CN106432489A - 一种检测人cirbp的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学人CIRBP单克隆抗体工程，采用抗CIRBP‑N单克隆抗体36B4‑D8‑F4，和/或抗CIRBP‑C单克隆抗体11F11‑D9‑C6用于人CIRBP的ELISA试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人CIRBP中的应用。

Description

一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
CIRBP(Cold-inducible RNA-binding protein)被称为冷诱导蛋白，首先是作为当细胞受到冷刺激时，高度表达的一种蛋白而被发现的，同时也可以在低温下起到保护作用。随后被证明其含量的升高与机体的炎症有关。当机体受到刺激时，巨噬细胞会释放CIRBP，以DAMP方式诱导一些促炎因子(如IL-1β)的表达，严重时，进而引发大出血和脓毒症。CIRBP正常情况下存在于细胞核中，当细胞受到刺激时(如低氧、渗透压的改变、UV辐射)，CIRBP由细胞核转移到细胞质中，并集中在一个沉默mRNA集中的应急颗粒中。CIRBP可以结合到应急蛋白mRNA的3UTR区，稳定并促进这些蛋白的翻译，从而保护细胞免受应激所带来的伤害。近年来，CIRBP被认为是与肿瘤发生和发展相关的蛋白，编码CIRBP的基因又被称为是原癌基因，经报道，CIRBP在肿瘤细胞内以及肿瘤患者的血清中都有很高丰度的表达，一方面，CIRBP可以上调肿瘤细胞中的ERK、MEK、NF-κB的表达，并使之磷酸化，加速肿瘤细胞的恶化，促进癌症的发展；另一方面，CIRBP可以上调TERT mRNA的表达，同时结合并稳定TREC区域，共同增强端粒酶的活性，延长端粒以维持肿瘤细胞的活性。总之，CIRBP是与肿瘤增殖、侵袭、复发相关的一类蛋白，可以作为肿瘤进展的标志物。
CIRBP是一个含172个氨基酸的蛋白，分子量为18KDa左右，有2个保守的结构域：N端的RRM(RNA识别区域)和C端的GGR(甘氨酸富集区域)。由于CIRBP比较保守，且在种属间具有较强的同源性。由于人和鼠的亲缘性较近，免疫鼠不容易得到亲和力高、特异性好的抗体，结构相差不大的蛋白甚至不容易产生免疫反应。相比之下，选择兔为免疫动物往往能解决上述问题，产生能针对某一抗原决定簇的高特异性、强亲和力的抗体。同时，兔的免疫系统产生的抗体多是位于小表位的，这在制备高灵敏度ELISA试剂盒时是需要的。
目前，纵观各抗体生产商对于CIRBP抗体的研制，多数厂家生产的抗体免疫宿主来源是羊或兔，但基本上是以多克隆形式存在的。而对于的ELISA试剂盒的研发就更少。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用。
本发明研发制备检测人CIRBP的ELISA试剂盒的思路如下：根据CIRBP空间结构上的特点，先是通过原核表达系统表达了其N端和C端的功能结构域片段，再将这2个功能片段分别免疫新西兰大白兔，得到了分别针对这2个片段的高效价单克隆抗体。再以针对不同抗原的单克隆抗体两两配对，组装成ELISA检测对。并对研发的ELISA试剂盒进行特异性、灵敏度、检测范围的验证。最后对临床上患有肝癌、结直肠癌、卵巢癌的患者血浆进行CIRBP含量的测定。
本发明具体的技术方案如下：
抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明还包括用于制备抗CIRBP的一对单克隆抗体对：包括
抗CIRBP-N单克隆抗体，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:5所示，所述编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:6所示；
抗CIRBP-C单克隆抗体，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:7所示，所述编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:8所示；
上述单克隆抗体主要由以下方法制备：
首先将CIRBP-N和CIRBP-C多肽片段作为抗原免疫兔子，通过多次不同途径的免疫，选取效价最高的兔子进行细胞融合；
细胞融合时，取效价最高兔子的脾脏单细胞悬液，和对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E-W3，在助融剂的作用下进行融合；
将所述细胞融合后的细胞悬液进行单克隆培养，取长出克隆的上清做间接ELISA检测，所述单克隆培养采用的培养基为含有HAT的20％血清的RPMI1640；
