CN107496937A - 一种预靶向给药体系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种预靶向给药体系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种预靶向给药体系及其制备方法和应用，所述预靶向给药体系，包括预靶向纳米颗粒Biotin‑MSNs‑DBCO及含叠氮基钌配合物N3‑S‑S‑NHC‑Ru，其中，所述Biotin‑MSNs‑DBCO中的DBCO表示二苯基环辛炔，Biotin表示生物素，MSNs表示纳米颗粒，Biotin和DBCO通过PEG与MSNs连接；本发明的预靶向纳米颗粒Biotin‑MSNs‑DBCO，在生物素的靶向作用及EPR效应下，在肿瘤内富集，然后在SPAAC反应的作用下，能够更加特异性的捕获钌配合物N3‑S‑S‑NHC‑Ru，使其在肿瘤部位富集，增强了对线粒体的损伤，提高了其抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种给药体系及其制备方法和应用，具体涉及一种预靶向给药体系及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，中国每年约有两百万人死于癌症。化疗是治疗癌症的主要方法之一，但目前临床上多数化疗药物都缺少靶向性，存在较强的毒副作用，对患者的身体造成了严重的影响；此外还有一些生物治疗方法，如抗体、疫苗和小RNA等，但这些治疗方法均存在一定的缺陷。探寻新型高效的抗癌药物，尤其是金属类抗癌药物，是当前提高癌症疗效的重要方法之一。
钌配合物由于具有相对低的毒性，在生物体内易于吸收，而且易于聚集在肿瘤组织中，作为抗肿瘤药物受到越来越多的关注。氮杂环卡宾-钌(RuNHC)类配合物一方面配体和金属离子之间存在较稳定的σ键；另一方面，易于修饰，可以很好的调控其理化性质，因此该类配合物在金属抗癌药物方面受到了广泛关注。前期工作中，我们设计合成了一系列RuNHC类配合物。研究发现，这类配合物对多种肿瘤细胞都表现出较高的抑制活性，但由于其缺少靶向性，限制了对其体内活性的研究。
靶向输药系统的构建，例如纳米载药体系，为提高药物靶向性提供了重大机遇。当前大量纳米材料被用作药物输送的载体，如介孔硅纳米颗粒，由于其具有较高的比表面积、可控的孔道大小和形状、化学稳定性好、表面可修饰性、良好的生物相容性等特点，受到了人们的广泛关注。
现有纳米载药技术中，多是基于将药物包裹于介孔硅孔道中，纳米颗粒携带药物进入肿瘤，到达肿瘤部位后，再控制释放药物。尽管这一策略已经取得了不错的成果，但也存在一些不足。一方面介孔硅包裹药物需要合适孔径大小；另一方面需要控制药物在肿瘤部位的定点释放，防止药物在运输过程中的泄露，失去靶向。因此，为解决这一问题，临床实践中需要一种可以直接赋予药物靶向性的给药策略。
近期研究发现，DBCO和含叠氮化合物可以在体内发生生物正交反应，这为纳米载药提供了新的思路。利用DBCO修饰纳米颗粒后，提前注入体内，纳米颗粒在肿瘤部位富集，即预靶向。然后注入含叠氮药物，肿瘤内纳米颗粒会特异性结合含叠氮药物，增加药物在肿瘤部位的摄取，进而增加其活性，这相当于为药物提供了外源性靶标。然而，目前还没有相关技术报道。
本发明旨在提供一种预靶向给药策略，克服现有纳米载药技术中存在的不足，直接为药物提供外源性靶标，增加药物抗肿瘤活性，避免了药物包裹及在运输过程中失靶的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中存在的金属抗癌药物特异性差，抗肿瘤效果差的技术问题，提供一种预靶向给药体系及其制备方法和应用，通过该预靶向给药体系，能够使预靶向纳米颗粒捕获药物颗粒的特异性提高，从而提高其抗肿瘤的活性。
除非特别指明，本文中的“Biotin-MSNs-DBCO”均指“预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO”。
除非特别指明，本文中的“N3-S-S-NHC-Ru”、“配合物N3-S-S-NHC-Ru”均指“含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru”。
除非特别指明，本文中的“N3-S-S-NHC”均指“N3-S-S-NHC配体”。
除非特别指明，本文中的“NHC”均指“NHC配体”。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一方面，本发明提供一种预靶向给药体系，包括预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO及含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，其中，所述Biotin-MSNs-DBCO中的DBCO表示二苯基环辛炔，Biotin表示生物素，MSNs表示纳米颗粒，Biotin和DBCO通过PEG与MSNs连接；
所述N3-S-S-NHC-Ru的结构式如下述(Ⅰ)式所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯。
优选地，所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru在癌症细胞中通过谷胱甘肽剪切。
优选地，所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru对癌症细胞的IC50值为6.125～100μM；所述IC50值优选为25.38-28.92μM；
更优选地，所述癌症为宫颈癌、肺癌或结肠癌。
另一方面，本发明还提供一种用于制备上述的预靶向给药系统中的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，所述N3-S-S-NHC-Ru的结构式如下述(Ⅰ)式所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯。
另一方面，本发明还提供一种上述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的制备方法，包括以下步骤：
1)NHC配体的合成：将适量的4-羟甲基咪唑、K2CO3和对叔丁基苄氯在乙腈中加热回流，将反应液旋干，层析柱分离得到中间体；再将所述中间体与对叔丁基卞氯在乙腈中加热回流，层析柱分离得到NHC配体，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
