CN106414772A - 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 - Google Patents
用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106414772A CN106414772A CN201580029257.2A CN201580029257A CN106414772A CN 106414772 A CN106414772 A CN 106414772A CN 201580029257 A CN201580029257 A CN 201580029257A CN 106414772 A CN106414772 A CN 106414772A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- droplet
- less
- fluid
- methods according
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 518
- 238000003556 assay Methods 0.000 title abstract 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 266
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 136
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 134
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 373
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 353
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 184
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 155
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 92
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 84
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 72
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 69
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 69
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 67
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 60
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 56
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 52
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 42
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 35
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 27
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 26
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 22
- 230000015654 memory Effects 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 20
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims description 16
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 claims description 16
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 15
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 10
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 10
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000004531 microgranule Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 8
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims description 6
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 43
- 238000004513 sizing Methods 0.000 abstract description 11
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 82
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 22
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 14
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 10
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 7
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 description 6
- -1 alcohol acid anhydride Chemical class 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 6
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 6
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N perfluorotributylamine Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)N(C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F RVZRBWKZFJCCIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- QGJOPFRUJISHPQ-UHFFFAOYSA-N Carbon disulfide Chemical compound S=C=S QGJOPFRUJISHPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 4
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003706 image smoothing Methods 0.000 description 4
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 4
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- USPWUOFNOTUBAD-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4,5-pentafluoro-6-(trifluoromethyl)benzene Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(C(F)(F)F)C(F)=C1F USPWUOFNOTUBAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222065 Lycoperdon Species 0.000 description 2
- 241000768494 Polymorphum Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 2
- DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N hexadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229950011087 perflunafene Drugs 0.000 description 2
- UWEYRJFJVCLAGH-IJWZVTFUSA-N perfluorodecalin Chemical compound FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)[C@@]2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)[C@@]21F UWEYRJFJVCLAGH-IJWZVTFUSA-N 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N propanil Chemical compound CCC(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910000404 tripotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 1-oleoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)CO RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- PJDOLCGOTSNFJM-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-pentadecafluorooctan-1-ol Chemical compound OCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F PJDOLCGOTSNFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIBCXMVHDVUGFI-UHFFFAOYSA-N 2-(2-phenoxyethoxy)decan-2-ol Chemical compound CCCCCCCCC(C)(O)OCCOC1=CC=CC=C1 IIBCXMVHDVUGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJAVYWPXOXAOBS-UHFFFAOYSA-N 2-fluoro-1,4-dimethylbenzene Chemical group CC1=CC=C(C)C(F)=C1 WJAVYWPXOXAOBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctan-1-ol Chemical compound OCCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 244000173166 Pyrus ussuriensis Species 0.000 description 1
- 235000011572 Pyrus ussuriensis Nutrition 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002199 base oil Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- PXTQQOLKZBLYDY-UHFFFAOYSA-N bis(2-ethylhexyl) carbonate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)OCC(CC)CCCC PXTQQOLKZBLYDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003682 fluorination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000295 fuel oil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000005055 memory storage Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009416 shuttering Methods 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T7/00—Image analysis
- G06T7/60—Analysis of geometric attributes
- G06T7/62—Analysis of geometric attributes of area, perimeter, diameter or volume
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
- G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
- G06V20/60—Type of objects
- G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
- G06V20/695—Preprocessing, e.g. image segmentation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
- G01N2015/144—Imaging characterised by its optical setup
- G01N2015/1445—Three-dimensional imaging, imaging in different image planes, e.g. under different angles or at different depths, e.g. by a relative motion of sample and detector, for instance by tomography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
- G06T2207/10—Image acquisition modality
- G06T2207/10056—Microscopic image
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
- G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
- G06T2207/30004—Biomedical image processing
- G06T2207/30072—Microarray; Biochip, DNA array; Well plate
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Geometry (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Multimedia (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提供用于执行数字检定的方法、装置和系统。在某些方面中，所述方法、装置和系统可用于核酸的扩增和检测。在某些方面中，所述方法、装置和系统可用于体积中的小滴的辨识、检测和定大小。本发明还提供适合于与本公开的所述方法和装置一起使用的组合物和套件。
Description
交叉引用
本申请主张2014年4月8日申请的第61/976,918号美国临时申请和2014年9月8日申请的第62/047,570号美国临时申请的权益，所述两个申请的全文以引用的方式并入本文中。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国政府支持下依据国家卫生研究院(NIH)授权号R21 GM103459而进行。
背景技术
基于二元是或否响应的计数而进行测量的数字检定由于其稳健性、敏感性和准确性而在生物学中越来越重要。模拟测量常常需要使用现行标准进行校准，而数字测量不需要校准，且相比于模拟方法具有更快、更易于实施、更准确且更稳健的潜力。
数字检定的重要应用是样本中的DNA或RNA的准确检测和测量。用以检测样本中的DNA的最常用的方法是聚合酶链反应(PCR)，其中在由DNA聚合酶催化的温度敏感反应中扩增DNA。在PCR中，通常由热循环装置使样本在范围为从约60℃到约95℃的两个或三个温度之间循环。使用PCR来扩增DNA已极大地推进了从基础生物学到临床诊断学和法医学的广泛范围的学科。常常用于诊断学和生物医学研究中的一种特定形式的PCR是定量PCR(qPCR)，其不仅检测DNA在样本中的存在，而且提供DNA浓度的准确量度。
用于进行qPCR的最常用的方法是实时PCR，其中从扩增过程的时间演化来推断样本的绝对浓度，其在热循环过程期间使用特定地辨识扩增产物的荧光探测剂(例如，分子信标或Taqman探测剂)予以反复地监测。
实时PCR易遭受各种误差，包含非想要的引物二聚体的形成，其中引物分子由于它们的序列中的互补伸展而彼此附接。结果，产生了副产物，所述副产物与目标元素争用可用的PCR试剂，因此潜在地抑制目标序列的扩增且干扰准确的量化。目标的量化还需要每个循环的扩增效率的精确知识，且因为增长是呈指数，所以扩增效率中的微小不确定性(例如，低于阈值检测水平)将在确定目标副本数目方面引起非常大的误差。当核酸的初始浓度低时或当荧光检测不足够敏感时，此误差可变得非常大。因此，尽管实时PCR具有从复杂样本识别和量化目标DNA的能力，但实时PCR不能够可靠地且精确地量化低样本浓度，而例如在病原体检测或临床诊断学中需要可靠地且精确地量化低样本浓度。
可使用数字PCR(dPCR)潜在地克服实时PCR准确地量化低副本数目DNA的限制。在dPCR中，将含有样本的体积划分为较小体积的阵列，使得基于Poisson统计，所述体积中的至少一些体积不含有目标DNA，而其余体积可含有一或多个目标分子。随后在较小体积的阵列中同时地实行DNA扩增，从而引起仅在扩增之前含有一或多个目标分子的那些体积中增加荧光(或其他信号)。可通过知晓所述体积以及与井的总数目相比较具有增加的信号的井(即，含有经扩增DNA的井)的数目来容易地且准确地确定DNA副本数目。
大多数现有数字检定依赖于从不变大小的体积(例如，单分散小滴乳剂)获得的二元响应的计数。虽然微流体系统的进步已使能够产生单分散小滴乳剂，但这些系统在技术上困难，从而与常规的模拟方法相比较引起针对终端用户的时间和成本增加。
在给出例如实时PCR等模拟检定中固有的限制以及现有数字检定的技术困难的情况下，显然需要提供用于执行数字检定的改进式方法和设备。本文中所描述的本发明解决此需要和其他需要。
发明内容
本公开提供用于执行数字检定的方法、系统、组合物和套件。本公开部分地涉及惊人发现的数字检定，其可在含有多分散小滴的系统中执行而不会引入过度的实验误差。
在各种方面中，本发明的方法、系统、组合物和套件可用于执行涉及核苷酸样本的扩增的数字PCR检定。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法，其包括：产生多个多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括样本；扩增所述样本；使用可检测剂标记所述样本；获得小滴的图像栈；从所述图像栈确定所述小滴的体积；从所述图像栈确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在；以及基于所述可检测剂在多个小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
在一些方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法，其包括：产生多个多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括样本；扩增所述样本；使用可检测剂标记所述样本；使所述多个多分散小滴流动穿过流式细胞仪通道；随着小滴流动穿过所述流式细胞仪通道而确定所述小滴的体积；确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在；以及基于所述可检测剂在多个小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的组合物和套件，其包括：第一流体；第二流体，其中所述第一流体和所述第二流体彼此不混溶且能够在被物理地搅拌时形成乳剂；表面活性剂；以及扩增试剂。
