KR20170013261A - 폐 고혈압 바이오마커 - Google Patents

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KR20170013261A
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마리아나 롤랜즈
클레멘스 앤 잔 마리 테시에
폴 앤드류 휘태커
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노파르티스 아게
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Abstract

폐 고혈압은 혈관 재형성 (remodelling)과 연관되고 우심실 기능장애를 일으키는 다양한 기원의 진행성 질환이다. 축적된 증거는 폐 고혈압의 발병기전 및 진행에서 면역 세포 및 염증성 케모카인의 중요한 역할을 제시한다. 본 발명자들은 CCL21을 폐 고혈압에 대한 항-재형성 효능 바이오마커로서 확인하였다. CCL21은 폐 고혈압 환자를 매치된 대조군으로부터 식별할 때 감수성 및 특이성이 높은 것으로 밝혀졌다. CCL21은 폐 고혈압에서 상향조절되고, 항-재형성제를 사용한 치료시에 하향조절되었다.

Description

폐 고혈압 바이오마커{PULMONARY HYPERTENSION BIOMARKER}
본 발명은 호흡기 질환에서의 바이오마커 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 폐 고혈압에 대한 바이오마커로서 CCL21 발현의 용도에 관한 것이다.
폐 고혈압은 불량한 예후와 연관되고 우심실 기능장애를 일으키는 다양한 기원의 진행성 질환이다. 그의 모든 변형 형태에서, 상기 질환은 세계적으로 1억 명에 이르는 사람에서 이환된 것으로 추정된다1. 2008년에 열린 4차 세계 폐 고혈압 심포지엄 (4th World Symposium on Pulmonary Hypertension)에서 합의된 현재의 폐 고혈압 분류에 따르면, 5가지 카테고리의 만성 폐 고혈압이 존재한다.
폐 고혈압 (PH)는 휴식시 폐 동맥압의 평균 상승 >25 mmHg으로서 정의된다 (운동 후 >30 mmHg). 1군 PH는 증가한 폐 혈관 저항성이 전-모세혈관 미세혈관병증으로 인한 것인 질환 (전-모세혈관 쐐기압 <15 mmHg으로서 진단됨)으로 더욱 세분될 수 있다. 상기 군 내에 특발성 폐 동맥 고혈압 (IPAH) 및 가족성 폐 동맥 고혈압, 동반 폐 동맥 고혈압, 정맥/모세혈관 관련 폐 동맥 고혈압, 및 신생아의 지속 폐 고혈압이 있다. 2군은 좌심장 질병으로 인한 폐 고혈압을 포함하는 한편, 3군은 폐 질환/저산소혈증 (예를 들어, COPD)과 연관된 폐 고혈압을 포함하고, 4군은 만성 혈전색전 장애와 연관된 폐 고혈압을 포함한다2.
폐 고혈압의 근본 병리생물학의 이해에서 진보 및 진단에서 일부 개선 및 새로운 치료제의 개발에도 불구하고, 폐 고혈압의 범위 전체에서 여전히 상당한 충족되지 않은 의료적 필요 및 허용되지 않은 비율의 이환율 및 사망률이 존재한다.
폐 고혈압의 하위 카테고리는 근본 원인에 있어서 상이하다. 그러나, 이들은 모두 과도한 폐 혈관수축 및 비정상적인 혈관 재형성 (remodelling) 특유 얼기 (plexiform) 병변을 특징으로 한다. 염증 및 산화 스트레스와 연관된 내피 기능장애, 및 혈관 평활근 세포 (SMC) 증식은 폐 동맥 고혈압의 주요 특징이다3 - 5. 이들 구조적 변화는 휴지 상태로부터 증식성, 아포톱시스(apoptosis)-저항 세포 표현형으로의 전환 (switch)을 제안한다6 , 7. 혈관 재형성은 폐 혈관 저항성의 만성적인 상승, 우심실 기능부전 및 사망을 일으킨다.
몇몇 연구에서는 또한 폐 동맥 고혈압 병태생리학에서 면역 기전에 대한 역할을 제안하였다8. 염증성 세포 및 강한 케모카인 생산이 재형성된 폐 동맥 내에서 검출되었고, 혈관 기질 세포는 염증성 자극에 감수성인 것으로 나타났다9. 추가로, 상승된 순환 시토킨 수준이 IPAH에서 측정되었다10 , 11. 폐 동맥 고혈압이 있는 환자의 1/3에 이르기까지 다양한 혈관 자가-항원에 대한 순환 자가항체를 갖는다12 , 13. 이것은 T 및 B 림프구로 이루어지는 적응 면역계가 관여하는 것을 제안하고, 실제로 혈관주위 T 및 B 림프구가 폐 혈관 폐 동맥 고혈압 병변 내에서 검출되었다14. 만성 염증성 장애 및 자가면역 질환에 대한 연구에서는 병원성 항체 및 T 세포가 또한 국소에서, 표적화된 장기 내에서, 흔히 3차 림프 조직 (tLT)으로 불리는 고도로 조직화된 이소성 림프 소포에서 생성될 수 있음을 제안한다15. 만성 폐 질환에서 tLT의 역할은 특히 만성 폐쇄성 폐 질환16, 특발성 폐 섬유증17 및 폐색 세기관지염18과 보다 최근에 폐 동맥 고혈압19에서 중요해지고 있다. 2차 림프 조직의 이소성 형성은 나이브 (naive) T 및 B 세포의 국소 유인에 의해 개시된다. 따라서, 항상성 케모카인, 및 CCR7-발현 세포, 예컨대 성숙 DC, 나이브 T 세포, 및 B 세포를 유인하는 CCL21와 같은 림프구 생존 인자20의 국소 생산은 이소성 림프 조직의 형성에서 중대한 사건일 수 있다. 특히, CCL21 발현이 IPAH 환자로부터 체외이식된 폐에서 tLT에서 최근에 검출되었다19.
현재 지침은 사망 위험 층화를 위한 바이오마커로서 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 또는 프로-BNP의 N-말단 단편 (NT-프로BNP)의 사용을 권장한다. 나트륨이뇨 펩티드는 폐 고혈압의 최초의 혈액-유래 마커였다. 나가야 (Nagaya) 등은 BNP의 혈장 수준이 폐 고혈압에서 예후 유의성을 가짐을 처음으로 보여주었다21. BNP 수준은 증상성 선천 심장 질환이 있는 성인 환자에서 사망률을 예측하였고22, BNP는 또한 치료 반응의 독립적인 예측인자였다. 후향적 연구에서, 폐 동맥 고혈압의 환자에서, NT-프로BNP (BNP 합성의 부산물)의 연속 측정치는 생존율과 연관되었다23. NT-프로BNP 값의 로그-변환은 98%의 특이성 및 60%의 감수성으로 유해 사건의 위험에 처한 폐 동맥 고혈압의 환자를 확인하였다24.
