CN106459158A - 针对Cry1CA特异性的单克隆抗体和相关的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请中描述了可用于测定和定量Cry1Ca delta内毒素的存在的单克隆抗体和方法。请求保护的抗体特异性地结合核心毒素区，使得它们既适合于检测全长Cry1Ca毒素，亦适合于检测氨基核心毒素和N‑末端29残基截短形式。

Description

针对Cry1CA特异性的单克隆抗体和相关的检测方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2014年4月29日递交的美国临时申请61/985,654的优先权和利益。该申请的全部内容通过援引并入本申请。
技术领域
本发明广义而言属于免疫学领域，涉及与名为Cry1Ca的昆虫delta内毒素特异性结合的单克隆抗体(单抗)、产生此类抗体的细胞、以及用于检测多种样品中的Cry1Ca的酶联免疫吸附测定(ELISA)。
发明背景
苏云金芽孢杆菌是一类革兰氏阳性细菌，它们在芽孢形成过程中会产生多种结晶状蛋白质毒素，统称为delta内毒素，或者Cry蛋白。这些蛋白质中很多对多种农艺学害虫具有高度的毒性，但对于哺乳动物和大多数其他生物一般而言是无害的。一种这样的delta内毒素，Cry1Ca，对北美洲和南美洲田野中存在的某些鳞翅目害虫具有杀昆虫性。
已经显示Cry1Ca当作为全长蛋白在玉米植株中表达时，可有效控制秋粘虫，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，以及Cry1Fa抗性的秋粘虫(Sheets,J.,et al.,Entomological Society of America,Annual Meeting,Nov.12,2013,Austin TX)。全长Cry1Fa全毒素在昆虫肠道中被天然酶切割而产生一种核心毒素，该毒素具有氨基末端的大约624个残基，根据昆虫和肠道条件而定。因此，含有Cry1Fa核心毒素的蛋白质和基因是开发重组作物植株，例如玉米、大豆、棉花、芥花(canola)、以及其他常被称为遗传修饰(GM)植物的重组作物植株的引人注意的候选者。
含有可赋予有益的新性状的重组DNA的GM作物种子的开发和上市公司被要求制订、实施并遵守严格的产品监管计划。这些产品监管计划要求使用经过验证的对重组蛋白的定性和定量蛋白质检测方法，用来追踪性状的渗入和种子产生活性，以及在收获过程中和收获之后监控GM性状。这些检测方法应该足够易行且足够鲁棒，使其足以在标准实验室操作(GLP)和非GLP条件下使用。此外，这些方法应当足够用户友好，以便于农民在田间、粮食收购商在仓库、以及海关官员在边境使用。因此，鲁棒、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是有用且必要的。
虽然免疫测定是本领域公知的，但鲁棒、高质量、经验证的，在实验室和田间条件下均能够可重复地检测多种植物组织中特定的转基因蛋白产物ELISA方法的开发不是轻而易举，亦非例行公事。更具挑战性的是找到特别适合的抗体对，用于开发侧向流试条ELISA，用来检测作物中转基因事件所表达的Cry1Ca。
发明概要
本发明提供了一组单克隆抗体(表1)，以及产生它们的杂交瘤系。下面的表格列出了杂交瘤系的命名和它们相应的ATCC保藏物命名，这些保藏物依照布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心。本发明包括用于鉴定Cry1Ca酶的存在的方法，包括：a)将第一种权利要求1的单克隆抗体固定在测定表面上，然后洗涤所述测定表面；b)使所述测定表面与怀疑含有Cry1Ca的液体接触一段足以允许结合的时间，然后洗涤所述测定表面；c)使所述测定表面与缀合于报告基团不同的第二种本发明抗体(a different second antibody ofthe invention conjugated to a reporting group)接触一段足以允许所述第二缀合单克隆抗体结合的时间，然后洗涤所述测定表面；和d)检测所述报告基团的存在或不存在。
