CN106460059B - 肺动脉高压生物标志物 - Google Patents

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Abstract

肺动脉高压是一种与血管重塑相关并且导致右心机能障碍的具有多种来源的渐进性疾病。累积的证据表明，免疫细胞和炎性趋化因子在肺动脉高压的发病机理和进展中的重要作用。我们已经鉴定了CCL21作为肺动脉高压中抗重塑疗效的生物标志物。我们发现CCL21在区分肺动脉高压患者与匹配对照中是高度灵敏和特异性的。CCL21在肺动脉高压中上调并且用抗重塑剂治疗时下调。

Description

肺动脉高压生物标志物
发明领域
本发明是呼吸疾病生物标志物领域。特别地，涉及CCL21表达作为肺动脉高压的生物标志物的用途。
发明背景
肺动脉高压是一种与不良预后相关的具有多种来源的渐进性疾病，并且导致右心机能障碍。以其所有的变化呈现形式，估计这种疾病影响了全世界多达1亿的人1。根据肺动脉高压目前的分类(在2008年第4届世界肺动脉高压研讨会上达成一致)，存在五类慢性肺动脉高压。
肺动脉高压(PH)定义为静息时>25mmHg(运动后>30mmHg)的平均肺动脉压升高。第1类PH可以进一步细分成由前毛细血管微血管病变引起增加的肺血管阻力的疾病(诊断为<15mmHg的前毛细血管楔压)。在这类中，我们发现，特发性肺动脉高压(IPAH)和家族性肺动脉高压，相关性肺动脉高压，涉及静脉/毛细血管的肺动脉高压，以及新生儿持续性肺动脉高压。第2类包括由于左心疾病引起的肺动脉高压，而第3类包括与肺部疾病/缺氧相关的肺动脉高压(例如，COPD)，第4类肺动脉高压与慢性血栓栓塞性疾病相关2。
尽管在了解肺动脉高压的基础病理学中的进展以及诊断和新治疗剂研发中的一些提高，但仍然存在显著的未满足的医疗需求以及在一系列肺动脉高压中不可接受的发病率和死亡率。
肺动脉高压的亚分类区分其基础病因。然而，它们均通过过度肺血管收缩和异常血管重塑独特丛状损伤来表征。与炎症和氧化应激相关的内皮功能障碍和血管平滑肌细胞(SMC)增殖是肺动脉高压的主要特征3-5。这些结构变化表明从静止状态向增殖、抗凋亡细胞表型的转变6,7。血管重塑可以导致肺血管阻力的慢性升高、右心衰竭和死亡。
几项研究还提出免疫机制在肺动脉高压病理生理学中的作用8。已经在重塑的肺动脉中检测到炎性细胞和强烈的细胞因子产生，并且已经证实血管基质细胞对炎性刺激是敏感的9。此外，已经在IPAH中检测到升高的循环细胞因子水平10,11。多达三分之一患有肺动脉高压的患者具有对抗各种血管自身抗原的循环自身抗体12,13。这表明由T和B淋巴细胞组成的适应性免疫系统的参与，并且事实上已经在肺血管肺动脉高压损伤中检测到血管周T和B淋巴细胞14。在慢性炎性疾病和自身免疫疾病方面的工作表明，致病性抗体和T细胞也可以局部产生，在靶器官中，在通常称为三级淋巴组织(tLT)的高度组织化的异位淋巴样滤泡中15。tLT在慢性肺部疾病中作用的重要性正在增加，尤其是在慢性阻塞性肺疾病16、特发性肺纤维化17和闭塞性细支气管炎18以及最近的肺动脉高压19中。通过局部吸引幼稚T和B细胞，启动二级淋巴样组织的异位形成。因此，稳态趋化因子和淋巴细胞存活因子，例如吸引CCR7-表达细胞(如成熟DC、幼稚T细胞和B细胞)的CCL21，的局部产生20，可能是异位淋巴组织形成中的关键事件。尤其是，最近已经在来自IPAH患者的肺外植体中在tLT中检测到了CCL21表达19。
目前的指导原则推荐使用脑钠尿肽(BNP)或BNP肽原的N-末端片段(NT-proBNP)，作为死亡风险分层的生物标志物。钠尿肽是肺动脉高压的第一种血液来源的标志物。Nagaya等首次证明，BNP的血浆水平在肺动脉高压中具有预后意义21。BNP水平预测了症状性先天性心脏病成年患者的死亡率22，并且BNP还是治疗反应的独立预测物。在肺动脉高压患者的回顾性研究中，NT-proBNP(BNP合成的副产物)的系列测量与存活相关23。NT-proBNP值的对数转化鉴定了处于不良事件风险中的肺动脉高压患者，具有98％的特异性和60％的灵敏度24。
然而，BNP或NT-proBNP是心肌应变(心脏过度伸展)和提高的心律的标志物，不直接反映肺中负责驱动肺动脉高压病理生理学的远端肺动脉的变化。心脏并且尤其是右心室的重塑变化被认为跟随着肺动脉重塑。因此，尤为有意义的是，在疾病进展引起右心中可以观察到该效应之前，使用替代性非侵入性循环生物标志物来评价和监控肺动脉重塑。
特别是指示病理机制、疾病严重度或治疗反应的生物标志物，将是用于管理肺动脉高压的理想工具，并且也将促进未来临床试验的成功执行。
发明概述
现在已经发现，CCL21是用于从匹配的对照中区分出肺动脉高压患者的高特异性和灵敏性生物标志物。
本发明因此提供一种用于确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括
a)提供自怀疑患有肺动脉高压的受试者获得的生物样品；
b)检测生物样品的CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；
其中与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压。
本发明还提供治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果与基线值CCL21表达和/或CCL21蛋白量相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白的量。
本发明还提供预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括，分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性。
在这些方面的一些实施方案中，分析步骤包括：分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，例如该核酸可以选自CCL21核糖核酸(RNA)或其片段和互补脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。在一些其他实施方案中，分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段。
在这些方面的一些其他实施方案中，生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、粪便和组织样品。