그러나, BNP 또는 NT-프로BNP는 심근 긴장 (strain), 심장의 과도한 펼쳐짐 (stretching) 및 증가된 심장 박동의 마커이고, 폐 고혈압 병태생리학을 일으키는 원인이 되는, 폐 내의 원위 폐 동맥에서의 변화를 직접적으로 반영하지 않는다. 심장 및 우심실에서 재형성 변화는 구체적으로 폐 동맥 재형성에 뒤이어 일어나는 것으로 생각된다. 따라서, 효과가 질병 진행의 결과로서 우측 심장에서 가시화될 수 있기 전에 대용의 비-침습적 순환 바이오마커를 이용하여 폐 동맥 재형성을 평가하고 모니터링하는 것이 매우 중요하다.
바이오마커는 병리학적 기전, 질병의 중증도, 또는 치료 반응이 폐 고혈압의 관리를 위한 이상적인 도구가 될 것인지, 또는 미래의 임상 시험의 성공적인 실행을 용이하게 할 것인지를 구체적으로 나타낸다.
발명의 개요
CCL21이 폐 고혈압 환자를 매치된 (matched) 대조군으로부터 식별하기 위한 고특이적이고 고감수성인 바이오마커임이 본원에서 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하는, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타낸다.
본 발명은 또한
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하는, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내는 것인, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 핵산은 예컨대 CCL21 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택된다. 일부의 다른 실시양태에서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
상기 측면의 일부의 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 대변 및 조직 샘플로부터 선택된다.
상기 측면의 일부의 다른 실시양태에서, 검정 단계는 노던 블롯 (Northern blot) 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 택맨(TaqMan)-기반 검정, 직접적인 서열결정, 동적 (dynamic) 대립유전자-특이적 혼성화, 프라이머 연장 검정, 올리고뉴클레오티드 리가제 검정, 온도 구배 겔 전기영동 (TGGE), 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상 용융 분석, DNA 미스매치-결합 단백질 검정, 모세관 전기영동, 서던 블롯 (Southern Blot), 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유동 세포 분석, 웨스턴 블롯 (Western blot), HPLC, 및 질량 분광법으로부터 선택되는 기술을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정할 때 사용하기 위한 또는 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측할 때 사용하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는
a) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재를 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브; 및
b) 환자로부터의 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재에 대해 검정하기 위해 프로브를 사용하기 위한 설명서
를 포함한다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 프로브는 CCL21 핵산 서열의 발현 영역에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 또는 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 결합 분자로부터 선택된다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 결합 분자는 항체 또는 그의 단편이다.
도 1: 이마티닙을 사용한 치료 후에 PH의 저산소증/수겐 (sugen) 래트 모델에서 폐 mRNA 발현 프로파일로부터의 후보 바이오마커.
도 2: PH 환자 및 매치된 대조군 (연령, 민족성, 성비-매치된)으로부터의 혈청 및 혈장 샘플 내의 인간 CCL21 단백질 수준.
도 3: 폐 이식을 받고 있는 PH 환자로부터의 인간 폐 절편에서 CCL21 단백질 발현 및 면역조직화학에 의한 위치 확인.
발명의 상세한 설명
정의
본원의 설명을 위해, 다음 정의가 적용될 것이고, 적절한 경우, 단수로 사용되는 용어는 또한 복수를 포함할 것이고, 그 반대도 성립한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시된다.
용어 "CCL21"은 달리 특정되지 않으면, 예를 들어 ENST00000259607 (앙상블 (Ensembl))에 규정된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 인간 CCL21을 의미한다.
용어 "CCL21"은 달리 특정되지 않으면, 예를 들어 ENSP00000259607 (앙상블)에 규정된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 CCL21 유전자를 의미한다.
용어 "CCL21"는 SCYA21; ECL; SLC; CKb9; TCA4; 6Ckine; 6Ckine; 엑소더스(exodus)-2; "케모카인 (C-C 모티프) 리간드 21 [호모 사피엔스 (Homo sapiens) (인간)]"; "C-C 모티프 케모카인 21"; "베타 케모카인 엑소더스-2"; "림프구에 대한 효율적인 화학유인물질"; 엑소더스-2; "2차 림프 조직 케모카인"; "작은 유도성 시토킨 하위패밀리 A (Cys-Cys), 멤버 21"의 동의어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 유전자 및 현재 알려진 그의 모든 변이형을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수준"은 본 발명에 따른 바이오마커의 RNA 및/또는 DNA 및/또는 단백질 카피수를 의미한다. 일반적으로, 치료 중인 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 내의 바이오마커의 수준은 건강한 대상체에서 얻은 유사한 샘플 내의 동일한 바이오마커의 수준과 상이하다 (즉, 증가 또는 감소한다).
용어 "검정하는", "검정하기 위해", "검출", "검출하는" 및 "검출하기 위해"는 하나 이상의 바이오마커(들)의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 나타낸다. 용어 "측정", "측정하는" 및 "측정하기 위해"는 하나 이상의 바이오마커(들)의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기준선 값"은 일반적으로 폐 고혈압을 보이지 않는 "정상의" 건강한 대상체로부터의 대등한 샘플 (예를 들어, 시험된 조직과 동일한 종류의 조직)에서의 CCL21 발현 (예를 들어, mRNA) 또는 CCL21 폴리펩티드 (또는 단백질)의 수준 (양)을 의미한다. 요구될 경우, 정상 대상체로부터의 동일한 조직의 풀 (pool) 또는 집단이 사용될 수 있고, 기준선 값은 측정치의 평균일 수 있다. 적합한 기준선 값은 과도한 실험을 수행하지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기준선 값은 값으로부터 편집된 데이타베이스에서 이용가능할 수 있고/있거나, 공개된 데이타 또는 환자의 조직의 후향적 연구, 및 본 발명의 방법을 실행하는 통상의 기술자에게 자명할 다른 정보를 기초로 하여 결정될 수 있다. 적합한 기준선 값은 표준 값을 벗어난 측정된 수준이 진단 관점으로부터 정상이 아닌 것으로, 및 폐 고혈압을 예측하는 것으로서 받아들여질 수 있도록 적절한 신뢰 구간을 제공하는 통계학적 도구를 사용하여 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 값의 "유의한" 증가는 일반적으로 불규칙적인 변동에 의한 5% 미만의 변화 가능성의 확률 값으로, 적절하고 관련 기술 분야에 공지된 통계 방법을 사용하여 결정되는 재현가능한 또는 통계상 유의한 차이를 의미할 수 있다. 일반적으로, 통계상 유의한 값은 "정상의" 건강한 대조군 대상체에서의 값으로부터의 적어도 2의 표준 편차이다. 적합한 통계 시험은 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 예를 들어, 기준선 값에 비해 단백질의 양의 유의한 증가는 약 50%, 2배, 또는 그 초과일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동체" 또는 "상동성"은 공통 진화 조상을 공유하거나 야생형과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 변이체를 의미한다.