本发明还包括使用请求要求保护的单克隆抗体来分离或检测Cry1Ca的方法，包括：a)将所述抗体固定到表面上；b)使所述固定化抗体与含有Cry1Ca的混合物接触；c)从所述混合物分离出与Cry1Ca结合的所述固定化抗体；以及d)通过使结合于抗体的Cry1Ca从所述固定化抗体脱离来回收Cry1Ca。
附图简要说明
图1是一条Cry1Ca标准曲线。测试了参考Cry1Ca蛋白的七个浓度，这七个浓度使用二次曲线拟合分析显示出线性度。0.999的R2值显示相关性可接受。
图2是氨基端截短的Cry1Ca与全长Cry1Ca ELISA标准曲线的比较，显示了两种标准之间的斜率差。
详细说明
本发明涵盖表1中列出的单抗以及产生这些单抗的杂交瘤，这些单抗特异性地结合Cry1Ca核心毒素。
表1
杂交瘤/单抗名称 ADCC保藏物名称 ATCC保藏日
3-34 PTA-121061 2014年3月5日
4-39 PTA-121062 2014年3月5日
4-45 PTA-121063 2014年3月5日
4-40 PTA-121064 2014年3月5日
4-41 PTA-121065 2014年3月5日
4-42 PTA-121066 2014年3月5日
这些单抗令人惊奇地适合于检测在多种植物和植物组织中由转基因事件表达的Cry1Ca全毒素和Cry1Ca核心毒素。本发明进一步提供使用本发明的免疫球蛋白的定量和定性的免疫测定。验证了一种用于测定玉米叶组织中Cry1Ca蛋白的双单抗夹心ELISA。基于二次拟合分析确定了从1.525-100ng/ml全长Cry1Ca参考标准曲线具有线性度，且有0.999的相关性。当用两种分析方法(ELISA和蛋白质印迹分析)比较样品的类似蛋白质水平时，以及与掺入玉米基质的Cry1Ca的理论浓度比较Cry1Ca蛋白的回收时，该Cry1Ca ELISA是准确的。此测定在经历多日的测定中也精确地测定了蛋白水平。当测试玉米样品时，五次稀释之间蛋白水平的测量结果相似，所以基于玉米样品所需的稀释度不会发生未偏倚的测量。
本发明还包括使用请求保护的抗体鉴定生物样品中Cry1Ca的存在的方法，包括：a)将所述抗体固定化于测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有Cry1Ca的液体接触，并用合适的溶液洗涤所述测定表面；c)使所述测定表面与用报告基团标记的抗Cry1Ca抗体接触，并用合适的溶液洗涤所述测定表面；d)检测所述报告基团的存在。
本发明还包括用于定量测定转基因植株，尤其是大豆和棉花植株中表达的Cry1Ca毒素的分析方法。用PBST(含0.05％TweenTM 20的磷酸盐缓冲盐水溶液)从大豆样品中提取Cry1Ca蛋白。将提取物离心；收集水性上清液并稀释。按照夹心ELISA格式，在用抗Cry1Ca多克隆或单克隆抗体包被的平板的孔中将一份稀释样品与酶偶联的抗Cry1Ca单克隆抗体温育。夹心对中的两种抗体都可捕捉样品中的Cry1Ca蛋白。在温育期结束时，用PBST洗涤从平板去除未结合的试剂。通过将酶偶联物与酶底物一起温育产生颜色产物来检测Cry1Ca的存在。由于Cry1Ca被结合在抗体夹心物中，颜色产生的水平与样品中Cry1Ca的浓度成比例(即浓度越低，导致的颜色生成越低)。利用酶标仪测定450nm吸收减去参考波长(例如650nm)的吸收。使用二次回归方程，从7个标准浓度估计校准曲线。该Cry1Ca ELISA对于植物组织样品提取物中Cry1Ca的定量而言是足够特异性并且灵敏的。此外，可以利用本发明的抗体，通过标准Western印迹程序来确认Cry1Ca的存在。
针对感兴趣的蛋白质的抗体的制备是本领域公知的，参见，Galfre andMilstein,Methods in Enzymology,Vol.73,Academic Press,New York(1981)；JamesW.Coding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,Orlando,Florida(1986)；Current Protocols in Molecular Biolopy,F.M.Ausubel,etal.ed.,Wiley Interscience,New York,(1987)。