在这些方面的一些其他实施方案中，分析步骤包括：选自Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、基于TaqMan的检测、直接测序、动态等位基因特异性杂交、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶试验、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解分析、DNA错配-结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹、免疫试验、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、Western印迹、HPLC和质谱的技术。
本发明还提供用于确定受试者是否患有肺动脉高压或用于预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的试剂盒，该试剂盒包括
a)至少一个能够检测CCL21表达和/或CCL21蛋白存在的探针；和
b)使用探针分析来自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白存在的说明书。
在这个方面的一些实施方案中，探针选自：与CCL21表达的核苷酸序列的区域特异性杂交的寡核苷酸、或能够结合CCL21蛋白或其片段的结合分子。
在这个方面的一些实施方案，结合分子是抗体或其片段。
附图简述
图1：来自用伊马替尼(Imatinib)治疗后缺氧/Sugen大鼠PH模型中肺mRNA表达谱的候选生物标志物。
图2：来自PH患者和匹配对照(年龄、种族、性别比例匹配)的血清和血浆样品中的人CCL21蛋白水平。
图3：在来自经历肺移植的PH患者的人肺切片中通过免疫组织化学检查的CCL21蛋白表达和定位。
发明详述
定义
为了解释本说明书的目的，将应用以下定义并且在适当的时候，单数形式使用的术语还将包括复数并且反之亦然。其他定义在整个说明书中阐述。
除非另行指明，术语“CCL21”是指人CCL21，具有例如ENST00000259607(Ensembl)中定义的氨基酸序列。
除非另行指明，术语“CCL21”是指人CCL21基因，具有例如ENSP00000259607(Ensembl)中定义的核苷酸序列。
术语“CCL21”与SCYA21；ECL；SLC；CKb9；TCA4；6Ckine；6Ckine；exodus-2；“趋化因子(C-C基序)配体21[智人(Homo sapiens人)]”；“C-C基序趋化因子21”；“β趋化因子exodus-2”；“有效的淋巴细胞化学引诱物”；exodus-2；“二级淋巴组织趋化因子”；“小的可诱导细胞因子亚家族A(Cys-Cys),成员21”同义。
如本文中使用的，术语“基因”表示基因及其所有目前已知的变体。
如本文中使用的，术语“水平”是指，根据本发明的生物标志物的RNA和/或DNA和/或蛋白拷贝数。通常，在获自治疗中的患者的生物样品中生物标志物的水平，与获自健康受试者的相似样品中相同生物标志物的水平，不同(即，提高或降低)。
术语“分析(assaying)”、“分析(to assay)”、“检测(detection)”、“检测(detecting)”和“检测(to detect)”是指，鉴定一种或多种生物标志物的存在或不存在。术语“测量(measurement)”、“测量(measuring)”和“测量(to measure)”是指，鉴定一种或多种生物标志物的存在、不存在或量。
如本文中使用的，“基线值”通常是指，在来自没有显示肺动脉高压的“正常”健康受试者的相当样品(例如，来自与测试组织相同类型的组织)中，CCL2表达(例如，mRNA)或CCL21多肽(或蛋白)的水平(量)。如果需要，可以使用一组或一系列来自正常受试者的相同组织，并且基线值可以是测量值的平均指(average或mean)。本领域技术人员无需过度实验即可确定合适的基线值。合适的基线值可以从这些数值汇编的数据库中获得，和/或可以基于公开的数据或患者组织的回顾性研究、以及本领域普通技术人员实施本发明方法时将明了的其他信息来确定。可以使用提供合适的置信区间的统计学工具来选择合适的基线值，使得落在标准值外的测量水平可以从诊断角度被接受为异常的并且预测肺动脉高压。
如本文中使用的，数值的“显著”提高可以指，可重现的或统计学显著的差异，如使用合适的和本领域公知的统计学方法测定的，其中通常低于百分之五变化几率的概率值由随机变异引起。通常，统计学上显著的值是偏离“正常”健康对照受试者的数值至少两个标准偏差。合适的统计学检验将是本领域技术人员显而易见的。例如，与基线值相比，蛋白量的显著提高可以为约50％，2倍或更高。
如本文中使用的，术语“同源物”或“同源的”是指，与野生型具有共同的进化祖先或具有至少50％序列同一性的多核苷酸或多肽变体。
如本文中使用的，术语“结合分子”表示特异性地结合CCL21多肽的任何蛋白或肽。“结合分子”包括，但不限于，抗体及其片段，如免疫学功能片段。如本文中使用的，术语抗体或免疫球蛋白链的“免疫学功能片段”是包含抗体的一部分(抗原结合部分)(但与该部分是怎样获得或合成的无关)的一类结合蛋白，其中所述部分缺少存在于全长抗体链中的至少一些氨基酸但其仍能够特异地结合CCL21。
术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其功能片段。如本文中使用的，术语“抗体”表示，来自免疫球蛋白基因或其片段的包含框架区的多肽，其特异性地结合并识别表位，例如，人CCL21上的表位。术语“抗体”包括完整抗体(如单克隆、嵌合、人源化和人抗体)，包括单链完整抗体，及其抗原结合片段。术语“抗体”包括抗原结合抗体片段、单链抗体，其可以仅包含可变区，或包含可变区与以下的全部或部分多肽元件的组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。
如本文中使用的，“能够结合CCL21”的结合分子用来表示以1×10-6M或更低，或1×10-7M或更低，或1×10-8M或更低，或1×10-9M或更低，1×10-10M或更低的KD结合CCL21的结合分子。
如本文中使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“患者”包括任何人或非人动物。