용어 "결합 분자"는 본원에서 사용되는 바와 같이, CCL21 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 의미한다. "결합 분자"는 항체 및 그의 단편, 예컨대 면역학상 기능적 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 용어 항체 또는 이뮤노글로불린 사슬의 "면역학상 기능적 단편"은 본원에서 사용되는 바와 같이 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부가 결여되지만 여전히 CCL21에 특이적으로 결합할 수 있는, 항체의 일부 (항원-결합 부분) (그 일부가 얻어지거나 합성되는 방법과 무관하게)를 포함하는 결합 단백질의 종이다.
용어 "항체"는 무손상 이뮤노글로불린 또는 기능적 그의 단편을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 에피토프, 예를 들어 인간 CCL21 상에서 발견되는 에피토프에 특이적으로 결합하고 인식하는, 이뮤노글로불린 유전자로부터의 프레임워크 영역 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "항체"는 단일쇄 전체 항체포함하는 전체 항체 (예컨대 모노클로날, 키메라, 인간화 및 인간 항체), 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 가변 영역을 단독으로, 또는 다음과 같은 폴리펩티드 요소의 전부 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있는 항원-결합 항체 단편, 단일쇄 항체를 포함한다: 항체 분자의 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CCL21에 결합할 수 있는" 결합 분자는 1 x 10-6 M 이하, 또는 1 x 10-7 M 이하, 또는 1 x 10-8 M 이하, 또는 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하의 KD로 CCL21에 결합하는 결합 분자를 나타내도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
용어 "환자"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
용어 "폐 고혈압 길항제"는 폐 고혈압을 억제, 치료, 예방, 치유하는 임의의 분자를 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는", "치료", "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 치료적 처리, 예방적 처치 및 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 적용을 포함한다. 치료 및/또는 예방은 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않고, 증상 또는 근본적인 위험 인자의 감소 또는 적어도 질병 진행의 둔화를 포함한다.
용어 "포함하는"은 "이루어지는"뿐만 아니라 "포괄하는"을 의미하고, 예를 들어, X를 "포함하는"은 X만으로 이루어질 수 있거나 또는 추가의 성분을, 예를 들어, X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x에 대한 용어 "약"은 예를 들어 x+10%를 의미한다. 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 비율의 언급은 정렬될 때, 해당 비율의 아미노산이 두 서열 비교시에 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 비율은 관련 기술 분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30]의 섹션 7.7.18에 기재된 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62를 사용한 아핀 (affine) 갭 검색을 이용하여 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘은 문헌 [Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]에 개시되어 있다.
폐 고혈압에 대한 바이오마커로서의 CCL21
케모카인 (C-C 모티프) 리간드 21 (CCL21)은 CC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 시토킨이다. CCL21은 면역조절 및 염증 과정에 관여하는 여러 CC 시토킨 유전자 중의 하나이다. CC 시토킨은 2개의 인접한 시스테인을 특징으로 하는 단백질이다. 다른 케모카인과 유사하게, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 조혈을 억제하고, 화학주성을 자극한다. 상기 단백질은 시험관 내에서 흉선세포 및 T 세포, 특히 나이브 T-세포에 대해 화학주성을 보이지만, B 세포, 대식세포, 또는 호중구에 대해서는 보이지 않는다. 이것은 T 및 B 림프구에서 발현되는 케모카인 수용체 7에 대한 고친화도 기능적 리간드이다25. CCL21은 림프구의 2차 림프 장기로의 귀소 (homing)을 매개할 때 기능하는 것으로 생각된다. 보다 최근에는, 특발성 폐 동맥 고혈압이 있는 환자로부터 체외이식된 폐에서 tLT에서 2차 림프 조직의 이소성 형성에서 CCL21 발현이 검출되었다19. 상기 연구에서, CCL21는 인간 및 래트 샘플 둘 모두에서 연구되었다. 래트 및 인간 CCL21 단백질 서열은 67% 동일하고, 이것은 두 종 사이의 고도의 상동성을 나타낸다.
진단 및 치료 방법
본 발명은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하는, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타낸다.
본 발명은 또한 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내는 것인, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하는, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산의 발현에 대해 검정하는 것을 포함한다.
CCL21 유전자 발현의 결과는 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 및 그의 임의의 변형된 뉴클레오시드일 수 있는 적어도 2개의 핵산의 사슬을 포함하는 분자이다. 구체적으로, DNA 분자 및 게놈 및 cDNA 서열, RNA 분자, 예컨대 mRNA 및 비스플라이싱된 또는 부분적으로 스플라이싱된 전사체 및 스플라이싱 생성물이 포함된다.
한 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
또 다른 실시양태에서, 폐 동맥 고혈압이 존재하는 환자가 폐 동맥 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고, 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고, 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 CCL21 단백질 (또는 폴리펩티드)은 인간 CCL21 유전자의 (완전한 또는 불완전한) 전사 및 번역에 의해 얻은 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드 변이체가 또한 본 발명에 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 야생형 인간 CCL21 유전자의 전사 및 번역에 의해 또는 해당 유전자의 야생형 폴리리보뉴클레오티드 전사체의 번역에 의해 얻은 야생형 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하는 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 바이오마커는 CCL21 폴리펩티드 (또는 단백질)의 단편 또는 분해 생성물일 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고; 폐 고혈압은 특발성 폐 동맥 고혈압이다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고; 폐 고혈압은 특발성 폐 동맥 고혈압이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고; 여기서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고; 폐 고혈압은 특발성 폐 동맥 고혈압이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21의 변형된 핵산 서열의 발현에 대해 또는 변형된 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변형은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 변형은 각각 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 아미노산 잔기에 대해 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 상기 언급된 화학적 변형과 조합하여, 단량체 사이의 연결이 변형될 수 있다. 추가의 알려진 변형은 태그 (tag) 또는 표지의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 바이오마커에 대한 접합을 포함한다.