为了制备与感兴趣的蛋白质具有反应性的抗体，该蛋白质首先需要富集或纯化。蛋白质的相对粗的抗原性制备物可以用于免疫接种目的。然而，为了准确地确定杂交瘤是否在产生追求的单克隆抗体，或者为了测定免疫血清的抗体效价，需要高度纯化的蛋白质。
一旦已经分离Cry1Ca，可以用本领域公知的常规方法来激发对Cry1Ca特异性的抗体。在数周的时间内对选定的宿主进行反复注射将引发免疫应答，并导致生成显著的抗Cry1Ca血清效价。优选的宿主是哺乳动物物种，更优选的物种是兔、山羊、绵羊和小鼠。对于从这样经免疫的动物抽出的血液，可以用确立的方法进行处理以获得与Cry1Ca具有反应性的抗血清(多克隆抗体)。然后可以按照本领域已知的技术，通过抗血清与Cry1Ca的吸附来对抗血清进行亲和纯化。对于亲和纯化后的抗血清，可以通过本领域已知的程序分离抗血清内的免疫清蛋白级分，从而进一步纯化该抗血清。由此产生的材料是由与Cry1Ca反应性的免疫球蛋白构成的异质群体。
利用纯化的Cry1Ca可以容易地制备抗Cry1Ca单抗。产生单抗的方法已经被应用于实践数十年，对本领域的技术人员而言是公知的。用包含Cry1Ca的佐剂反复腹膜内或者皮下注射，可以在大多数动物，尤其是小鼠中引发免疫应答。从该动物中移出高免疫的(hyperimmunized)B淋巴细胞，并将其与能够无限培养的合适的融合伴侣细胞系融合。对杂交瘤的产生而言，有多种哺乳动物细胞系是合适的融合伴侣。许多这样的细胞系在ATCC和提供商处有市售。
一旦融合之后，将所得的杂交瘤在选择性生长培养基中培养1到2周。有两种已知的选择系统可以用于去除混合杂交瘤培养物中未融合的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞之间的融合物。选择系统的选择取决于被免疫的小鼠的株系和所用的骨髓瘤融合伴侣。可以使用由Taggart and Samloff,Science 219,1228(1982)描述的AAT选择系统，但优选的是由Littlefield,Science 145,709(1964)描述的HAT(次黄嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶)选择系统，因为这种系统与上述的小鼠细胞和融合伴侣具有相容性。
然后筛选用过的培养基是否有免疫特异性单抗分泌。酶联免疫吸附测定对此目的是最佳的；不过适用于大容量筛选的放射免疫测定也是可接受的。为了分离小比例的本发明的单抗，必须进行多次筛选，以便连续缩减数目可观的无关或不太想要的培养物。对于分泌与Cry1Ca反应性的单抗的培养物，用可商购的测定系统鉴定同种型。
对于分泌所追求的抗Cry1Ca单抗的杂交瘤培养物，应当亚克隆数次以确立单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核非贴壁细胞培养物的公知方法包括有限稀释、软琼脂和荧光激活细胞分选技术。在每次亚克隆之后，对所得的培养物必须重新测定抗体分泌和同种型，以确保已经建立了稳定的抗体分泌性培养物。
所要求保护的抗Cry1Ca抗体可以固定到表面上，使得一部分抗体结合位点保持暴露，能够结合Cry1Ca。过去几十年来已经开发了各式各样用于固定化抗体的方案。固定化可以通过直接将抗体共价偶联到所需的表面、或通过将抗体桥接到表面来实现。
抗体与基于多糖的珠子如(Pharmacia,Pistcataway,NJ)的溴化氰和碳二亚胺偶联是符合本发明的一种示例性说明性直接偶联方案。直接偶联一般不会使抗体具有任何特定的朝向；然而，某些类型的直接偶联能够可重复地使抗体在固定化物质上定向。
优选的偶联方案可如此定向抗体，使得其抗原结合区保持暴露。一种这样的方案利用在抗体重链中发现的天然糖。通过首先氧化糖部分为相应的醛，然后使该醛与在表面上的伯氨基反应，有可能以有利的朝向连接抗体。
许多类型的桥接是可能的，包括将抗体共价结合到固定化物质的小有机接头。这样的间隔臂是可以接受的，并且一旦已经形成桥接，其不应与蛋白质相互作用。