将效价高的孔中的克隆进行扩大培养，通过有限稀释法进行至少2次亚克隆，选取亚克隆的阳性率为90％以上的克隆为稳定克隆；
将筛选出的细胞株进行扩大培养，培养上清经proteinA柱纯化，获得相应的抗体。
本发明还包括抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4和/或抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6在制备检测人CIRBP的ELISA试剂盒中的应用。其中，抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4作为包被抗体；抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6作为检测抗体。
一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒，包括以下成分：
1)预包被捕获抗体的酶条：包被终浓度为10μg/mL的抗CIRBP-N单克隆抗体，该单克隆抗体来自于权利要求1或2所述的单克隆抗体36B4-D8-F4；
2)封闭液：2wt％海藻糖和0.4wt％明胶；
3)稀释液：1wt％酪蛋白；
4)检测抗体反应液：浓度为1mg/mL的生物素化抗CIRBP-C单克隆抗体；该单克隆抗体来自于权利要求2所述的单克隆抗体11F11-D9-C6；
5)酶结合工作液：HRP偶联的链霉亲和素1mg/mL。
优选的，所述ELISA试剂盒还包括：
6)底物显色液：TMB底物反应液；
7)终止液：2M H2SO4；
8)标准品：10ng/mL的CIRBP溶液，100uL。
本发明还包括上述ELISA试剂盒在检测人CIRBP的应用。其中，待检物反应时间为90min；检测抗体反应时间为60min。优选检测对象为人血液、血清，还包括人组织和细胞。
本发明的ELISA试剂盒被证明对CIRBP有很好的检测效率的同时，也检测对于IFN-α、TNF-α、VEGF、MMP-9、IL-1β的反应。实验证明了检测CIRBP的值较高，而对于血浆中可能含有的其他蛋白的检测值都很低，证明本发明ELISA试剂盒有较好的特异性。
同时本发明ELISA检测试剂盒是将抗CIRBP-N抗体作为捕获抗体，固定在96孔板上，用带有生物素标记的抗CIRBP-C抗体为检测抗体，这样极大程度降低了反应的假阳性，提高了检测的特异性以及灵敏度。通过一系列稀释梯度的CIRBP进行灵敏度的检测，得到本发明ELISA试剂盒检测限为1pg/mL，同时得到了检测范围是1-50g/mL。
本发明利用研制的ELISA检测试剂盒对正常人和肿瘤患者的血清中CIRBP含量进行检测，发现肿瘤患者的血清中CIRBP含量较正常人明显升高，说明本发明ELISA试剂盒可以很有效地检测出人血清中CIRBP的含量。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1：CIRBP-C-his和CIRBP-N-his克隆株表达产物鉴定图；其中1-a：抗His标签的抗体检测CIRBP-C-his的表达，1-b：抗His标签的抗体检测CIRBP-N-his的表达；
图2：CIRBP-C-his偶联KLH的WB鉴定图，其中：Lane1：CIRBP-N-his；Lane2：KLH；Lane3：CIRBP-N-his偶联KLH；
图3：KLH偶联的CIRBP-N-his抗原第三次免疫后血清效价测定；
图4：SDS-PAGE单克隆抗体11F11-D9-C6表达产物的纯化，其中，Lane1：抗体的非还原状态；Lane2：抗体的还原状态；
图5：ELISA验证单克隆抗体11F11-D9-C6生物素化结果；
图6：抗体配对的特异性检测。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：抗原片段的表达
1.1 CIRBPN端和C端多肽片段表达序列的合成
查阅基因，根据已经公开的CIRBP蛋白质序列(NCBI:NP_001271.1)，得到表达RRM(7-79氨基酸)区和GGR(145-172氨基酸)区的蛋白序列，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
由金斯瑞生物科技公司合成能表达RRM(7-79氨基酸)和GGR(145-172氨基酸)区对应的DNA序列(如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)，并在5’端和3’端分别加上BamH I和XhoI酶切位点，通过这2个酶切位点将目的片段克隆入pET-22b载体中，分别得到周质表达的多肽片段CIRBP-N-his或CIRBP-C-his的载体。
1.2 CIRBP-N和CIRBP-C的表达