폴리뉴클레오티드의 화학적 변형은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 알킬, 아실 또는 아미노 기에 의한 수소의 치환, 당 모이어티 (moiety) 또는 당 사이의 연결 (즉, 포스포로티오에이트)의 변경, 방사성-뉴클레오티드 (즉, 32P)를 사용한 뉴클레오티드의 표지, 태그 또는 표지 분자, 예컨대 형광 태그 (즉, 로다민, 플루오레세인, Cy3 및/또는 Cy5), 화학발광 태그, 발색 태그 또는 다른 표지 (즉, 디곡시게닌 또는 비오틴 및 자성 입자)와의 접합. 또한, 당 모이어티, 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 및 그의 헤테로시클릭 유사체 및 호변체의 변형도 본원에 포함된다. 실증적인 예는 디아미노퓨린 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오로우라실, 5브로모우라실, 2-히드록시-5메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 미국 특허 5,432,272; 문헌 [Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980]; [Freier and Altmann, Nucl. Acid Res., 1997, 25(22), 4429-43]; [Toulme', J.J., Nature Biotechnology 19:17-18 (2001)]; [Manoharan M.; Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139 (1999)]; [Freier S.M., Nucleic acid Research, 25:4429-4443 (1997)]; [Uhlman E., Drug Discovery & Development, 3:203-213 (2000)]; [Herdewin P., Antisense & Nucleic acid Drug Dev., 10:297-310 (2000)]에 기재된 예이다.
매우 다양한 표지 및 접합 기술이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 표지는 예를 들어 올리고-표지, 닉 (nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 바이오마커의 화학적 변형은 바람직하게는 방사성 동위원소 표지 및/또는 형광제 표지를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 바이오마커(들)는 특히 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 카피수가 증폭될 때, 형광 태그 (예를 들어, 한 쌍의 비표지된 PCR 프라이머 및 택맨® 프로브 (5' 단부에 FAM™ 또는 VIC® 염료 표지, 및 3' 단부에 작은 홈 (minor groove) 바인더 (MGB) 비형광 켄쳐 (NFQ)를 갖는다)로 이루어진 택맨® 유전자 발현 검정)를 포함한다.
생물학적 샘플
본 발명의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 대변 및 조직 샘플로부터 선택된다.
"제공되는" 샘플은 검정을 수행하는 사람 (또는 기계)에 의해 얻을 수 있거나, 또는 또 다른 사람 등에 의해 얻은 후, 검정을 수행하는 사람 (또는 기계)에게 전달될 수 있다.
많은 적합한 샘플 종류가 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플, 예컨대 전혈, 혈장, 또는 혈청 (응고 인자가 제거된 혈장)이다. 예를 들어, 말초 또는 정맥 혈장 또는 혈청이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 소변, 땀, 또는 단백질이 종종 혈류로부터 제거되어 그로 유입되는 또 다른 체액이다. 소변의 경우에, 예를 들어, 단백질은 분해될 가능성이 있고, 따라서 본 발명의 단백질의 진단 단편이 스크리닝될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 폐 조직으로서, 이것은 예를 들어 생검 후에 수거된다. 샘플을 얻고, 이를 분석을 위해 준비하는 방법은 통상적인 것으로서, 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.
한 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고; 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고; 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고; 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고; 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 CCL21 리보핵산 (RNA) 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서,
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하는, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법이 제공되고, 여기서 폐 고혈압 길항제는 칼슘 채널 차단제, 포스포디에스테라제 (PDE) 5 억제제, 구아닐레이트 시클라제 (sGC) 자극제, 엔도텔린 수용체 길항제 (ERA) 및 프로스타시클린 효능제로부터 선택된다.
검출 (또는 검정) 방법
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있거나 명백한 다양한 방법이 유전자 또는 단백질 발현 프로파일링을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서 검정 단계는 노던 블롯 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 택맨-기반 검정, 직접적인 서열결정, 동적 대립유전자-특이적 혼성화, 프라이머 연장 검정, 올리고뉴클레오티드 리가제 검정, 온도 구배 겔 전기영동 (TGGE), 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상 용융 분석, DNA 미스매치-결합 단백질 검정, 모세관 전기영동, 서던 블롯, 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유동 세포 분석, 웨스턴 블롯, HPLC, 및 질량 분광법으로부터 선택되는 기술을 포함한다.
일반적으로, 유전자 발현 프로파일링 방법은 다음 2개의 큰 군으로 나눌 수 있다: 폴리뉴클레오티드의 혼성화 분석을 기초로 한 방법, 및 폴리뉴클레오티드의 생화학적 검출 또는 서열결정을 기초로 한 다른 방법. 샘플 내의 mRNA 발현의 정량을 위한 관련 기술 분야에 알려진 가장 일반적으로 사용되는 방법은 노던 블로팅 및 계내 (in situ) 혼성화 (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); RNAse 보호 검정 (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992))을 포함한다.
별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 혼성 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하기 위한 다양한 방법은 유전자 발현 프로파일링, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 포함하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 제조자의 프로토콜에 따라 상업상 이용가능한 장비에 의해, 예컨대 아피메트릭스 젠칩 (Affymetrix GenChip) 기술을 사용하여 수행할 수 있는 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE) ([Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995)]; 및 [Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)]), MassARRAY, 대량 동시 시그너쳐 서열결정 (Massively Parallel Signature Sequencing)에 의한 유전자 발현 분석 (MPSS) (Brenner et al., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)), 단백질체학 (proteomics), 면역조직화학 (IHC) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, mRNA가 정량된다. 그러한 mRNA 분석은 바람직하게는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 기술을 사용하여, 또는 마이크로어레이 분석에 의해 수행한다. PCR을 이용하는 경우에, PCR의 바람직한 형태는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이다.
면역조직화학 방법이 또한 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 검출하기 위해 적합하다. 따라서, 각각의 마커에 특이적인 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 폴리클로날 항혈청, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체가 발현을 검출하기 위해 사용된다. 항체는 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예컨대, 비오틴, 또는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 사용한 항체 자체의 직접 표지에 의해 검출할 수 있다. 별법으로, 1차 항체에 특이적인 항혈청, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 포함하는 표지된 2차 항체와 함께 비표지된 1차 항체가 사용된다. 면역조직화학 프로토콜 및 키트는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다.
발현 수준은 또한 예를 들어, 다양한 종류의 면역검정 또는 단백질체학 기술을 사용하여 단백질 수준에서 결정할 수 있다.