术语“肺动脉高压拮抗剂”表示抑制、治疗、预防、治愈肺动脉高压的任何分子。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treament)”、“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”包括，治疗性处理、预防性处理和应用，其中降低受试者罹患疾病的风险或其他风险因素。治疗和/或预防不需要疾病的完全治愈，包括症状或根本性风险因素的减少或至少疾病进展的减缓。
术语“包含”表示“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以只由X组成，或可以包括一些其他物，例如，X+Y。
关于数值x，术语“约”表示，例如，x+10％。关于两个氨基酸序列之间的百分比序列同一性，是指，比对时，在两个序列的比较中相同的氨基酸的百分比。可以使用本领域已知的软件程序，例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987)增补30的7.7.18部分中所述的那些，来确定该比对和百分比同源性或序列同一性。优选的比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法来确定，使用仿射空位搜索(affine gapsearch)，使用12的空位开放罚分和2的空位延伸罚分，62的BLOSUM矩阵。Smith-Waterman同源性搜索算法公开于Smith&Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489。
CCL21作为肺动脉高压的生物标志物
趋化因子(C-C基序)配体21(CCL21)是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL21是参与免疫调节和炎性过程的几种CC细胞因子基因之一。CC细胞因子是特征在于两个相邻半胱氨酸的蛋白。与其他趋化因子相似，由这种基因编码的蛋白抑制造血并刺激趋化性。这种蛋白在体外对于胸腺细胞和T细胞，特别是幼稚T-细胞，是趋化性的，但对于B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞则不是。其是T和B淋巴细胞上表达的趋化因子受体7的高亲和性功能配体25。CCL21被认为在介导淋巴细胞至二级淋巴器官的归巢中起作用。最近，已经在来自特发性肺动脉高压患者的外植肺中在tLT中在二级淋巴组织的异位形成中检测到CCL21表达19。在此研究中，在人和大鼠样品中都研究了CCL21。大鼠和人CCL21蛋白序列为67％相同，这表明两个物种之间的高度同源性。
诊断和治疗的方法
本发明提供用于确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中的CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；
其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量表示肺动脉高压。
本发明还提供预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括，分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性。
此外，本发明提供治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果与基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白的量。
在本发明的实施方案中，分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸。
CCL21基因表达的结果可以是多核苷酸(或核酸)。多核苷酸或核酸是包含至少两个核酸单体的链的分子，所述单体可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、及其任何修饰的核苷。特别包括DNA分子以及基因组和cDNA序列，RNA分子如mRNA，以及未剪接或部分剪接的转录产物和剪接产物。
在一个实施方案中，用于确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在再一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在本发明的其他实施方案中，分析步骤包括分析生物样品中CCL21蛋白或其片段。
根据本发明的CCL21蛋白(或多肽)包括通过人CCL21基因的(完全或不完全)转录和翻译获得的多肽。
多肽变体也包括在本发明中。变体多肽包括，与野生型多肽相比，含有一个或多个缺失、插入和/或置换的分子，其中所述野生型多肽通过野生型人CCL21基因的转录和翻译、或通过该基因的野生型多核糖核苷酸转录物的翻译而获得。
根据本发明的生物标志物可以是CCL21多肽(或蛋白)的片段或降解产物。
在一个实施方案中，确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段。
在另一个实施方案中，确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，该方法包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中肺动脉高压是特发性肺动脉高压。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中肺动脉高压是特发性肺动脉高压。
再在另一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段。
在另一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中肺动脉高压是特发性肺动脉高压。
在本发明的其他实施方案中，分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的修饰核酸序列或修饰的CCL21蛋白或其片段。
多核苷酸或多肽的修饰是本领域公知的。可以分别对多核苷酸或多肽的一个或多个核苷或氨基酸残基进行修饰。备选地，或与上述化学修饰组合，可以修饰单体之间的连接。更多已知的修饰包括标签或标记与多核苷酸或多肽生物标志物的缀合。