2)化合物2的合成：将适量的羰基二咪唑(CDI)和2-叠氮乙醇溶于二氯甲烷中反应，然后将其慢慢滴加至适量的2-羟乙基二硫化物的二氯甲烷溶液中反应，反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物2为油状液体，所述反应过程如下述所示：
3)N3-S-S-NHC配体(化合物3)的合成：将适量的羰基二咪唑和步骤2)中制备的化合物2溶于适量的二氯甲烷中反应；然后将其慢慢滴加至步骤1)中制备的NHC配体的二氯甲烷溶液中反应；反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物3为油状液体，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
4)配合物N3-S-S-NHC-Ru的合成：将适量的步骤3)制备的N3-S-S-NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌,然后加入二适量的二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌；反应结束后，过滤，除掉副产物AgCl，向滤液中加入正己烷，得粗产物；再将所述粗产物通过重结晶，得橙色固体为N3-S-S-NHC-Ru，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
优选地，所述方法还包括配合物NHC-Ru的合成，通过包括以下步骤的方法合成：将适量的步骤1)制备的步骤1)制备的NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌,然后加入适量的二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌；反应结束后，过滤，除掉副产物AgCl，向滤液中加入正己烷，得粗产物；再将所述粗产物通过重结晶，得橙色固体为NHC-Ru，所述反应过程如下述所示：
优选地，将NHC配体或N3-S-S-NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌4h,然后加入二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌4h；该条件下，反应温和，避光下，避免了钌配合物的光分解，产率较高，副产物少，便于分离提纯。
更优选地，将所述粗产物通过体积比为1:4的二氯甲烷/正己烷进行重结晶。
优选地，在步骤1)中，将4-羟甲基咪唑、对叔丁基苄氯和K2CO3以1:3:1的摩尔比在乙腈中加热回流8h；该条件下，4-羟甲基咪唑与对叔丁基苄氯当量相当，避免了副产物的生成，产率较高，便于分离提纯。
优选地，再将所述中间体与对叔丁基苄氯在乙腈中加热回流，所述对叔丁基苄氯的加入量与获得中间体的反应中的加入量相同；
更优选地，所述中间体通过体积比为10:1的CH2Cl2/CH3OH进行层析柱分离获得；所述NHC配体通过体积比为3:1的CH2Cl2/CH3OH进行层析柱分离获得。
优选地，在步骤2)中，将适量的羰基二咪唑和2-叠氮乙醇溶于二氯甲烷中反应30min，然后将其慢慢滴加至适量的2-羟乙基二硫化物的二氯甲烷溶液中，于室温反应12h，反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物2为油状液体；该条件下，反应温和，采用慢慢滴加的方式，避免了2-羟乙基二硫化物与两分子的中间体反应，减少了副产物的量，产率较高，便于分离提纯。
优选地，在步骤2)的整个反应中，羰基二咪唑、2-叠氮乙醇和2-羟乙基二硫化物加入的物质的量相同；
更为优选地，将溶剂旋干后通过体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷进行层析柱分离。
优选地，在步骤3)中，将羰基二咪唑和步骤2)中制备的化合物2溶于二氯甲烷中，于室温反应30min；然后将其慢慢滴加至步骤1)中制备的NHC配体的二氯甲烷溶液中反应12h；反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物3为油状液体，该条件下，避免了副产物的生成，产率较高，便于分离提纯；
优选地，在步骤3)的整个反应中，羰基二咪唑、化合物2和NHC配体加入的物质的量相同；
更为优选地，将溶剂旋干后通过体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇进行层析柱分离。
还一方面，本发明还提供一种用于制备上述的预靶向给药系统中的预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO，所述预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO通过包括以下步骤的方法制得：
(1)MSN纳米颗粒的合成:将适量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三乙胺(TEA)加入水中搅拌，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，继续搅拌，得到反应液；再将所述反应液离心，去上清得到固体，然后将所述固体在HCl/MeOH中回流，离心，真空干燥，得MSN纳米颗粒；优选地，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三乙胺(TEA)加入水中，于95℃下搅拌1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，继续搅拌1h；更优选地，将所述固体在HCl/MeOH中回流6h；
(2)MSNs-NH2的合成:将适量的步骤(1)中制备的MSN纳米颗粒悬浮于无水乙醇中，得到混合溶液，再向所述混合溶液中加入适量的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)搅拌，离心，干燥，得MSNs-NH2；优选地，将MSN纳米颗粒悬浮于无水乙醇中，36℃下搅拌6h，得到混合溶液；更优选地，于60℃下真空干燥；
(3)预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO的合成:将适量的步骤(2)中制备的MSNs-NH2悬浮于适量的干燥的四氢呋喃(THF)中，搅拌下，加入适量Biotin-PEG2000-NHS反应，优选于室温反应24h；然后加入适量DBCO-PEG2000-NHS继续反应，优选继续于室温反应24h得到反应液，再将所述反应液离心，真空干燥得预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO。