上面的讨论不应以任何方式限制本发明的范围。其他用于将抗体与固定化物质连接的公知方案是与本发明一致的。
公知的是，标记有报告基团抗体可用于识别多种环境中抗原的存在。几十年来，标记放射性同位素的抗体已在放射免疫测定法被使用来以极大的精度和灵敏度确定抗原在各种生物流体中的存在。更近来，酶标记的抗体已被用来在流行的ELISA中作为放射性标记抗体的替代物。
本发明的抗体可结合于固定化物质(如聚苯乙烯孔或颗粒)，并在免疫测定中用来确定Cry1Ca是否存在于测试样品中。在本发明的这个实施方案中，使样品与免疫亲和表面接触并使其温育。洗涤步骤之后，通过使免疫亲和表面与标记有报告基团的另一种本发明抗体接触来检测任何已结合到该免疫亲和表面上的Cry1Ca。
与请求保护的抗体和测定方法结合使用侧向流试条或免疫层析试条是与本发明一致的。侧向流测定法是本领域中公知的。例如见US 6,485,982。在这种模式下侧向流测试可以用于定性地或半定量地检测单独的Cry1Ca或同时检测Cry1Ca与其它的分析物。侧向流测试是在本文描述的所有测试格式中使用起来最简单的，在田间条件下特别有用：将植物材料迅速地提取到溶液中，然后借助侧向流试条加以测试。在这种模式下，只需要将侧向流试条放置到液体样品中，或者将液体试样施加到侧向流试条上，经过一段预定的时间之后读出结果。所有的侧向流测试均应包括流程对照线或样品对照线，用于验证测试结果。因此，出现两条线表明阳性结果，而有效的阴性测试仅产生对照线。如果只出现测试线，或者没有线出现，则测试无效。
一种典型的侧向流测试试条由四个主要组成部分组成：样品垫，在其上施加测试样品；偶联物垫，含有与有色颗粒(通常为胶体金颗粒，或胶乳微球体)偶联的本发明的抗体；反应膜，例如疏水硝酸纤维素或醋酸纤维素膜，在横跨其上一条线中固定有一种不同的本发明抗体，作为捕获区或测试线；以及废液池，设计为通过毛细作用吸引样品穿过反应膜。
侧向流试条的各组分通常被固定于惰性背衬材料，并可能以简单的浸渍条形式提供，或者在塑料外壳中提供，其中所述塑料外壳具有样品端口以及显示捕捉区和控制区的反应窗口。在测定实施方案的另一个模式中，将怀疑含有Cry1Ca的试验样品在表面上干燥，形成固定化的测试样品。然后令标记的本发明的抗体与该固定化的测试样品接触，并使其温育。如果样品含有Cry1Ca，则该标记的抗体将结合到固定化的Cry1Ca。此方法也可以使用未标记的本发明抗体，随后使用标记的第二抗体，该第二抗体可结合已经结合于Cry1Ca的本发明的抗体。洗涤后，测量固定化的测试样品以检测任何报告基团的存在。
报告基团一般是酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-D-半乳糖苷酶。合适的底物当与酶反应时，产生颜色变化。在这样做的过程中，颜色强度的测量可以使用分光光度计进行量化。如果报告基团是放射性同位素，可以适宜地采用γ或β射线检测仪定量报告基团。报告基团的强度与测试样品中Cry1Ca的量直接相关。
下面的实施例将帮助描述本发明是如何实施的，并将示例地说明所要求保护的抗Cry1Ca抗体和测定法的特性。
实施例1
免疫原制备
使用荧光假单胞菌蛋白质表达系统产生全长Cry1Ca全毒素。参见例如，Retallacket al.,Protein Expression and Purification；Vol 81,2,pp 157-165；Feb.2012。用5至10克细胞糊(cell paste)来制备蛋白质样品。对于高表达者(可达0.5g/1)，5克细胞糊就足够了。对于低表达者，通常用10g细胞糊进行处理。利用均质机(Pro Scientific Inc.,Model Pro300A)将宿主细胞悬浮在10-20倍体积或100ml的溶液中，并在冰上超声10分钟(Branson Sonifier Model 450)，所述溶液含有20mM Tris-HCl pH 8、150mM NaCl、5％甘油、5mM EDTA、1mM DTT。以12k rpm离心20min后丢弃含可溶性蛋白的上清液。将含有靶蛋白的沉淀在100毫升新鲜溶液(同前)中洗涤，然后离心。这个过程重复2-3次，直到回收的包涵体(IB)洗净(clear)。每克IB(湿重)加10毫升含有10mM DTT和4M尿素的50mM CAPS,pH 11溶液，并置于摇板上室温下约2小时溶解蛋白质。将样品在12krpm离心20分钟，将上清液转移到SnakeSkinTM褶皱式透析管(Thermo Scientific，10kDa截留)，在4℃下对1升含10mM DTT的50mM CAPS，pH 11透析过夜。将样品以12k rpm离心20分钟以除去任何沉淀。