多核苷酸的化学修饰包括但不限于，由烷基、酰基或氨基基团替代氢，糖部分或糖间连接(即，硫代磷酸酯)的改变，用放射性核苷酸(即，32P)标记核苷酸，与标签或标记分子缀合，如荧光标签(即，若丹明、荧光素、Cy3和/或Cy5)、化学发光标签、生色标签或其他标记(即，地高辛或生物素和磁粒)。本文中还包括糖部分、嘌呤和嘧啶杂环及其杂环类似物和互变异构体的修饰。举例说明性的实例是二氨基嘌呤8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-氮杂黄嘌呤、7-氮杂鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基-胞嘧啶、N6,N6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、,5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、次黄嘌呤和美国专利No.5,432,272；Scheit，Nucleotide Analogs，JohnWiley，New York，1980；Freier和Altmann，Nucl.Acid Res.，1997，25(22)，4429-43；Toulme’，J.J.，Nature Biotechnology 19:17-18(2001)；Manoharan M.；Biochemica etBiophysica Acta 1489:117-139(1999)；Freier S.M.，Nucleic acid Research，25:4429-4443(1997)；Uhlman E.，Drug Discovery&Development，3:203-213(2000)；Herdewin P.，Antisense&Nucleic acid Drug Dev.，10:297-310(2000)中所述的实例。
各种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的。例如，可以通过寡聚物标记、切口平移、末端标记或使用标记引物的PCR扩增，来实现多核苷酸或核酸标记。
根据本发明的多核苷酸生物标志物的化学修饰优选包括放射性同位素标记和/或荧光剂标记。更优选，根据本发明的多核苷酸生物标志物，尤其是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增拷贝数时，包含荧光标签(例如，
Figure BDA0001168067640000131
基因表达试验由一对未标记的PCR引物、和在5’端具有FAMTM或
Figure BDA0001168067640000132
染料标记以及在3’端上具有小沟结合物(MGB)非荧光淬灭剂(NFQ)的
Figure BDA0001168067640000133
探针组成。
生物样品
在本发明的实施方案中，生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、粪便和组织样品。
“提供的”样品可以由实施分析的人(或机器)获取，或可以已经由其他人(机器)获取并转移给实施分析的人(或机器)。
许多合适的样品类型是本领域技术人员清楚的。在本发明的一个实施方案中，样品是血样，如全血、血浆、或血清(已经除去了凝血因子的血浆)。例如，可以使用外周或静脉血浆或血清。在另一个实施方案中，样品是尿液、汗液、或其它体液，有时候蛋白质可以从血流中移动至其中。例如，在尿液的情况中，蛋白质很可能会被分解，因此可以筛查本发明的蛋白质的诊断性片段。在另一个实施方案中，样品是收获的(例如在活检后)肺组织。用于获得样品并将其制备用于分析的方法是常规的并且是本领域公知的。
在一个实施方案中，确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，该方法包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；
其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在再一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在另一个实施方案中，确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
再在另一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
在一些实施方案中，提供治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中肺动脉高压拮抗剂选自：钙通道阻断剂、磷酸二酯酶(PDE)5抑制剂、鸟苷酸环化酶(sGC)刺激剂、内皮素受体拮抗剂(ERA)和前列环素激动剂。
检测(或分析)方法
可以使用本领域技术人员已知的或清楚的各种方法来进行基因或蛋白表达谱分析。
在一些实施方案中，分析步骤包括选自Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、基于TaqMan的试验、直接测序、动态等位基因特异性杂交、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶试验、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解分析、DNA错配-结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹、免疫试验、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、Western印迹、HPLC和质谱的技术。
通常，基因表达谱分析的方法可以分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法，和基于多核苷酸的生化检测或测序的其他方法。本领域已知的用于定量样品中的mRNA表达的最常用方法包括，northern印迹和原位杂交(Parker&Barnes，Methods in MolecularBiology 106:247-283(1999))；RNAse保护试验(Hod，Biotechniques 13:852-854(1992))；和反向转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(Weis等，Trends in Genetics 8:263-264(1992))。
