面与聚乙二醇PEG一端连接，所述聚乙二醇PEG另一端与生物素Biotin连接。

3.根据权利要求1或2所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，其特征在于，所述纳米介孔硅球MSNs的钌配合物负载量为345-370μg/mg；所述纳米介孔硅球MSNs的粒径为85-95nm，孔径为2.5-3.0nm。

4.一种制备权利权利要求1-3任一项所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs加入含所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温下避光搅拌至所述钌配合物RuNHC负载在纳米介孔硅球MSNs上，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取所述壳聚糖CTS悬浮于四氢呋喃中，搅拌下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS，室温下反应至所述生物素Biotin连接在所述壳聚糖表面上，然后离心、真空干燥，得到所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin，备用；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于醋酸溶液中，调节pH值到5.5-6.5，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs，室温下避光搅拌至所述CTS-Biotin包覆所述RuNHC@MSNs，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs 50-150重量份，加入到5-15体积份的含5-15mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌12-36h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取所述壳聚糖CTS 20-80重量份悬浮于5-15体积份的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 5-15重量份，室温反应12-36h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于体积浓度为5-15％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为1％-3％的混合物，取上述混合物15-25体积份，调节pH值为5.8-6.2，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs 50-100重量份，室温下避光搅拌12-36h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs；

所述重量份与体积份的关系为mg/mL的关系。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取所述纳米介孔硅球MSNs 100重量份，加入到10体积份的含10 mg/mL所述钌配合物RuNHC的乙腈溶液中，室温避光下搅拌24h，然后离心、真空干燥，得到负载所述钌配合物RuNHC的纳米介孔硅球即RuNHC@MSNs，备用；

(2)取所述壳聚糖CTS 50重量份悬浮于10体积份的四氢呋喃中，搅拌条件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 10重量份，室温反应24h，然后经离心、真空干燥得所述生物素化壳聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步骤(2)制备的所述CTS-Biotin溶于体积浓度为10％的醋酸溶液中制备成所述CTS-Biotin质量浓度为2％的混合物，取上述混合物20体积份，调节pH值为6，然后加入步骤(1)制备的所述RuNHC@MSNs 70重量份，室温下避光搅拌24h，然后离心、水洗、真空干燥，即得所述的负载钌配合物介孔硅纳米药物颗粒RuNPs。

7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括纳米介孔硅球MSNs的制备步骤，具体包括如下步骤：取十六烷三甲基溴化铵1000-3000重量份和三乙胺0.02-0.1体积份于10-30体积份的水中90-100℃下回流反应0.5-1.5h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1-2体积份，继续回流反应0.5-1.5h，抽滤，水洗，将得到的固体产物在甲酸醇溶液中回流3-9h，离心，真空干燥，即得纳米介孔硅球MSNs。

8.一种药物组合物，其包括有效治疗量的权利要求1-3任一项所述的负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs，以及药学上接受的辅料。

9.权利要求1或2所述负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，包括所述负载钌配合物介孔硅纳米颗粒RuNPs在制备抗肺癌、抗宫颈癌、抗卵巢癌、抗前列腺癌、抗乳腺癌或抗食管癌药物中的用途。