在各种方面中，本公开提供用于使用双面乳剂执行数字检定的方法、组合物和套件。在一些方面中，所述双面乳剂包括两个水相和一油相。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法。可产生多个多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括样本。可扩增所述样本。可使用可检测剂标记所述样本。可获得小滴的图像栈。可从所述图像栈确定所述小滴的体积。可从所述图像栈确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在。可基于所述可检测剂在所述多个小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法。可产生多个多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括样本。可扩增所述样本。可使用可检测剂标记所述样本。可使所述多个多分散小滴流动穿过流式细胞仪通道。可随着小滴流动穿过所述流式细胞仪通道而确定所述小滴的体积。可确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在。可基于所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。在一些方面中，可通过检测从所述小滴散射的光来确定所述小滴的大小。可基于所述小滴的所述大小或大小分布而确定所述多个多分散小滴中的所述样本的所述浓度。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的组合物。组合物可包括第一流体、第二流体、表面活性剂，以及扩增试剂。所述第一流体和所述第二流体可彼此不混溶且可能够在被搅拌时形成乳剂。在一些方面中，所述组合物可进一步包括例如核苷酸的样本，和/或能够标记所述样本的可检测剂。
在各种方面中，本公开提供用于确定至少一个小滴的体积的系统。所述系统可包括容器、成像源，以及计算装置。所述容器可被配置成用于保持所述小滴。所述成像源可被配置成获得所述容器中的所述小滴的图像。所述计算装置可包括处理器和存储器(例如，非暂时性有形计算机可读存储媒体，例如ROM、RAM、闪速存储器，或类似者)。所述存储器可存储一组指令，所述一组指令在由所述处理器执行时致使(i)所述成像源获得所述小滴的图像栈，以及(ii)所述处理器基于所述所获得的图像栈而确定样本中的所述小滴的所述体积。
在各种方面中，本公开提供用于确定小滴的体积的方法。可获得所述小滴的图像栈。可识别所述图像栈的个别图像中的像素组。可将所述像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分。可基于所述对应而从所述像素组识别个别小滴。可基于所述至少一个像素组而确定所述所识别的个别小滴的所述体积。至少一个小滴的所述部分可包括单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的系统。所述系统可包括容器、成像源，以及计算装置。所述容器可被配置成用于保持多个多分散小滴。所述小滴中的至少一些小滴可包括使用可检测剂标记的样本。所述成像源可被配置成获得所述容器中保持的所述多个多分散小滴的图像栈。所述计算装置可被配置成操作所述成像源。所述计算装置可包括处理器和存储器(例如，非暂时性有形计算机可读存储媒体，例如ROM、RAM、闪速存储器，或类似者)。所述存储器可存储一组指令，所述一组指令在由所述处理器执行时致使(i)所述成像源获得所述容器中保持的所述多个多分散小滴的所述图像栈，(ii)所述处理器基于所述所获得的图像栈而确定所述多个多分散小滴的体积，(iii)所述处理器确定所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的存在或不存在，以及(iv)所述处理器基于所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的所述存在或不存在以及所述多个多分散小滴的所述体积而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
附图说明
在所附权利要求书中特定地陈述了本公开的新颖特征。将通过参考陈述供利用本公开的原理的说明性实施例的以下详细描述及其附图而获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1是使用共聚焦荧光显微术获得的示范性多分散小滴乳剂系统的灰度图像。
图2A示意性地说明被配置成分析样本在多个小滴中的存在或不存在的示范性检测系统。
图2B示意性地说明用以分析样本在多个小滴中的存在和或不存在的示范性检测方法。
图2C示意性地说明用以分析样本在多个小滴中的存在和或不存在的另一示范性检测方法。
图2D示意性地说明用以识别体积中的小滴的示范性扫描检测方法，其可与图2A的系统一起使用以实施图2B和图2A的方法。
图2E示意性地说明用以识别体积中的小滴的示范性简单边界方法，其可与图2A的系统一起使用以实施图2B和图2A的方法。
图2F示意性地说明用以识别体积中的小滴的示范性反向分水线方法，其可与图2A的系统一起使用以实施图2B和图2A的方法。
图2G示意性地说明用以识别体积中的小滴的示范性圆检测方法，其可与图2A的系统一起使用以实施图2B和图2A的方法。
图2H示意性地说明用以识别体积中的小滴的示范性组合式反向分水线与圆检测方法，其可与图2A的系统一起使用以实施图2B和图2A的方法。
图3描绘根据本公开的一个方面的用于执行数字检定的示范性方法。根据此方面，可通过涡旋来产生含有核苷酸样本的多分散小滴(步骤3A)，可通过PCR来扩增核苷酸(步骤3B)，且可以多井板格式分析核苷酸样本(步骤3C)。
图4描绘根据本公开的一个方面的用于执行数字检定的示范性方法。根据此方面，可将乳剂PCR执行为具有对样本转移的最少需要的优化高通量系统的部分。根据此方面，将油和含水PCR组分加载到多井板上，使整个多井板涡旋以诱发乳化，核苷酸组分在热循环仪中经历PCR扩增，且使用荧光显微镜来使所得产物成像。
图5A和图5B描绘如应用于图1中的图像的反向分水线方法的初始步骤的结果，包含如图5A所示的所关注区(ROI)的识别，和如图5B所示的具有优化圆形区的最终经处理图像，可从其确定关于小滴大小和目标分子存在的信息。
图6A示出在执行如应用于图1的图像的圆检测方法的初始步骤之后所产生的经处理图像。图6B示出在对图6A中的圆进行分类以识别和定位小滴之后所获得的最终结果。
图7A示出在执行如应用于图1的图像的组合式反向分水线与圆检测方法的初始步骤之后所产生的经处理图像。图7B示出在对图7A中的圆进行分类以识别和定位小滴之后所获得的最终结果。
图8A和图8B示出使用用于红色荧光(图8A)和绿色荧光(图8B)检测系统的扫描共聚焦显微镜获取的多分散小滴乳剂的荧光图像。图8A和图8B中的圆指示所识别的小滴。在图8A和图8B右侧的曲线图沿着在左侧的图像中所描绘的直线描绘荧光强度。图8C示出在乳化之后使用ROX荧光信号测量的489个小滴的小滴直径分布。
图9示出针对以dsDNA的三种不同起始浓度(直方图9A中的～2×103dsDNA个副本/μL、直方图9B中的～2×106dsDNA个副本/μL，和直方图9C中的～2×107dsDNA个副本/μL)加载的多分散小滴的群体的绿色对红色荧光强度的比率的频率分布。
图10示出用于计算机模拟中以验证用于执行数字检定的方法的小滴直径的计算机产生的截尾对数正态分布。所述分布是图8C所示的实验分布的理想化近似。
图11示出样本大小(即，在水平轴上示出的小滴数目)、小滴直径测量中的误差与样本浓度测量中的误差(在垂直轴上示出的测量可变性)之间的关系。使用在样本浓度被设置为4.4×10-5个分子/fL的情况下执行的数字检定的计算机模拟而产生数据。
图12示出样本浓度与统计功效之间的关系，可借此使用来自具有高50％的浓度的第二样本的数字检定来区别给定浓度的样本。
图13示出当在没有小滴直径测量误差的情况下对多分散小滴(灰色圆)或单分散小滴(黑色三角形)执行时的数字检定的样本大小(在水平轴上示出的小滴数目)与动态范围(在垂直轴上示出)之间的关系。
图14示出自发地或由于热循环而在多分散小滴乳剂中发生的小滴融合事件的频率。含有ROX但没有绿色荧光探测剂的乳化小滴与含有绿色荧光探测剂但没有ROX的小滴进行组合。在图像14A(红色荧光)和图像14B(绿色荧光)中所示的组合混合物随后保持在室温以用作对照(没有加热)或经受热启动以及1或50个热循环中的一者。以含有ROX和绿色荧光探测剂两者的小滴的百分比反映小滴融合事件的频率(图表14C)。
图15示出不经受加热(白色条)、经受1个热循环(灰色条)或50个热循环(黑色条)的多分散小滴直径的频率。
图16示出使用构成多分散小滴乳剂的流体的折射率匹配实现的数据获取能力的改进。使用共聚焦显微镜从两个不同乳剂系统(分别在图16的A1到A5和图16的B1到B5中描绘)在逐渐较深(从左到右)的焦平面处获取荧光图像。在含水样本(图16的A1到A5)中，两种不混溶流体组分的折射率不同，且小滴边界在较深的焦平面处获取的图像中变得越来越不清楚，如在图16的A5中。在混合的水和甘油样本(图16的B1到B5)中，两种不混溶流体组分的折射率类似，且小滴边界甚至在较深的焦平面处获取的图像中也仍然清楚，如在图16的B5中。
图17示出水/油/水双面乳剂的荧光图像。
图18示出针对以跨越四个数量级(净化dsDNA的2×103、2×104、2×105和2×106个dsDNA副本/μL)的dsDNA浓度加载的样本的如通过最佳拟合方法(在垂直轴上示出)所确定以及如通过260nm处的吸收测量(在水平轴上示出)所确定的样本浓度值之间的关系。
具体实施方式
本公开涉及用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和系统。具体来说，本公开涉及用于多分散小滴系统中的样本的扩增和分析的方法。本发明的方法和系统可用于识别多分散小滴系统中的小滴，确定所述小滴是否含有所关注样本，以及执行检定步骤，例如数字聚合酶链反应(dPCR)。
本公开的方法和系统有利地使能够通过使用多分散小滴执行样本的高通量扩增和分析。本公开通过产生可变大小的体积而展现在数字检定的性能中的显著改进的动态范围。对于给定样本浓度，体积的大小可界定被一或多个所关注分子(例如，模板分子)占据的概率。在扩增相关技术的实例中，体积大小的变化可用于更改此占据概率且因此更改示出扩增的井或样本体积(例如，小滴)的数目。值得注意的是，本公开改进了简单地增加具有恒定大小的体积的数目的现有技术，以便增加动态范围。与现有方法不同，可变体积样本的使用不需要使用大区域来容纳扩展动态范围所需要的体积，使用大区域会例如增加一些数字化体积未适当地形成或具有其他缺陷的芯片上的缺陷的可能性。另外，增加体积的数目还会增加分析所有那些数字化体积所需要的时间。
本公开提供可用于多分散小滴样本的产生、操纵、分析和建模中的装置、系统和设备。还提供了相关方法。本公开还包含一种用于分析数字量化平台的方法。虽然本公开被设计成实现使用多分散平台的数字检定，但本公开也可应用于使用单分散乳剂平台的数字检定。本公开还包含用于乳剂分布建模、数据获取和乳剂产生的方法。
本公开的一些方面包含用于操纵和分析物质的方法和设备，所述物质包括但不限于化学品、生化品、基因材料(例如，DNA、RNA，和类似者)、基因材料的表达产物、蛋白质、代谢物、肽、多肽，结晶分子，或生物细胞，包含稀有细胞、细胞层、细胞器、外来体、线粒体、药物、在周边血液或淋巴系统中循环的生物粒子，或粒子。
在一些方面中，本公开的设备、装置、方法和系统可用于例如使用以下各者扩增多核苷酸样本：聚合酶链反应(PCR)、反转录酶PCR(RT-PCR)、连接酶链反应(LCR)、环介导扩增(LAMP)、反转录环介导扩增(RT-LAMP)、解旋酶相依扩增(HDA)、反转录解旋酶相依扩增(RT-HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)、催化U形装配反应(CHA)、杂化链反应(HCR)、熵驱动催化、链置换扩增(SDA)，和/或反转录链置换扩增(RT-SDA)。在某些方面中，本公开的设备、装置、方法和系统可用于基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导扩增(TMA)、自持序列复制(3SR)，以及单引物等温扩增(SPIA)。可使用的其他技术包含(例如)RNA技术信号介导扩增(SMART)、滚环扩增(RCA)、超支化滚环扩增(HRCA)、指数式扩增反应(EXPAR)、智能扩增(SmartAmp)、核酸等温和嵌合引物起始扩增(ICANS)，以及多重置换扩增(MDA)。其他方面可包含蛋白质和小分子的结晶、细胞(例如，稀有细胞或单细胞)的操纵和/或分析、其他生物粒子(例如，隔离线粒体、细菌、病毒粒子)或其他生物或化学组分的操纵和/或分析。
用于数字检定的多分散小滴乳剂
本公开提供用于以增加的动态范围执行数字检定的方法、系统和装置，其中产生不同大小的大量体积。与现有平台不同，本公开的方法和系统可包含使用连续而不是离散的大小(例如，体积)分布。在一些方面中，可以各种方式(随机地或通过微流体的受控施加)产生可变大小的小滴。举例来说，通过使用三通接头或流聚焦装置，恒定体积小滴的微流体产生在本领域中是众所周知的。在这些系统中，可通过剪切速率和通道尺寸来控制小滴的大小。如果对于给定三通接头几何形状，剪切速率连续地变化，那么可产生不同体积的小滴。可例如通过计算机控制的注射泵或经调制空气压力来实现这些方法，所述经调制空气压力调整水相和油载流体的相对流动速度。
在本公开的各种方面中，可在两种或多于两种不混溶流体之间产生多分散小滴的乳剂。如本文中所使用，术语“不混溶流体”意指在一组给定实验条件下甚至在彼此物理接触时也不在明显程度上经历混合或掺合以形成同质混合物的两种或多于两种流体。
如本文中进一步所描述，可通过多种方式来产生和分析用于数字测量的体积。本公开包含样本保持器，其可用于保持所述体积，使得可进一步处理和/或分析所述体积。本公开的样本保持器可包含试管、微量离心管、在标准多井板中的井阵列、在微阵列上或在微流体芯片中的井阵列、被配置成产生小滴的微流体芯片，以及能够保持样本的离散体积(例如，井或小滴)的其他市售或以其他方式通常已知的装置。
在一些方面中，可通过在样本保持器(例如，试管)中的乳化而随机地产生各种大小的小滴。小滴随机性可简化实验，这是因为(例如)不需要努力控制小滴的大小。在乳化期间，可通过使用任何合适的表面活性剂来使不同体积的小滴稳定。乳化途径出于以下若干原因而特别有用：(1)所述方法与在每个生物医学实验室中发现的基本仪表兼容，(2)小滴产生是简单的；它不需要用于流量控制的复杂芯片设计或高级设备，(3)小滴不限制在个别井中，这使容纳大量小滴所需要的空间最小化，以及(4)检定是简单的，这是因为在扩增期间可将同一容器用于小滴产生和小滴存储。有利的是，通过使用此方法，在小滴产生与扩增反应之间不需要样本转移。
本公开的一些方面包含在不混溶流体中产生小滴。如在本领域中众所周知，可组合广泛多种不混溶流体以产生不同体积的小滴。如本文中进一步所描述，可通过各种方式(例如通过乳化)来组合流体。举例来说，含水溶液(例如，水)可与非含水流体(例如，油)组合以在样本保持器中或在微流体芯片上产生小滴。适合用于本公开中的含水溶液可包含水基溶液，其还可进一步包含缓冲剂、盐，和通常已知用于检测检定(例如，PCR)中的其他组分。因此，本文中所描述的含水溶液可包含(例如)引物、核苷酸和探测剂。合适的非含水流体可包含但不限于有机相流体，例如矿物油(例如，轻矿物油)、硅酮油、氟化油或流体(例如，氟化酒精或全氟三丁胺)、其他市售材料(例如，Tegosoft)，或其组合。
可以多种方法产生乳剂。根据本公开的某些方面，可通过搅拌(其通常为物理搅拌)来产生乳剂。用于乳剂产生的物理搅拌的一些方法包含但不限于摇动、涡旋(其可包含使个别管或整个井板或其他装置涡旋)、声波处理、与磁体混合、快速移液或某一其他挤压方法，或经由在微流体装置内的流聚焦，以及其他方法。根据本公开而使用的搅拌可为足以产生乳剂的任何合适的搅拌手段。举例来说，可容易地调整用于涡旋、声波处理、移液、挤压或其他搅拌方法的速度、程度和时间，使得足以产生本公开的乳剂系统。可通过调整所述系统中的化学组分和所述系统所经受的搅拌条件来调谐乳剂的特定特性。
多种流体或液体可用于制备根据本公开的乳剂。在一些方面中，所述系统包含两种或多于两种不混溶流体，其在适当条件下混合时分离成分散小滴相和连续载体相。举例来说，将变为分散小滴相的第一流体可含有样本。在一些方面中，此第一流体将为含水溶液。在一些方面中，此第一流体将仍是液体，在其他方面中，其可为或变为凝胶或固体。在一些方面中，此第一流体可具有或可形成不同壳层。
可用作小滴乳剂的一个相的可能的含水流体包含但不限于各种PCR和RT-PCR溶液、等温扩增溶液(例如用于LAMP或NASBA)、血液样本、血浆样本、血清样本、含有细胞溶菌产物或分泌物或细菌溶菌产物或分泌物的溶液，和含有蛋白质、细菌、病毒粒子和/或细胞(真核、原核，或其粒子)的其他生物样本，以及其他者。在某些方面中，含水流体还可含有表面活性剂或其他剂以促进与不混溶流体和/或它们可能接触的其他材料或界面的所要交互和/或兼容性。在某些方面中，加载在装置上的含水溶液可具有表达恶性表型的细胞、胚胎细胞、循环内皮细胞、肿瘤细胞、感染上病毒的细胞、使用所关注基因转染的细胞，或存在于患有自体免疫或自体反应紊乱的主体的周边血液中的T细胞或B细胞，或其他亚型的免疫细胞，或稀有细胞或生物粒子(例如，外来体、线粒体)，其在周边血液中或在淋巴系统或脊髓液或其他体液中循环。细胞或生物粒子在一些情况下在样本中可为稀有的，且可使用离散化，例如，以在空间上隔离细胞，由此允许检测稀有细胞或生物粒子。
在一些方面中，将变为连续相的第二流体将是与第一流体不混溶的流体。第二流体有时被称作油，但不需要是油。可用作第二流体的潜在流体包含但不限于碳氟基油、硅化合物基油、烃基油(例如矿物油和十六烷)、植物基油、离子液体、与第一水相的不混溶或与第一相形成物理屏障的水相、超临界流体、空气或其他气相。
在本公开的一些方面中，多分散小滴可包括流体界面改性。流体界面改性元素包含界面稳定或改性分子，例如但不限于表面活性剂、脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其他组分。在一些方面中，一或多个流体界面改性元素可存在于将包括在分散小滴相流体中的流体中。在其他方面中，一或多个流体界面改性元素可存在于将包括在连续载体相流体中的流体中。在又其他方面中，一或多个流体界面改性元素可存在于分散小滴相流体和连续载体相流体两者中。存在于将包括在乳剂的一个相中的流体中的流体界面改性元素可与存在于将包括在乳剂的另一相中的流体中的流体界面改性元素相同或不同。
在本公开的一些方面中，流体界面改性元素可用于防止相邻乳剂小滴的聚结，从而导致长期的乳剂稳定性。在一些方面中，流体界面改性元素可具有一些其他或额外重要作用，例如在小滴内提供生物兼容表面，这也可或可不促成乳剂稳定性。在一些方面中，所述组分可在控制流体之间或小滴之间的组分输送方面起作用。流体界面改性元素的一些非限制性实例包含但不限于ABIL WE 09、ABIL EM90、TEGOSOFT DEC、牛血清白蛋白(BSA)、山梨醇酐(例如，Span 80)、聚山梨醇酯(例如，聚乙二醇化山梨醇酐，例如TWEEN 20和TWEEN80)、十二烷基硫酸钠(SDS)、1H，1H，2H，2H-全氟辛醇(PFO)、Triton-X100、monolein、油酸、磷脂，和Pico-Surf，以及各种氟化表面活性剂，以及其他者。
在一些方面中，乳剂系统将由被连续油相环绕的分散水相(含有所关注样本)组成。其他方面可为此系统的变化或修改，或它们可为完全不同的组成或构造的乳剂。替代性乳剂系统包含多种乳剂，例如水包油包水(水/油/水，或w/o/w)乳剂，或油包水包油(油/水/油，或o/w/o)乳剂。这些多种乳剂系统于是将具有内部相、中间相和外部相。在一些方面中，内部相和外部相可具有相同组成。在其他方面中，内部相和外部相可类似-例如，都是含水的，或都是相同的油-但具有不同的子组分。在其他方面中，所有三种乳剂相可具有不同且有时非常不同的组成。
在某些方面中，乳剂系统可包括两种不混溶流体，其都是含水的或都非含水的。在另外方面中，两种乳剂流体都可为油基，其中油彼此不混溶。举例来说，所述油中的一者可为烃基油，且另一油可为碳氟基油。在其他乳剂系统中，两种流体可主要是含水的，但仍彼此不混溶。在一些方面中，这会在含水溶液含有彼此相分离的组分时发生。可使用的溶质的一些实例包含但不限于含有以下各者的系统：右旋糖酐、聚蔗糖、甲基纤维素、不同长度的聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Reppal PES、K3PO4、柠檬酸钠、硫酸钠、Na2HPO4，以及K3PO4。
除了含水溶液和非含水流体之外，还可包含表面活性剂，例如，以改进小滴的稳定性和/或促进小滴形成。合适的表面活性剂可包含但不限于非离子表面活性剂、离子表面活性剂、硅酮基表面活性剂、氟化表面活性剂或其组合。非离子表面活性剂可包含(例如)山梨醇酐单硬脂酸酯(Span 60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚环氧乙烷山梨醇酐单油酸酯(Tween 80)和山梨醇酐单油酸酯(Span 80)。硅酮基表面活性剂可包含(例如)ABIL WE 09表面活性剂。可类似地使用在本领域中通常众所周知的其他类型的表面活性剂。在一些方面中，表面活性剂可以多种浓度或浓度范围而存在，例如按重量计大约0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、5％，或10％。