将上述载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过氨苄青霉素抗性筛选出成功转化的克隆：BL21(DE3)/CIRBP-N-his或BL21(DE3)/CIRBP-C-his。对应的每种蛋白分别挑取10个克隆，将表达每种蛋白的克隆产物通过抗His的抗体进行WB验证后，将表达量高的通过10L发酵罐大量发酵之。
上述载体的表达方式为大肠杆菌周质表达，利用渗透压休克法释放周质内容物后，周质内容物通过His-tag柱亲和纯化蛋白，得到1mg蛋白，周质蛋白提取过程如下：
1)将发酵上清于4℃，8000rpm离心20min，收集菌体。
2)所得沉淀用100mL的30mM Tris HCl、20％蔗糖、1mM EDTA((pH8.0)的溶液悬浮后冰浴，轻轻振荡10min。
3)4℃8000g离心20min，去除上清，沉淀用100mL的5mM MgSO4悬浮后冰浴，轻轻振荡10min。
4)4℃12000g离心15min，取上清即为释放的周质内容物。
实施例2：抗原片段的偶联
得到的多肽片段CIRBP-N-his或CIRBP-C-his再通过KLH进行偶联。KLH进行偶联的过程如下：
1)用20mL的10mM pH8.0的PBS溶解2.5mg的KLH，并在其中缓慢加入CIRBP-N-his或CIRBP-C-his。
2)用20mL的10mM pH8.0的PBS溶解10mg的EDC，并逐滴加入上述反应液中。
3)室温搅拌1h，4℃搅拌12h后，在4℃静置10h。
4)用截留分子量为7KDa的透析袋透析过夜，得到的经透析的偶联浓缩物。产物经过SDS-PAGE验证，确定纯度后，开始免疫。
实施例3：间接ELISA的方法检测血清中效价
1)用碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释多肽CIRBP--N-his或CIRBP-C-his至浓度为10μg/mL包被，经紫外照射30min活化的酶条，4℃包被过夜。
2)弃抗原，250μL的PBS洗涤三次，拍干。每孔加入200μL封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃静置2h，封闭酶条中未包被的空白位点。
3)弃封闭液，拍干。用封闭液梯度稀释免疫血清，加100μL至孔中，37℃孵育2h。
4)弃一抗，200μL的PBST振荡洗涤3次，每次5min，拍干。每孔加入1:5000稀释的100μL羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育2h。
5)每孔加入新鲜配制TMB显色液100μL，37℃避光显色10min。
6)每孔加50μL的2M H2SO4以终止反应。
7)酶标仪上测定OD450nm与OD630nm数值，以OD450nm-OD630nm为最终值，实验孔/实验孔>2为阳性，即P/N>2。
实施例4：动物的免疫
1)每种融合抗原免疫3只新西兰大白兔(雄性，3月龄)，在免疫前期，每只耳缘静脉取血2mL，
2)首次免疫时，将1mg抗原溶于1mLPBS中的抗原，加入1mL的完全弗氏佐剂充分乳化。注射部位为背部和趾处的多点注射，注射方式为皮内注射。
3)一次加强免疫时，将1mg抗原溶于1mLPBS中，加入1mL的不完全弗氏佐剂充分乳化。注射部位为背部和趾处的多点注射，注射方式为皮下注射。
4)二次加强免疫时，将1mg抗原溶于1mLPBS中，加入1mL的不完全弗氏佐剂充分乳化。注射部位为背部和趾处的多点注射，注射方式为皮下注射。
5)三次加强免疫时，将1mg抗原溶于1mLPBS中，加入1mL的不完全弗氏佐剂充分乳化。注射部位为背部和趾处的多点注射，注射方式为皮下注射。
6)每次加强免疫2周后，耳缘静脉取血5mL进行ELISA检测效价，效价测定时抗原包被浓度为5ug/mL，封闭液用3％的脱脂牛奶，将兔子血清按分别用PBS稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍后进行检测。
7)进行细胞融合的前3天，将0.5mg抗原溶于0.5mLPBS中，无需乳化通过耳缘静脉注射入兔子体内。
实施例5：细胞融合法制备杂交瘤
1)将兔子处死，剥离脾脏，用充满PBS的无菌注射器灌满脾脏，使劲推拉，得到的组织悬液通过70um筛网过滤，用红细胞裂解液去除红细胞后。室温下，1500rpm离心5min，将细胞沉淀用5mL无血清RPMI1640重悬，再次1500rpm离心5min。最后将细胞沉淀用5mL无血清RPMI1640重悬，细胞计数后，再将细胞用5mL无血清RPMI1640重悬2次，期间取对数生长期的约1×107～6×107的骨髓瘤细胞(240E-W3)，也用无血清RPMI1640清洗2次。最后，将脾重悬的细胞和240E-W3按2:1的比例同时移入15mL离心管，1500rpm离心5min。得到的混合沉淀用于融合。