再一方面，本发明还提供一种预靶向给药体系在用于制备抗肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
优选地，所述给药体系中的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru在癌症细胞中通过谷胱甘肽剪切。
优选地，所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru对癌症细胞的IC50值为6.125～100μM；所述IC50值优选为25.38-28.92μM；
更优选地，所述癌症为宫颈癌、肺癌或结肠癌。
优选地，所述抗肿瘤的药物或试剂盒还包括FITC-N3；通过FITC-N3能够预先检测该预靶向给药体系中Biotin-MSNs-DBCO与含叠氮基药物的结合能力。
优选地，所述FITC-N3通过包括以下步骤的方法制得：
A.3-叠氮基丙胺的制得：将适量3-溴丙胺氢溴酸盐和叠氮化钠溶于水中，回流过夜，得到反应混合液；再将所述反应混合液冷却后，通过二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥旋干，得中间产物3-叠氮基丙胺；优选地，所述3-溴丙胺氢溴酸盐和叠氮化钠以1:3的摩尔比进行反应；更优选地，于90℃回流过夜；所述反应过程如下述所示：
B.FITC-N3的制得：将步骤A中制得的适量的3-叠氮基丙胺和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于适量DMF中，慢慢加入适量的异硫氰酸荧光素(FITC-NCS)的DMF溶液，室温避光下反应过夜，反应结束后，将DMF旋干，乙醚洗涤三次，得FITC-N3；优选地，在该反应步骤中，3-叠氮基丙胺、DIPEA和FITC-NCS加入的物质的量的比为1:2：1；所述反应过程如下述所示：
还一方面，本发明还提供一种用于抗肿瘤的预靶向药物组合物，包括有效量的上述所述的预靶向给药体系和药学上接受的辅料。
优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌或结肠癌。
本发明的有益效果是：首次合成了预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO及含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，通过一种新的输药策略——预靶向输药，增加药物靶向性，进而提高其抗肿瘤活性。即将纳米颗粒与药物分开，先用纳米颗粒预处理肿瘤，使其在肿瘤部位富集，此为预靶向，然后再注射药物。肿瘤部位预靶向的纳米颗粒可以特异性的捕获药物，使得药物在肿瘤部位富集，这样就相当于增加了药物的靶向性；这是由于一方面本发明的预靶向给药体系的纳米颗粒在细胞中摄取较高；另外一方面预靶向纳米颗粒在细胞中能特异性结合药物。
具体地：DBCO能够特异性地与叠氮基团结合，并快速地发生环张力催化反应(SPAAC)，而本发明合成的预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO，在生物素的靶向作用及EPR效应下，在肿瘤内富集，然后在SPAAC反应的作用下，能够更加特异性的捕获钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，使其在肿瘤部位富集，随后肿瘤中的谷胱甘肽(GSH)剪切配合物中的二硫键，释放药物NHC-Ru，尤其是通过生物素的靶向性能够与宫颈癌、肺癌或结肠癌细胞特异性结合，并且由于宫颈癌、肺癌或结肠癌中的生物素受体过表达，能够使其结合特异性进一步提高，从而提高其抗肿瘤的作用；并且通过试验比较，在Biotin-MSNs-DBCO的作用下，能够将N3-S-S-NHC-Ru的抗肿瘤活性升高了4倍，同时增强了对线粒体的损伤，提高了其抗肿瘤效果，为新型载药系统的构建提供了研究基础，开拓了治疗宫颈癌的新方向。
此外，与其它载药相比，本发明的预靶向给药体系还具有以下优点：一是避免了寻找合适载体对药物的包裹和释放过程；二是通过生物正交反应，给药物提供了特异性结合的靶点，提高药物靶向性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的预靶向给药体系的反应原理图；
图2是本发明的含叠氮基钌配合物的具体合成路线；
图3是本发明的Biotin-MSNs-DBCO的具体合成路线；
图4是本发明的FITC-N3的具体合成路线；
图5a是本发明的MSNs的粒径分布图及TEM图，其中，柱图为粒径图，插图为TEM图；
图5b是本发明的Biotin-MSNs-DBCO的粒径分布图及TEM图，其中，柱图为粒径图，插图为TEM图；
图5c是本发明的MSNs和Biotin-MSNs-DBCO的氮气吸附-脱附曲线；
图5d是本发明的MSNs和Biotin-MSNs-DBCO的孔径分布图；
图6是本发明的MSNs、MSNs-NH2、Biotin-MSNs-DBCO的zeta电位结果；
图7是本发明的Biotin-MSNs-DBCO的红外光谱图；
图8是本发明的NHC-Ru的1H/NMR谱图；
图9是本发明的NHC-Ru的13C/NMR谱图；
图10本发明的N3-S-S-NHC-Ru的1H/NMR谱图；
图11是本发明的N3-S-S-NHC-Ru的13C/NMR谱图；
图12a是本发明中的SPAAC反应原理图；
图12b是本发明的FITC及Biotin-MSNs-DBCO-FITC的UV-vis光谱图；
图12c是本发明的FITC在495nm下PBS 7.4中的吸收标准曲线；
图12d是本发明的Biotin-MSNs-DBCO和FITC-N3的SPAAC反应速率结果；
图13是本发明的HeLa细胞中的FITC-N3荧光显像图(magnification400×)，其中，第一行表示：Biotin-MSNs-DBCO预靶向4h的结果；第二行表示：Biotin-MSNs-DBCO预靶向后,用N3-OH(10μM)提前处理2h的结果；第三行表示：预靶向之前，生物素(10μM)提前处理2h的结果；第四行表示：FITC-N3处理细胞30min的结果；第一列为白光下的结果，第二列蓝光为DAPI下的结果，第三列绿光为FITC下的结果，merge表示：在DAPI和FITC下共定位的结果；
图14a是本发明的N3-S-S-NHC-Ru在不同浓度的GSH下，于30min内的剪切反应结果；
图14b是本发明的N3-S-S-NHC-Ru在1mM GSH下，于不同时间下的剪切反应结果；