在一些方面中，本公开的多分散小滴具有连续体积分布。如本文中所提供，术语“连续体积分布”意欲描述横越体积分布连续地变化而不是按预界定的离散阶跃而变化的体积分布。举例来说，基于芯片的平台可包含覆盖被制造为芯片的部分的预界定的离散阶跃界定的体积分布的井或小滴体积。即，可将芯片制成具有以100nL、10nL和1nL而存在的体积，而不具有存在于那些离散阶跃之间的其他体积。与此对比，连续体积分布不是预界定的(即，体积分布在产生或形成小滴体积之前未被界定)。可例如经由乳化而产生连续体积分布，如本文中进一步所描述。在乳剂中，体积(例如小滴体积)具有离散体积，但分布中的小滴体积在产生小滴之前未被界定(即，未通过制造技术预界定)，且所述体积沿着连续体积分布随机地分布。根据本公开，可通过物理搅拌(例如使样本涡旋或摇动)来产生乳化系统。可通过赋予在乳剂上的力(例如，通过涡旋速度或摇动强度)来修改小滴体积的上边界和下边界。然而，通过此类技术产生的小滴体积沿着所产生的体积分布连续地变化。
根据本公开的各种方面，通过两种或多于两种不混溶流体的乳化来形成多分散小滴。根据这些方面，至少一些多分散小滴含有样本，其随后通过目前描述的方法予以扩增和分析。如本文中所使用，术语“多分散”是指具有连续体积分布的小滴系统中的多个小滴。给定多分散小滴系统的最小、最大、平均和中值小滴直径以及它们的相应标准偏差取决于乳剂的物理性质(例如，化学组分和温度)和形成多分散小滴的方式(例如，产生多分散小滴系统的物理搅拌的类型和持续时间)。可通过调整给定系统的这些参数来调谐小滴和它们的相应概率的分布。
在一些方面中，也可特性化连续体积分布，使得对于任一组(或多个)小滴体积，其分布函数可被表示为f(x)，其中f(x)dx是所述组中的给定小滴将具有介于x与x+dx之间的体积的概率。(dx是无限小的数。)在某些方面中，连续分布是小滴组中的小滴的体积满足以下条件的分布：(1)是未预指定的；和(2)对于某一范围x_lower＜x＜x_upper，f(x)始终大于零(x_lower不能等于x_upper，且不需要知晓关于f(x)的其他方面)。因此，本公开在一些方面中可包含使用从连续分布提取的小滴组，测量所述组中的每个小滴的体积，以及在分析中使用所测量的小滴体积。
图8C示出根据目前描述的方法和系统产生的小滴直径和它们的相应概率的实验上测量的分布。实验上确定的小滴直径和概率的分布与理论上确定的值一致，如图10所描绘，且两个图描绘小滴的连续体积分布。
如本文中所描述，可产生具有多种体积分布的体积，其可使用多种不同方法予以分析。在一些方面中，样本可含有可被分析的所关注分子。可产生样本的离散体积以用于经由数字测量进行分析。举例来说，本文中的方法可包含产生具有体积分布的多个小滴。在一些方面中，可在包含组合的不混溶流体的乳剂中产生样本的多个小滴，如本文中进一步所描述。在一个实例中，样本可包含含水溶液，含水溶液包含所关注分子(例如，核酸分子)。样本可与油混合以形成悬浮在油中的样本的小滴。取决于所使用的方法，乳剂中的多个小滴的体积可沿着连续体积分布随机地分布。此外，可通过用于形成乳剂的方法来控制体积范围。举例来说，可控制涡旋、摇动、声波处理和/或挤压的强度以产生所要的体积分布，或通过变化表面活性剂和/或油的组成而进行。
本领域的普通技术人员将了解，体积分布的范围和体积分布内的体积将取决于用于给定分析的多种因素。在一些方面中，多个小滴的体积分布可包含以下体积范围：从大约100毫微升(nL)到大约1毫微微升(fL)、从大约10nL到大约10fL、从大约1nL到大约100fL、从大约100nL到大约1微微升(pL)、从大约10nL到大约10pL、从大约1nL到大约1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。取决于用于产生小滴的选定因素，常规的是通过(例如)改变使样本和油与表面活性剂混合的强度来界定体积分布的上边界和下边界。可存在体积分布中的体积范围。举例来说，分布中的体积范围可多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大约2倍、多于大约10倍、多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。通过将范围变动2倍，体积分布的下边界可为(例如)10nL，其中上边界为20nL。类似地，通过将范围变动10倍，体积分布的下边界可为(例如)10nL，其中上边界为100nL。
在本公开的一些方面中，多分散小滴具有标准偏差比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的小滴直径分布。
在本公开的一些方面中，多分散小滴具有标准偏差比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的小滴直径分布。
在本公开的一些方面中，可使用阀、井或小滴产生体积。此处，可使用广泛范围的方法产生不同体积(直径)的小滴。在一种方法中，使用微流体(例如，使用在本领域中众所周知的T形通道或流聚焦)产生所界定的体积的小滴；通过变化通道尺寸的剪切速率，可形成不同大小的小滴。在另一方法中，凭借不同的表面活性剂通过乳化来产生不同体积的小滴；此处，通过使用不同的表面活性剂来稳定和控制不同体积的小滴。通过任一方法，可在不同体积(大小)的所有小滴中同时地实行分析物的扩增(例如，数字PCR)。在某些方面中，小滴随后可以单行格式流动穿过可确定小滴的大小且可询问来自小滴的荧光所处的流式细胞仪或其他类似装置。当使用流式细胞仪或其他流入式方法时，基于每个小滴的荧光和大小(体积)而确定扩增产物在每个小滴中的存在，所述荧光和大小是基于来自小滴的散射信号予以确定。替代地，可通过以类似于基于图像的流式细胞仪的方式随着小滴穿过设备而取得图像来确定大小。以此方式，通过标注每个小滴的大小以及扩增产物在给定大小的每个小滴中的存在或不存在，有可能在询问不同大小的足够数目个小滴之后反算样本中存在的分析物的原始浓度。因为小滴具有不同大小，所以对于给定动态范围，出于先前所论述的原因，分析会比小滴全部具有类似大小的情况快得多。
在某些方面中，本发明的方法和系统可用于分析数字化体积中的样本。术语“数字化体积”是指在获得初始样本且将其分离为物理上不同的较小体积以准备用于检定之后产生的体积。
根据本公开的某些方面，可在芯片中形成和检定小滴。根据另外方面，扩增和数字测量可在数字化芯片中进行。
在一个方面中，本公开提供一种用于产生与数字测量和读出整合的浓度梯度的方法。举例来说，可将微流体梯度产生与样本数字化芯片整合。为了增加动态范围，对数或指数浓度梯度是优选的，但大量方法现在可用于在芯片上形成各种类型和形状的浓度梯度，包含非线性梯度，例如幂、指数、误差、高斯和立方根函数。
根据本公开的某些方面，可使用微流体装置中的浓度梯度，其中仅存在两个入口储集器或通道，但更多入口储集器或通道也适合于本公开的使用。根据此方面，一个入口用于样本且一个入口用于缓冲剂(或在数字PCR的情况下是PCR试剂)。随着两种溶液流动穿过网络，样本溶液以预界定的方式被缓冲剂(水或PCR试剂)溶液稀释，使得在入口通道中的每一者处，存在不同浓度的样本。跨越六个数量级的线性、多项式和对数梯度已全部使用此设计的变化予以产生。
在另一方面中，使用在浓度上跨越六个数量级的对数或指数梯度。将样本和PCR溶液移液到两个入口储集器中，此后，它们将经过井阵列。一旦井已被填充有浓度梯度，轻矿物油或某一其他不混溶流体就流过井以在井内产生个别数字化体积。此实例中的井具有相同体积。在本公开的另一方面中，可使用不同体积的井。
在另一方面中，将样本和PCR溶液移液到两个入口储集器中，此后，它们将经过亲水和疏水小片的阵列。随着样本流过亲水小片，它们致使形成不同大小样本体积的润湿小滴。替代地，可将样本数字化。
在本公开的另一方面中，结合使用阀、井或小滴产生的数字化体积而使用梯度。在具有小滴的方面中，可以连续流方式而以T形通道几何形状或流聚焦几何形状形成小滴，所述几何形状两者在本领域中是众所周知的。
为了将已稀释的样本数字化，可使用数字化方案。此处，使含有不同浓度的目标分子的样本溶液流过构形上图案化的表面以形成数字化和离散体积，以供后续数字测量和读出。替代地，有可能使用经图案化表面将样本数字化。
在另一方面中，可使用微流体通道和不混溶流体相将样本数字化。在此方面中，将样本相引入到通道中，随后是不混溶相，其形成由侧空腔的几何尺寸界定的离散样本体积(D.E.Cohen、T.Schneider、M.Wang、D.T.Chiu，《分析化学(Anal.Chem.)》，82，5707-5717)。
根据一个示范性方面，本公开提供不同大小的数字化体积阵列，其中使用经图案化表面来产生不同大小的体积阵列。根据此方面，产生七组阵列，其中每个阵列含有900个数字化体积(30×30)。通过在疏水表面的背景中产生亲水圆形小片而形成所述阵列。结果，当所述表面暴露于含水溶液和油时，亲水小片将被由油环绕的含水液滴覆盖。小滴可为半球形，但形状可改变(更扁平或更圆)，这取决于所使用的确切表面以及所使用的油和含水溶液。在一个方面中，使用重油，且因为油将推动液滴，所以液滴更扁平。
界定每组900个亲水小片的圆具有不同大小，其范围为从1μm的直径到5μm到10μm到50μm到100μm到500μm且最终到1mm的直径。因为液滴的体积大致与液滴的直径的立方成比例，所以将小片的直径增加十倍会将体积增加大约1,000倍。结果，使用不同大小的数字化体积相比于简单地使用相同大小的更多数字化体积在空间和读出方面更有效。在一个方面中，使用阵列的每组的900个数字化体积，这是因为此数目适合于达到统计上稳健的数字读出。然而，取决于特定应用和读出的所需稳健性，可设计阵列的每组内的更多数字化体积或更少数字化体积。根据此方面，归因于不同大小的表面图案化亲水小片的简易性，可以不同大小产生大的数字化体积阵列。此方面对于例如常常需要广泛动态范围的数字PCR等应用可为有用的，高度地有益的是在使用经图案化表面产生的液滴中执行PCR。
在某些方面中，分散小滴系统可经受分散小滴系统的至少一部分从液相到固相的改变。在一些方面中，可通过胶凝过程将分散小滴系统的液体转化为固体。举例来说，琼脂糖的溶液可随着温度下降到低于其熔化温度而固化。在另外方面中，可通过由可溶前驱物形成藻酸钙(通过溶液组分的光聚合、使用诱发光聚合的交联剂)发生液体到固体转化。在一些方面中，整个小滴固化，而在其他方面中，仅界面处的层固化。
在一些方面中，本公开的乳剂系统可被配置成使得可增强或最小化小滴与周围媒介之间的扩散程度，这取决于所关注应用。在某些方面中，多分散小滴乳剂系统可被设计成增强小滴与周围相之间的试剂扩散。在某些方面中，多分散小滴乳剂系统可被设计成减少或消除小滴与周围相之间的试剂扩散。举例来说，在高于琼脂糖熔化温度的温度下形成的琼脂糖小滴在冷却到室温时固化，且取决于溶液中的琼脂糖的浓度，可发生在液滴边界内或横越液滴边界的扩散。在某些方面中，可调谐小滴和周围媒介的组成以最大化在小滴囊封之后的扩散。还可调谐小滴的性质以防止(例如)目标分子的非想要的扩散。在某些方面中，目标分子可在原处交联或锚定。举例来说，例如引物等关键分子可锚定到基质。将目标分子锚定在原处可使能够在非油基平台中使用乳剂，这可具有更好地促进下游处理或样本回收的优点，以及其他优点。
在一些方面中，可在分散小滴系统中的多个相之间产生物理屏障。在某些方面中，环绕小滴的物理屏障可为聚合固体壳层、脂双层、沉淀界面，或例如界面处的蛋白质、纳米粒子、囊泡、沉淀物、微观粒子或其他材料等材料的聚集体。
可对乳剂系统作出其他修改以更改可有益于乳剂的操纵、处理或分析的某些性质。取决于分析方法，乳剂系统的不同物理和光学性质可起到非常重要的作用。这些性质包含但不限于乳剂小滴的大小分布、流体的相对密度、流体的粘度、流体的折射率，以及连续流体内的小滴的整体和局部密度。
折射率匹配可有益于改进用于光学分析的成像深度(例如，减少小滴边界的失真)。水相的折射率通常接近于水的折射率，即，大约n＝1.33。水相的折射率通常低于烃基油的折射率，但稍微高于氟化油的折射率。在本公开的一个方面中，可通过向乳剂的水相添加例如但不限于甘油、蔗糖、Cargille光学液体、乙二醇、丙二醇、CS2、水杨酸甲酯、二甲亚砜(DMSO)以及其他者等高折射率(即，n＞1.45)组分以使水相的折射率能够更接近地匹配于油的折射率来实现折射率匹配。在其他方面中，可通过调整非水相的折射率来实现折射率匹配，所述非水相相比于水相通常由具有较高折射率的组分与具有较低折射率的组分的混合物组成。任何合适的添加物可用于提高低折射率流体的折射率，例如但不限于：碳氟基油(例如，全氟萘烷；全氟三丁胺油，例如FC-40、FC-70；Krytox油以及其他者，具有高折射率(即，n＝1.36到1.4)；碳氟溶剂，例如但不限于八氟甲苯、六氟苯、五氟苯、1，2，4，5-四氟苯十氟-对-二甲苯，以及其他者。下表1提供添加物的非包含性列表，所述添加物可用于调整非水相的折射率，由此致使其更接近地匹配于水相(即，水，n＝1.33)的折射率：
表1.以递增折射率的次序所列出一系列碳氟油和溶剂的物理性质的概述。包含水以供参考。
小滴的适当间距对于最大化可在不具有来自一个小滴干扰另一小滴的信息的情况下分析的小滴的数目是重要的。在一些方面中，可通过更改油系统的密度来增加小滴之间的空间。举例来说，部分氟化烃化合物可用于降低碳氟油的密度。在另一方面中，可通过添加CsCl或某一其他合适密度增加组分来更改含水溶液的密度。举例来说，按重量计含有56％的CsCl的溶液将具有接近1.7g/mL的密度，且按重量计含有65％的CsCl的溶液将具有大约1.9g/mL的密度，其中这些密度接近地匹配于许多碳氟化合物的密度。还可更改油的粘度，使得小滴移动得较慢和/或增加小滴之间的润湿层。在另一方面中，第二流体可经历到更固态性质的相转变，使得在某些位置处捕获离散相。在另一方面中，可使用双面乳剂(例如，w/o/w)以将小滴接近地包在一起，同时还防止直接接触/重叠。
在一些方面中，小滴直径分布具有比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。在一些方面中，小滴直径分布具有比中值小滴直径大大约1000％、大大约500％、大大约100％、大大约50％、大大约30％、大大约20％、大大约15％、大大约10％、大大约9％、大大约8％、大大约7％、大大约6％或大大约5％的标准偏差。
在其他方面中，小滴直径分布具有比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。在一些方面中，小滴直径分布具有比平均小滴直径大大约1000％、大大约500％、大大约100％、大大约50％、大大约30％、大大约20％、大大约15％、大大约10％、大大约9％、大大约8％、大大约7％、大大约6％或大大约5％的标准偏差。
在另外方面中，多分散小滴中的体积变化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于2倍、多于10倍、多于100倍。在又另外方面中，多分散小滴中的体积变化多于大约2倍、多于大约10倍，或多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。
在一些方面中，多分散小滴具有以下范围的体积分布：从100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、从10nL到10fL、从1nL到100fL、从100nL到1pL、从10nL到10pL，或从1nL到1pL、从500pL到50fL、从100pL到100fL。在另外方面中，多分散小滴具有以下范围的体积分布：从大约100毫微升(nL)到大约1毫微微升(fL)、从大约10nL到大约10fL、从大约1nL到大约100fL、从大约100nL到大约1pL、从大约10nL到大约10pL，或从大约1nL到大约1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。
在某些方面中，多分散小滴的平均体积在扩增样本期间改变少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。在其他方面中，多分散小滴的中值体积在扩增样本期间改变少于大约50％、少于大约40％、少于大约35％、少于大约30％、少于大约25％、少于大约20％、少于大约15％、少于大约10％、少于大约5％、少于大约4％、少于大约3％、少于大约2％，或少于大约1％。
在一些方面中，扩增样本包括第一扩增循环，且其中少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴在第一扩增循环之后融合。在另外方面中，扩增样本包括第一扩增循环，且其中少于大约50％、少于大约45％、少于大约40％、少于大约35％、少于大约30％、少于大约25％、少于大约20％、少于大约19％、少于大约18％、少于大约17％、少于大约16％、少于大约15％、少于大约14％、少于大约13％、少于大约12％、少于大约11％、少于大约10％、少于大约9％、少于大约8％、少于大约7％、少于大约6％、少于大约5％、少于大约4％、少于大约3％、少于大约2％或少于大约1％的多分散小滴在第一扩增循环之后融合。
在一些方面中，第一流体的折射率与第二流体的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。在另外方面中，第一流体的折射率与第二流体的折射率相差少于大约200％、少于大约100％、少于大约60％、少于大约50％、少于大约45％、少于大约40％、少于大约35％、少于大约30％、少于大约25％、少于大约20％、少于大约19％、少于大约18％、少于大约17％、少于大约16％、少于大约15％、少于大约14％、少于大约13％、少于大约12％、少于大约11％、少于大约10％、少于大约9％、少于大约8％、少于大约7％、少于大约6％、少于大约5％、少于大约4％、少于大约3％、少于大约2％，或少于大约1％。
在一些方面中，例如在双面乳剂中，第一流体的折射率与块体媒介的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
在一些方面中，多分散小滴包括多种乳剂。在某些方面中，通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备多种乳剂。
用于执行数字测量的装置和方法
本公开的另一方面包括一种用于实行本公开的方法的装置。根据此方面，本公开提供用于产生具有体积分布的多个多分散小滴的构件、用于测量多个多分散小滴中的给定小滴的体积的构件、用于确定样本在小滴中的存在或不存在以及多个多分散小滴中的样本的浓度的构件。本发明的方法使能够遍及大动态范围执行数字测量且使能够执行用于增加动态范围的方法和系统。具体来说，所述装置尤其通过产生不同大小的样本体积而增加样本的数字测量的动态范围。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法，其包括：产生多个多分散小滴，其中小滴中的至少一些小滴包括样本；扩增样本；使用可检测剂标记样本；获得小滴的图像栈；从图像栈确定小滴的体积；从图像栈确定可检测剂在小滴中的存在或不存在；以及基于可检测剂在多个小滴中的存在或不存在而确定多个小滴中的样本的浓度。
在一些方面中，获得图像栈包括光学成像。在一些方面中，检测可检测剂包括光学成像。
在另外方面中，通过以下各者执行光学成像：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
在某些方面中，图像栈包括从穿过单个小滴的单独焦深取得的多个图像。
在另外方面中，图像栈包括从针对小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。在其他方面中，图像栈包括从针对小滴的单独焦深取得的大于2、大于3、大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于15、大于20、大于25、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95或大于100个图像。在又其他方面中，图像栈包括从针对小滴的单独焦深取得的大于大约2、大于大约3、大于大约4、大于大约5、大于大约6、大于大约7、大于大约8、大于大约9、大于大约10、大于大约15、大于大约20、大于大约25、大于大约30、大于大约35、大于大约40、大于大约45、大于大约50、大于大约55、大于大约60、大于大约65、大于大约70、大于大约75、大于大约80、大于大约85、大于大约90、大于大约95或大于大约100个图像。
在另外方面中，图像栈包括从针对小滴的单独焦深或成像装置的物平面取得的从100到50、100到75、100到25、100到20、100到10、100到5、50到20、50到10、50到5、20到10、20到5、10到5、10到2、大约100到大约50、大约100到大约75、大约100到大约25、大约100到大约20、大约100到大约10、大约100到大约5、大约50到大约20、大约50到大约10、大约50到大约5、大约20到大约10、大约20到大约5、大约10到大约5或大约10到大约2个图像。
在一些方面中，对多个小滴同时地执行本发明的方法。在另外方面中，多个多分散小滴包括多分散小滴阵列。在又另外方面中，多分散小滴阵列安置在多井板中。
在一些方面中，通过以下各者从图像栈确定小滴的体积：行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、圆检测方法、组合式反向分水线与圆检测方法，或其组合。
在一些方面中，遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定可检测剂的浓度。
在一些方面中，多个多分散小滴包括第一流体和第二流体，其中第一流体不混溶于第二流体中。在某些方面中，通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中第一流体不混溶于第二流体中。在另外方面中，搅拌包括涡旋。
在各种方面中，本公开提供包括以下操作的方法：通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中第一流体不混溶于第二流体中；以及在第三流体中搅拌乳剂，其中第三流体不混溶于第二流体中，由此形成双面乳剂。