收集上清液，以5ml/min施加到5ml的HiTrapTMQ(GEHC，Fast Flow或HighPerformance柱)。洗涤柱子2-3个柱体积，然后历时20分钟以0-100％缓冲液B(含1M NaCl的缓冲液A，等于50mM CAPS，pH 11，10mM DTT)洗脱，收集25毫升的级分。然后通过SDS-PAGE分析峰洗脱物。Cry1Ca在20-45mS/cm洗脱，对应于第10-20个级分，抽取20μl样品用于凝胶分析。汇集大多数含Cry1Ca核心蛋白的较早洗脱峰，并转移到装配50KDa截留滤膜的Millipore浓缩单元，并且以4000rpm在室温下离心5-15分钟，最终获得1毫升体积的样品。将该样品以1ml/min注射到24ml SuperdexTM200柱(10/300规格)上。用20mM CAPS，pH 11，0.1M的NaCl，和10mM DTT的缓冲液运行该大小排阻柱，收集1ml级分。对于覆盖主峰的各级分，将20μl等份的样品在SDS-PAGE上进行分析。通常，较高级的寡聚物在13-14分钟洗脱，而较小的单体靶蛋白在16分钟或16分钟后洗脱。汇集经纯化的Cry1Ca毒素，并保存在-20℃。
用胰蛋白酶裂解全毒素制备了氨基端截短的Cry1Ca核心毒素(残基29-628)用于进一步的测定法验证研究。使用抗Cry1Ca多克隆抗体进行Western印迹时，一个纯化Cry1Ca全毒素的样品显示了预期大小的阳性信号。通过昆虫生物测定验证了纯化的Cry1Ca全毒素和氨基端截短型核心毒素的生物活性，该昆虫生物测定以掺有Cry1Ca的饵料喂养的新生小菜蛾幼虫。
实施例2
杂交瘤制备
用纯化的Cry1Ca免疫小鼠，并利用标准杂交瘤融合技术制备一组表达抗Cry1Ca单克隆抗体的杂交瘤。从每个含有杂交瘤的孔中无菌地取出经过培养的(spent)组织培养基的样品，并使用下述的抗体捕获ELISA法测定Cry1Ca反应性。用1-10μg/mL的纯化Cry1Ca的溶液包被微量滴定孔。洗涤各孔，将经过培养的组织培养基的样品放置在孔中，并使其温育。洗涤各孔，加入带辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗血清并使其温育。洗涤各平板，加入底物显色反应，并读取各平板的OD(光密度)。将高OD读数的孔与相应的包含杂交瘤的培养孔对应起来。在培养扩大的同时，对Cry1Ca抗体阳性培养物不断地筛选抗体产生，以确保增长的稳定性和抗体产生。进行几轮的有限稀释克隆，以建立每一个培养物的真正的单克隆。对抗体的阳性克隆实施进一步的测定，以确定各抗体是否适用于请求保护的使用植物材料的田间应用的检测方法。对各单克隆抗体筛选对Cry1Ca全毒素和核心毒素的特异性。测试所有抗体的交叉反应性，均未发现与Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Be、Cry1Da和Cry1F的交叉反应。
实施例3
定量ELISA验证研究
将抗体4-40用作捕获抗体，以1ug/ml的浓度[在含有0.75％卵清蛋白的PBST(含有0.05％Tween TM 20的磷酸盐缓冲盐水溶液)(PBST/OVA)中]将其包被在96孔微量滴定板上，然后在冷藏下储存。检测抗体4-42使用标准技术与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。制备一个测定试剂盒以用于该验证实验，该试剂盒由包被有抗体的微量滴定板、4-42的液体HRP缀合物(1X)，酶底物溶液、和标准反应终止剂组成。