图15是本发明的不同浓度和给药策略下处理HeLa细胞后，HeLa细胞的生存抑制曲线，其中：NHC-Ru表示NHC-Ru处理细胞后的细胞生存抑制曲线；N3-S-S-NHC-Ru表示N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的细胞生存抑制曲线；Biotin-MSNs-DBCO+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的细胞生存抑制曲线；Biotin-MSNs-DBCO/N3-OH+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，先用N3-OH处理细胞，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的的细胞生存抑制曲线；
图16是本发明的Biotin-MSNs-DBCO预靶向后，N3-S-S-NHC-Ru对HeLa细胞的IC50值，其中：NHC-Ru表示NHC-Ru处理细胞后的细胞IC50值；N3-S-S-NHC-Ru表示N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的细胞IC50值；Biotin-MSNs-DBCO+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的细胞IC50值；Biotin-MSNs-DBCO/N3-OH+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，先用N3-OH处理细胞，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的细胞IC50值；
图17是本发明的不同策略下，钌配合物对HeLa细胞线粒体膜电位的影响，图中的标尺为20μm，其中，Control表示对照组，Biotin-MSNs-DBCO表示Biotin-MSNs-DBCO处理HeLa细胞后的线粒体膜电位，N3-S-S-NHC-Ru表示N3-S-S-NHC-Ru处理HeLa细胞后的线粒体膜电位，Biotin-MSNs-DBCO+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后线粒体膜电位，Biotin-MSNs-DBCO/N3-OH+N3-S-S-NHC-Ru表示使用Biotin-MSNs-DBCO预靶细胞后，先用N3-OH处理细胞，再用N3-S-S-NHC-Ru处理细胞后的线粒体膜电位；
图18为本发明的FITC-N3的质谱图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
除非特别指明，以下实施例中的试剂均可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中的HeLa细胞购自中科院细胞库。
实施例1：含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的合成
1.NHC配体的合成：4-羟甲基咪唑(1.34g,10mmol)，K2CO3(4.14g,30mmol)和对叔丁基苄氯(1.82g,10mmol)在乙腈中加热回流8h，将反应液旋干。层析柱分离(CH2Cl2/CH3OH＝10:1),得反应中间体a为淡黄色固体。然后将所得化合物a与对叔丁基苄氯(1.82g,10mmol)在乙腈中加热回流过夜，将溶剂旋干，层析柱分离(CH2Cl2/CH3OH＝3:1),得白色固体NHC配体。
2.化合物2的合成：将羰基二咪唑(1.62g,10mmol)和2-叠氮乙醇(0.87g,10mmol)溶于50mL二氯甲烷中，室温反应30min。然后将其慢慢滴加至2-羟乙基二硫化物(1.54g,10mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应12h。反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离(乙酸乙酯/正己烷＝1:1),得化合物2为油状液体。
3.化合物3-N3-S-S-NHC配体的合成：将羰基二咪唑(1.62g,10mmol)和化合物2(2.67g,10mmol)溶于50mL二氯甲烷中，室温反应30min。然后将其慢慢滴加至NHC(4.26g,10mmol)的二氯甲烷溶液中，室温反应12h。反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离(二氯甲烷/甲醇＝10:1),得化合物3为油状液体。
4.配合物NHC-Ru和N3-S-S-NHC-Ru的合成：室温下，NHC或N3-S-S-NHC配体(2eq)和Ag2O(1eq)在10mL二氯甲烷中避光搅拌4h,然后加入二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II)(1eq),继续避光搅拌4h。反应结束后，过滤，除掉副产物AgCl，向滤液中加入正己烷40mL(可以根据实际情况在40-50mL内选择调整)，得粗产物。二氯甲烷/正己烷＝1/4重结晶，得橙色固体。
上述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的具体合成路线如图2所示，图中的R为亚甲基-4-叔丁基苯。
实施例2：预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO的合成
1.MSNs的合成:CTAB(2.0g)和TEA(50μL)于20mL水中95℃下搅拌1h，然后逐滴加入TEOS(1.5mL)，继续搅拌1h。离心，固体在HCl/MeOH中回流6h。离心，真空干燥，得MSNs纳米颗粒。
2.MSNs-NH2的合成:将MSNs(50mg)悬浮于100mL无水乙醇中，向其中加入APTES(0.5mL)，36℃下搅拌6h。离心，乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥，得MSNs-NH2。
3.Biotin-MSNs-DBCO的合成:将MSN-NH2(50mg)悬浮于10mL干燥的THF中，搅拌下，加入Biotin-PEG2000-NHS(5mg)，室温反应24h。然后加入DBCO-PEG2000-NHS(5mg)，继续室温反应24h。离心，真空干燥得Biotin-MSNs-DBCO。
上述Biotin-MSNs-DBCO的具体合成路线如图3所示。
实施例3：FITC-N3的合成