면역검정에서, 표적 진단적 단백질 마커는 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용함으로써 검출된다. 항체는 대개 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 일반적으로 다음 카테고리로 분류될 수 있는 많은 표지가 이용가능하다: 방사성 동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. (1991) Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사성은 섬광 계수 (scintillation counting)를 이용하여 측정할 수 있다.
형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리싸민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용가능하다. 형광 표지는 예를 들어 문헌 ["Current Protocols in Immunology", 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광측정기를 사용하여 정량할 수 있다.
다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 4,275,149에서는 이들 중 일부에 대한 검토를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들어, 효소는 분광광도법에 의해 측정할 수 있는 기질의 색상 변화를 촉매할 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량하기 위한 기술을 위에 설명되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 측정할 수 있거나 (예를 들어 화학광도계를 사용하여) 또는 형광 수용자에게 에너지를 제공하는 광을 방출할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대 우라카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합하기 위한 기술은 문헌 [O'Sullivan et al. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York 73: 147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다: 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO) 및 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴); 알칼리성 포스파타제 (AP) 및 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal) 및 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.
다른 많은 효소-기질 조합이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이용가능하다. 이들에 대한 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
면역검정 기술의 다른 버전에서, 항체는 표지될 필요가 없고, 그의 존재는 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 혈장 및 혈청 샘플 내에서 인간 CCL21 단백질의 검출을 위해, 메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery)®(MSD) 플랫폼 상의 주문 제작 면역검정을 이용하였다. MSD의 전기화학발광 검출 기술에서는
MULTI-ARRAY 및 MULTI-SPOT® 마이크로플레이트의 전극 표면에서 개시된 전기화학적 자극시에 광을 방출하는 SULFO-TAG™ 표지를 사용한다.
따라서, 본원에서 진단적 면역검정은 예를 들어, 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 (sandwich) 검정, 예컨대 ELISA, 및 면역침전 검정을 비롯한 임의의 검정 형식일 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 PCR 또는 RT-PCR에 의해 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고; 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 PCR 또는 RT-PCR에 의해 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고; 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고; 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 PCR 또는 RT-PCR에 의해 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하고; 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되고; 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다. 바람직하게는, 핵산은 CCL21 mRNA로부터 증폭된 cDNA이다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법은
a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내고; 검정 단계는 생물학적 샘플을 면역검정 또는 ELISA에 의해 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 면역검정 또는 ELISA에 의해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내고, 검정 단계는 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법은
a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
을 포함하고, 여기서 검정 단계는 생물학적 샘플을 면역검정 또는 ELISA에 의해 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하고, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 또는 혈청으로부터 선택된다.
본 발명의 키트
본 발명은 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정할 때 사용하기 위한 또는 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측할 때 사용하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는
a) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재를 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브; 및
b) 환자로부터의 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재에 대해 검정하기 위해 프로브를 사용하기 위한 설명서
를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 프로브는 CCL21 핵산 서열의 발현 영역에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 CCL21의 발현을 정량하기 위한 유전자-특이적 또는 유전자-선택적 프로브 및/또는 프라이머로부터 선택된다.
키트는 임의로 샘플, 특히, 고정된 파라핀-포매 조직 샘플로부터 RNA의 추출을 위한 시약 및/또는 RNA 증폭을 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 각각 하나 이상의 다양한 시약 (일반적으로 농축된 형태의), 예를 들어, 미리 제작된 마이크로어레이, 버퍼, 적절한 뉴클레오티드 트리포스페이트 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP; 또는 rATP, rCTP, rGTP 및 UTP), 역전사효소, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제가 존재하는 용기 (방법의 자동 실행시에 사용하기 적합한 미량역가 플레이트 포함)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 프로브는 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 결합 분자이다. 바람직하게는, 결합 분자는 항체 또는 그의 단편이다.
다른 결합 분자는 피브로넥틴 타입 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 타입 III의 10번째 모듈 (10Fn3 도메인))을 기초로 한 스캐폴드를 갖는 분자, 애드넥틴 (애드넥틴스(Adnectins)®), 안키린 유래 반복 모듈을 포함하는 분자, 아피바디(Affibody)® 분자, 안티칼린스(Anticalins)® 분자, 아필린(Affilin)® 분자 및 단백질 에피토프 모방체 (mimetic)일 수 있다.
실시예
본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
1. 저산소증/수겐 래트 모델 유전자칩 프로파일링
실험적 PH가 존재하는 래트 폐 샘플과 나이브 래트 폐 사이의 비교에 의한 총전사체 (transcriptome) 프로파일링을 수행하기 위해 PH의 래트 저산소증/수겐 모델을 사용하였다.
모든 동물 절차는 영국 내무성의 1986년 (과학적 절차) 법률 (British Home Office regulations (Scientific Procedures) Act of 1986)에 따라 수행하였다.
수겐 (250 mg; SU5416; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)®)을 비히클 (12.5 ml; 탈이온수 내의 0.5% (wt/vol) 카르복실 메틸셀룰로스 나트륨, 0.9% (wt/vol) NaCl, 0.4% (vol/vol) 폴리소르베이트, 0.9% (vol/vol) 벤질 알콜) 내에 용해시키고, 15 min 동안 초음파 처리한 후, 볼텍싱하였다. 제0일에, 동물을 마취하고, 칭량하고, 수겐 20 mg/kg을 피하 주사에 의해 투여하였다. 동물을 저산소실에 두고, O2 수준을 서서히 10%로 감소시켰다. 대조군 동물은 연구를 위한 정상 산소 대조군으로서 기능하도록 실내 공기 (21% O2)에서 유지하였다. 2주 후에, 모든 동물을 저산소실로부터 내보냈다. 제4주에, 동물을 세보플루오란 마취 하에서 심장 초음파 검사에 의한 측정을 수행하고, 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링하였다. 케타민 및 메데토미딘 마취제의 혼합물 하에 우심실 압력 (RVP)의 측정을 위해 동물에게 RV 카테터를 삽입하였다. 스케쥴 (Schedule) 1에 의한 안락사 후에, 폐의 좌엽을 제거하고, 부풀리고, 조직학적 분석을 위해 10% 포르말린에 고정하고 파라핀 내에 포매하였다. 폐의 우엽은 전사 프로파일링을 위해 즉시 동결하였다.