2)融合的整个过程都在37℃中进行，在超净台中准备37℃无菌水浴，其中水浴锅经75％的乙醇搽试后，注入无菌水加热。将50％PEG4000和无血清RPMI1640都事先在37℃中平衡。
3)将上述离心得到的混合细胞沉淀用1mL的50％PEG4000逐滴加入，加入时间不能短于1min，同时每滴加一滴，就用1mL的枪头搅拌使充分混匀。
4)再在上述混合细胞中滴加入1mL的无血清RPMI1640，滴加时间也是不能短于1min，同时每滴加一滴，就用1mL的枪头搅拌使充分混匀。再重复上述步骤一次。
5)再在上述混合细胞中滴加入1mL的无血清RPMI1640，滴加时间也是不能短于3min。
6)室温下，1500rpm离心5min，沉淀先用5mL含20％FBS的RPMI1640重悬，再用培养基将体积补至50mL后，1500rpm离心5min。再重复清洗一次。
7)得到的沉淀用5mL含20％FBS的RPMI1640重悬，经计数后，铺96孔板，保证每孔10个细胞。
8)次日，将96孔板中细胞的培养基更换为含20％FBS的RPMI1640加上HAT，培养7天后，小心弃去原来的培养基，而更换新鲜含有20％FBS和HAT的RPMI1640培养基。
9)15天后，标记阳性孔，取上清做间接ELISA检测，分别以CIRBP-N和CIRBP-C多肽片段为抗原进行包被，1：5000稀释的上清做检测，用HRP标记的鼠抗兔二抗做为检测抗体，同时以KLH包被检测是否存在交叉反应。
10)将ELISA检测值高的孔作为阳性孔，进行保种，同时转至24孔板中进行扩增后，再进行2轮有限稀释。
11)最终得到抗CIRBP-N抗体：40E5-F6-B7，36B4-D8-F4，13D7-G8-F10；抗CIRBP-C抗体：24E8-D5-E9，15G9-D3-B3，11F11-D9-C6。
实施例6：抗体的生物素化
将上述3个抗CIRBP-C的单克隆抗体生物素化，生物素化所用的试剂为Sulfo-NHS-LC-biotin(Thermo Scientific，货号：21335)，反应时加入20倍摩尔质量的Sulfo-NHS-LC-biotin。
配制10mM的Sulfo-NHS-LC-biotin溶液：迅速称取20mg的Sulfo-NHS-LC-biotin于5mL的EP管中，并立即加入3.6mL的ddH2O，充分溶解后需立即使用。
取2mg/mL的抗CIRBP-C抗体溶液1mL，并加入57uL10mM的Sulfo-NHS-LC-biotin，通过在冰上反应3h，期间用枪头吹打以确保反应充分。反应后的产物用脱盐柱除盐。脱盐柱使用方法如下：PBS充分平衡过的除盐柱(Thermo Scientific，货号：89889)上样，4℃1000g离心5min，离心得到的流出液即为生物素化抗体。通过ELISA的方法将以上生物素化抗体进行验证：将生物素化和未生物素化的抗体以5ng/mL的浓度包被，再加入HRP-链霉亲和素，通过显色反应证实了抗体被生物素化标记。
实施例7：ELISA配对的选择
以筛选出的抗CIRBP-N-和抗CIRBP-C抗体进行一对一的配对，即以抗CIRBP-N抗体包被，用生物素化抗CIRBP-C抗体作为检测抗体检测CIRBP的含量。所用的重组人CIRBP来源于北京义翘神州。获得9个配对组合，见表1：
表1：包被抗体和生物素化检测抗体的配对组合名称
包被抗体 生物素化检测抗体
配对1 40E5-F6-B7 24E8-D5-E9
配对2 40E5-F6-B7 15G9-D3-B3
配对3 40E5-F6-B7 11F11-D9-C6
配对4 36B4-D8-F4 24E8-D5-E9
配对5 36B4-D8-F4 15G9-D3-B3
配对6 36B4-D8-F4 11F11-D9-C6
配对7 13D7-G8-F10 24E8-D5-E9
配对8 13D7-G8-F10 15G9-D3-B3
配对9 13D7-G8-F10 11F11-D9-C6
用这9个配对组合检测100pg/mL的CIRBP，以及相同浓度的IFN-α、TNF-α、VEGF、MMP-9、IL-1β，通过反应强度以确最佳的组合。检测结果如图6所示，得到了最佳配对组合为配对6：即抗CIRBP-N抗体36B4-D8-F4和生物素化抗CIRBP-C抗体11F11-D9-C6。
其中，抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4的轻链可变区多肽序列用SEQ ID NO:5所示，重链可变区多肽序列用SEQ ID NO:6所示。
抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6的轻链可变区多肽序列用SEQ ID NO:7所示，重链可变区多肽序列用SEQ ID NO:8所示。