或者，可以使用能够识别特定双链体的抗体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白双链体。用于测定mRNA或蛋白表达的各种方法包括，但不限于，基因表达谱分析、聚合酶链式反应(PCR)，包括定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析(可以通过商业购得的设备按照制造商的实验方案进行，如通过使用Affymetrix GenChip技术)，基因表达的系列分析(SAGE)(Velculescu等，Science 270:484-487(1995)和Velculescu等，Cell 88:243-51(1997))，MassARRAY，通过大规模平行标签测序(MPSS)的基因表达分析(Brenner等，Nature Biotechnology 18:630-634(2000))，蛋白质组学，免疫组织化学(IHC)等。优选，定量mRNA。优选使用聚合酶链式反应(PCR)的技术或通过微阵列分析来进行这样的mRNA分析。在使用PCR的情况中，优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。
免疫组织化学方法也适用于检测本发明的生物标志物的表达水平。因此，可以使用每种标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，和最优选单克隆抗体，来检测表达。可以通过直接标记抗体自身来检测抗体，例如，使用放射性标记，荧光标记，半抗原标记，如生物素，或酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，将未标记的一抗组合标记的二抗来使用，二抗包括对一抗特异的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组织化学方案和试剂盒是本领域公知的并且是商业上可购得的。
还可以在蛋白水平检测表达水平，例如，使用各种类型的免疫试验或蛋白质组学技术。
在免疫试验中，通过使用特异性地结合标志物的抗体来检测目标诊断性蛋白标志物。通常用可检测部分来标记抗体。各种标记是可利用的，其通常可以分为以下类别：放射性同位素，如35S、14C、1251、3H和1311。可以使用例如Current Protocols in Immunology(免疫学通用实验方案)，卷1和2，Coligen等(1991)编辑，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs中描述的技术，用放射性同位素来标记抗体，并且可以使用闪烁计数来测量放射性。
荧光标记，如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和得克萨斯红(Texas Red)是可利用的。可以使用例如上引文“Current Protocols in Immunology(免疫学通用实验方案)”中公开的技术，将荧光标记与抗体缀合。可以使用荧光计定量荧光。
各种酶-底物标记是可利用的，并且美国专利No.4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶通常催化生色底物的化学改变，该化学改变可以使用各种技术来测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以通过分光光度来测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。以上描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物可以通过化学反应被电激发，并且随后可以发射可被测量(例如，使用化学光度计)的光，或向荧光受体提供能量。酶标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan等(1981)，Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay(用于制备用于酶免疫检测中的酶-抗体缀合物的方法)，见Methods in Enzym.(酶方法)，(编辑J.Langone&H.Van Vunakis)，Academic press，New York 73:147-166。
酶-底物组合的实例包括，例如，辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对-硝基苯基磷酸盐；和β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可利用各种其他酶-底物组合。对于这些的概述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
在其他形式的免疫试验技术中，抗体不需要标记，并且可以使用结合该抗体的标记抗体来检测其存在。为了检测血浆和血清样品中的人CCL21蛋白，使用了在Mesoscale
Figure BDA0001168067640000191
(MSD)平台上的定制免疫试验。MSD的电化学发光检测技术使用SULFO-TAGTM标记，其在MULTI-ARRAY和
Figure BDA0001168067640000192
微板的电极表面启动电化学刺激时发射光。
因此，本文中的诊断免疫试验可以是任何分析形式，包括，例如，竞争性结合试验、直接和间接夹心试验如ELISA，和免疫沉淀试验。
在一个实施方案中，用于确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，该方法包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括通过PCR或RT-PCR分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括通过PCR或RT-PCR分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在再一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括通过PCR或RT-PCR分析生物样品中CCL21表达的核酸序列，其中所述核酸选自核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。优选，核酸是从CCL21mRNA扩增的cDNA。