在一些方面中，本公开提供包括流体搅拌的方法，其中搅拌可为摇动、涡旋、声波处理、与磁体混合、挤压、经由流聚焦，或其组合。在另外方面中，搅拌足以形成乳剂。在另外方面中，挤压包括对流体进行移液，其中移液足以产生乳剂。在某些方面中，搅拌发生在微流体装置中。
在各种方面中，第一流体包括水，第二流体包括油且第三流体包括水。
在各种方面中，多分散小滴包括多种乳剂。在另外方面中，通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备多种乳剂。
在一些方面中，第一流体是含水的。在某些方面中，第一流体包括样本。在另外方面中，第二流体是油。在某些方面中，第二流体是油，且第二流体与第一流体和第三流体不混溶。在一些方面中，第一流体不同于第三流体。在某些方面中，第三流体是油，且其中第三流体与第一流体和第二流体不混溶。
在一些方面中，乳剂包括水相和非水相。在另外方面中，第一流体包括水且第二流体包括油。
在某些方面中，多个多分散小滴进一步包括流体界面改性元素。在另外方面中，流体界面改性元素是表面活性剂。在又另外方面中，流体界面改性元素是选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
在一些方面中，本发明的方法进一步包括将不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体。在某些方面中，在扩增样本之前、在扩增样本期间或在扩增样本之后将不混溶流体转化成凝胶或固体。
在各种方面中，用于本发明的方法中的可检测剂是荧光的或冷光的。在某些方面中，可检测剂是荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
如本文中所使用，术语“动态范围”被界定为可改变量的最大可能值与最小可能值之间的比率。
术语“数字检定”是指基于较小测量的计数进行测量的检定，其中每个较小测量是二元的，其具有为可被指派给所述测量的确切两个可能值中的一者的值。本文中所描述的数字检定包括基于从流体的个别体积获得的二元测量的计数而测量流体中存在的样本。
可在分析具有不同大小的体积以确定在哪些体积中已经历反应(例如，具有经扩增产物)之前或期间在所述体积中实行反应(例如，扩增)。在某些实例中，可对体积(例如，小滴)进行定大小，且对被占据小滴(例如，含有可检测剂的小滴)的数目进行计数。可分析小滴中的全部或仅仅一些小滴。可例如通过使小滴以单行流动穿过流式细胞仪或类似装置而实现分析，其中可确定小滴的大小且可检测扩增的存在。可例如基于来自小滴的散射信号而确定小滴的大小，且可由来自小滴的荧光信号指示扩增的存在。替代地，可通过显微术确定小滴的直径。可从样本保持器提取小滴(在完成反应(例如，扩增)之前、期间或之后)，且使用CCD相机在宽场中使其成像。小滴(例如)可在表面上展开或嵌入在两个玻璃载片之间，且放置在宽场显微镜下方。通过使用适当的激发和发射滤波器，可对小滴内的荧光进行量化以揭露扩增的存在或不存在。通过标注小滴的大小以及扩增产物在每个小滴中的存在或不存在，有可能在询问不同大小的足够数目个小滴之后反算样本中存在的分析物的原始浓度。因为小滴具有不同大小，所以对于给定动态范围，分析会比小滴全部具有类似大小的情况快得多。在一些方面中，本文中的方法进一步包含使用多个小滴中的若干小滴以及多个小滴中的小滴的个别体积以进行数字测量。举例来说，可使用多个小滴中的小滴的数目、多个小滴中具有一或多个所关注分子的小滴的数目且通过测量多个小滴中的一些或所有小滴的体积来确定所关注分子的样本浓度。可在实例章节中找到用于确定样本浓度的实例方法。
在一些方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法，其包括：产生多个多分散小滴，其中小滴中的至少一些小滴包括样本；扩增样本；使用可检测剂标记样本；使多个多分散小滴流动穿过流式细胞仪通道；随着小滴流动穿过流式细胞仪通道而确定小滴的体积；确定可检测剂在小滴中的存在或不存在；以及基于可检测剂在多个小滴中的存在或不存在而确定多个小滴中的样本的浓度。
在某些方面中，确定样本的浓度包括检测从小滴散射的光。
本公开可用于数字测量提供关于样本的有用信息的任何技术。因而，本文中所提供的方法、系统和装置可包含含有可检测剂的体积。在某些方面中，体积可为微流体芯片中的井或腔室或含有可检测剂的小滴(例如，形成于乳剂中或芯片的表面上的小水滴)。通常将理解，可检测剂可包含单个可检测分子或多个可检测分子。可使用其他类型的可检测剂，例如，珠粒、量子点、纳米粒子，和类似者。此外，可检测剂可例如为待分析的样本中存在的所关注分子(例如，血液、血清、唾液或其他溶液中的核酸分子)。替代地，可检测剂可为与样本中的所关注分子(例如，核酸分子)相关联的分子，由此允许检测所述分子。在一些方面中，本公开的方法和系统可用于涉及数字测量的扩增相关技术(例如，数字PCR)。对于扩增测量，体积(例如，小滴)可例如包含单个DNA分子，但体积还将含有通常众所周知为用于扩增和检测的必要组分。在一些方面中，可检测剂是荧光的，且因此可通过本领域中所知的基于荧光的检测方法进行检测。然而，可使用其他检测方法(例如，吸收、化学发光、浊度和/或散射)来分析体积的内含物。适合于本公开的多种可检测剂在本领域中通常是众所周知的，且可例如在《分子探测剂手册(Molecular Probes Handbook)》第11版(2010年)中被找到。
在某些方面中，可检测剂可与用于检测的所关注分子相关联。举例来说，可检测剂可与核酸分子(例如，DNA或RNA)、肽、蛋白质、脂类或存在于样本中的其他分子(例如，生物分子)相关联。如本文中所界定，在可检测剂的上下文中的“关联”包含经由共价和/或非共价相互作用而与分子相互作用。举例来说，可检测剂可共价地附接到所关注分子。替代地，可检测剂可(例如)为可用于检测核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)的插层剂或Taqman探测剂。可使用其他可检测剂，例如可不与所关注体积中的分子相关联的参考染料。本公开进一步包含确定样本的浓度。举例来说，所述方法和系统可用于确定(1)小滴的体积和(2)含有可检测剂的小滴的数目，其可用于确定样本的浓度(即，通过确定样本在给定小滴中的存在或不存在)。此信息可以多种方式用于确定样本浓度。举例来说，目标分子以一浓度(以分子/体积为单位)存在于样本中。样本可分布成可被分析的可变体积的小滴。可通过本文中所提供的方法来确定小滴(全部或仅仅一些)的个别体积。另外，通过使用本文中所描述的方法，可分析小滴是否含有可检测剂。对于给定样本浓度，一些可变体积小滴可含有可检测剂，且一些可不含有可检测剂。对于较高样本浓度，通常多个小滴中的较多小滴将含有可检测剂且反之亦然；对于低样本浓度，多个小滴中的较少小滴可被可检测剂占据。如本文中进一步所描述，可针对广泛范围的样本浓度来界定特定体积分布中的可检测剂的占据概率，其随后可与实际数据进行比较以确定未知样本的浓度。可在以下实例8中找到用于确定样本浓度的额外公开内容。实例8中所说明的方法涉及作出针对样本浓度的初始估计，且随后计算将被预测为含有一或多个可检测剂的小滴(被占据小滴)的数目。随后使用众所周知的数值方法来调整针对样本浓度的估计，直到被占据小滴的预测数目在所要的准确度内等于多个小滴中的被占据小滴的实际数目。
在一些方面中，本公开的方法包括仅在小滴包括样本的情况下才测量小滴的体积。在另外方面中，所述方法包括将被确定为不包括样本的任何小滴排除在测量之外。在一些方面中，根据本文中所公开的方法而通过识别、定大小或枚举仅被确定为包括样本的那些小滴来确定样本浓度。在一些方面中，通过测量或知晓样本的总体积且通过识别、定大小和枚举仅被确定为包括样本的那些小滴来确定样本浓度。在另外方面中，通过测量或知晓样本的总体积且通过枚举所有肯定小滴且确定每个肯定小滴的体积来确定样本中的分析物的浓度。此方法的优点包含减少所扫描的小滴的数目且由此减少用于确定样本浓度的分析时间。
如本文中进一步所描述，本公开提供不能通过现有方法和系统实现的数字测量的各种方面。举例来说，本公开可提供遍及广泛动态范围测量样本浓度的能力。在一些方面中，动态范围可为至少三个数量级、至少四个数量级、至少五个数量级或至少六个数量级。在一些方面中，动态范围可介于以下各者之间：大约10与1010个分子/毫升、大约102与107个分子/毫升、大约104与1010个分子/毫升、大约105与109个分子/毫升。在某些方面中，可通过检测与样本中的所关注分子相关联的可检测剂来执行确定动态范围内的样本浓度。动态范围可取决于多种因素，例如乳剂中产生的体积的范围和/或所分析和检测的体积的范围。在某些方面中，体积分布包含连续变化的小滴体积。
在一些方面中，使用浓度梯度在芯片上执行本发明的方法。通过将dPCR与芯片上梯度产生整合，或通过使用不同大小的数字化体积，或这两种方法的组合，本公开有效地将我们的dPCR芯片的动态范围增加一到六个数量级，这与由RT-PCR提供的动态范围相当。通过使用较大范围的浓度梯度或具有较大的大小差异的数字化体积阵列，可在需要时甚至进一步增加动态范围。用于实行定量PCR(qPCR)的此方法与现有技术相比较提供若干关键优点：(1)其较准确；(2)其不需要运行RT-PCR所需要的类型的校准样本，且因此具有较高通量；和(3)其不需要实时的敏感荧光检测，其负责RT-PCR对标准PCR装置的相对较高成本(～10x)。
本公开的另一方面包括一种用于实行本公开的方法的装置，其中所述装置产生不同大小的数字化和离散体积的阵列。在另一方面中，所述装置实行用于增加样本的数字测量的动态范围的方法，所述方法包括产生样本浓度梯度以及产生不同大小的样本体积。
在一些方面中，本公开提供用于使用数字测量来确定样本的浓度的方法。所述方法可包含：产生具有体积分布的多个小滴，其中多个小滴中的至少一个小滴含有来自样本的内含物；确定小滴的体积；确定样本在小滴中的存在或不存在；以及使用被发现为含有可检测剂的小滴的体积和小滴的数目来确定样本的浓度。
在一些方面中，本公开包含用以增加基于产生不同大小(即，体积)的数字化和离散体积的阵列的数字测量的动态范围的方法。此方法比简单地增加数字化体积的数目以便增加动态范围更佳。这是因为，简单地增加数字化体积的数目会增加体积占据的面积，以及增加在一些数字化体积未适当地形成或具有其他缺陷的芯片上具有缺陷的可能性。简单地增加数字化体积的数目还会由于增加了分析所有数字化体积所需要的时间而减少了通量。在某些方面中，可通过产生不同大小的数字化体积的阵列而不是简单地增加数字化体积的数目来增加动态范围。不同大小的数字化体积的阵列可为随机阵列(例如，不同直径的小滴全部存在和随机地分布于容器中)，或可为规则阵列。
样本扩增
本公开还提供用于样本(例如，核酸样本)的扩增的方法、装置和系统。在某些方面中，样本扩增包括PCR。在另外方面中，样本扩增包括dPCR。
在各种方面中，样本包括核苷酸。在各种方面中，扩增样本包括执行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。在另外方面中，扩增样本包括核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增。
任何合适的装置可用于执行根据本公开的扩增。可包含多种装置特征，例如，用于维持或循环温度的构件，其可用于使能够执行基于PCR的扩增。其他装置特征可包含但不限于温水浴、保温箱，和其他热源，以及用于将热捕获到有限体积中的绝缘体。
在各种方面中，本公开提供用于执行同质检定的方法、装置和系统。如本文中所使用，术语“同质检定”是指所有检定组分在检测时以溶液相而存在的检定。在同质检定中，检定的任何组分都不散射可检测光。
在另外方面中，本公开提供用于执行非同质检定的方法、装置和系统。如本文中所使用，术语“非同质检定”是指一或多个检定组分在检测时以固相而存在的检定。术语非同质检定与术语“异质检定”可被互换地使用。例如在LAMP或滚环扩增中形成沉淀物或颗粒是常见形式的异质检定。在此类型的检定中，固相组分可散射可检测光。
在各种方面中，本公开提供用于通过执行数字PCR(dPCR)进行扩增的方法、装置和系统。数字PCR是一种在一或多个目标序列的PCR扩增之前将存在于样本中的个别核酸分子分布到许多单独反应体积(例如，腔室或小份)的方法。调整样本中的个别分子的浓度，使得至少一些反应体积不含有目标分子，且至少一些反应体积含有至少一个目标分子。目标序列的扩增会引起二元数字输出，其中将每个腔室识别为含有或不含有指示对应目标序列的存在的PCR产物。含有可检测水平的PCR最终产物的反应体积的计数是绝对核酸数量的直接量度。在本公开的各种方面中，通过将核酸样本分割为单独反应体积来分布核酸样本。随后在存在PCR试剂的情况下对数字化样本进行热循环，由此促进核酸样本的扩增。
在本公开的另外方面中，本文中所描述的方法、系统和装置可应用于等温扩增技术，例如数字ELISA、NASBA和LAMP。ELISA是基于蛋白质的，且通常用于蛋白质或小分子的量化。NASBA和LAMP是已被开发以补充PCR的等温扩增方案。
在等温扩增中，与在传统PCR中一样，不发生温度循环。存在若干类型的等温核酸扩增方法，例如转录介导扩增、基于核酸序列的扩增、RNA技术信号介导扩增、链置换扩增、滚环扩增、DNA环介导等温扩增、等温多重置换扩增、解旋酶相依扩增、单引物等温扩增，以及循环解旋酶相依扩增。
NASBA(基于核酸序列的扩增)是用于扩增RNA的等温(～40℃°)过程，且已成功地用于检测临床样本中的病毒RNA和细菌RNA两者。由NASBA提供的优点是：(1)它具有高扩增效率和快扩增动力学，其中可在一小时或两小时内实现超过一千倍的扩增；(2)与在RT-PCR的情况下一样，它没有给出由基因组dsDNA造成的错误肯定；(3)可在不使用基因内区侧翼引物的情况下执行基因表达研究；(4)它不需要PCR所需要的温度控制和反馈的程度。因此，NASBA已变得普遍用于检测病毒RNA和细菌RNA。NASBA是等温方法的事实使有可能在使用温度控制箱的情况下同时地运行多个样本，这在许多领域工作中是重要的实践优点。
LAMP(其代表环介导等温扩增)能够在等温条件(～60°℃)下以高特定性、效率和快速性扩增DNA。由于LAMP的扩增反应的特性，LAMP能够在扩增期间区分单核苷酸差异。结果，LAMP已应用于SNP(单核苷酸多态性)分型。LAMP还已被示出为在检测病毒方面具有比RT-PCR高大约10倍的敏感性。另外，因为DNA的LAMP扩增可与焦磷酸镁的产生直接相关，这会增加溶液的浊度，所以已使用简单的浊度计来监测LAMP的进展。因此，非同质检定可用于检测由LAMP引起的扩增产物。
在一个方面中，本公开提供一种用于执行样本的数字环介导扩增的方法。所述方法可包含：在微流体装置上产生样本的多个小滴，其中多个小滴中的至少一个小滴包括核酸分子(例如，DNA和/或RNA分子)；以及在至少一个小滴中执行环介导扩增以产生核酸分子的经扩增产物。所述方法还可包含检测经扩增产物。在一些方面中，所述方法包含：确定多个小滴中包括经扩增产物的小滴的数目；以及使用多个小滴中的小滴的个别体积和多个小滴中含有核酸分子的小滴的数目来计算样本中的核酸分子的浓度。微流体装置可包含被配置成形成多个小滴的多个腔室。
尽管NASBA和LAMP提供一些优点，但一个重要缺点是难以按常规的实时方式或大批地执行量化，按常规的实时方式或大批地执行量化在大多数情形中是有益的。量化常常要求使用在同等条件下扩增的标准进行细致的校准和控制，这可为非常繁琐的(尤其对于现场研究)且在许多情况下不实用。对于非同质检定，例如，LAMP中的沉淀物检测，准确的校准可尤其具挑战性。通过采用端点检测的本发明的数字方法来有效地解决此问题。
滚环扩增(RCA)是等温核酸扩增方法。它在若干方面不同于聚合酶链反应和其他核酸扩增方案。在RCA期间，短DNA探测剂退火到所关注目标DNA，例如致病生物的DNA或含有有害变异的人类基因。探测剂随后充当用于滚环扩增反应的引物。探测剂的自由端退火到小圆形DNA模板。添加DNA聚合酶来延伸引物。DNA聚合酶围绕圆形DNA模板连续地延伸引物，从而产生由圆的许多重复副本组成的长DNA产物。在反应结束时，聚合酶产生圆形模板的数千个副本，其中副本的链系接到原始目标DNA。这允许目标的空间解析和信号的快速扩增。使用正向和反向引物可将以上线性扩增反应改变为指数模式，其可在1小时内产生多达1012个副本。此类定量测量所需要的校准可为麻烦的
为了克服此缺点，本公开提供数字等温扩增，例如NASBA和LAMP，其中数字化体积阵列的使用(类似于数字PCR)用于实行数字NASBA、数字LAMP，以及滚环扩增。此外，通过使用不同大小的数字化体积的浓度梯度和/或阵列，我们可有效地增加这些数字测量的动态范围。当前方法理想地补充这些等温扩增方案以使其成为用于测量RNA和DNA的存在的定量技术。在本公开的另一方面中，所述方法应用于基于抗体的扩增。在另一方面中，所述方法应用于基于特定分子辨识的扩增。
根据本公开可使用各种可检测剂。在各种方面中，可检测剂是荧光的。在另外方面中，可检测剂是冷光的。所使用的可检测剂可取决于所采用的扩增方法的类型。在一个方面中，信号产生可来自不连续特定荧光团，例如EvaGreen或SYBRgreen，其中荧光团在溶液中时猝熄，但可插入到双链DNA中，其中其展现明亮得多的荧光。因此，在PCR期间产生的大量双链DNA引起荧光的显著增加。在另一方面中，使用连续特定荧光探测剂。在一个方面中，这由例如U形结构的分子信标组成，其荧光在其闭合构造中高度地猝熄，且其强度在其杂交到经扩增目标DNA时就增加。在另一方面中，其由Taqman探测剂组成，其杂交到目标DNA，且在下一个扩增步骤期间经历荧光报告从探测剂DNA的裂解。
这些探测剂具有不可忽略的背景荧光，且在扩增期间的强度的相对增加可相当小，这取决于添加到反应的探测剂的量。此外，激发强度可在检测过程期间横越视场而变化。在一些方面中，从图像中的所有像素减去阈值像素强度值以确定小滴中的荧光强度是否大到足以指示扩增产物的存在。在一些方面中，可将参考染料添加到一或多种不混溶流体，参考染料的光谱特征可与报告扩增的荧光探测剂很好地分离，且参考染料的荧光信号对扩增或其他反应或试剂条件不敏感。
分析方法和系统
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法。可产生多个多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括样本。可扩增样本。可使用可检测剂标记样本。可获得小滴的图像栈。可从图像栈确定小滴的体积。可从图像栈确定可检测剂在小滴中的存在或不存在。可基于可检测剂在多个小滴中的存在或不存在而确定多个小滴中的样本的浓度。
可通过光学成像来获得图像栈。可通过光学成像来检测可检测剂。可以许多方式执行光学成像，例如通过共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。在一些方面中，光学成像包括使用自适应光学器件和成像。
图像栈可包括从穿过单个小滴的单独焦深取得的多个图像。图像栈可包括从针对小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
可对多个小滴同时地执行本公开的方法。多个多分散小滴可包括多分散小滴阵列。多分散小滴阵列可安置在多井板中。
可以许多方式从图像栈确定小滴的体积，例如通过行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、圆检测方法、组合式反向分水线与圆检测方法，或其组合。可遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定可检测剂的浓度。
多个多分散小滴可包括第一流体和第二流体。第一流体可不混溶于第二流体中。可通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中第一流体不混溶于第二流体中。为了形成多分散小滴的乳剂，可搅拌包括第一流体和第二流体的溶液。第一流体可不混溶于第二流体中。可在第三流体中搅拌乳剂。第三流体可不混溶于第二流体中，由此形成双面乳剂。可以许多方式搅拌流体，例如摇动、涡旋、声波处理、与磁体混合、挤压、流聚焦或其组合。搅拌可足以形成乳剂。举例来说，挤压可包括对流体进行移液，其中移液足以产生乳剂。搅拌可发生在微流体装置中。搅拌可例如为涡旋。所产生的乳剂可包括水相和非水相。第一流体可包括水且第二流体可包括油。第一流体可包括水，第二流体可包括油，且第三流体可包括水。
多个多分散小滴可包括多种乳剂。可通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备多种乳剂。第一流体可为含水的。第一流体可包括样本。第二流体可包括油。第二流体可包括油，且第二流体可与第一流体和第三流体不混溶。第一流体可不同于第三流体。第三流体可包括油，且第三流体可与第一流体和第二流体不混溶。
多个多分散小滴可进一步包括流体界面改性元素。流体界面改性元素可包括表面活性剂。流体界面改性元素可选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
可将不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体。可在扩增样本之前、在扩增样本期间或在扩增样本之后将不混溶流体转化成凝胶或固体。
可检测剂可为荧光的或冷光的。可检测剂可包括以下各者中的一或多者：荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。样本可包括核苷酸。
为了扩增样本，可执行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。替代地或组合地，可通过核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增来扩增样本。
小滴直径分布可具有比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。替代地或组合地，小滴直径分布可具有比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