线性测试是用在缓冲液中稀释的Cry1Ca全毒素蛋白标准曲线测试Cry1Ca试剂盒，以确定曲线在所有浓度上是否为线性。使包被的抗Cry1Ca测定板达到室温(约30分钟)。制备Cry1Ca蛋白标准品(PBST中100ng/mL)。除非另有说明，PBST用作本实验的稀释缓冲液。
将200μL Cry1Ca标准品一式三份加入A行，10-12列。其余孔中的10-12列加入100μL PBST缓冲液。沿着平板的各列进行2倍顺序稀释，方法是取100μL的第一标准品加入到含有缓冲液的下一个孔中，产生100、50、25、12.5、6.25、3.125、3.25、3.125、和1.4525ng/mL的Cry1Ca标准曲线。将板密封并使用平板振荡器在室温下振荡1小时。使用Quadra WashTM 2洗板器(Tomtec)将板用PBST洗涤4次。
洗涤后，在板的各孔中加入100μL的Cry1Ca/HRP酶缀合物。将板密封并在室温下振荡30分钟。然后使用洗板器洗板。在板的各孔中加入100μL HRP底物溶液，并在室温下温育15分钟。在板的各孔中加入100μL的终止溶液(0.4M H2SO4)。然后使用SpectraMax TM酶标仪(Molecular Devices)在450nm读板。
参考Cry1Ca标准曲线(100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.4525ng/mL)显示这些浓度基于二次拟合分析是线性的(图1)。线性是基于相关性(r2)值为0.999而确定的。对于本项验证，该曲线用于所有后续的ELISA测试。
使用截短型Cry1Ca核心毒素重复了上述测定，并与全毒素结果进行比较(图2)。由于全毒素和核心毒素之间大约100％的大小差异，全长毒素的斜率与核心毒素的斜率显著不同。这项I级验证研究演示了利用ELISA测定以所需的确定的性能水平检测Cry1Ca全毒素或核心毒素，提供了所得结果的高置信度。
这些方法的精密度使用多天内以标准品“加标”(spike-in)实验的结果来确定。将标准品分配到一次性使用的小瓶中并储存在-80℃直到用于测试。对于六个总加标重复中的每一个，计算标准偏差和百分比变异系数。为每个强化水平(level of fortification)计算变异系数，在50-0.80ng/ml的预期浓度之间具有<20％的可接受范围，如表2所示。
表2
实施例4
选择性/基质效应
测试无效(null)转基因玉米叶组织与Cry1Ca标准品的基质干扰。将玉米叶组织的混合物置于具有40mL提取缓冲液(PBST+5ul/ml植物蛋白酶抑制剂Cat#P9599Sigma)和40个DaisyTM BB(4.5mm)的50mL锥形管中。将管在改良的颜料搅拌器中振荡3分钟，然后以3600rpm离心10分钟。除去上清液，置于冰上并使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Cat#23227，Thermo Scientific)测试总可溶性蛋白。一旦确定了总蛋白浓度，将基质在PBST中稀释至0.24mg/mL，用作玉米基质。
将纯化的Cry1Ca蛋白标准品在玉米基质溶液中稀释至100ng/mL，并一式三份地加100μL到Cry1Ca包被的微量滴定测定板的A行、10-12列的孔中。板的其余孔中加100μL的玉米基质(无Cry1Ca标准)。沿着测定板的各列进行2倍系列稀释，并使用来自实施例3的ELISA试剂盒进行测试。通过ELISA测定的每个标准浓度的％回收，与添加到基质的理论蛋白质量比较，以确定基质效应。利用加标到玉米基质中的参考Cry1Ca来确定当玉米基质中存在Cry1Ca时是否能以可接受的水平检出。玉米样品通常以1:25稀释，因此样品中总可提取的可溶性蛋白质(total extractable soluble protein)浓度为0.24mg/mL。该浓度将用于所有使用玉米基质的测试。
基于ELISA结果，七个Cry1Ca标准浓度中的每一个与掺入基质中的理论蛋白(表3)相比均具有可接受的信号(80-120％)。因此，在测试的玉米基质浓度下，任何Cry1Ca标准品中均未观察到基质效应。