在另一个实施方案中，确定受试者是否患有肺动脉高压的方法，包括：
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量指示肺动脉高压；其中分析步骤包括通过免疫试验或ELISA分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
在另一个实施方案中，预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性的方法，包括：通过免疫试验或ELISA分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；其中，相对于基线值提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白水平，指示增加的患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性；其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
再在另一个实施方案中，治疗肺动脉高压患者的方法，包括
a)分析获自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
b)如果，与指示未患有肺动脉高压的受试者中的CCL21表达和/或CCL21蛋白量的基线值相比，患者具有统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白量，则施用治疗有效量的肺动脉高压拮抗剂；其中分析步骤包括通过免疫试验或ELISA分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段；其中生物样品选自血液或血浆或血清。
本发明的试剂盒
本发明提供试剂盒，所述试剂盒用于确定受试者是否患有肺动脉高压、或用于预测肺动脉高压患者应答肺动脉高压拮抗剂治疗的可能性，所述试剂盒包括，
a)至少一个能够检测CCL21表达和/或CCL21蛋白的存在的探针；和
b)使用探针分析来自患者的生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的存在的说明书。
在一个实施方案中，探针选自与CCL21表达的核苷酸序列的区域特异性杂交的寡核苷酸，如基因特异性或基因选择性探针和/或引物，用于定量CCL21的表达。
试剂盒可以任选进一步包括用于从样品(特别是固定的石蜡包埋的组织样品)提取RNA的试剂，和/或用于RNA扩增的试剂。试剂盒可以包括容器(包括适用于自动化实施所述方法的微滴定板)，其分别含有一种或多种不同试剂(通常是浓缩形式)，例如，预制的微阵列、缓冲液、合适的核苷三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶。
在另一个实施方案中，探针是能够结合CCL21蛋白或其片段的结合分子。优选，结合分子是抗体或其片段。
其他结合分子可以是具有基于III型纤连蛋白结构域(例如，III型纤连蛋白的第十模块(10Fn3结构域))的支架的分子、adnectin
Figure BDA0001168067640000224
包括锚蛋白来源的重复模块的分子、
Figure BDA0001168067640000222
分子、
Figure BDA0001168067640000223
分子、
Figure BDA0001168067640000221
分子、和蛋白表位模拟物。
实施例
通过以下实施例进一步举例说明本发明，所述实施例不应当解释为限制性的。
1.缺氧/Sugen大鼠模型基因芯片谱分析
使用PH的大鼠缺氧/Sugen模型，以实验PH和幼稚大鼠肺，进行大鼠肺样品之间的比较性转录物组谱分析。
根据英国内政部条例(科学程序)1986条(the British Home Officeregulations(Scientific Procedures)Act of 1986,UK)，进行所有动物操作。
将Sugen(250mg；SU5416；
Figure BDA0001168067640000225
)溶解于载体(12.5ml；去离子水中0.5％(wt/vol)羧甲基纤维素钠，0.9％(wt/vol)NaCl，0.4％(vol/vol)聚山梨酸酯，0.9％(vol/vol)苄醇)中，超声处理15min，随后涡旋。在第0天，将动物麻醉，称重，并通过皮下注射接受Sugen 20mg/kg。将动物放入缺氧室中，并且将O2水平缓慢降至10％。对照动物保持在房间空气(21％O2)中，以作为研究的常氧对照。2周后，所有动物从缺氧室中取出。在第4周，将动物在七氟醚(sevofluorane)麻醉下接受超声心动图测量并且密切监控直至完全恢复。动物在氯胺酮(ketamin)和美托咪定(medetomidine)混合物麻醉下接受RV插管，用于右心室压(RVP)测量。按照进度表1实施安乐死后，取出左肺叶，充气并在10％甲醛中固定，并包埋在石蜡中，用于组织学分析。将右肺叶速冻，用于转录谱分析。
使用Covaris CryoPrep CP02粉碎收集在TT2组织袋(K
Figure BDA0001168067640000231
Cat#520021)中的冷冻大鼠肺样品。根据制造商的实验方案(QiagenTM)，通过RNeasy迷你试剂盒，从粉碎的肺样品提取总RNA。通过用DNase I(Turbo DNase试剂盒，Invotrogen)处理，除去基因组DNA。用NanoDrop ND-1000分光光度计检测RNA的精确含量。通过2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上的基于微流体学的电泳，分析18S和28SrRNA，来评价RNA质量。