多分散小滴中的体积可变化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大约2倍、多于大约10倍、多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。多分散小滴可具有以下范围的体积分布：从100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、从10nL到10fL、从1nL到100fL、从100nL到1pL、从10nL到10pL，或从1nL到1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。多分散小滴的平均体积可在扩增样本期间改变少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
扩增样本可包括第一扩增循环，且少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴可在第一扩增循环之后融合。
第一流体的折射率可与第二流体的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的方法。可产生多个多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括样本。可扩增样本。可使用可检测剂标记样本。可使多个多分散小滴流动穿过流式细胞仪通道。可随着小滴流动穿过流式细胞仪通道而确定小滴的体积。可确定可检测剂在小滴中的存在或不存在。可基于可检测剂在多个多分散小滴中的存在或不存在而确定多个小滴中的样本的浓度。在一些方面中，可通过检测从小滴散射的光来确定小滴的大小和/或小滴中的样本的浓度。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的组合物。组合物可包括第一流体、第二流体、表面活性剂，以及扩增试剂。第一流体和第二流体可彼此不混溶且可能够在被搅拌时形成乳剂。在一些方面中，组合物可进一步包括例如核苷酸的样本，和/或能够标记样本的可检测剂。可使用可检测剂标记样本。
组合物可进一步包括能够结合核酸样本的可检测剂。
组合物的扩增试剂可选自聚合酶链反应(PCR)试剂、滚环扩增(RCA)试剂、基于核酸序列的扩增(NASBA)试剂、环介导扩增(LAMP)试剂，或其组合。扩增试剂可包括PCR试剂，例如热稳定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探测剂或其组合。
组合物可进一步包括第三流体。第三流体可不混溶于第二流体中。组合物可能够形成双面乳剂。第一流体可为含水的。第一流体可包括扩增试剂。第二流体可包括油。第二流体可与第一流体和第三流体不混溶。第一流体可不同于第三流体。第三流体可包括油，且可与第一流体和第二流体不混溶。
组合物可进一步包括流体界面改性元素。流体界面改性元素可包括表面活性剂。流体界面改性元素可选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
组合物可进一步包括能够将不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体的固化或胶凝剂。
在一些方面中，本公开提供用于执行数字检定的套件，其包括前述组合物中的任一者。
在各种方面中，本公开提供用于确定小滴的体积的系统。所述系统可包括容器、成像源，以及计算装置。容器可被配置成用于保持小滴。成像源可被配置成获得容器中的小滴的图像。计算装置可包括处理器和存储器(例如，非暂时性有形计算机可读存储媒体，例如ROM、RAM、闪速存储器，或类似者)。存储器可存储一组指令，所述一组指令在由处理器执行时致使(i)成像源获得小滴的图像栈，以及(ii)处理器基于所获得的图像栈而确定样本中的小滴的体积。
小滴可包括多个小滴。多个小滴可为多分散的。容器可包括多井板。
成像源可包括光学成像源。光学成像源可被配置成执行共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
小滴的图像栈可包括从穿过小滴的单独焦深取得的多个图像。图像栈可包括从针对小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
所述一组指令在由处理器执行时可致使处理器通过以下操作来确定小滴的体积：(i)识别图像栈的个别图像中的像素组；(ii)将像素组识别为至少一个小滴的至少一部分；(iii)基于对应而从像素组识别个别小滴；以及(iv)基于像素组而确定所识别的小滴的体积。至少一个小滴的至少一部分可包括单个小滴、多个小滴的多个部分、单个整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
所述一组指令在由处理器执行时可致使处理器基于所获得的图像栈而确定多个小滴的多个体积。所述一组指令在由处理器执行时可进一步致使处理器确定可检测剂在多个小滴中的至少一些小滴中的存在或不存在。所述一组指令在由处理器执行时可进一步致使处理器基于可检测剂在多个小滴中的存在或不存在以及多个小滴的所确定的多个体积而确定多个小滴中的样本的浓度。样本可包括核苷酸。可检测剂可为荧光的或冷光的。可检测剂可包括荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
多个小滴可包括样本，样本包括核苷酸。多个小滴中的样本可已被扩增。可已通过执行以下各者来扩增多个小滴中的样本：聚合酶链反应(PCR)、数字聚合酶链反应(dPCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。可已通过核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增来扩增样本。所述一组指令在由处理器执行时可致使遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定可检测剂的浓度。
在各种方面中，本公开提供用于确定小滴的体积的方法。可获得小滴的图像栈。可识别图像栈的个别图像中的像素组。可将像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分，其可包括单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。可基于对应而从像素组识别个别小滴。可基于像素组而确定所识别的个别小滴的体积。
可通过获得从穿过小滴的单独焦深取得的多个图像而获得样本的图像栈。可从针对小滴的单独焦深取得2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
可通过以以下方式单独地或以各种组合使用图像栈的至少一个图像来确定所识别的小滴的直径而确定所识别的小滴的体积。1、可使所识别的小滴在图像栈的多个图像之间相关，且可测量多个图像中的所识别的小滴的最大直径。2、可使曲线拟合到所识别的小滴的边界，且可基于所拟合的曲线而内插所识别的小滴的直径。3、可使所识别的小滴的直径在图像栈的多个图像之间相关，可在每个图像中识别所识别的小滴的直径，且可从图像栈的多个图像中的所识别的小滴的直径确定所识别的小滴的直径。4、可使所识别的小滴在图像栈的多个图像之间相关，可在每个图像中确定所识别的小滴的直径，且可从图像栈的多个图像中的所识别的小滴的直径以及多个图像之间的图像深度差确定所识别的小滴的直径。还预期确定所识别的小滴的直径的其他方式，且其在本公开的范围内。
可确定多个小滴的体积。可从图像栈确定可检测剂在多个小滴中的存在或不存在。可基于可检测剂在多个小滴中的存在或不存在以及多个小滴的所确定的体积而确定多个小滴中的样本的浓度。
样本可包括核苷酸。可以许多方式来扩增多个小滴中的样本，例如通过执行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。替代地或组合地，可通过核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增来扩增样本。
可遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定可检测剂的浓度。可检测剂可为荧光的或冷光的。可检测剂可包括荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
可通过光学成像来获得图像栈。可通过以下各者执行光学成像：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
可获得多个多分散小滴的图像栈。多个多分散小滴可包括第一流体和第二流体。第一流体可不混溶于第二流体中。可通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂。为了获得图像栈，可使所形成的乳剂成像。第一流体可包括水且第二流体可包括油。
此外，可通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂。第一流体可不混溶于第二流体中。而且，可在第三流体中搅拌乳剂。第三流体可不混溶于第二流体中，由此形成双面乳剂。第一流体可包括水，第二流体可包括油，且第三流体可包括水。可以许多方式搅拌流体，例如通过摇动、涡旋、声波处理、与磁体混合、挤压、流聚焦或其组合。搅拌可足以形成乳剂。挤压(例如)可包括对流体进行移液，其中移液足以产生乳剂。搅拌可发生在微流体装置中。
乳剂可包括水相和非水相。多分散小滴可包括多种乳剂。多分散小滴可包括多种乳剂。可通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备多种乳剂。三种或多于三种不混溶流体可包括第一流体、第二流体和第三流体。第一流体可为含水的。第二流体可包括油。第二流体可与第一流体和第三流体不混溶。可将不混溶的第一、第二和/或第三流体转化成凝胶或固体。第一流体可不同于第三流体。第三流体可包括油。第三流体可与第一流体和第二流体不混溶。可将不混溶的第三流体转化成固体或凝胶。第一流体可包括用于检测的样本。第一流体的折射率可与第二流体的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
多个多分散小滴可进一步包括流体界面改性元素。流体界面改性元素可包括表面活性剂。流体界面改性元素可选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。举例来说，流体界面改性元素可包括基于PEG的表面活性剂。
小滴直径分布可具有比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。小滴直径分布可具有比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
多分散小滴中的体积可变化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大约2倍、多于大约10倍、多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。
多分散小滴可具有以下范围的体积分布：从100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、从10nL到10fL、从1nL到100fL、从100nL到1pL、从10nL到10pL，或从1nL到1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。
可扩增样本以用于在多分散小滴中进行检测。
多分散小滴的平均体积可在扩增样本期间改变少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
扩增样本可包括第一扩增循环，且少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的多分散小滴可在第一扩增循环之后融合。
此外，可通过以下操作来识别图像栈的个别图像中的像素组：在个别图像内获得多个行扫描；设置阈值水平；以及将在阈值水平之外的多个行扫描中的区域识别为像素组(例如，如果所述区域低于或高于阈值水平，那么所述区域可在阈值水平之外)。虽然本文中大体上论述行扫描，但还预期产生扫描的其他方法。这些方法可包含共聚焦扫描、行照明和收集、Nipkow盘型扫描，或类似者。
为了识别图像中的一或多个小滴，可使用简单边界方法。为了执行简单边界方法，可识别高于阈值的图像栈的个别图像的一或多个像素组。像素组可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。可通过确定像素组的纵横比而将像素组识别为对应于一个小滴。可在像素组的纵横比小于或等于阈值时将像素组识别为对应于一个小滴。阈值可为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。
为了识别图像中的小滴，可执行反向分水线方法。执行反向分水线方法可包括：基于图像栈的个别图像的像素强度而产生地图；识别所产生的地图中的一或多个像素组；将个别像素组识别为所关注区；使所关注区的边界与最佳拟合圆拟合。像素组可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。可在产生地图之前使图像栈的个别图像平滑。基于图像栈的个别图像的像素强度而产生的地图可包括拓扑地图。为了识别一或多个像素组，可基于个别像素的像素强度以及一或多个阈值而确定个别像素是否包括背景像素或小滴像素。可在个别像素组具有高于最小所需区域的区域时将个别像素组识别为所关注区。此外，可确定个别像素组是否包括多个所关注区，且可将多个所关注区组合为单个所关注区。所关注区可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
为了识别图像中的一或多个小滴，可执行圆检测方法。为了执行圆检测方法，可识别高于阈值的图像栈的个别图像的一或多个像素组，可将多个圆叠加在所识别的一或多个像素组上方，可在所叠加的多个圆中的一或多个圆不满足至少一个预定准则时拒绝所述一或多个圆，且可将一或多个剩余圆识别为对应于小滴。像素组可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
为了识别图像中的一或多个小滴，可执行组合式反向分水线与圆检测方法。为了执行组合式反向分水线与圆检测方法，可产生基于图像栈的个别图像的像素强度的地图，可识别地图中的一或多个像素组，可将个别像素组识别为所关注区，可将多个圆叠加在所关注区上方，可在所叠加的多个圆中的一或多个圆不满足至少一个预定准则时拒绝所述一或多个圆，且可将一或多个剩余圆识别为对应于一个小滴。像素组可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。可在产生地图之前使图像栈的个别图像平滑。基于图像栈的个别图像的图像强度的地图可包括拓扑地图。为了识别一或多个像素组，可基于个别像素的像素强度以及一或多个阈值而将个别像素识别为背景像素或小滴像素。所关注区可包含单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
可在个别像素组具有高于最小所需区域的区域的情况下将个别像素组确定为包括所关注区。至少一个预定准则可包括以下各者中的一或多者：(i)选择包含所关注区的外部边界像素的最大分数的一或多个圆；(ii)选择包含所关注区的区域的最大分数的一或多个圆；(iii)拒绝包含来自与所关注区不同的像素群组的像素的一或多个圆；(iv)拒绝包含大量非群组像素的一或多个圆；或(v)排斥在像素群组的内部中具有它们的圆周的巨大分数的一或多个圆。
为了拒绝一或多个圆，可成对地检查多个所叠加的圆。被检查的圆可包括第一圆和第二圆。此外，可基于可为用户定义的投票而拒绝第一圆或第二圆中的一者。
可通过将一或多个剩余圆指派给一个小滴而将一或多个剩余圆识别为对应于一个小滴。可基于以下各者中的一或多者而将一或多个圆指派给一个小滴：(i)向小滴指派与小滴具有最佳拟合优度统计的圆；或(ii)将所关注区指派给在区域上与所关注区的一或多个圆具有最大重叠的小滴。
为了基于所关注区而确定所识别的小滴的体积，可确定对应于小滴的一或多个所识别的圆的一或多个直径。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的系统。所述系统可包括容器、成像源，以及计算装置。容器可被配置成用于保持多个多分散小滴。小滴中的至少一些小滴可包括使用可检测剂标记的样本。成像源可被配置成获得容器中保持的多个多分散小滴的图像栈。计算装置可被配置成操作成像源。计算装置可包括处理器和存储器(例如，非暂时性有形计算机可读存储媒体，例如ROM、RAM、闪速存储器，或类似者)。存储器可存储一组指令，所述一组指令在由处理器执行时致使(i)成像源获得容器中保持的多个多分散小滴的图像栈，(ii)处理器基于所获得的图像栈而确定多个多分散小滴的体积，(iii)处理器确定可检测剂在多个多分散小滴中的存在或不存在，以及(iv)处理器基于可检测剂在多个多分散小滴中的存在或不存在以及多个多分散小滴的体积而确定多个小滴中的样本的浓度。
容器可包括多井板。成像源可包括光学成像源。光学成像源可被配置成执行以下各者中的一或多者：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
所获得的图像栈可包括从穿过单个小滴的单独焦深取得的多个图像。图像栈可包括从针对单个小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
所述一组指令在由处理器执行时可致使处理器通过以下操作来确定多个多分散小滴的体积：(i)识别图像栈的个别图像中的像素组；(ii)将像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分(其可包括单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合)；(iii)从像素组识别个别小滴；以及(iv)基于像素组而确定所识别的小滴的体积。
样本可包括核苷酸。样本可已被扩增。可检测剂可为荧光的或冷光的。多个多分散小滴可包括第一流体和第二流体，第一流体与第二流体不混溶。
本公开的系统进一步包含被配置成分析体积以及样本在多个小滴中的存在或不存在的检测系统。检测系统可包含用于分析体积的内含物、确定小滴的体积和/或其他所关注特性的检测器。本文中所描述的方法将与能够检测和分析体积(例如，小滴和/或井)的任何已知系统大体上兼容。
在各种方面中，本公开提供用于执行样本的数字测量的系统和方法。在某些方面中，可识别小滴且使用目前描述的系统和方法来测量小滴的体积。在一些方面中，通过获得给定小滴的图像栈来测量小滴的体积。图像栈中的每个图像对应于在单个平面中取得的测量。获得给定小滴中的两个或多于两个平面的图像使能够确定小滴体积。如果小滴足够小，那么可有可能从其在图像栈的单个图像中的外观确定其体积。图像栈还可被称作“z栈”，这是因为焦平面通常在显微镜的光学系统的z方向上被分离用户选择的距离。给定z栈的高度可与所使用的显微镜物镜的工作距离一样大。在另外方面中，可针对给定小滴确定样本在给定小滴中的存在或不存在。在某些方面中，小滴体积以及样本在多个小滴中的每一者中的存在或不存在的确定可用于确定多个多分散小滴中的任何给定小滴将含有样本的概率，所述概率随后可用于确定样本的浓度。
在各种方面中，本公开提供用于使用数字测量来确定样本的浓度的系统。所述系统可包含：样本保持器，其含有具有体积分布的多个多分散小滴；检测器，其用于检测小滴大小(即，体积)以及多个多分散小滴中的至少一个小滴中含有的可检测剂；以及计算机，其包括被存储有可执行指令的存储器装置，所述指令在由处理器执行时致使处理器进行以下操作：分析具有体积分布的多个多分散小滴以确定小滴的体积以及它们是否含有可检测剂以确定样本的浓度。在一些方面中，样本中的可检测剂的浓度用于计算样本浓度。在各种方面中，可检测剂的浓度与样本的浓度直接相关。
在各种方面中，通过光学检测方法检测小滴直径以及可检测剂的存在。通过检测可测量的光学性质(例如光的存在)而操作的任何检测器或其组件包括光学检测器。光学检测器的实例包含但不限于相机、光电倍增管、光电二极管和光电二极管阵列，以及显微镜，及其关联组件，例如物镜、光学滤波器、镜子，和类似者。
在某些方面中，处理由光学检测器或其他合适检测器检测的信号，以便解释由检测器测量的信号。在某些方面中，由存储和/或处理由检测器(例如，光学检测器)获取的信息的装置、设备或其组件处理所测量的信息。信息处理器的实例包含但不限于个人计算装置，其存储由检测器获取的信息，以及在个人计算装置上运行的处理所述信息的软件。在其他方面中，信息处理器或其组件可嵌入在检测器中，例如在嵌入在相机的永久地或临时地存储由相机获取的光学信息的芯片中。在其他方面中，信息处理器和检测器可为既获取又处理光学信息以执行数字检定的完全集成装置的组件。
在又一方面中，所述系统可包含用于进行数字测量的计算机可读存储媒体。计算机可读存储媒体具有存储在其上的指令，所述指令在由计算机的一或多个处理器执行时致使计算机进行以下操作：分析具有体积分布的多个小滴以确定多个小滴中含有可检测剂的小滴的数目；以及使用多个小滴中的小滴的数目、多个小滴中的一些或所有小滴的体积和第二多个小滴中含有一或多个可检测剂的小滴的数目来确定样本中的可检测剂的浓度。
在另一方面中，提供用于分析体积以检测和计算给定小滴的信息的系统。所述系统包含一或多个处理器，以及包含可由一或多个处理器执行的指令的存储器装置。当由一或多个处理器执行指令时，所述系统至少接收用户输入来分析体积(例如，多个小滴)。所述系统可被配置成实行本公开的方法的多个方面，例如对体积(例如，小滴)的数目进行计数，确定体积分布中的多个小滴的体积，以及使用含有一或多个可检测剂的小滴的数目来确定样本中的可检测剂的浓度。所述系统还向用户提供数据。提供给用户的数据可包含样本中的可检测剂的浓度或样本浓度。