表3
实施例5
准确性
通过将ELISA结果与Western印迹比较来确定测定的准确性。如上所述提取来自经基因工程化以表达Cry1Ca全毒素的玉米植物的三个叶片样品。然后将样品以3600rpm离心5分钟。取出100μL上清液，置于冰上直至用于ELISA。向样品中加入200μL提取缓冲液，并重复提取过程。然后将来自两次提取的上清液汇集在一起。将样品以2、4、8、16和32稀释倍稀释，一式两份，并加入到ELISA板中。制备Cry1Ca标准品，并以100ng/mL开始一式两份加入板中。然后基于上述方法进行ELISA测定。将每个样品的所有稀释液一起平均，得到每个玉米样品的平均ng/mL值。
使用来自上述ELISA测试的提取物，通过Western印迹分析一式两份地测试三个玉米样品。收集上清液后，向样品提取物中加入含有400mM二硫苏糖醇(DTT)的4X上样缓冲液(NUPAGE LDS Sample Buffer，Invitrogen)，使最终浓度为1X。将样品在90℃下加热5分钟。将样品、全长Cry1Ca蛋白标准品(20ng/泳道，10ng/泳道)、截短的Cry1Ca蛋白标准品(20ng/泳道，10ng/泳道)、以及阴性玉米基质上样到4-12％Bis-Tris NUPAGE迷你凝胶(Mini Gel)(Invitrogen)上。一旦凝胶的每个泳道均已上样，即将凝胶盒在200V下运行45分钟。在凝胶分离之后，通过槽转移(tank transfer)将蛋白质转移到膜上。按照以下顺序组装印迹模块(Xcell II BlotTM模块，Invitrogen)：模块的底部(负电极)部件、3个预湿滤膜垫、1片预湿滤纸、迷你凝胶、膜(PVDF，Invitrogen)，1片预湿滤纸，3个预湿滤膜垫、和模块的顶部(正电极)部件。然后将转移三明治置于转移槽中，并在槽的内室和外室中加入1X转移缓冲液(Invitrogen)。将凝胶在冷室中在5V下转移过夜。转移后，将膜用ECL封闭剂(AmershamBiosciences)在室温下以50rpm振荡封闭60分钟。除去封闭溶液，将在封闭缓冲液中稀释至1ug/mL的第一抗体(兔抗Cry ICa截短)在室温下振荡加入膜1小时。除去一抗，用PBST漂洗印迹两次，用PBST洗涤两次，每次5分钟。洗涤后，将用PBST以1:5000稀释的二抗(山羊抗兔HRP，KPL)加入膜中，并在室温下振荡温育1小时。然后除去二抗，将膜用PBST漂洗3次，用PBST洗涤4次，每次5分钟，然后用1X PBS漂洗3次。洗涤后，使印迹经受4mL化学发光底物(Pierce SuperSignal West Pico Luminol Enhancer TM和稳定的过氧化物溶液)4分钟。除去底物，将印迹包裹在保鲜膜中。然后将印迹带到暗室中并对胶片曝光以检测凝胶上存在的蛋白质。一旦蛋白质图像显示在胶片上，在Syngene XR成像仪(Syngene)上扫描胶片，并使用Quantity OneTM软件(Bio-Rad)对标准和样品条带确定密度。结果示于表4中。
表4
实施例6
平行性
测试Cry1Ca测定法的平行性，以确保所要求保护的抗体可支持这样的测定法：其中对样品的多个连续稀释不会导致对表达CrylCa的玉米植物的偏倚测量。通过ELISA测试经遗传修饰以表达CrylCa的玉米的6个叶样品。发现对于每个样品，五个稀释度(1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64)落在标准曲线的定量范围内，并且定量结果的CV(变异系数)小于20％，如表5所示。每个样品一式三份测试，并且确定各单独测试的样品中每个稀释度的平均浓度。SD对应于标准偏差，其用于确定％CV。在测试的整个稀释度范围内，没有蛋白质浓度的估计增加或减少的趋势。因此，对于CrylCa阳性玉米植物，CrylCa ELISA显示了在五个稀释度上的平行性。
表5
稀释度 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6
1∶4 508.191 508.191 508.191 508.191 508.191 508.191