동결된 래트 폐 샘플을 TT2 조직 백 (케이 바이오사이언스(K Bioscience)® Cat# 520021)에 수거하고, 코바리스 크리오프렙(Covaris CryoPrep) CP02를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄된 폐 샘플로부터의 총 RNA는 제조자의 프로토콜 (퀴아겐(Qiagen)™)에 따라 RNeasy 미니 키트에 의해 추출하였다. 게놈 DNA는 DNase I (터보 (Turbo) DNase 키트, 인비트로겐 (Invitrogen))로 처리하여 제거하였다. RNA의 정확한 정량은 나노드롭 (NanoDrop) ND-1000 분광광도계를 사용하여 결정하였다. RNA 품질은 2100 바이오어낼라이저 (Bioanalyzer) (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라)에서 미세유체역학-기반 전기영동에 의해 18S 및 28S rRNA를 분석함으로써 평가하였다.
마이크로어레이 제조 및 분석을 위해, 아피메트릭스 1라운드 시험관내 전사 RNA 증폭 키트 (One-Round In Vitro Transcription RNA Amplification Kit)를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA를 증폭하였다. 상보성 DNA (cDNA)는 올리고 (dT)를 함유하는 프라이머 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 사용하여 합성하였다. 이어서, 이중 가닥 cDNA를 정제하고, 비오티닐화 cRNA를 생성하기 위한 주형으로 사용하였다. 증폭된 cRNA의 양 및 품질은 나노드롭 ND-1000 분광광도계 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)) 및 애질런트 바이오어낼라이저 (Agilent Bioanalyzer)를 이용하여 평가하였다. 비오티닐화 cRNA를 단편화하여 아피메트릭스 래트 젠칩 어레이 230_2에 혼성화하였다. 혼성화 후에, 젠칩 어레이를 세척하고, 염색하고, 젠칩 스캐너 3000 7G를 사용하여 스캐닝하였다. 영상 획득을 위해 아피메트릭스 젠칩 구동 소프트웨어를 사용하였다. 분석은 젠스프링 (GeneSpring) GX 11.5.1 소프트웨어 (애질런트 테크놀로지스 인크., USA)를 사용하여 수행하였다. 데이타 정규화는 로버스트 멀티칩 어낼리시스 (Robust Multichip Analysis) (RMA) 알고리즘 및 모든 샘플의 중앙값으로의 기준선 변환을 사용하여 달성하였다.
분비된 단백질 (혈액 샘플에서 검출될 가능성이 있는)을 코딩하고 재형성 과정에 연관되는 차별적으로 발현되는 유전자 (> 1.5배, p 값≤ 0.05, T-검정)를 추가의 확인을 위해 목록을 작성하였다 (표 1). 재형성과 연관된 유전자는 다음 공급원으로부터 수집하였다: 메타코어 (MetaCore) 경로 데이타베이스 (http://thomsonreuters.com/metacore formerly GeneGO), 정교한 경로 분석 데이타베이스 (Ingenuity Pathway Analysis database) (IPA) (http://www.ingenuity.com/products/ipa), 유전자 내비게이터 (Naviagator)에서 유전자 탐색 (Gene Prospector) 도구 (http://hugenavigator.net/HuGENavigator). 혈액에서 분비 또는 검출된 것으로 주석이 달린 유전자는 다음 공급원을 사용하여 발견하였다: 정교한 경로 분석 데이타베이스 (IPA) (http://www.ingenuity.com/products/ipa) 및 독점 소유의 데이타 세트 (SECTRANS).
<표 1>
나이브 대조군에 비해 저산소증 수겐 처리 동물의 폐 샘플에서 차별적으로 발현되는 유전자.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00004
2. 이마티닙을 사용한 처리 후에 특발성 폐 동맥 고혈압의 저산소증 수겐 래트 모델에서 후보 바이오마커 mRNA 수준의 평가
모든 동물 절차는 상기한 바와 같이 수행하였다.
본 연구에서, 저산소실에서 제0일 및 14일의 기간에 초기 용량의 수겐을 투여한 후, 래트에게 100 mg/kg의 이마티닙 또는 비히클 대조군을 추가의 2주 동안 매일 투여하였다.
스케쥴 1에 의한 안락사 후에, 폐의 좌엽을 제거하고, 부풀리고, 기도 팽창에 의한 조직학적 분석을 위해 10% 포르말린에 고정하고 파라핀 내에 포매하였다. 조직 절편 (3 ㎛)을 폰 빌레브란트 인자 (vWF) 및 α-평활근 액틴 (α-SMA)에 대한 항체로 염색하였다. DMLB 및 공초점 현미경, 디지털 카메라, 및 IM50 영상화 소프트웨어 (레이카 마이크로시스템즈 (Leica Microsystems), 영국 런던)를 사용하여 슬라이드를 조사하였다. 작은 폐 혈관 (vWF 염색에 의해 표시된 10-100 ㎛ 직경)을 근육 형성 (muscularisation)을 나타내는 환상 (circumferential) α-SMA-양성 염색에 대해 평가하였다. 폐의 우엽은 후보 바이오마커 mRNA 발현 측정을 위해 즉시 동결하였다. 총 RNA를 상기 섹션에서 언급된 바와 같이 추출하고, 품질을 관리하였다.
키트 제조자의 프로토콜에 따라 고용량 RNA-대-cDNA (High Capacity RNA-to-cDNA) 키트 (인비트로겐)를 사용하여 cDNA을 합성하였다. QPCR을 택맨 유니버셜 PCR 매스터 믹스 (Universal PCR Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 ABI 프리즘 (Prism) 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), USA)에서 수행하였다. 택맨 검정은 어플라이드 바이오시스템즈®로부터 구입하였다. 상대적인 발현을 10개의 상이한 하우스키핑 (housekeeping) 유전자의 조합으로 정규화하였다. 데이타는 SDS RQ 매니저 (Manager), 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈, 버전 2.4)를 사용하여 분석하였다. 각각의 유전자에 대해 정규화된 유전자 발현 값 (2- Δct)을 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 6.02으로 이원 (two-way) ANOVA를 사용하여 플로팅하고, 분석하였다.
표 1에 제시된 모든 전사체의 발현은 비히클 또는 이마티닙으로 처리된 동물로부터의 폐 샘플에서 평가하였다. 다음 6개의 유전자 전사체가 래트 Hy/Su 폐에서 상향조절되고, 이마티닙을 사용한 치료로 하향조절되는 것으로 발견되었다: Ccl21, Col18a1, Cxcl12, Cxcl13, Dmp1, Frzb (도 1). 추가로, 본 발명자들은 제28일에 이마티닙 또는 비히클로 처리된 군 및 대조군 나이브 동물으로부터의 폐 샘플에서 CCL21 mRNA 발현 수준을 측정하고, 나이브 대조군에 비해 비히클 처리 동물의 폐에서 CCL21 mRNA 수준의 증가 및 이마티닙 처리 후 감소를 관찰하였다 (도 3, 상부 그래프). 상기 군으로부터의 폐 샘플 내의 CCL21 발현 수준은 우심실 압력 및 동맥 근육 형성 둘 모두와 유의하게 상관성이 있었다 (P<0.0001).