将3-溴丙胺氢溴酸盐(2.19g,10mmol)和叠氮化钠(1.95g,30mmol)溶于50mL水中，90℃回流过夜。冷至室温后，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干。得中间产物3-叠氮基丙胺。
将3-叠氮基丙胺(100mg,1mmol)、DIPEA(320μL,2mmol)溶于2mLDMF中，慢慢加入FITC-NCS(389mg,1mmol)的DMF溶液(2mL)。室温避光下反应过夜。反应结束后，将DMF旋干，乙醚洗涤三次，得FITC-N3为黄色固体。
上述FITC-N3的具体合成路线如图4所示。
此外，通过Quattro Micro,Micromass/Waters Corp.,USA型号的电喷雾质谱仪(ESI-MS)测定上述合成的FITC-N3的质谱图，结果如图18所示，从图18中可以看出，490.15为FITC-N3的分子离子峰，说明该FITC-N3合成成功。
实施例4：MSNs、Biotin-MSNs-DBCO的验证
测定实施例2制得的MSNs、Biotin-MSNs-DBCO的粒径分布图和透视电镜图(粒径分布和透视电镜图的测定，参见ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,9078-9087，粒径分布及Zeta电位的仪器马尔文公司NanoSight NS300；TEM仪器Hitachi(H-7650))，MSNs的结果如图5a所示，Biotin-MSNs-DBCO的结果如图5b所示，从图中可以看出所得纳米颗粒MSNs及Biotin-MSNs-DBCO均有较好的单分散性，纳米尺寸在85nm左右。
通过BJH方法(Barrett–Joyner–Halenda)测定MSNs及Biotin-MSNs-DBCO的氮气吸附-脱附曲线及孔径分布图，结果如图5c和图5d所示，从图中可以看出MSNs的比表面积为864.731m2g-1，孔体积约为2.59nm，而Biotin-MSNs-DBCO的比表面积减小为151.049m2g-1，孔径约为2.35nm，这是由于MSNs表面修饰Biotin及DBCO后，封堵了介孔硅的孔道所造成的。
测定MSNs、Biotin-MSNs-DBCO的zeta电位(电位的测定方法，参见ACSAppl.Mater.Interfaces 2015,7,9078-9087，粒径分布及Zeta电位的仪器马尔文公司NanoSight NS300；TEM仪器Hitachi(H-7650))，结果如图6所示，从图中可以看出，同时表面修饰后，zeta电位也从-14.2升高为8.6mV。
通过TENSOR27，Bruker型号的红外光谱仪测定Biotin-MSNs-DBCO的红外光谱图，结果如图7所示，从图中可以看出，Biotin-MSNs-DBCO的红外光谱中2940，1661,1500，1400cm-1的峰分别对应C-H,C＝O,C＝C和C-N的振动峰，所有结果表明，Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒合成成功。
实施例5：NHC-Ru及N3-S-S-NHC-Ru的表征
通过Bruker 400MHz仪器，在CDCl3为溶剂条件下测定NHC-Ru及N3-S-S-NHC-Ru的1H/13C NMR表征结果，结果如图8-11所示。
如图8所示，NHC-Ru:1H/NMR(400MHz,CDCl3,δ:ppm)下的特征峰为7.40(m,4H,CHphenyl),7.20(d,2H,J＝8.0Hz,CHphenyl),6.98(d,2H,J＝12.0Hz,CHphenyl),6.88(s,1H,CHim),5.64(s,2H,CHcymene),5.43(d,2H,J＝16.0Hz,CH2phenyl),5.29(s,1H,CHcymene),5.16(s,1H,CHcymene),5.00(d,2H,J＝44.0Hz,CH2phenyl),4.22(d,2H,J＝32Hz,CH2OH),3.49(m,1H,OH),2.68(m,1H,CH(CH3)2isopropyl),1.87(s,3H,CH3cymene),1.31(s,18H,C(CH3)3),1.18(m,6H,CH(CH3)2cymene)。
如图9所示，13C/NMR(100MHz,CDCl3,δ:ppm)下的特征峰为:176.92(NCN),150.85,150.46,135.83,134.47,130.74,128.62,128.30,127.27,125.79,125.15,122.54(Cimidazol+Cphenyl),107.12,96.72,85.72,84.14,83.78,83.51(Ccymene),65.83(CH2OH),54.82,52.08(CH2phenyl),34.57(C(CH3)3),31.36(C(CH3)3),30.48(CH(CH3)2cymene),22.91,22.12(CH(CH3)2cymene),18.37(CH3cymene)。
如图10所示，化合物N3-S-S-NHC-Ru:1H/NMR(400MHz,CDCl3,δ:ppm)下的特征峰为7.43(m,4H,CHphenyl),7.24(d,2H,J＝8.0Hz,CHphenyl),6.98(m,3H,CHphenyl+CHim),5.77(d,2H,J＝56.0Hz,CHcymene),5.45(d,2H,J＝36.0Hz,CHcymene),5.30(d,2H,J＝32.0Hz,CH2phenyl),5.08(d,2H,J＝40.0Hz,CH2phenyl),4.42(d,2H,J＝4.0Hz,CH2OH),4.39(m,4H,CH2C＝O),3.53(t,2H,J＝4.0Hz,CH2CH2N3),2.99(m,4H,CH2S-S),2.68(m,1H,CH(CH3)2isopropyl),1.96(s,3H,CH3cymene),1.88(s,2H,CH2N3),1.31(s,18H,C(CH3)3),1.26(m,6H,CH(CH3)2cymene)。
如图11所示，13C/NMR(100MHz,CDCl3,δ:ppm)下的特征峰为:179.29(NCN),154.56,154.17(C＝O),151.19,150.75,135.27,133.88,129.75,128.25,127.59,127.10,125.91,125.20,125.00(Cimidazol+Cphenyl),107.13,97.00,85.58,84.38,84.18,82.51(Ccymene),66.26,65.91(CH2C＝O),58.55,55.19(CH2im+CH2CH2N3),52.35(CH2phenyl),49.64(CH2N3),37.00,36.72(CH2S-S),34.63(C(CH3)3),31.35(C(CH3)3),30.58(CH(CH3)2cymene),22.64,22.34(CH(CH3)2cymene),18.38(CH3cymene)。