对于微阵列制备和分析，使用Affymetrix One-Round体外转录RNA扩增试剂盒来扩增1μg总RNA。用含有寡(dT)的引物和T7RNA聚合酶启动子序列来合成互补DNA(cDNA)。然后纯化双链cDNA并用作模板来产生生物素化的cRNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer评价了扩增的cRNA的含量和质量。将生物素化的cRNA片段化并与Affymetrix Rat GeneChip阵列230_2杂交。杂交后，洗涤GeneChip阵列、染色并使用GeneChip Scanner 3000 7G扫描。使用Affymetrix GeneChip Operating软件获取图像。使用GeneSpring GX 11.5.1软件(Agilent Technologies Inc.，USA)进行了分析。使用Robust Multichip分析(RNA)算法和基线转化成所有样品的中值，实现数据标准化。
将编码分泌蛋白(可能在血样中检测到)并与重塑过程相关的差异表达基因(>1.5倍，p值≤0.05，T-检验)列出候选名单，用于进一步的验证(表1)。从以下来源整理与重塑相关的基因：MetaCore路径数据库(http://thomsonreuters.com/metacore，之前为GeneGO)、智能路径分析数据库(IPA)(http://www.ingenuity.com/products/ipa)、基因导航中的基因探矿工具(http://hugenavigator.net/HuGENavigator)。使用以下来源发现了注释为分泌或血液中检测的基因：智能路径分析数据库(IPA)(http://www.ingenuity.com/ products/ipa)和专利数据集(SECTRANS)。
表1-与幼稚对照相比，缺氧Sugen处理的动物的肺样品中差异表达的基因
Figure BDA0001168067640000241
Figure BDA0001168067640000251
Figure BDA0001168067640000261
2.用伊马替尼治疗后在特发性肺动脉高压的缺氧Sugen大鼠模型中评价候选生物标志物mRNA的水平
所有动物程序按照以上所述的进行。
在此研究中，在第0天给药初始剂量的Sugen并随后在缺氧室中14天后，再持续两周每天给大鼠施用100mg/kg的伊马替尼或载体对照。
按照进度表1进行安乐死后，取出左肺叶，通过气道充气，充气并在10％甲醛中固定，并包埋在石蜡中，用于组织学分析。用抗von Willebrand因子(vWF)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的抗体，染色组织切片(3μm)。使用DMLB和共焦显微镜、数码相机和IM50成像软件(Leica Microsystems，伦敦，UK)检查载玻片。评价小的肺血管(通过vWF染色显示为10-100μm直径)中周缘的α-SMA阳性染色程度(指示肌化(muscularisation))。将右肺叶速冻，用于候选生物标志物mRNA表达测量。如以上部分中所述的，提取总RNA并且接受质量控制。
根据试剂盒制造商的实验方案，使用高容量RNA至cDNA试剂盒(High CapacityRNA-to-cDNA Kit)(Invitrogen)来合成cDNA。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)，在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，USA)上进行了QPCR。Taqman试验购自Applied
Figure BDA0001168067640000271
相对10个不同管家基因的组合，标化相对表达。使用SDS RQ Manager，软件(Applied Biosystems，版本2.4)分析了数据。将每个基因的标化后基因表达值(2-Δct)绘制为曲线并且使用GraphPad Prism 6.02中的双向ANOVA进行分析。
在来自用载体或伊马替尼处理的动物的肺样品中评价表1中所列的所有转录物的表达。发现以下6个基因转录物在大鼠Hy/Su肺中上调并且在用伊马替尼处理时下调：Ccl21、Col18a1、Cxcl12、Cxcl13、Dmp1、Frzb(图1)。此外，我们测量了来自第28天用伊马替尼或载体处理的组和对照幼稚动物的肺样品中的CCL21mRNA表达水平，并且观察到，与幼稚对照相比，载体处理的动物的肺中的CCL21mRNA水平提高，而用伊马替尼处理后降低(图3，上图)。来自这些组的肺样品中的CCL21表达水平与右心室压和动脉肌化两者都是显著相关的(P<0.0001)。
因此我们推断，作为治疗药物给药的结果，在肺动脉高压动物的肺中，以上基因的转录物水平应答抗重塑剂而下调。
3.大鼠缺氧/Sugen中纵向评价候选生物标志物mRNA与血管重塑读数的相关性
所有动物程序按照以上所述的进行。在此研究中，在第0天给药初始剂量的Sugen并在缺氧室中21天后，大鼠产生了升高的右心室压和动脉肌化。按照进度表1进行安乐死后，取出左肺叶，用于组织学分析，并且右肺叶用于mRNA分析。我们测量了来自以下研究时间点：第3、5、8和14周和幼稚动物的肺样品中所有6个候选生物标志物mRNA表达水平(每组n＝6)。使用Pearson相关性，评价候选生物标志物mRNA表达与肌化百分比、右心室压(RVP)和堵塞血管数量之间的相关性的显著性。在来自这些组的肺样品中评价的所有标志物的转录物表达与三个血管重塑读数中的至少两个显著相关：动脉肌化的百分比、堵塞血管的百分比和右心室压(表2)。因此我们得出结论：评价的候选生物标志物的转录物可以指示血管重塑的程度。
表2：候选生物标志物转录物表达水平与血管重塑读数的相关性。
Figure BDA0001168067640000281
Figure BDA0001168067640000282
Figure BDA0001168067640000283
4.评价PH患者和匹配对照的血清和血浆样品中候选生物标志物蛋白水平
为了确定与匹配的对照相比，PH患者的血清和血浆样品中的候选生物标志物的循环蛋白水平是否升高，我们研发了针对CCL21、CXCL12、CXCL13和Col181a的免疫试验，并且测量了30名PH患者和25名年龄、种族和性别比例匹配的对照中的这些生物标志物的循环水平。
根据批准的伦理审查委员会申请，获得并处理人外周血样品。收集了来自30名肺动脉高压患者的匹配血清和血浆样品。根据世界卫生组织(WHO)分类系统(Dana Point2008)2，30名PH患者中，24.8％属于第1类，28.4％属于第2类，10％属于第2和3类，33.3％属于第3类，3.5％属于第4类。