따라서, 본 발명자들은 상기 유전자들의 전사체 수준이 치료 약물 투여의 결과로서 폐 고혈압이 있는 동물의 폐에서 항-재형성제에 반응하여 하향조절된다고 결론지었다.
3. 래트 저산소증/수겐 종단 연구에서 혈관 재형성 판독치와 후보 바이 오마커 mRNA의 상관관계에 대한 평가
모든 동물 절차는 상기한 바와 같이 수행하였다. 본 연구에서, 저산소실에서 제0일 및 21일의 기간에 초기 용량의 수겐을 투여한 후, 래트에서 상승된 우심실 압력 및 동맥 근육 형성이 발생하였다. 스케쥴 1에 의한 안락사 후에, 폐의 좌엽을 조직학적 분석을 위해 및 우엽을 mRNA 분석을 위해 제거하였다. 본 발명자들은 다음과 같은 연구 시점으로부터의 폐 샘플에서 6개의 모든 후보 바이오마커 mRNA 발현 수준을 측정하였다: 제3, 5, 8 및 14주 및 나이브 동물 (각각의 군에서 n=6). 피어슨 (Pearson) 상관관계를 사용하여 후보 바이오마커 mRNA 발현과 근육 형성 비율, 우심실 압력 (RVP) 및 폐색된 혈관의 수 사이의 상관관계의 유의성을 평가하였다. 상기 군으로부터의 폐 샘플에서 평가된 모든 마커의 전사체 발현은 다음과 같은 3개의 혈관 재형성 판독치 중 적어도 2개와 유의하게 상관관계가 존재하였다: 동맥 근육 형성 비율, 폐색된 혈관 비율 및 우심실 압력 (표 2). 본 발명자들은 따라서 평가된 후보 바이오마커의 전사체가 혈관 재형성 정도를 나타낸다고 결론지었다.
<표 2>
후보 바이오마커 전사체 발현 수준과 혈관 재형성 판독치의 상관관계
Figure pct00005
4. PH 환자 및 매치된 대조군의 혈청 및 혈장 샘플 내의 후보 바이오마커 단백질 수준의 평가
매치된 대조군에 비해 PH 환자의 혈청 및 혈장 샘플에서 후보 바이오마커의 순환 단백질 수준이 상승되는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 CCL21, CXCL12, CXCL13 및 Col181a에 대한 면역검정을 개발하고, 30명의 PH 환자 및 25명의 연령, 민족성 및 성비 매치된 대조군에서 이들의 순환 수준을 측정하였다.
인간 말초 혈액 샘플을 얻고, 승인된 윤리 심의 위원회 기준 (Ethical Review Board application)에 따라 취급하였다. 30명의 폐 고혈압 환자로부터 매치된 혈청 및 혈장 샘플을 수집하였다. 30명의 PH 환자 중에서, 24.8%는 국제 보건 기구 (World Health Organisation: WHO) 분류 체계 (Dana Point 2008)에 따른 1군에, 28.4%는 2군에, 10%는 2군 및 3군에, 33.3%는 3군에, 3.5%는 4군에 속하였다2.
MSD 코팅된 맞춤 플레이트를 사용한 면역검정은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 플레이트를 25 ㎕/웰의 독점 소유의 희석제 2와 함께 인큐베이팅하고, 접착 커버 필름으로 밀봉하고, 30분 동안 실온에서 플레이트 진탕기 (300-1000 rpm) 상에서 인큐베이팅하였다. CCL21 재조합 단백질 (R&D 시스템즈®, cat# DY366, Part 841709)을 1% BSA (깁코 (Gibco), cat# 15260-037)/PBS (깁코, cat# 14190)로 재구성하고, 10,000 pg/ml로 첨가하고, 희석제 2를 사용하여 1:5 연속 희석을 수행하였고, 8번째 지점이 영점 표준물 (0 pg/ml)이었다.
표준물, 샘플, 및 검정 대조군을 희석제 2와 함께 25 ㎕/웰로 MSD 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 2시간 동안 플레이트 진탕기 (300-1000 rpm) 상에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰을 세척 버퍼 (PBS pH7.4 내의 0.05% 트윈(Tween)-20 시그마™, cat# P3563-10PAK)로 3회 세척하였다.
CCL21 검출 및 포획 항체 (MSD 코팅된 맞춤 플레이트와 함께 공급된 인간 CCL21/6Ckine DuoSet ELISA 개발 시스템, R&D 시스템즈®, cat# DY366, Parts 841707 및 841708)를 1 ㎍/ml의 최종 농도로 R&D 시스템® DuoSet 프로토콜에 따라 재구성하였다. 검출 항체 용액을 세척된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 2시간 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 최종 세척 단계 후에, 리버스 피페팅 (reverse pipetting)을 사용하여 150 ㎕의 2x 판독 버퍼 T (동일한 부피의 H2O로 희석됨)를 첨가하고, 플레이트를 MSD 기기 섹터 이미저 (SECTOR Imager) 6000으로 판독하였다.
통계적 분석을 위해, 독립표본-t 검정을 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 수행하였다. 수신자 작동 특징 (Receiver Operating Characteristic) (ROC) 곡선 분석을 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 수행하였다. 소프트웨어에 의해 생성된 곡선하 면적 (AUC)은 바이오마커의 특이성 및 선택성을 반영한다. 1의 AUC는 두 집단을 식별할 때 바이오마커의 100% 감수성 및 특이성을 나타낸다.
본 발명자들은 Col18a1, CXCL12 또는 13 (데이타 미제시)은 그렇지 않지만, CCL21이 혈청 및 혈장 샘플 둘 모두에서 매치된 대조군에 비해 PH 환자에서 상향조절됨을 발견하였다 (도 2). 데이타 세트의 수신자 작동 특징 (ROC) 곡선 분석은 CCL21 순환 수준에 의해, 대조군으로부터 높은 감수성 및 특이성으로 환자를 식별할 수 있음을 나타내었고, 곡선하 면적 (AUC)은 혈청 샘플에서 0.91이고 혈장 샘플에서 0.89이었다 (도 2). 따라서, 본 발명자들은 매치된 대조군에 비해 PH 환자의 혈청 및 혈장 샘플에서 CCL21이 상향조절되고, 대조군으로부터 높은 감수성/특이성으로 환자를 식별할 수 있다고 결론내렸다.