在本公开的一些方面中，通过在特定波长范围内的荧光的增加来指示一或多个目标分子在小滴内的存在。在一些方面中，PCR反应产物通过在特定波长范围内的荧光(指示剂荧光)的增加来指示目标分子的存在。在一些方面中，可与目标分子并行地利用参考剂。根据此方面，小滴发射在与目标分子的波长范围分离的波长范围内的荧光(即，参考荧光)，而不管是否存在目标分子。对于一组给定小滴，获得指示剂荧光和参考荧光的单独组图像，且识别和测量每个图像中的小滴。可比较来自给定小滴的指示剂荧光和参考荧光。在一些方面中，指示剂荧光对参考荧光的比率可用于指示所述特定小滴是否含有目标分子。在其他方面中，指示剂荧光的绝对强度将足以指示小滴是否含有目标。在一些方面中，在比较指示剂的荧光强度和参考强度之前，可从小滴内的像素强度减去背景像素的平均值或其倍数。通过执行此分析，获得小滴直径的列表，且对于每个所测量的小滴，获得界定小滴是否被占据(含有一或多个目标分子)的二元量度。被占据小滴的小滴大小和总数的列表随后可用于获得样本的目标浓度。
在应用本公开的方法时，存在用于测量乳剂中的多分散小滴的大小、内含物和/或其他方面的许多可能方式。在一些方面中，可由包括流式细胞仪的光学检测器光学地测量小滴。根据此方面，小滴可流过大流动通道，其中小滴形状未失真，且它们的体积可在小滴通过光激发源时由计算机软件基于由光学检测器(例如，光电倍增管)获取的光散射图案的测量而确定。在其他方面中，小滴可穿过窄流动通道，其中小滴与通道宽度相符。根据此方面，可通过使用通道宽度以及通道中的个别小滴的长度来界定小滴的体积而确定分散小滴的体积。
根据本公开可使用多种信号检测方法。在各种方面中，本发明的方法和系统实现使用光学检测方法和光学检测器来检测小滴方面。在一些方面中，可由包括荧光显微镜及其关联组件的光学检测器光学地测量乳剂系统。可例如使用共聚焦激光扫描显微镜、旋转盘(Nipkow盘)共聚焦显微镜或使用镜子或空间光调制器的可编程阵列以从多个焦深获取数据的显微镜来获取图像。在其他方面中，可使用落射荧光显微镜获取图像。在一些方面中，随后可使用由计算机软件执行的3D反卷积算法来处理使用落射荧光显微镜获取的图像。在其他方面中，可使用多光子显微镜(例如，二光子显微镜)来获取图像。在其他方面中，可使用平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、明场成像、暗场成像或倾斜照明来获取图像。在一些方面中，可使用本文中所列出的成像装置和方法或可合理地应用于本发明的方法的任何其他合适成像装置和方法的组合来获取图像。
小滴成像的方法提供关于小滴大小以及小滴是否含有所关注目标分子两者的信息，其根据本发明的方法而用于确定样本浓度。在一些方面中，可基于使用共聚焦荧光显微术获取的光学信息而确定小滴大小和信号强度。根据此方面，乳剂可存储在井、腔室或其他容器中，且可从其获取多组图像栈。在一些方面中，对于给定多分散小滴样本中的每个样本区域，收集图像栈，所述图像栈由在大致相同的XY位置(相同的样本区域)但不同的Z位置(不同的深度)处取得的至少两个图像组成。样本区域中大于Z中的间距的小滴将在大致相同的XY位置处出现在多个帧中，但具有不同的直径。图像栈使能够确定各种参数，包含小滴大小以及目标分析物在小滴中的存在或不存在。
在一些方面中，由信息处理器仅基于在含有最大直径的Z栈的帧中确定的小滴边界而确定小滴直径。在其他方面中，由信息处理器基于在Z栈中的多个图像处确定的小滴边界以及Z维度上的图像的相对位置而确定小滴直径。此方法可包含假设球形小滴形状，或某一其他经修改形状，这取决于多个因素，包含两种流体的折射率、两种流体的相对密度以及表面张力。
根据本公开，存在用于识别和选择个别小滴的众多方法。在一个方面中，在图像内获得行扫描，且在设置适当阈值水平之后，测量所关注区的直径。在另一方面中，选择每个图像的阈值，且将高于阈值的区域评估为可能的单个小滴。如果所述区域足够圆(即，具有低于选定阈值水平的纵横比)，那么将所述区域视为单个小滴。针对每个图像产生小滴列表。
在一些方面中，一旦已识别图像中的小滴，就使它们在图像栈的不同帧之间相关。最大的小滴将出现在多于一个图像中，因此有必要穿过图像栈的帧来识别圆的痕迹。可容易地通过使用本领域的普通技术人员所知的任何数目种合适跟踪算法来实现小滴相关。通常由于小滴在帧之间不会显著地移动的事实且因为所关注小滴相当大(以像素计)而促进跟踪。根据本公开，特定小滴的直径可被假设为在图像栈中与所述小滴相关联的最大圆的直径。替代地，可使曲线拟合到特定小滴的圆直径且从所述曲线内插最大直径。所述最大直径随后将用作小滴的直径。在本公开的各种方面中，获得图像栈中的多个图像且将其用于确定给定小滴的各种所关注参数，且不要求小滴自身经历额外检定。
本发明的方法服从自动化，且可使用任何合适方法来用于识别、选择和分析小滴以及那些小滴内含有的样本。示范性方法包含行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、经修改反向分水线方法、圆检测方法、圆Hough变换方法，以及组合式反向分水线与圆检测方法。还预期其他方法且其在本公开的范围内。下文描述这些方法中的每一者。
行扫描方法。在本公开的一个方面中，可使用行扫描方法来分析多分散小滴系统中的小滴。根据此方面，在图像内获得行扫描，且在设置适当信号阈值水平之后，测量所关注区的直径。
简单边界方法。在本公开的一个方面中，可使用简单边界方法来分析多分散小滴系统中的小滴。根据此方面，起初选择每个图像的阈值。将给定样本中高于阈值的像素组评估为可能的单个小滴。如果像素组足够圆(即，具有低于选定水平的纵横比)，那么将所述区域视为单个小滴。随后针对每个图像产生小滴列表。
反向分水线方法。在本公开的一个方面中，可使用反向分水线方法来分析多分散小滴系统中的小滴。在标准分水线方法中，将图像的像素强度视为3D构形地图中的评估。在局部极小值处引入“水”，其中水相对于全局零点的高度对于所有“池”是相同的。随着水高度均一地升高，不同池中的水将合并。不同池合并的像素位置用于在图像内构建单独区。
在反向分水线方法中，相同地处理像素，但起初使“水”位置于图像中的最高“峰”上方，且随后排泄水，从而维持水贯穿图像的相同高度。随着水位下降，最密集的像素将作为小岛突出在水上方。这些岛被标注为小滴的潜在质心，且随着水位下降而跟踪每个“岛”的大小。此过程继续直到水位已下降到预定阈值。将岛看作可为单个小滴的全部或部分的区。由于测量噪声，有可能使单个小滴在以上过程期间出现时具有两个或多于两个峰。图1表示以灰度示出的典型图像。可通过在这些参数内拟合的任何合适手段来执行反向分水线方法。以下实例3描述一组示范性步骤，借此可根据本公开的一方面执行反向分水线方法。
根据本公开的一些方面，可通过以下操作来执行反向分水线方法：首先确定每个图像的背景内的信号的标准偏差，且使其乘以信噪比(通常为2.5到3.5，然而，信噪比可由用户取决于存在于图像中的噪声的量而调整)，且将结果加到背景像素的平均强度。此过程可迭代地进行，且背景截止的初始估计用于识别可能的背景像素(强度小于初始估计的那些像素)。这些像素的强度又用于计算背景像素的强度的平均值和标准偏差。随后使用新的平均值和标准偏差来估计新的背景截止。如果新的背景截止显著地不同于原始的背景截止，那么重复所述过程，直到原始的背景截止与新的背景截止一致。
还可使用用于确定背景截止的其他方法。在一些方面中，用户可选择界定截止来识别背景像素，且放弃上文所描述的迭代方法。在一些方面中，用户可选择将图像内的某些像素识别为背景像素，且从那些像素计算背景和标准偏差。在其他方面中，用户可计算其中不具有样本的所取得的图像(即，暗图像)中的像素的平均值和标准偏差。如下文所描述，可使用背景像素的平均值来分析荧光以确定哪些小滴含有目标分子。
根据本公开的一些方面，随后选择截止阈值。通常在图像的最大像素强度处或附近选择截止阈值。逐步地降低此截止阈值，直到其达到最小截止阈值(SCT)。在一些方面中，SCT等效于背景阈值(BT)。在其他方面中，SCT可为从背景像素强度的平均值和标准偏差计算的不同值。在其他方面中，SCT可为用户定义的值。一旦确定SCT，用户就选择步骤的数目以及连续截止阈值之间的间距。将SCT选择为识别作为小滴的部分的像素。将BT选择为识别作为背景的部分的像素。在一些方面中，BT可小于SCT，在此情况下，可存在未指派给小滴或背景的一些像素。
根据本公开的一些方面，随后可在每个步骤处使用成像分析软件来找到图像中高于当前步骤的截止阈值的多组连接像素(在下文中被简称为“像素组”)。在一些方面中，用户可要求所述一组像素是4连接或8连接。如果每个像素水平地或垂直地邻近于正方形阵列中的一组像素中的至少一个其他像素，那么所述一组像素被视为“4连接”。如果每个像素水平地、垂直地或对角地邻近于正方形阵列中的一组像素中的至少一个其他像素，那么所述一组像素被视为“8连接”。在一些方面中，可使用不同形式的连接性来界定图像中的多组连接像素。在一些方面中，可使用用户定义的结构化元素以在形态上接近由截止确定的多组连接像素。如果此类像素组的区域超过用户定义的准则(即，“最小所需区域”或“MRA”)，那么将其标记为所关注区(ROI)。通过在给定像素组被接受为ROI之前使用MRA，有可能排斥背景像素中的噪声。噪声可造成背景中的隔离像素具有大于所需SCT的强度。可使用用户定义的MRA来排除此类隔离像素。将MRA选择成使得具有大于MRA的区域的一组给定连接背景像素可全部具有大于SCT的强度的概率足够小(用户满意)，使得所找到的对象事实上是小滴且在背景中没有噪声。可基于小滴区域内的噪声的量以及用户希望能够识别的图像中的最小的小滴的区域而选择MRA的大小。
一旦ROI出现在图像的特定位置中，就可随着减小截止阈值而跟踪ROI的区域。还可跟踪每个ROI内的最大强度像素的位置以及ROI内的像素的值。使用SCT识别的像素组被称作“群组”。如果群组含有多于一个小滴，那么群组内的像素的区可实际上表示小滴之间的空间。如果在单个群组中含有三个或多于三个小滴，那么有可能在小滴之间可存在间隙，其将显现为群组的内部中的孔。在一些方面中，应用用于识别孔的孔阈值(HT)来找到由单个群组内的连接像素组成的可能的孔。指定孔的用户指定的最小的大小来区别孔与图像中的噪声。将仅把其区域等于或超过孔的最小的大小的多组连接像素标记为孔。在一些方面中，HT将等于SCT。在其他方面中，用户可选择不等于SCT的HT。
群组的外部边界是由群组内的像素组成，所述像素邻近于在群组外部的具有低于SCT的强度的像素和/或在群组内部中且邻近于孔中的像素的像素。这些像素被称作非群组像素。反向分水线程序随后识别作为同一小滴的部分的外部边界像素，且使用现有优化方法来确定对那些外部边界像素的最佳拟合圆。
根据本公开的一些方面，随着降低截止阈值，两个或多于两个ROI可合并。高于特定截止阈值水平的像素组可包含对于较大截止阈值是单独的两个或多于两个ROI。这之所以可发生是因为不同的ROI表示不同的小滴，所述小滴靠近在一起以使得它们之间的边界区具有大于当前截止阈值的像素强度，或样本中的噪声的振幅足够大以使得单个小滴内的两个或多于两个区展现局部极大值。这些极大值对于算法可显现为较大截止阈值处的单独ROI。
根据本公开的另外方面，用户定义的准则可用于决定其区域包含在当前步骤同一像素组内的不同ROI应(a)被合并且此后被看作一个ROI，还是(b)不被合并且作为单独ROI被跟踪。这些准则可包含但不限于：(i)不同ROI的最大强度像素之间的距离，和/或(ii)与在像素组中将它们分离的最小强度像素相比较的不同ROI的最大强度像素的值，和/或(iii)在不同ROI的平滑之后的最大强度像素的值。
对于以上准则(i)，可使用图像的平滑版本来代替实际图像。使图像平滑可减少噪声在评估两个ROI的“峰”之间的距离方面的影响。另外，对于以上准则(i)，还可使用ROI的质心或另一中心估计量。此估计量的实例包含：未加权质心，其中每个像素对于确定质心贡献相等权重；或经加权质心，其中每个像素向质心贡献等于其强度的某一函数的权重。
对于以上准则(ii)，如果ROI是单独小滴的部分，那么将预期到，它们将被强度上显著地小于两个ROI的峰的像素区分离。如果位于两个峰之间的像素的强度代替地类似于峰的强度，那么可得出结论：两个ROI事实上是同一小滴的部分且应被组合。用户定义的准则可基于取决于图像的任何性质的函数，所述性质可包含：(a)ROI的最大峰强度，(b)在平滑之后的ROI的最大峰强度，(c)平均背景强度，(d)背景强度的标准偏差，(e)用于确定当前像素组的截止水平，或(f)任何任意的用户指定的值。
对于以上准则(iii)，在一些方面中，图像中的噪声可引起单个像素含有由小得多的强度的像素环绕的ROI的最大强度。这在一些情况下可通过平滑而揭露，这是因为在平滑之后的ROI的最大像素强度将显著地较低。如果此类平滑将两个ROI的最大强度减小到低于用户定义的水平，那么两个ROI将被确定为同一小滴的部分且被组合。用户定义的水平可为取决于图像的任何性质的函数，所述性质可包含：(a)ROI的最大峰强度，(b)在平滑之后的ROI的最大峰强度，(c)平均背景强度，(d)背景强度的标准偏差，(e)用于确定当前像素组的截止水平，或(f)任何任意的用户指定的值。
根据本公开的某些方面，如果其区域包含在当前步骤的同一像素组内的不同ROI未被合并，那么必须通过少许方法中的一者来指派先前未指派给ROI的那个像素组的像素，所述方法例如是以下两种可能的方法。第一，按强度对像素组内的未指派像素的列表进行分类，且将紧接地邻近于ROI中的一者且仅一者的具有最大强度的像素指派给那个ROI。重复此过程，直到剩余的仅未指派像素是紧接地邻近于两个或多于两个不同ROI的像素，在此情况下，那些像素保持未指派。第二，未指派像素可保持未指派，直到在最后步骤之后(即，已使用SCT且像素组随后被称作群组)。在那种情况下，随后将上文在此段落中所描述的第一方法应用于群组的未指派像素。
根据本公开的某些方面，可将到此时的程序的结果应用于小滴图像。根据此方面，可将小滴图像划分为被其强度低于SCT的像素分离的群组。所述群组中的一些仅含有单个ROI，且一些含有两个或多于两个ROI。边界像素是属于邻近于非群组像素的群组的那些像素。
根据本公开的某些方面，如果群组仅由单个ROI组成，那么将其视为单个小滴，且使其边界像素拟合到圆以获得小滴直径。
根据本公开的另外方面，如果群组是由两个或多于两个ROI组成，那么分析来自那个群组的多组ROI(即，包括一或多个ROI的组)。将作为被分析的组的部分的边界像素拟合到圆。随后将用户定义的准则应用于最佳拟合圆来确定所述组的ROI是否应被组合且被视为单个小滴的部分。可迭代地应用此程序，一次一个ROI地将一小滴拼接在一起。可用于决定要检查ROI的哪些组合的可能准则包含但不限于：(i)检查彼此邻近的多对ROI(它们在群组内的内部边界彼此接近)；(ii)检查其最佳拟合圆具有彼此靠近的中心的多对ROI；以及(iii)检查其区域大体上位于另一ROI或另一组ROI的最佳拟合圆内部的ROI。可用于确定两个或多于两个ROI是否应被组合且分类为单个小滴的可能准则包含但不限于：(i)拟合的质量(由给定拟合的优度的均方误差或某一其他统计量度界定)；(ii)来自所述组的ROI的多少区域处于最佳拟合圆内；(iii)最佳拟合圆内多少区域是由图像背景中的像素组成；以及(iv)包含在拟合中的背景像素的圆度。
在另一方面中，以上协议可包含额外修改。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例为不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。在此实例中，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
对上述反向分水线方法的另一可能修改可为：BT和SCT可不同。可使用小于最小截止阈值的背景阈值以从背景像素组消除含有太模糊而无法特性化的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
根据本公开，对上述反向分水线方法的其他修改是可能的。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例例如采用以下假定：不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。根据此假设，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
在某些方面中，反向分水线方法可被修改成使得准许BT和SCT不同。可使用小于SCT的BT以从背景像素组消除含有太模糊而无法特性化的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
圆检测方法。在本公开的一个方面中，可使用圆检测方法来分析多分散小滴系统中的小滴。根据此方法，将阈值(如针对以上反向分水线方法所确定)应用于图像。如反向分水线方法中所描述，可使用SCT来识别群组，然而，不识别ROI。还可应用孔阈值来识别单个群组内的孔，如反向分水线方法中所描述。在识别孔阈值之后，可确定每个群组的外部边界，如反向分水线方法中所描述。在一些方面中，随后可通过圆Hough变换来分析所形成的群组的边界。圆Hough变换是用于检测存在分析描述的形状(在此情况下是圆)的原始Hough变换(即，用于检测图像中的线)的一般化。根据本公开的某些方面，圆检测方法分析外部边界像素(也被称为“特征像素”)的坐标以找到形成圆的全部或部分的边界像素组。边界像素的识别会引起分析大量潜在圆，且仅保留很可能是小滴的圆。
根据此方法，可将通过圆检测方法识别的圆叠加在图像上，例如以下实例5中所描述。可丢弃未满足圆检测方法中所陈述的准则的区。举例来说，由一个群组的一些或整个外部边界形成的圆可不包含来自不同的单独群组的像素。随后可根据此方法而应用的可能准则可包含但不限于：(i)选择重叠或邻近于群组的边界像素的最大可能百分比的潜在圆；(ii)选择重叠或邻近于边界像素的其圆周像素的分数尽可能地接近1的潜在圆；(iii)拒绝具有完全在群组内的显著量的其圆周的潜在圆；(iv)拒绝其区域包含大量非群组像素的潜在圆；(v)拒绝其区域包含不同群组中的像素的潜在圆；(vi)对于特定群组，拒绝其区域包含那个群组的孔中的大量像素的潜在圆；和/或(vii)在给定特征像素的最佳拟合圆被判断为具有低质量(即，其中质量程度是统计上计算的给定拟合的优度的用户定义的量度，且低质量拟合是拟合未通过用户定义的准则的拟合)的情况下拒绝潜在圆。
在某些方面中，此时可存在重叠的圆。可检查此类对来确定是否应拒绝任一者。随后可应用于此类对的准则可包含但不限于：(i)如果圆中的一者中的唯一区域(即，一个圆中的不在其他圆中的区域)的量小于总区域的用户定义的分数，那么移除所述圆中的一者；以及(ii)如果唯一特征像素(即，一个圆的不是其他圆的特征像素的特征像素)的数目小于特征像素的总数的用户定义的分数，那么移除所述圆中的一者。如果将移除一对中的一个圆，那么用于确定将移除哪个圆的可能准则可包含但不限于：(i)移除具有较小数目个特征像素的圆；(ii)移除具有最小区域的圆；或(iii)移除含有较大数目个不是群组的部分的像素(即，在背景中的最大数目)或具有不被包含为群组的部分的其区域的较大分数的圆。
在应用以上准则之后，可仍存在彼此显著地重叠的圆。决定是否将此类圆接受为小滴将取决于乳剂的性质。在一些乳剂系统中，可常见的是找到以使接触表面平坦的方式被一起推动的小滴，这可具有使小滴失真的效应(即，造成它们不是呈严格球形的形状)。在此例子中，用户可决定包含还是排除那些小滴，这取决于在确定此类小滴的大小方面的准确性的要求。在一些系统中，小的小滴可与大得多的小滴重叠。在那种情况下，描述较小的小滴的圆可具有在大得多的圆内的其区域的巨大分数。如果足够的小的小滴的边界是其群组的外部边界的部分，那么用户可选择接受小的小滴，且将其包含在分析中。在一些方面中，圆可具有在群组的内部中的其圆周的巨大分数。在某些方面中，可使用用户定义的准则来排除具有多于群组内部中的其边界的指定分数圆的小滴，理由是所述圆由于图像中的使群组的外部边界失真的噪声而为假影。在一些方面中，类似大小的两个可能小滴具有显著量的重叠。这可归因于由于小滴如上述被一起推动而引起的失真。或者，这可归因于在假设图像中的椭圆形形状的情况下引起球形小滴的光学失真。可使用用户准则来标记此类圆且将它们排除在进一步分析之外。
在一些方面中，用户可将拟合质量测试应用于小滴且拒绝不认为被准确地定大小的小滴。可针对圆到小滴的特征像素的最佳拟合来计算拟合优度统计，且可在小滴未能满足用户定义的标准的情况下拒绝所述小滴。在其他方面中，可检查小滴内的强度，且可在从某种意义上整个小滴强度太低的情况下拒绝所述小滴。这可发生的一种方式是归因于显微镜在z方向上的有限分辨率。在z方向上的一个位置处的来自小滴的荧光可显示针对z方向上的不同位置而取得的样本的图像中的极大减小的强度。总强度的测试可用于识别和拒绝此类模糊对象。
在另一方面中，以上协议可包含额外修改。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例为不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。在此实例中，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
对上述圆检测方法的另一可能修改可为：BT和SCT可不同。可使用小于SCT的BT以从背景像素组消除含有太模糊而无法特性化的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
根据本公开，对上述圆检测方法的其他修改是可能的。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例例如采用以下假定：不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。根据此假设，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
对圆检测方法的另一可能修改是：准许BT和SCT不同。可使用小于SCT的BT以从背景像素组消除含有太模糊而无法特性化的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