实施例8：ELISA试剂盒的优化
将实施例7中筛选出来的抗体配对组合进行包被抗体浓度、检测抗体浓度、封闭液、稀释液、待检物反应时间、检测抗体反应时间的优化，所用的CIRBP来源于北京义翘神州，检测CIRBP浓度为25pg/mL时的反应能力。
①先是测试不同种类的封闭液：5％脱脂牛奶、0.5％BSA、2％海藻糖、0.4％明胶；
以及不同种类的待检物或抗体稀释液：5％脱脂牛奶、0.5％BSA、1％酪蛋白
表2：不同封闭液以及样品稀释液对CIRBP和阴性值的影响
(三次实验结果的平均值)
表2-1：待检物为阳性(25pg/mL CIRBP)
表2-2：待检物为阴性(封闭液)
结果可以看出：5％脱脂牛奶造成的背景值最大：0.082，这可能是脱脂牛奶中含有生物素，对检测造成了干扰。通过可以看出，用2％海藻糖+0.4％明胶作封闭液，1％酪蛋白作为待检物或抗体稀释液能得到很好的检测灵敏度，同时提高了检测的P/N值。
②接下来利用棋盘标定法确定包被抗体浓度(20、10、5、1μg/mL)和检测抗体浓度(2、1、0.5、0.25μg/mL)。
表3：不同浓度的包被抗体以及检测抗体对CIRBP和阴性值的影响
(三次实验结果的平均值)
表3-1：待检物为阳性(25pg/mL CIRBP)
表3-2：待检物为阴性(封闭液)
结果显示，包被浓度为20μg/mL时样品的值最高，但同时阴性值也越大，而当包被浓度降至5μg/mL时，样品的值有所降低，得到的浓度组合为：包被浓度10μg/mL，检测浓度为1μg/mL。
③再在此基础上测试不同待检物反应时间、检测抗体反应时间：45min、60min、90min、120min。
表4：待检物和生物素化检测抗体不同孵育时间对CIRBP和阴性值的影响
(三次实验结果的平均值)。
确定最佳的时间组合为：待检物和检测抗体的作用时间分别为90min和60min。
综上所述，最佳组合方案为：包被抗体(36B4-D8-F4)浓度：10μg/mL；检测抗体(生物素化11F11-D9-C6)浓度：1μg/mL；封闭液：2％海藻糖+0.4％明胶；稀释液：1％酪蛋白；待检物反应时间：90min；检测抗体反应时间：60min。
因此，优化后的ELISA试剂盒组成为：
1)本试剂盒采用预包被抗原(100μl/孔)的酶标条，且包被完成后即进行封闭。
2)包被液：终浓度为10μg/mL的抗CIRBP-N抗体36B4-D8-F4
3)封闭液：2％海藻糖+0.4％明胶
4)稀释液：1％酪蛋白
5)检测抗体反应液：生物素化抗CIRBP-C抗体11F11-D9-C6，1mg/mL，使用时用稀释液1:1000稀释
6)酶结合工作液：HRP偶联的链霉亲和素1mg/mL，购自麦约尔生物科技有限公司，使用时用稀释液1:10000稀释
7)底物显色液：TMB底物反应液，购自碧云天生物科技有限公司
8)终止液：2M H2SO4
9)标准品：10ng/mL的CIRBP溶液，100uL
以上所有试剂都保存在4℃，使用时需放室温平衡15-30min后方可使用。
需使用者自备溶液：PBS、PBST。
优化后的ELISA试剂盒具体使用方法如下：
1)使用前，将所有试剂从4℃拿出，并于室温平衡15-30min。
2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样本(含标准品)和空白都应做至少3个复孔。加入稀释后的标准品和样品，每孔100uL，37℃孵育90min。
3)洗板：弃去孔内液体，每孔先用250μL的PBST洗3次，再用250μL的PBS洗3次，每次洗时在震荡器中反应5min后，甩去孔中液体，并在滤纸上扣干。
4)每孔加入100μL二抗反应液，37℃孵育60min。
5)洗板：重复步骤3。
6)每孔加入100μL酶结合工作液，室温孵育30min。
7)洗板：重复步骤3。
8)每孔加入100uL的TMB底物反应液，室温避光孵育10min。
9)每孔加入50uL的终止液以终止反应。
10)终止后10min内，检测波长450nm和630nm处的读值。
实施例9：ELISA试剂盒检测限和检测范围的测试
按实例的最佳组合方案进行检测。检测用稀释液梯度稀释的抗原CIRBP：100、50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05pg/mL，以检测结果的OD450-OD630为纵坐标，检测浓度为横坐标，对检测结果进行线性拟合，发现在CIRBP浓度在1-50pg/mL范围内，吸光值与浓度有很好的线性关系，即检测范围为：1-50pg/mL，检测限为1pg/mL。
实施例10：应用ELISA试剂盒检测人体中的CIRBP水平
正常人体内的CIRBP浓度为1.41-5ng/mL，肿瘤患者体内的CIRBP浓度会有所升高：10-50ng/mL。