5. PH 환자로부터의 인간 IHC CCL21 단백질 데이타
PH로부터의 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편은 고지에 입각한 사전 동의서 및 기관 동의 하에 폐 이식을 받는 환자로부터, 캠브리지 유니버시티 (University of Cambridge)로부터 입수하였다.
CCL21은 다음 프로토콜을 이용하여 벤타나 디스커버리 (Ventana Discovery) XT에서 면역조직화학에 의해 검출되었다. 간단히 설명하면, 절편을 EZprep 용액을 사용하여 왁스제거하고, 고 pH8 항원 복구 (retrieval)를 벤타나 cc1 시약을 사용하여 수행하였다. CCL21은 염소 항-인간 CCL21 항체 (R&D 시스템® AF366, 3.33 ㎍/ml)을 사용하여 검출하였고 - 항체는 12시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 2차 항체는 1/200으로 희석하고 37℃에서 20분 인큐베이션한 비오티닐화 토끼 항-염소 (DAKO E0466)이었다. 비오티닐화 2차 항체는 DABMap 키트 (벤타나 650-010)을 사용하여 검출하였다. 절편을 해리스(Harris)의 해마톡실린을 사용하여 대조염색하고, 커버슬립으로 덮었다. 영상을 아페리오(Aperio) XT 슬라이드 스캐너로 스캔하고, 디피니언스 티슈 스튜디오 (Definiens Tissue Studio)를 사용하여 분석하였다.
CCL21 단백질은 상피하/상피 및 폐포 대식세포를 갖는 영역뿐만 아니라 림프관 내에서 진행성 PH 환자로부터의 PAH 병변 내에서 검출되었다 (도 3A-D). 따라서, 본 발명자들은 CCL21이 질병 병인 부위에서 발현되는 것으로 결론지었다.
참조문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (11)

  1. a) 폐 고혈압이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하고;
    b) 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
    c) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을, 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값과 비교하는 것
    을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의하게 증가한 양은 폐 고혈압을 나타내는 것인, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정하는 방법.
  2. 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 기준선 값에 비해 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 증가된 수준은 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성의 증가를 나타내는 것인, 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법.
  3. a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 수준에 대해 검정하고;
    b) 환자가, CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 폐 고혈압이 존재하지 않는 대상체의 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 양을 나타내는 기준선 값에 비교할 때 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 통계상 유의한 양의 증가를 보일 경우, 치료 유효량의 폐 고혈압 길항제를 투여하는 것
    을 포함하는, 폐 고혈압이 존재하는 환자의 치료 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계가 생물학적 샘플을 CCL21 핵산 서열의 발현에 대해 검정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 핵산이 CCL21 리보핵산 (RNA) 또는 그의 단편 및 상보성 데옥시리보핵산 (cDNA) 또는 그의 단편으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계가 생물학적 샘플을 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 대해 검정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 대변 및 조직 샘플로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계가 노던 블롯 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 택맨(TaqMan)-기반 검정, 직접적인 서열결정, 동적 (dynamic) 대립유전자-특이적 혼성화, 프라이머 연장 검정, 올리고뉴클레오티드 리가제 검정, 온도 구배 겔 전기영동 (TGGE), 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상 용융 분석, DNA 미스매치-결합 단백질 검정, 모세관 전기영동, 서던 블롯 (Southern Blot), 면역검정, 면역조직화학, ELISA, 유동 세포 분석, 웨스턴 블롯 (Western blot), HPLC, 및 질량 분광법으로부터 선택되는 기술을 포함하는 것인 방법.
  9. a) CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재를 검출할 수 있는 적어도 하나의 프로브; 및
    b) 환자로부터의 생물학적 샘플을 CCL21 발현 및/또는 CCL21 단백질의 존재에 대해 검정하기 위해 프로브를 사용하기 위한 설명서
    를 포함하는, 대상체에 폐 고혈압이 존재하는지 결정할 때 사용하기 위한 또는 폐 고혈압이 존재하는 환자가 폐 고혈압 길항제를 사용한 치료에 반응할 가능성을 예측할 때 사용하기 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 프로브가 CCL21 핵산 서열의 발현 영역에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 또는 CCL21 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 결합 분자로부터 선택되는 것인 키트.
  11. 제9항에 있어서, 결합 분자가 항체 또는 그의 단편인 키트.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3537962A4 (en) * 2016-11-10 2019-11-27 Auburn University METHOD AND SYSTEM FOR ASSESSING A BLOOD VESSEL
CN106978485A (zh) * 2017-03-22 2017-07-25 首都医科大学 卵泡抑素样蛋白1对肺动脉高压的保护作用
WO2018213800A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzastaurin and fragile histidine triad (fhit)-increasing agents for the treatment of pulmonary hypertension
CN107436333B (zh) * 2017-09-05 2019-12-20 中国医学科学院阜外医院 精胺作为标志物在制备肺动脉高压的诊断产品中的应用及医疗器械
WO2022202950A1 (ja) * 2021-03-25 2022-09-29 中外製薬株式会社 肺動脈性肺高血圧症患者の選定方法およびバイオマーカー
CN113493829B (zh) * 2021-09-09 2021-11-12 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 生物标志物在肺动脉高压诊疗中的应用
CN116148471B (zh) * 2022-11-01 2024-05-07 中南大学 肺动脉高压的生物标志物及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US20060019272A1 (en) * 2004-05-03 2006-01-26 The Regents Of The University Of Colorado Diagnosis of disease and monitoring of therapy using gene expression analysis of peripheral blood cells
EP2120961A1 (en) * 2007-02-09 2009-11-25 United Therapeutics Corporation Treprostinil treatment for interstitial lung disease and asthma
KR101362951B1 (ko) * 2007-04-26 2014-02-28 동국대학교 산학협력단 기미 형성 예지방법 및 기미 형성 예지용 진단 키트
WO2009123730A1 (en) * 2008-04-02 2009-10-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for diagnosis and prognosis of pulmonary hypertension
CN101318932A (zh) * 2008-07-15 2008-12-10 东华大学 2′-羧基-5′-氟联苯衍生物、其制备及应用
WO2011080050A2 (en) * 2009-12-11 2011-07-07 Novartis Ag Binding molecules
NZ616308A (en) * 2011-04-08 2016-03-31 Biogen Ma Inc Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to ifnβ and uses thereof

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