在对圆进行分类之后，使用最佳地界定小滴的圆来找出应使用哪些边界像素来描述所述小滴。随后将这些像素拟合到圆来获得对应于小滴的最佳拟合圆的集合。
在其他方面中，可由不同特征提取方法替换圆Hough变换方法，所述不同特征提取方法将用于通过分析图像中的边界像素来检测圆形对象。
组合式反向分水线与圆检测方法。在本公开的又一方面中，对反向分水线与圆检测方法的多个方面进行组合来得到用于分析多分散小滴系统中的小滴的组合式反向分水线与圆检测方法。根据此方法，使用在反向分水线方法中所描述的程序来确定ROI和群组的边界像素(即，针对SCT所找到的像素组)。随后针对每个ROI，将圆Hough变换应用于ROI的外部边界像素，其也是含有ROI的群组的外部边界像素。根据用户确定的准则对用于特定ROI的圆进行分类，以找到描述那个ROI的边界的最小数目个圆。在大多数情况下，每个ROI将存在一个圆。可使用的可能准则包含但不限于：(i)选择包含ROI的外部边界像素的最大分数的圆；(ii)选择包含ROI的区域的最大分数的圆；(iii)拒绝包含来自不同群组的像素的圆；(iv)拒绝包含大量非群组像素的圆；(v)排斥在群组的内部中具有它们的圆周的巨大分数的圆。
根据本公开的某些方面，可成对地检查用于ROI的初始组圆，其中两个圆中的一者被拒绝以便支持另一个圆。此处可使用的可能准则包含但不限于：(i)如果相同或类似大小的两个圆的中心彼此紧密地接近，那么拒绝具有较小数目个投票的圆；或(ii)如果两个圆共同地具有多于它们投票的用户定义的分数，那么拒绝具有较小数目个投票的圆。举例来说，如果可能的Hough变换圆包含来自特定ROI的外部边界像素，那么将拒绝所述圆，除非其包含那个ROI的区域的至少某一用户定义的分数。在此情况下，最小所需分数可取决于ROI有多少边界像素与Hough变换圆相关联。
而且，在存在彼此紧密地接近的多个小滴的情况下，靠近两个或多于两个小滴但实际上不是所述小滴中的任一者的部分的像素的强度可具有相对于背景的高强度，且可被包含为群组的部分，且形成外部群组边界的部分。在反向分水线方法中，这可导致困难，这是因为包含在群组中的额外像素将造成外部边界的部分为非圆形。包含实际上不是小滴的部分的外部边界像素可引起作为小滴的较不准确的描述的最佳拟合圆。可通过使用圆Hough变换来减轻在具有高像素强度的两个小滴之间的区导致非圆形边界的问题，这是因为其排斥拟合中将形成非圆形边界的像素。
与ROI相关联的圆是ROI可为其部分的小滴的大小的估计。此信息可用于将ROI分组为小滴。举例来说，如果与同一群组中的两个ROI相关联的圆具有类似的半径且具有靠近在一起的中心，那么所述两个ROI将被视为同一小滴的部分。将使用用户定义的准则来决定圆的半径必须有多相似以及圆的中心必须有多靠近来使所述两个ROI组成为一个小滴。与中心必须有多靠近相关的准则可取决于两个圆的大小。
有可能的是，可将ROI指派给两个或多于两个小滴，或考虑指派给两个或多于两个小滴。在一些方面中，用于确定应将ROI指派给哪一小滴的可能准则包含但不限于：(i)计算到使用参数被视为小滴中的每一者的最佳拟合圆的ROI的特征像素的拟合统计的优度，且将ROI指派给其圆是到ROI的特征像素的最佳拟合的小滴；或(ii)将ROI指派给在区域上与其具有最大重叠的小滴。
在一些方面中，在将具有圆的所有ROI指派给小滴之后，检查不是任何圆的部分的任何剩余外部边界像素，以查看它们是否处于现有圆的边界的用户定义的距离内。如果是，那么那些外部边界像素包含在小滴的边界中。如果ROI的外部边界因噪声而失真以使得圆Hough变换找不到用于那个ROI的可接受圆，那么可出现仍处于小滴的边界上的未指派的外部边界像素。随后使每个小滴的外部边界像素拟合到圆以获得大小和位置。可接受或丢弃显著地重叠的小滴，这取决于所允许的此类重叠的量的用户定义的准则，且其可取决于乳剂的性质。取决于用户定义的准则，可接受或丢弃显现为在群组的内部中具有其边界的巨大分数的小滴。另外，如果用户愿意接受略微失真的小滴，那么可使用Hough变换来检测图像中的椭圆，且可将满足用户设置的准则(例如，具有小于用户选择的极限的纵横比)的那些椭圆接受为小滴。
此方法可包含额外修改。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例为不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。在此实例中，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
对上述组合式反向分水线与圆检测方法的另一可能修改可为：BT和SCT可不同。可使用小于SCT的BT以从背景像素组消除含有太模糊而无法识别的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
根据本公开，对上述组合式反向分水线与圆检测方法的其他修改是可能的。对此程序的可能修改可包含检查群组的边界像素，且不在任何拟合中包含显现为噪声的那些像素。可使用的准则的实例例如采用以下假定：不邻近于群组的内部像素的任何边界像素将不包含在边界到圆的任何拟合中。根据此假设，内部像素可为作为群组的成员但不是边界像素(即，不邻近于非群组像素)的像素。
另一可能修改是：准许BT和SCT不同。可使用小于SCT的BT以从背景像素组消除含有太模糊而无法特性化的对象的那些区域。这些区域可含有来自高于或低于被分析的样本的焦平面的小滴的不同焦平面的信号。此情形的典型实例在使用荧光显微术来使样本成像时出现。由于显微镜在z方向上的分辨率的限制，来自一个焦平面的荧光可渗透到其他焦平面的图像中。
在另一方面中，可由识别圆的不同特征提取方法替换圆Hough变换。在那种情况下，通过替代特征提取方法产生的信息将用于识别小滴。
在又一方面中，此方法可用于搜索图像中的非圆形对象。可由识别所需形状的对象的特征提取方法替换圆Hough变换。
占据率的确定。在一些方面中，在已识别小滴且确定它们的大小之后，使用荧光强度来确定所述小滴是否含有目标分子。
在一些方面中，目标分子的存在将引起来自小滴的荧光的增加。在那些情况下，可强加强度截止标准，其中其强度超过截止的小滴被视为被占据，且剩余者将被视为空白。在目标分子的存在会引起荧光的减小的系统中，其强度超过截止的小滴被视为空白，且其他者将被视为被占据。在以上两种情况下，与小滴截止比较较的强度可为：(i)小滴内的平均强度；(ii)小滴内的峰强度；或(iii)小滴内的像素的强度的任何用户选择的函数(例如，可使用中值强度或强度的百分位)。
在一些方面中，用于确定占据率的方法将使用每个小滴的两个荧光图像。在所述图像中的一者中，荧光的强度将适度地取决于小滴是否被占据。在另一图像中，荧光的强度将由于目标分子的存在而不改变或改变很小。来自两个图像的小滴的强度的函数(例如，比率)可用于决定小滴的占据率。使用比率或某一其他函数来代替来自单个图像的强度可校正可能的仪器假影。此外，对于较大的小滴，来自高于所成像的平面的样本中的焦平面的荧光可出现在图像中，从而造成那个小滴内的像素的所测量的强度增加。使用来自两个不同图像的小滴的强度将会允许用户避免这些问题。所分析的小滴的强度可为：(i)小滴内的平均强度；(ii)小滴内的峰强度；或(iii)小滴内的像素的强度的任何用户选择的函数(例如，可使用中值强度或强度的百分位)。在用户的自由裁量权下，强度可为被减去背景的强度。在一些方面中，从图像中的每个像素的强度减去用于识别群组的平均背景。
在一些方面中，在此阶段确定一组经校正背景像素。一种用于确定经校正组的方法是以在群组(其可包含在群组内部的孔中的像素)内部的一组像素开始。在用户的自由裁量权下，这些组像素可由一或多个像素扩大(即，放大)。未包含在这些组像素中的像素将形成所述一组经校正边界像素。
示范性分析系统和方法。如本文中所论述，本公开包含被配置成分析体积以及样本在乳剂系统中的多个小滴中的存在或不存在的检测系统。图2A示意性地说明示范性检测系统1000。所述检测系统可包括：计算装置1001，其被配置成由用户US操作；成像源1040，其被配置成由计算装置1001操作；以及多井板1050，其被配置成由成像平台或源1040成像且其可含有待成像和分析的小滴系统或乳剂系统1055。
计算装置1001可经编程以实施本文中所描述的方法中的一或多者。举例来说，计算装置1001可包括个人计算机、工作站，或服务器。计算装置1001包含处理器、计算机处理器、中央处理单元，或CPU 1005，其可为单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。
计算装置1001还可包含存储器1010(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器、硬盘，或类似者)。存储器1010可存储文件，例如由成像源1040取得的计算机可读图像文件。计算装置1001在一些情况下可包含一或多个额外数据存储单元，其在计算装置1001外部，例如定位在通过一或多个网络而与计算装置1001通信的远程服务器上。
计算装置1001可进一步包括输入/输出或I/O系统1015，其可由计算装置1001使用以与以下各者中的一或多者通信：用户US、一或多个其他计算装置或系统、一或多个网络(例如，局域网(LAN)、外联网、内联网、因特网、电信网络、数据网络、蜂窝式数据网络，或类似者)，或一或多个外围装置，包含成像源1040、外部存储器、各种适配器等等。I/O系统1015可包括显示器1020、用户接口1025，以及通信接口1030。举例来说，显示器1020可包括触摸屏显示器，通过所述触摸屏显示器将用户接口1025投影到用户US。通信接口1030可包括网络适配器以用于将计算装置1001连接到一或多个网络。用户US例如可通过一或多个网络远程地操作计算装置1001。举例来说，计算装置1001可包括基于云的计算系统，例如操作可在用户US本地的成像源1040的分布式计算系统。计算装置1001可通过一或多个网络或通过直接通信而与成像源1040通信。
本文中所描述的方法可由机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)实施，所述机器可执行代码存储在计算装置1001的电子存储位置上，例如存储在存储器1010或其他电子存储单元上。在使用期间，所述代码可由处理器1005执行。在一些情况下，所述代码可从存储单元进行检索且存储在存储器1010上以准备好由处理器1005存取。在一些情形中，可排除电子存储单元，且机器可执行指令存储在存储器1010中。替代地，可在远程计算机系统上执行所述代码。所执行的代码可操作成像源1040以根据本文中所描述的方法中的任一者而对多井板1050进行成像和分析。所述代码可由计算装置1001自动地执行，或可根据由例如用户US等操作者提供的指令而执行。
所述代码可被预编译和配置成用于与具有适应于执行所述代码的处理器的机器一起使用，或可在运行时间期间被编译。可以编程语言供应所述代码，可将所述编程语言选择成使所述代码能够以预编译或依编译的方式而执行。
可在编程中体现本文中所提供的系统和方法的各方面，例如计算装置1001。技术的各种方面可通常以机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式被视为“产品”或“制品”，所述机器可执行代码和/或关联数据被携载于一种类型的机器可读媒体上或体现于其中。机器可执行代码可存储在电子存储单元上，电子存储单元例如为存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘。“存储”类型媒体可包含计算机、处理器或类似者的任何或所有有形存储器，或其关联模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器和类似者，其可在任何时间提供非暂时性存储以用于软件编程。软件的全部或部分可有时通过因特网或各种其他电信网络进行通信。举例来说，此类通信可使能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元件的另一类型的媒体包含例如横越本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络且经由各种空中链路而使用的光学、电和电磁波。携载此类波的物理元件(例如，有线或无线链路、光学链路或类似者)也可被视为承载软件的媒体。如本文中所使用，除非限定于非暂时性有形“存储”媒体，否则例如计算机或机器“可读媒体”等术语是指参与将指令提供给处理器以供执行的任何媒体。
因此，机器可读媒体(例如计算机可执行代码)可采取许多形式，包含但不限于有形存储媒体、载波媒体或物理传输媒体。非易失性存储媒体包含(例如)光盘或磁盘，例如任何计算机或类似者中的例如可用于实施数据库等等的存储装置中的任一者(图式中示出)。易失性存储媒体包含动态存储器，例如此类计算机平台的主存储器。有形传输媒体包含：同轴电缆；铜线和光纤，包含电线，其包括计算机系统内的总线。载波传输媒体可采取电信号或电磁信号或声波或光波(例如，在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间所产生的声波或光波)的形式。常见形式的计算机可读媒体因此包含(例如)：软盘、柔性磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁性媒体、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学媒体，穿孔卡纸带、具有孔图案的任何其他物理存储媒体、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带、输送数据或指令的载波，输送此类载波的电缆或链路，或可供计算机读取编程代码和/或数据的任何其他媒体。在将一或多个指令的一或多个序列携载到处理器以供执行的过程中可涉及这些形式的计算机可读媒体中的许多者。
可在用户US或其他操作者的电子装置的用户接口或UI 1025或其他用户接口(其可包含图形用户接口(GUI))上向用户显示本公开的方法的结果。可在用户的电子装置(例如，平板计算机、智能电话、可穿戴计算机，或类似者)的显示器上提供例如GUI等其他UI。举例来说，所述显示器可为电容性或电阻性触摸显示器。此类显示器可与本公开的其他系统和方法一起使用。
成像源1040可包括本文中所描述的成像装置和源中的任一者。举例来说，成像源1040可包括光学成像源。成像源1040可被配置成执行以下各者中的一或多者：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
多井板1050可包括本领域中所知的任何多井板。可通过本文中所描述的方法中的任一者产生小滴系统或乳剂系统1055。
示范性检测系统1000可由用户US操作来实施本文中所描述的方法中的任一者。举例来说，检测系统1000可由用户US操作来实施图2B中示意性地所说明的示范性检测方法1100或图2C中示意性地所说明的示范性检测方法100。图2B的检测方法1100可包括如下各种步骤。在步骤1110中，可产生小滴或乳剂系统。可以如本文中所描述的许多方式产生小滴或乳剂系统，例如，通过摇动、涡旋，或其他搅拌。在步骤1120中，可以如本文中所描述的许多方式在多井板上提供小滴或乳剂系统。在步骤1130中，可以如本文中所描述的许多方式产生小滴或乳剂系统的图像栈。在步骤1140中，可以如本文中所描述的许多方式分析图像栈以检测或辨识小滴。举例来说，可使用以下各者中的一或多者来检测或辨识小滴：行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、圆检测方法、组合式反向分水线与圆检测方法，或其组合。在步骤1150中，可以如本文中所描述的许多方式在各种小滴中检测样本的存在(即，可确定占据率)。在步骤1170中，可以如本文中所描述的许多方式(例如，使用本文中所描述的统计方法)基于样本在各种小滴中的所检测的存在以及各种小滴的大小分布而确定样本的浓度。
图2C的检测方法100可包括如下各种步骤。在步骤105中，可获得样本。可以本文中所描述的方式中的任一者获得样本。在步骤110中，从样本制备乳剂。可以本文中所描述的方式中的任一者制备乳剂。在步骤115中，可扩增目标。可以本文中所描述的方式中的任一者扩增目标。在步骤120中，将乳剂放置在井或腔室中。在一些实施例中，步骤110和120可同时地进行，且可在井或腔室中制备乳剂。在步骤125中，可在第一水平位置和第一垂直位置处使乳剂成像。在步骤130中，可在相同的第一水平位置和不同于第一垂直位置的第二垂直位置处使乳剂成像。在步骤135中，可针对2+n个垂直位置重复成像步骤。在步骤140中，可例如通过执行先前步骤125、130和135而获取多个图像。在步骤145中，针对小滴大小来分析所获取的图像。可以本文中所描述的方式中的任一者分析所获取的图像。举例来说，可通过以下各者中的一或多者分析所获取的图像：在步骤145a中使用行扫描方法；在步骤145b中使用简单边界方法；在步骤145c中使用反向分水线方法；在步骤145d中使用圆检测方法；在步骤145e中使用组合式反向分水线与圆检测方法；或使用前述各者中的两者或多于两者的组合。小滴可出现在Z栈的多于一个图像中。在此情况下，可通过上文所描述的方法对那些图像中的信息进行组合来确定那个小滴的直径。在步骤150中，可针对目标在小滴中的存在来分析所获取的图像。可以本文中所描述的方式中的任一者执行针对目标的存在的分析。步骤150可例如包括检测和分析荧光的步骤150a。步骤150可在步骤145中针对小滴大小来分析图像之后进行，或可作为步骤145的并行步骤而进行。步骤150可包含检测和分析荧光的步骤150a。在步骤155中，可计算样本中的目标浓度。可以本文中所描述的方式中的任一者计算样本中的目标浓度。举例来说，所述计算可基于来自步骤145的针对小滴大小的图像分析以及来自步骤150的针对小滴中的目标存在的图像分析。
尽管以上步骤示出根据许多方面和实施例的用于目标检测的方法1100和100，但本领域的普通技术人员将辨识基于本文中所描述的教示的许多变化。可以不同次序完成所述步骤。可添加或删除多个步骤。所述步骤中的一些步骤可包括子步骤。每当有益时就可重复所述步骤中的许多步骤。
可使用如此处所描述的处理元件或电路(例如本文中所描述的系统1000的计算装置1001的处理器或CPU 1005中的一或多者)执行方法1100和100的步骤或子步骤中的一或多者。用于CPU 1005的指令可存储在系统1000的存储器1010上。这些指令在由CPU 1005执行时可执行方法1100和100的步骤或子步骤中的一或多者。
在各种方面中，本公开提供用于检测或辨识小滴的许多方法，例如本文中所描述的行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、圆检测方法、组合式反向分水线与圆检测方法，或其组合。在一些方面中，检测或辨识小滴的方法可独立于用于确定样本浓度的方法。也就是说，检测或辨识小滴的方法可用于除了执行本文中所描述的数字检定之外的许多目的。
图2D、图2E、图2F、图2G和图2H分别示意性地说明示范性小滴辨识方法1200、1300、1400、1500和1600。举例来说，步骤1140可应用方法1200、1300、1400、1500和1600中的一或多者来分析图像栈以检测或辨识小滴。
如图2D所示，小滴辨识方法1200可类似于或包括上文所描述的行扫描方法，且可包括如下各种步骤。在步骤1210中，可设置用于个别图像的适当阈值水平。举例来说，适当阈值水平可为像素强度阈值。在步骤1220中，可在图像内获得行扫描。在步骤1230中，可针对像素组分析行扫描。这些像素组可包括(例如)在所设置的阈值水平处或之外(例如，高于或低于所设置的阈值水平)且在邻近行扫描之间邻接的行扫描的片段。在步骤1240中，可从像素组识别小滴。举例来说，可将像素组的行扫描的最长片段视为小滴的直径，且可从所述直径计算小滴的大小。虽然本文中大体上论述行扫描，但还预期产生扫描的其他方法。这些方法可包含共聚焦扫描、行照明和收集、Nipkow盘型扫描，或类似者。
如图2E所示，小滴辨识方法1300可类似于或可包括上文所描述的简单边界方法，且可包括如下各种步骤。在步骤1310中，针对个别图像设置适当阈值水平。在步骤1320中，可将在阈值水平处或之外(例如，高于或低于阈值水平)的区域识别为像素组。在步骤1330中，可测量像素组的纵横比。在步骤1340中，将纵横比在阈值纵横比之外(例如，通常低于但替代地可高于阈值纵横比)的像素组识别为单个小滴。阈值纵横比可例如为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在步骤1350中，可编译每个图像的小滴列表。
如图2F所示，小滴辨识方法1400可类似于或可包括上文所描述的反向分水线方法，且可包括如下各种步骤。在步骤1405中，可产生基于个别图像的像素强度的3D拓扑地图。在步骤1410中，可使用“水”(即，水或其他流体的计算机化合成表示)将拓扑地图填充到高于拓扑地图的“峰”。可以如上文中所描述的许多方式使用“水”填充拓扑地图。举例来说，可确定每个图像的背景内的信号的标准偏差，将其乘以信噪比，且随后加到背景像素的平均强度。在步骤1415中，可降低“水位”。可以上文中所描述的许多方式降低拓扑地图的“水位”。举例来说，可建立和降低最大像素强度截止阈值，直到其达到背景像素强度阈值。在步骤1420中，可随着降低“水位”而跟踪“突出部”或“岛”(即，最高强度像素)。在步骤1425中，可在此类“突出部”或“岛”满足用户定义的准则(例如，最小所需区域)的情况下将它们识别为所关注区。可以如上文中所描述的许多方式定义用户定义的准则。在步骤1430中，可随着降低“水位”而合并所关注区，这取决于是否满足某些准则(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在确定是否合并两个或多于两个所关注区之前使图像平滑。在步骤1435中，当满足阈值时，“水位”的降低可结束。阈值可包括本文中所描述的背景强度阈值或截止，且可以如上文中所描述的许多方式予以确定。