应用研制的ELISA试剂盒检测30名正常人以及35名肿瘤患者(包括不同程度的前列腺癌、肝癌、结直肠癌)血清中的CIRBP水平，得到肿瘤患者的血清中CIRBP浓度显著高于正常人。CIRBP在肿瘤患者和正常人血清中的平均含量分别为26.5和2.13。具体方法如下：
按照研制的ELISA试剂盒操作步骤进行操作。
取正常人和肿瘤患者血液2mL至含有肝素钠的采血管中，4℃，3000rpm离心10min，取上清即血清，4℃保存，检测时，用稀释液将得到的血清进行500、1000、2000倍的稀释。每个浓度设3个复孔。
标准曲线测定：取10uL10ng/mL的CIRBP贮存液稀释到1mL，得到的浓度为100pg/mL，再用稀释液稀释至以下浓度：50、25、12.5、6.25、3.13、1.63pg/mL，每个检测浓度设3个复孔。将各浓度的标准液以及样品稀释液加到孔中，同时设置只加入稀释液的孔作为空白孔。比对标准曲线的测定结果，推算正常人和肿瘤患者血清中CIRBP浓度。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，其特征在于，所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4的编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:6所示。
2.用于制备抗CIRBP的单克隆抗体对，其特征在于，包括
抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:6所示；
抗CIRBP-C单克隆抗体1F11-D9-C6，所述抗CIRBP-C单克隆抗体1F11-D9-C6编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:7所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:8所示。
3.权利要求1或2所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先将CIRBP-N和/或CIRBP-C多肽片段作为抗原免疫兔子，通过不同途径的免疫，选取效价最高的兔子进行细胞融合；
细胞融合时，取效价最高兔子的脾脏单细胞悬液，和对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E-W3，在助融剂的作用下进行融合；
将所述细胞融合后的细胞悬液进行单克隆培养，取长出克隆的上清做间接ELISA检测，所述单克隆培养采用的培养基为含有HAT的20％血清的RPMI1640；
将效价高的克隆进行扩大培养，通过有限稀释法进行至少2次亚克隆，选取亚克隆的阳性率为90％以上的克隆为稳定克隆，得到杂交瘤细胞株；
将所得到的杂交瘤细胞株进行扩大培养，所得上清通过proteinA柱纯化，得到对应的单克隆抗体。
4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测人CIRBP的ELISA试剂盒中的应用。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4制备包被抗体。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4制备包被抗体；
抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6制备检测抗体。
7.一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
1)预包被捕获抗体的酶条：包被终浓度为10μg/mL的抗CIRBP-N单克隆抗体，该单克隆抗体来自于权利要求1或2所述的单克隆抗体36B4-D8-F4；
2)封闭液：2wt％海藻糖和0.4wt％明胶；
3)稀释液：1wt％酪蛋白；
4)检测抗体反应液：浓度为1mg/mL的生物素化抗CIRBP-C单克隆抗体；该单克隆抗体来自于权利要求2所述的单克隆抗体11F11-D9-C6。
5)酶结合工作液：HRP偶联的链霉亲和素1mg/mL。
8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
6)底物显色液：TMB底物反应液；
7)终止液：2mol/L的H2SO4；
8)标准品：100uL浓度为10ng/mL的CIRBP溶液。
9.如权利要求7-8任意一项所述ELISA试剂盒在检测人CIRBP的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测对象为人血液、血清，还包括人组织和细胞。
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