1∶8 470.131 628.031 323.393 394.814 440.835 622.827
1∶16 438.126 477.366 331.533 396.013 412.269 495.308
1∶32 481.099 512.159 369.047 407.615 450.533 532.541
1∶64 526.427 532.907 401.336 449.713 498.186 578.982
平均 484.7948 531.7308 386.7 431.2692 462.0028 547.5698
SD 34.23188 57.37556 74.72797 48.4475 40.29782 52.81624
CV 7.061106 10.79034 19.32453 11.2337 8.722419 9.645573

Claims (17)

1.特异性结合Cry1Ca核心毒素的单克隆抗体，其选自下组抗体：3-34、4-39、4-40、4-41、4-42、和4-45。
2.权利要求1的单克隆抗体，由命名为3-34的杂交瘤产生。
3.权利要求1的单克隆抗体，由命名为4-39的杂交瘤产生。
4.权利要求1的单克隆抗体，由命名为4-40的杂交瘤产生。
5.权利要求1的单克隆抗体，由命名为4-41的杂交瘤产生。
6.权利要求1的单克隆抗体，由命名为4-42的杂交瘤产生。
7.权利要求1的单克隆抗体，由命名为4-45的杂交瘤产生。
8.产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其以选自下组的登录号保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)：PTA-121061，PTA-121062，PTA-121063，PTA-121064，PTA-121065和PTA-121066。
9.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121061保藏。
10.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121062保藏。
11.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121063保藏。
12.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121064保藏。
13.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121065保藏。
14.权利要求8的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-121066保藏。
15.一种用于鉴定Cry1Ca蛋白的存在的方法，包括：
a)将第一种权利要求1的单克隆抗体固定化在测定表面上，然后洗涤该测定表面；
b)使该测定表面与怀疑含有Cry1Ca的液体接触足以允许结合的一段时间；然后洗涤该测定表面；
c)使该测定表面与缀合至报告基团的第二种不同的权利要求1的抗体接触足以允许该第二种缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后洗涤该测定表面；和，
d)检测所述报告基团的存在或不存在。
16.一种定量测定Cry1Ca蛋白的方法，包括：
a)将Cry1Ca抗血清固定化在测定表面上；
b)使该测定表面与怀疑含有Cry1Ca的液体接触足以允许结合的一段时间，然后洗涤该测定表面；
c)使该测定表面与缀合至报告基团的第二种不同的权利要求1的抗体接触足以允许该第二缀合单克隆抗体结合的一段时间，然后洗涤该测定表面；和，
d)通过与校准曲线比较来定量所述报告基团的存在。
17.权利要求15的方法，其中所述第一种单克隆抗体是4-40，且所述第二种偶联单克隆抗体是4-42。
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