从上述图8和10可以看出，1H/NMR中NHC配体中的C2氢的信号峰消失(9.27-11.51ppm)，表明前体和金属钌配位成功，形成NHC-Ru配位键；同时从上述图9和11可以看出，13C/NMR谱中，NCN中碳的化学位移向低场移动至180ppm，进一步说明了NHC-Ru的形成，表明配合物NHC-Ru及N3-S-S-NHC-Ru合成成功。
实施例6：SPAAC反应
1.Biotin-MSNs-DBCO特异性结合含叠氮基药物的测试
将10mg实施例2制备的Biotin-MSNs-DBCO悬浮于5mL PBS(pH 7.4)中，加入30mg实施例3制备的FITC-N3,37℃下反应1h。取不同时间点的反应液(10,20,40,60min)，利用UV-vis检测反应速率。结果如图12a-12b所示，反应结束后，Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒的紫外吸收谱中495nm处的吸收峰为FITC的吸收，这表明在PBS中Biotin-MSNs-DBCO与FITC-N3可以发生反应。且20min内，反应产率达到93％。
2.Biotin-MSNs-DBCO在细胞内也能特异性结合药物的验证
将HeLa细胞接种于5cm玻璃底的培养皿中，接种数目为105个细胞，加入1mL培养基(MEM培养基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。用Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒(1mg/mL)处理细胞4h后，加入FITC-N3(5ng/mL)继续培养30min。弃掉上清液，PBS洗涤三次，DAPI染色115min。荧光显微镜拍照(LCS,OLYMPUS,日本)，观察细胞内FITC摄取情况。对于N3-OH竞争组，在Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒预处理后，加入FITC-N3之前，用N3-OH(0.1μM)先处理细胞2h。对于生物素竞争实验，在Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒预处理前，先用生物素(0.1μM)预处理细胞2h，其余相同。
结果如图13所示，与单独的FITC-N3相比，利用Biotin-MSNs-DBCO预靶向之后，细胞内荧光信号明显增强，这表明Biotin-MSNs-DBCO与FITC-N3在细胞内发生了反应，使得FITC-N3在细胞内得以保持。同时N3-OH竞争实验表明，N3-OH可以明显的减弱预靶向后细胞内的荧光信号强度，进一步说明，细胞内DBCO基团与叠氮基发生反应。此外，生物素也可以明显抑制预靶向后细胞内的荧光信号强度，这说明预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO由生物素介导靶向。
实施例7：GSH剪切实验
为了检测N3-S-S-NHC-Ru在细胞内是否能被谷胱甘肽(GSH)剪切释放药物NHC-Ru，我们考察了N3-S-S-NHC-Ru在不同GSH浓度下的剪切反应。如图14a所示，当GSH浓度较低时(0.1mM)，30min内N3-S-S-NHC-Ru几乎没变化。如图14b所示，当GSH浓度较高时(5mM)，30min内N3-S-S-NHC-Ru几乎被全部剪切，生成NHC-Ru。而GSH浓度为1mM时，相同条件下有近50％的N3-S-S-NHC-Ru被剪切。根据文献报道，肿瘤细胞内GSH的浓度为1-10mM，因此我们测定了GSH为1mM时，不同时间下的剪切产率。如图14a所示，15min时，剪切产率约为15％，随着时间的延长，产率也不断增加，直到60min时，转化率约为100％。结果表明，N3-S-S-NHC-Ru可以被GSH剪切。
实施例8：细胞毒性试验
将HeLa细胞接种于5cm玻璃底的培养皿中，接种数目为105个细胞，加入1mL培养基(MEM培养基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。用Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒(1mg/mL)处理细胞4h后，加入不同浓度的N3-S-S-NHC-Ru(6.125,12.5,25,50,100μM)处理细胞48h并通过MTT法测试细胞毒性(参照文献Dalton Transactions,2016,45,18147-18155.)。此外，还设置竞争组和对照组，对于N3-OH竞争组，在Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒预处理后，加入N3-S-S-NHC-Ru之前，用N3-OH(10μM)先处理细胞2h。对照组不加Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒，仅用N3-S-S-NHC-Ru或者NHC-Ru处理细胞。分别计算在相应浓度下，对细胞的抑制率，得到HeLa细胞的生存抑制曲线，如图15所示，结果表明N3-S-S-NHC-Ru的IC50值为27.15±1.77μM。
此外，根据图15得到的IC50值，比较不同给药策略下的IC50值，结果如图16所示(试验结果为三次独立实验的平均值，误差棒表示±S.D.***P<0.001)，化合物N3-S-S-NHC-Ru和NHC-Ru毒性相当，IC50值分别为19.26±1.26和27.15±1.77μM。而通过Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒预靶向4h后，N3-S-S-NHC-Ru的毒性明显提高，IC50值降低至6.68±1.29μM，活性提高了3倍。这主要是由于Biotin-MSNs-DBCO预靶向后，细胞内的DBCO基团给N3-S-S-NHC-Ru提供了外源性的靶点，使得N3-S-S-NHC-Ru可以在细胞内被特异性结合，从而提高了其活性。为了验证这一说法，我们同时在上述试验中考察N3-OH竞争实验(如图11中的Biotin-MSNs-DBCO/N3-OH+N3-S-S-NHC-Ru试验组)。结果表明，Biotin-MSNs-DBCO预靶向后，先用N3-OH(10μM)处理4h,化合物N3-S-S-NHC-Ru的IC50值增加至16.03±1.21μM。这可能是由于加入N3-OH后，叠氮基团会与DBCO基团反应，占据了DBCO的位置，使得N3-S-S-NHC-Ru无法特异性结合。