按照制造商的推荐，进行了MSD涂层定制平板的免疫试验。简而言之，用专利稀释剂2以25μl/孔孵育平板，用粘附性覆盖膜密封并在平板振荡器(300-1000rpm)上在室温下孵育30分钟。在1％BSA(Gibco，cat#15260-037)/PBS(Gibco，cat#14190)中复水CCL21重组蛋白(R&D
Figure BDA0001168067640000291
cat#DY366，Part 841709)并且以10,000pg/ml加入，使用稀释剂2进行了1:5连续稀释，使用第8点作为零标准(0pg/ml)。
将标准品、样品和测试对照以25μl/孔加入含有稀释剂2的MSD平板中。将平板密封并且在平板振荡器(300-1000rpm)上在室温下孵育2小时。然后用洗涤缓冲液(PBS pH7.4中0.05％Tween-20，SigmaTM，cat#P3563-10PAK)将孔洗涤三次。
根据R&D
Figure BDA0001168067640000292
DuoSet实验方案，以1μg/ml的终浓度，复水了CCL21检测和捕获抗体(人CCL21/6Ckine DuoSet ELISA开发系统，R&D
Figure BDA0001168067640000293
cat#DY366，841707和841708部分，与MSD涂层定制平板一起提供)。将检测抗体溶液加入洗过的平板中。将平板密封，并在室温下振荡孵育2小时。最终洗涤步骤后，使用反向吸移来添加150μl 2×读数缓冲液T(用等体积的H2O稀释)并且使用MSD仪器SECTOR成像仪6000对平板进行读数。
对于统计学分析，使用GraphPad prism 6进行了未配对t-检验。使用GraphPadprism 6进行了受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析。通过软件产生的曲线下面积(AUC)反映出生物标志物的特异性和选择性。1的AUC表示生物标志物在区分两个群体中是100％灵敏和特异性的。
我们发现，与匹配对照相比，CCL21在PH患者中在血清和血浆样品中都上调(图2)，但Col18a1、CXCL12和13(数据未显示)则没有。数据集的受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，CCL21循环水平能够以高灵敏度和特异性区分患者与对照，血清样品中具有0.91的曲线下面积(AUC)，血浆样品中为0.89(图2)。因此我们得出结论，与匹配对照相比，CCL21在PH患者的血清和血浆样品中上调，CCL21能够以高灵敏度/特异性区分患者与对照。
5.来自PH患者的人IHC CCL21蛋白数据
来自PH的甲醛固定的石蜡包埋的组织切片来源于剑桥大学，在批准的知情同意和机构协议下，从正接受肺移植的患者获得。
使用以下实验方案，在Ventana Discovery XT上通过免疫组织化学检测了CCL21。简而言之，使用EZprep溶液将切片脱蜡，使用Ventana cc1试剂进行了高pH8抗原修复。使用山羊抗人CCL21抗体(R&D
Figure BDA0001168067640000301
AF366，3.33ug/ml)检测CCL21——将抗体在室温下孵育12小时。二抗是1/200稀释的生物素化兔抗山羊(DAKO E0466)，在37℃孵育20分钟。使用DABMap试剂盒(Ventana 650-010)检测生物素化的二抗。使用Harris’苏木精将切片复染并封片。使用Aperio XT载玻片扫描仪扫描图像并使用Definiens Tissue Studio分析。
在来自晚期PH患者的PAH损伤中，在具有上皮下/上皮和肺泡巨噬细胞以及淋巴管的区域中，检测到了CCL21蛋白(图3(A-D))。因此我们得出结论，CCL21在疾病病理部位表达。
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Claims (10)

1.用于检测肺动脉高压生物标志物CCL21的表达和/或蛋白水平的试剂在制备用于确定受试者是否患有肺动脉高压的试剂盒中的用途，包括
a)提供获自怀疑患有肺动脉高压的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL21表达和/或CCL21蛋白的水平；和
c)将该CCL21表达和/或CCL21蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有肺动脉高压的受试者中CCL21表达和/或CCL21蛋白的量；
其中，与基线值相比，统计学显著提高的CCL21表达和/或CCL21蛋白的量指示肺动脉高压。
2.根据权利要求1的用途，其中分析步骤包括分析生物样品中CCL21表达的核酸序列。
3.根据权利要求2的用途，其中所述核酸选自CCL21核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。
4.权利要求1的用途，其中分析步骤包括分析生物样品中的CCL21蛋白或其片段。
5.权利要求1至4任一项的用途，其中生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、粪便和组织样品。
6.根据权利要求1至4任一项的用途，其中分析步骤包括：选自Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)、基于TaqMan的检测、直接测序、动态等位基因特异性杂交、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶试验、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、高分辨率熔解分析、DNA错配-结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹、免疫试验、流式细胞术、Western印迹、HPLC和质谱的技术。
7.根据权利要求1至4任一项的用途，其中分析步骤包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
8.根据权利要求1至4任一项的用途，其中分析步骤包括变性高效液相色谱。
9.根据权利要求1至4任一项的用途，其中分析步骤包括免疫组织化学。
10.根据权利要求1至4任一项的用途，其中分析步骤包括ELISA。
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