实施例9：线粒体膜电位
为检测药物对线粒体膜电位的影响，在用不同策略的药物(包括对照组，)细胞处理48h后，加入JC-1染料(10μg/mL)染色15min，荧光显微镜观察细胞内红色荧光及绿色荧光的情况。参照文献European Journal of Pharmacology,2016,786,60–71。
结果如图17所示，Biotin-MSNs-DBCO纳米颗粒单独处理后，肿瘤细胞中呈现亮红色荧光，与对照组相似，这说明Biotin-MSNs-DBCO对肿瘤细胞无毒。而给药组中，与单独N3-S-S-NHC-Ru处理相比，Biotin-MSNs-DBCO预靶向后，肿瘤细胞内绿色荧光明显增强，这说明在预靶向策略下，N3-S-S-NHC-Ru对线粒体的破坏增加。当加入N3-OH抑制后，肿瘤细胞内绿色荧光强度减弱，进一步说明预靶向策略对钌配合物抗肿瘤活性的增强作用。
综上，本发明首次合成了设计合成了一个基于SPAAC反应的预靶向给药体系Biotin-MSNs-DBCO及含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，通过一种新的输药策略——预靶向输药，增加药物靶向性，进而提高其抗肿瘤活性。具体地，通过体外实验表明，肿瘤细胞内Biotin-MSNs-DBCO可以特异性捕获FITC-N3并快速反应。N3-S-S-NHC-Ru中的二硫键可以被谷胱甘肽还原，释放药物NHC-Ru，尤其是通过生物素的靶向性能够与宫颈癌、结肠癌或肺癌细胞特异性结合，并且由于宫颈癌、结肠癌或肺癌中的生物素受体过表达，能够使其结合特异性进一步提高，从而提高其抗肿瘤的作用。细胞毒性实验表明，通过Biotin-MSNs-DBCO预靶向，N3-S-S-NHC-Ru的抗肿瘤活性升高了4倍，同时增强了对线粒体的损失。这一研究为新型载药系统的构建提供了研究基础，开拓了治疗宫颈癌的新方向。
此外，本发明的预靶向给药体系还具有以下优点：一是避免了寻找合适载体对药物的包裹和释放过程；二是通过生物正交反应，给药物提供了特异性结合的靶点，提高药物靶向性；并且由于可直接赋予药物靶向性的给药，避免了药物包裹及在运输过程中失靶的问题。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (10)
1.一种预靶向给药体系，包括预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO及含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，其中，所述Biotin-MSNs-DBCO中的DBCO表示二苯基环辛炔，Biotin表示生物素，MSNs表示纳米颗粒，Biotin和DBCO通过PEG与MSNs连接；
所述N3-S-S-NHC-Ru的结构式如下述(Ⅰ)式所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯。
2.根据权利要求1所述的预靶向给药体系，所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru在癌症细胞中通过谷胱甘肽剪切；或
所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru对癌症细胞的IC50值为6.125～100μM；所述IC50值优选为25.38-28.92μM；
优选地，所述癌症为宫颈癌、肺癌或结肠癌。
3.一种用于制备权利要求1或2所述的预靶向给药系统中的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，所述N3-S-S-NHC-Ru的结构式如下述(Ⅰ)式所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯。
4.根据权利要求3所述的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的制备方法，包括以下步骤：
1)NHC配体的合成：将适量的4-羟甲基咪唑、K2CO3和对叔丁基苄氯在乙腈中加热回流，将反应液旋干，层析柱分离得到中间体；再将所述中间体与对叔丁基卞氯在乙腈中加热回流，层析柱分离得到NHC配体，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
2)化合物2的合成：将适量的羰基二咪唑(CDI)和2-叠氮乙醇溶于二氯甲烷中反应，然后将其慢慢滴加至适量的2-羟乙基二硫化物的二氯甲烷溶液中反应，反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物2为油状液体，所述反应过程如下述所示：
3)N3-S-S-NHC配体(化合物3)的合成：将适量的羰基二咪唑和步骤2)中制备的化合物2溶于适量的二氯甲烷中反应；然后将其慢慢滴加至适量的步骤1)中制备的NHC配体的二氯甲烷溶液中反应；反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物3为油状液体，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
优选地，将羰基二咪唑和步骤2)中制备的化合物2溶于二氯甲烷中，于室温反应30min；然后将其慢慢滴加至步骤1)中制备的NHC配体的二氯甲烷溶液中反应12h；反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物3为油状液体；
更为优选地，在步骤3)的整个反应中，羰基二咪唑、化合物2和NHC配体加入的物质的量相同；
进一步优选地，将溶剂旋干后通过体积比为10:1的二氯甲烷/甲醇进行层析柱分离；
4)含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的合成：将适量的步骤3)制备的N3-S-S-NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌,然后加入适量的二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌；反应结束后，过滤，除掉副产物AgCl，向滤液中加入正己烷，得粗产物；再将所述粗产物通过重结晶，得橙色固体为含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru，所述反应过程如下述所示：
其中：R为亚甲基-4-叔丁基苯；
优选地，将NHC配体或N3-S-S-NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌4h,然后加入二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌4h；
更优选地，将所述粗产物通过体积比为1:4的二氯甲烷/正己烷进行重结晶；
优选地，所述方法还包括配合物NHC-Ru的合成，通过包括以下步骤的方法合成：将适量的步骤1)制备的NHC配体和Ag2O在二氯甲烷中避光搅拌,然后加入适量的二氯双(4-甲基异丙基苯基)钌(II),继续避光搅拌；反应结束后，过滤，除掉副产物AgCl，向滤液中加入正己烷，得粗产物；再将所述粗产物通过重结晶，得橙色固体为配合物NHC-Ru，所述反应过程如下述所示：
5.根据权利要求4所述的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，将4-羟甲基咪唑、K2CO3和对叔丁基苄氯以1:3:1的摩尔比在乙腈中加热回流8h；
优选地，再将所述中间体与对叔丁基苄氯在乙腈中加热回流，所述对叔丁基苄氯的加入量与获得中间体的反应中对叔丁基苄氯的加入量相同；
更优选地，所述中间体通过体积比为10:1的CH2Cl2/CH3OH进行层析柱分离获得；所述NHC配体通过体积比为3:1的CH2Cl2/CH3OH进行层析柱分离获得。
6.根据权利要求4或5所述的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，将适量的羰基二咪唑和2-叠氮乙醇溶于二氯甲烷中反应30min，然后将其慢慢滴加至适量的2-羟乙基二硫化物的二氯甲烷溶液中，于室温反应12h，反应结束后，将溶剂旋干，层析柱分离,得化合物2为油状液体；
优选地，在步骤2)的整个反应中，羰基二咪唑、2-叠氮乙醇和2-羟乙基二硫化物加入的物质的量相同；
更为优选地，将溶剂旋干后通过体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷进行层析柱分离。
7.一种用于制备权利要求1或2所述的预靶向给药系统中的预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO，所述预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO通过包括以下步骤的方法制得：
(1)MSNs纳米颗粒的合成:将适量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三乙胺(TEA)加入水中搅拌，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，继续搅拌，得到反应液；再将所述反应液离心，去上清得到固体，然后将所述固体在HCl/MeOH中回流，离心，真空干燥，得MSN纳米颗粒；优选地，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三乙胺(TEA)加入水中，于95℃下搅拌1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，继续搅拌1h；更优选地，将所述固体在HCl/MeOH中回流6h；
(2)MSNs-NH2的合成:将适量的步骤(1)中制备的MSN纳米颗粒悬浮于无水乙醇中，得到混合溶液，再向所述混合溶液中加入适量的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)搅拌，离心，干燥，得MSNs-NH2；优选地，将MSN纳米颗粒悬浮于无水乙醇中，36℃下搅拌6h，得到混合溶液；更优选地，于60℃下真空干燥；
(3)预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO的合成:将适量的步骤(2)中制备的MSN-NH2悬浮于适量的干燥的四氢呋喃(THF)中，搅拌下，加入适量Biotin-PEG2000-NHS反应，优选于室温反应24h；然后加入适量DBCO-PEG2000-NHS继续反应，优选继续于室温反应24h，得到反应液，再将所述反应液离心，真空干燥得预靶向纳米颗粒Biotin-MSNs-DBCO。
8.根据权利要求1所述的预靶向给药体系在制备用于抗肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述给药体系中的含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru在癌症细胞中通过谷胱甘肽剪切；或
所述含叠氮基钌配合物N3-S-S-NHC-Ru对癌症细胞的IC50值为6.125～100μM；所述IC50值优选为25.38-28.92μM；
优选地，所述癌症为宫颈癌、肺癌或结肠癌；
更优选地，所述抗肿瘤的药物或试剂盒还包括FITC-N3；
进一步优选地，所述FITC-N3通过包括以下步骤的方法制得：
A.3-叠氮基丙胺的制得：将适量3-溴丙胺氢溴酸盐和叠氮化钠溶于水中，回流过夜，得到反应混合液；再将所述反应混合液冷却后，通过二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥旋干，得中间产物3-叠氮基丙胺；优选地，所述3-溴丙胺氢溴酸盐和叠氮化钠以1:3的摩尔比进行反应；更优选地，于90℃回流过夜；所述反应过程如下述所示：
B.FITC-N3的制得：将步骤A中制得的适量的3-叠氮基丙胺和
N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于适量DMF中，慢慢加入适量的异硫氰酸荧光素(FITC-NCS)的DMF溶液，室温避光下反应过夜，反应结束后，将DMF旋干，乙醚洗涤三次，得FITC-N3；优选地，在该反应步骤中，3-叠氮基丙胺、DIPEA和FITC-NCS加入的物质的量的比为1:2:1；所述反应过程如下述所示：
10.一种用于抗肿瘤的预靶向药物组合物，包括有效量的权利要求1或2所述的预靶向给药体系和药学上接受的辅料；优选地，所述肿瘤为宫颈癌、肺癌或结肠癌。
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|---|---|
| CN107496937B (zh) | 2020-09-25 |
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