在步骤1440中，可将连接像素的群组识别为像素群组。可以如上文中所描述的许多方式进行此类识别。在步骤1445中，可例如通过应用如上文中所描述的孔阈值而将像素群组内的间隙识别为孔或噪声。举例来说，孔可包括小滴之间的间隙。在步骤1450中，可随着降低“水位”或在“水位”的降低结束之后合并所关注区，这取决于是否满足某些准则(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在确定是否合并两个或多于两个所关注区之前使图像平滑。
在步骤1455中，可将仅包括单个所关注区的像素群组识别为小滴。在步骤1460中，可使圆拟合到单个所关注区的边界。可分析圆以获得小滴直径，如上文中所描述。可根据上文中所描述的方法识别具有多个所关注区的像素群组以识别最可能的小滴。在步骤1465中，可使单个像素群组内的所关注区与圆拟合。在步骤1470中，可将最佳拟合圆识别为小滴。可分析最佳拟合圆以获得小滴直径，如上文中所描述。
如图2G所示，小滴辨识方法1500可类似于或可包括上文所描述的圆检测方法，且可包括如下各种步骤。在步骤1510中，可将阈值应用于个别图像。可如在上文中所描述的反向分水线方法中一样确定阈值。在步骤1520中，可将连接像素的群组识别为像素群组。可如在上文中所描述的反向分水线方法中一样进行此类识别。在步骤1530中，可例如通过应用如上文中所描述的孔阈值而将像素群组内的间隙识别为孔或噪声。在步骤1540中，可确定像素群组的外部边界。在步骤1550中，将圆Hough变换应用于像素群组的边界。在步骤1560中，可消除未满足某些准则的圆。所述准则可为上文中所描述的准则中的任一者。在步骤1570中，可接受剩余圆中的一或多者。可如上文中所描述而应用准则来确定是否接受剩余圆。在步骤1580中，使用被接受的剩余圆来找到小滴的最佳边界像素。在步骤1590中，使边界像素拟合到圆来获得对应于小滴的最佳拟合圆的集合。可使用这些最佳拟合圆来确定小滴的直径和大小。
如图2H所示，小滴辨识方法1600可类似于或可包括上文所描述的组合式反向分水线与圆检测方法，且可包括如下各种步骤。步骤1605、1610、1615、1620、1625、1630、1635、1640和1645可分别类似于上文所描述的反向分水线方法1400的步骤1405、1410、1415、1420、1425、1430、1435、1440和1445。在步骤1605中，可产生基于个别图像的像素强度的3D拓扑地图。在步骤1610中，使用“水”(即，水或其他流体的计算机化合成表示)将拓扑地图填充到高于拓扑地图的“峰”。可以如上文中所描述的许多方式使用“水”填充拓扑地图。举例来说，可确定每个图像的背景内的信号的标准偏差，将其乘以信噪比，且随后加到背景像素的平均强度。在步骤1615中，可降低“水位”。可以上文中所描述的许多方式降低拓扑地图的“水位”。举例来说，可建立和降低最大像素强度截止阈值，直到其达到背景像素强度阈值。在步骤1620中，可随着降低“水位”而跟踪“突出部”或“岛”(即，最高强度像素)。在步骤1625中，可在此类“突出部”或“岛”满足用户定义的准则(例如，最小所需区域)的情况下将它们识别为所关注区。可以如上文中所描述的许多方式定义用户定义的准则。在步骤1630中，可随着降低“水位”而合并所关注区，这取决于是否满足某些准则(例如，如上文中所描述)。如上文中所描述，可在确定是否合并两个或多于两个所关注区之前使图像平滑。在步骤1635中，当满足阈值时，“水位”的降低可结束。阈值可包括如本文中所描述的背景强度阈值或截止，且可以如上文中所描述的许多方式予以确定。在步骤1640中，可将连接像素的群组识别为像素群组。可以如上文中所描述的许多方式进行此类识别。在步骤1645中，可例如通过应用如上文中所描述的孔阈值而将所关注区内的间隙识别为孔或噪声。在步骤1650中，将圆Hough变换应用于每个所关注区的边界。
步骤1655、1660、1670和1675可分别类似于以上步骤1560、1570、1580和1590。在步骤1655中，可消除未满足某些准则的圆。所述准则可为上文中所描述的准则中的任一者。在步骤1660中，可接受剩余圆。在步骤1665中，可使用被接受的剩余圆来找到小滴的最佳边界像素。在步骤1670中，使边界像素拟合到最佳拟合圆。可使用这些最佳拟合圆来确定小滴的直径和大小。
尽管以上步骤示出根据本公开的各种方面的用于检测小滴和/或分析小滴或乳剂系统的方法1100、1200、1300、1400、1500和1600，但本领域的普通技术人员将辨识基于本文中所描述的教示的许多变化。可以不同次序完成所述步骤。可添加或删除多个步骤。所述步骤中的一些步骤可包括子步骤。每当有益时就可重复所述步骤中的许多步骤。
可使用如本文中所描述的计算系统1000执行方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的步骤中的一或多者。替代地或组合地，可使用电路或逻辑电路(例如，用于现场可编程门阵列的可编程阵列逻辑、专用集成电路，或其他可编程或专用逻辑电路)执行方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的一或多个步骤。所述电路可经编程以提供方法1100、1200、1300、1400、1500和1600的步骤中的一或多者，且程序可包括存储在非暂时性计算机可读存储器或存储媒体上的程序指令，或逻辑电路的经编程步骤。
用于执行数字检定的组合物和套件
本公开提供用于执行如本文中所描述的数字检定的组合物和套件。在某些方面中，提供用于执行数字PCR的套件和检定。
在各种方面中，本公开提供用于执行数字检定的组合物和套件，其包括：第一流体；第二流体，其中第一流体和第二流体彼此不混溶且能够在被搅拌时形成乳剂；表面活性剂；以及扩增试剂。
在一些方面中，组合物进一步包括样本。在某些方面中，样本包括核苷酸。在另外方面中，组合物进一步包括可检测剂，其中可检测剂能够标记样本。在一些方面中，使用可检测剂标记样本。在另外方面中，组合物进一步包括能够结合核酸样本的可检测剂。
在各种方面中，组合物包括扩增试剂，扩增试剂是选自聚合酶链反应(PCR)试剂、滚环扩增(RCA)试剂、基于核酸序列的扩增(NASBA)试剂、环介导扩增(LAMP)试剂，或其组合。在一些方面中，扩增试剂是PCR试剂。在某些方面中，PCR试剂是选自热稳定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探测剂或其组合。
在一些方面中，组合物进一步包括第三流体，其中第三流体不混溶于第二流体中。在某些方面中，组合物能够形成双面乳剂。
在各种方面中，第一流体是含水的。在另外方面中，第一流体包括扩增试剂。在一些方面中，第二流体是油。在另外方面中，第二流体是油，且第二流体与第一流体和第三流体不混溶。在又另外方面中，第一流体不同于第三流体。在其他方面中，第三流体是油，且第三流体与第一流体和第二流体不混溶。
在一些方面中，组合物进一步包括流体界面改性元素。在某些方面中，流体界面改性元素是表面活性剂。在另外方面中，流体界面改性元素是选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
在某些方面中，组合物进一步包括能够将不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体的固化或胶凝剂。
在一些方面中，本公开提供用于执行数字检定的组合物和套件，组合物或套件包括：第一流体；第二流体，其中第一流体和第二流体彼此不混溶且能够在被物理地搅拌时形成乳剂；表面活性剂；以及PCR试剂。在另外方面中，PCR试剂是选自热稳定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探测剂或其组合。在其他方面中，可检测剂能够结合核酸样本。
在某些方面中，本公开提供用于执行PCR的组合物和套件，其包括：第一流体和第二流体，其中第一流体和第二流体彼此不混溶；核酸引物；脱氧核苷酸；适合于延伸核酸引物的酶；荧光标记；以及可检测剂，其能够结合扩增之后的核酸样本。
在另外方面中，组合物和套件可进一步包括与PCR扩增兼容的合适缓冲剂和稳定剂。
在提供值范围的情况下，应理解，在本文中所提供的公开内容内涵盖那个范围的上限与下限之间的直至下限的单位的十分之一的每个中介值(除非上下文另有清楚指示)，以及在所述规定范围内的任何其他规定或中介值。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围内，且也涵盖在本公开内，受制于规定范围内的任何特定排除的极限。在规定范围包含所述极限中的一者或两者的情况下，排除那些所包含的极限中的任一者或两者的范围也包含在本文中所提供的公开内容中。
本领域的技术人员鉴于本文中的公开内容将显而易见，本公开的设备、装置、系统及其组件中的任一者的特定尺寸可容易地取决于预期应用而变化。另外，应理解，本文中所描述的实例和方面是仅出于说明性目的，且可向本领域的技术人员建议按照所述实例和方面而进行的各种修改或改变，且其包含在本申请的精神和视界以及所附权利要求书的范围内。本文中所描述的方面的众多不同组合是可能的，且此类组合被视为本公开的部分。另外，结合本文中的任何一个方面所论述的所有特征可容易地适应于用于本文中的其他方面中。在不同方面中使用类似特征的不同术语或参考数字未必暗示除了明确陈述的差异之外的差异。因此，本公开意欲仅通过参考所附权利要求书予以描述，且不限于本文中所公开的方面。
除非另有指定，否则可以任何次序执行目前描述的方法和过程。举例来说，描述步骤(a)、(b)和(c)的方法可首先以步骤(a)执行，接着以步骤(b)执行，且随后以步骤(c)执行。或者，可以不同次序执行所述方法，例如首先以步骤(b)执行，接着以步骤(c)执行，且随后以步骤(a)执行。此外，可同时地或单独地执行那些步骤，除非另有特定指定。
虽然本文中已示出和描述本公开的优选方面，但应理解，本公开不限于下文所描述的公开内容的特定方面，这是因为可作出特定方面的变化且其仍属于所附权利要求书的范围内。还应理解，所采用的术语是出于描述本公开的特定方面的目的，且不意欲是限制性的。代替地，本公开的范围是由所附权利要求书确立。在本说明书和所附权利要求书中，单数形式“一”和“所述”包含复数参考，除非上下文另有清楚规定。
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请是按照以下程度以引用的方式并入本文中：如同每个个别公布、专利或专利申请都被特定地且个别地指示为以引用的方式并入。
实例
本领域的技术人员鉴于本文中的公开内容将显而易见，本公开的设备、装置、系统及其组件中的任一者的特定尺寸可容易地取决于预期应用而变化。另外，应理解，本文中所描述的实例和方面是仅出于说明性目的，且可向本领域的技术人员建议按照所述实例和方面而进行的各种修改或改变，且其包含在本申请的精神和视界以及所附权利要求书的范围内。本文中所描述的方面的众多不同组合是可能的，且此类组合被视为本公开的部分。另外，结合本文中的任何一个方面所论述的所有特征可容易地适应于用于本文中的其他方面中。在不同方面中使用类似特征的不同术语或参考数字未必暗示除了明确陈述的差异之外的差异。因此，本公开意欲仅通过参考所附权利要求书予以描述，且不限于本文中所公开的方面。
实例1
用于在管中产生可变体积的小滴的方法
此实例提供根据本公开的一个方面的用于产生可变体积的多分散小滴的示范性方法。在此实例中，使用PCR管，然而，根据本公开，可使用任何合适的器皿。
图3描绘通过使个别管涡旋而形成乳剂系统。在步骤4A中，将含有反应混合物的水相移液到0.2ml PCR管中，所述PCR管被预填充有适当的油-表面活性剂混合物。油相由73％的Tegosoft DEC、20％的轻矿物油和7％的ABIL WE 09表面活性剂组成，其被新近混合，且在使用之前均衡至少30分钟。与此混合物一起形成的乳剂在标准乳剂PCR期间示出优良的热稳定性。在步骤4B中，在将水相移液到油混合物之后，通过以大约3000rpm涡旋大约30秒而形成可变大小的小滴。通过将小搅拌棒添加到混合物来进一步增强乳化，所述小搅拌棒促进了涡旋期间水相分裂为较小的小滴。表面活性剂在油中的存在稳定了乳剂，这减小了混合物中小滴融合的频率。
将含有水相和油相两者的系统添加到含有小不锈钢珠的小收集微型管。随后在15Hz到17Hz下摇动所述管20秒以产生乳剂。在步骤4C中，随后将乳剂转移到0.2mL PCR管中，且在Bio-Rad C1000热循环仪中在95℃(热启动)下实行3分钟且在95℃下实行30秒的50个循环、在54℃下实行30秒的50个循环且在72℃下实行30秒的50个循环的PCR。
实例2
用于在多井板中产生可变体积的小滴的方法
此实例提供根据本公开的一个方面的用于产生可变体积的多分散小滴且随后进行改性和分析的方法。
图4描绘用于小滴乳剂PCR的经优化的高通量过程。在多通道移液管将油和含水PCR试剂加载到多井板上之后，在3000rpm下将整个多井板涡旋30秒以诱发乳化。随后将多井板装配有热循环仪适配器，且混合物在95℃(热启动)下经历3分钟且在95℃下经历30秒的50个循环、在54℃下经历30秒的50个循环且在72℃下经历30秒的50个循环的PCR扩增。随后从热循环仪移除多壁板且使用荧光显微镜来使其成像，而不需要另外样本转移步骤。在此实例中，在乳化之后的任何小滴不稳定性(例如，融合)将独立于机械处置。
实例3
最佳拟合圆的确定
此实例提供用于确定用于多分散小滴系统中的小滴的最佳拟合圆的方法。在此方面中，使用现有优化方法而使被假定为小滴的一些或整个边界的一组像素拟合到圆。在此方面中，使用如在MATLAB中所实施的Nelder-Mead算法。所述算法最小化如在以下方程式(1)中所界定的拟合误差：
在此方程式中，Xtrial和Ytrial对应于用于优化程序中的当前步骤的圆的中心的试验位置。Rtrial是用于优化程序中的当前步骤的圆的试验半径。在一组外部像素中存在与Xp拟合的Np个像素，且Yp是所述组中的第p个像素的位置。因此，平方根正负号内的量是从试验中心到第p个像素的距离，从所述距离减去试验半径而获得误差。对所述误差进行平方、遍及所述组中的所有像素进行求和，且随后除以试验半径的平方以获得拟合误差。
作为优化的部分，对在群组内部的也在当前试验圆内部的像素的数目进行计数。如果在圆内部的像素的数目(NC)超过既在圆内部又在群组内部的像素的数目(NC，G)，那么通过将下者(如方程式(2)中所界定)加到拟合误差来处罚当前试验位置和半径：
(NC-NC，G)2 (2)
来自方程式(2)的量的相加会抑制所述优化将太大且显著地延伸到群组之外的圆选择为最佳拟合圆，当仅拟合小滴的边界的分数且噪声造成那个分数展现不表示小滴的曲率时，可出现所述圆。在一些情况下，所述方法使用每个像素的拟合误差来作为评估到小滴的拟合的质量的部分。拟合中的像素的数目是Np，且在以下方程式(e)中界定每个像素的拟合误差：
在本公开的另一方面中，在评估到小滴的拟合的质量时使用均方误差。这在以下方程式(4)中予以界定：
实例4、5和6各自参考圆到外部边界像素或特征像素的拟合，其涉及此实例中所描述的方法。
实例4
用于识别小滴的反向分水线方法
此实例描述根据本公开的一方面的用于执行反向分水线方法的示范性过程。
根据此方面，通过假设40％的图像是背景来计算图像的初始背景截止。对于此初始背景截止，20％(等于40％除以2)是对应于背景像素强度的中值的图像强度的估计百分位。通过假设估计背景标准偏差是图像的20％百分位与图像的1％百分位之间的差的一半来计算估计背景标准偏差。背景截止的初始估计于是为估计中值加上估计标准偏差的两倍。针对下一步骤选择具有小于背景截止的初始估计的强度的像素。计算选定像素的强度的平均值和标准偏差，且确定具有小于所述平均值的强度的图像像素的百分比，且发现是22％。将那个百分比与20％进行比较，20％是对应于背景的中值的图像强度的估计百分位的初始估计。这些值被判断为良好地一致，且选定像素的平均值和标准偏差被接受为图像中的背景的平均值和标准偏差以用于计算SCT和BT。在那些值尚未良好地一致的情况下，随后将通过将22％用作对应于背景像素强度的中值的图像强度的估计百分位且重复在此段落开头开始的程序来计算新的初始背景截止。
随后通过使先前所计算的背景的标准偏差乘以信噪比且将结果加到先前所计算的平均背景的平均强度来确定图像的SCT。此处，将信噪比选择为3.2，然而，可由用户取决于图像中的噪声的量而调整此值。
随后选择等于图像的最大像素强度的截止阈值。在30步内降低此截止阈值，直到其达到SCT。在此情况下，所述步骤是以904.0、872.0、841.2、811.5、782.8、755.1、728.4、702.7、677.8、653.8、630.7、608.4、586.9、566.2、546.1、526.8、508.2、490.2、472.9、456.2、440.1、424.5、409.5、394.5、379.5、364.5、349.5、334.5、319.5和304.5而间隔。第一值等于图像中的最大像素强度，且最后值等于图像的SCT。创建经平滑的图像的副本以供在稍后步骤中使用。在此实例中，通过MATLAB的conv2()函数来执行所述平滑，所述函数使图像与被界定(使用MATLAB的记号法)为‘[0.05，0.10，0.05；0.10，0.40，0.10；0.05，0.10，0.05]’的平滑结构卷积。
在每个步骤处，使用成像分析软件来找到图像中的高于当前步骤的截止阈值的多组像素(在下文中被简称为像素组)。这些像素组可包括从“水位”起的“突出部”或“岛”。在此实例中，要求像素为4连接以被视为同一像素组的部分。如果此类像素组的区域等于或超过用户定义的准则(即，在此情况下是9)，那么将其标记为所关注区(ROI)。在此情况下，在确定所述组的区域是否具有足够大小之前，使用MATLAB例程imclose()来闭合图像，其中通过MATLAB表达strel(‘disk’，1)来界定结构化元素。一旦ROI出现在图像的特定位置中，就随着减小截止阈值而跟踪其区域。还跟踪每个ROI内的最大强度像素的位置以及像素的值。
随着降低截止阈值，有可能使两个或多于两个ROI合并。高于特定截止阈值的像素组可包含对于较大截止阈值是单独的两个或多于两个ROI。这可由于以下任一者而发生：(i)不同的ROI表示不同的小滴，所述小滴靠近在一起以使得它们之间的边界区具有大于当前截止阈值的像素强度；或(ii)样本中的噪声的振幅足够大以使得单个小滴内的两个或多于两个区展现局部极大值。这些极大值对于算法可显现为较大截止阈值处的单独ROI。
使用一组用户定义的准则来确定其区域包含在当前步骤的同一像素组内的不同ROI应被合并且此后被看作一个ROI，还是不被合并且作为单独ROI被跟踪。可取决于以下各者而作出此确定：(i)不同ROI的最大强度像素之间的距离，以及(ii)不同ROI的最大强度像素的值，且。还可应用其他用户定义的准则来作出此确定。
在此实例中，对于准则(i)，如果图像的平滑副本的最大强度像素中的距离小于5个像素，那么两个ROI被合并且此后被看作单个ROI。在此实例中，对于准则(ii)，如果最大强度像素具有在用于识别当前像素组的截止的背景标准偏差的0.75倍内的强度，那么两个ROI被合并且此后被看作单个ROI。推理是：如果两个先前单独的ROI对于当前截止值出现在同一像素组中，那么像素组中的位于两个最大强度像素之间的像素必须具有高于当前截止的强度。因此，如果两个ROI中的每一者中的最大强度两者都接近当前截止，那么像素组中的位于两个极大值之间的像素必定已具有接近极大值的强度。因此，两个ROI被组合且被指派给同一小滴。
在最后步骤(即，已使用SCT的点)之后，像素组被称作像素群组。在其区域包含在同一像素群组内的不同ROI未被合并的情况下，那个像素群组的未指派像素被指派给ROI。具体来说，按强度对像素群组内的未指派像素的列表进行分类，且将紧接地邻近于ROI中的一者且仅一者的具有最大强度的像素指派给那个ROI。重复此过程，直到剩余的仅未指派像素是紧接地邻近于两个或多于两个不同ROI的像素。那些像素保持未指派。
将反向分水线方法应用于图1中的图像，其为使用共聚焦荧光显微术获得的多分散小滴乳剂系统的灰度图像。如图5A所示，将图像划分为多个群组，所述多个群组是由其强度低于背景阈值的像素分离。所述群组中的一些仅含有单个ROI，且一些含有两个或多于两个ROI。图5A所描绘的边界像素是属于邻近于非群组像素的群组的那些像素。
分析所得的像素群组，且将其内的ROI指派给小滴且经受以下过程步骤，所述过程步骤未必需要以下文所描述的次序发生：
步骤1。如果群组仅含有单个ROI，那么将其视为单个小滴，且使其外部边界像素拟合到圆以获得小滴直径。
步骤2。对于尚未指派给小滴的ROI，如在实例3中所描述而获得到那个ROI的外部边界像素的最佳拟合圆。随后检查每个未指派ROI。如果在圆内部的ROI的像素的数目是圆的区域的至少30％，那么执行拟合，从而将被检查的ROI的外部边界像素与尚未指派给小滴的任何邻近ROI的外部边界像素进行组合。当一个ROI的内部边界由零个或一个像素而与另一ROI的内部边界分离时，两个ROI被视为“邻近”。在图5A中，被看似为二重线的东西分离的ROI被视为邻近。所述二重线表示彼此靠近而安放的两个内部边界。将外部边界像素的组合组拟合到圆，且评估结果来决定两个ROI是否应被组合且被视为单个小滴的部分。用于组合两个ROI的准则是：(i)两个ROI的组合的每个像素的拟合误差小于0.12，或者每个像素的拟合误差小于被检查的原始ROI的拟合误差的1.5倍；以及(ii)一起在最佳拟合圆内部的两个ROI的区域是ROI的区域的至少85％的区域。如果两个ROI被组合，那么它们此后被标示为小滴且被看作单个单元。所述小滴的外部边界像素于是为指派给所述小滴的ROI的一组外部边界像素。对所有邻近的ROI重复此过程。
步骤3。如果未指派ROI不具有未指派的邻近ROI，那么所述方法将那个ROI的外部边界拟合到圆。如果每个像素的拟合误差小于0.12且最佳拟合像素内部的ROI的区域是圆的区域的至少60％，那么将所述ROI接受为小滴。
步骤4。此方法随后检查多对小滴来确定它们是否事实上为同一小滴的多个部分。在此步骤处，要求被检查的小滴的最佳拟合圆在大小上彼此类似。所述方法比较已经被找到的小滴的中心之间的距离。有可能的是，在此阶段被识别为小滴的两个区实际上是同一小滴的多个部分。计算一对小滴的最佳拟合中心之间的距离，且如果其小于小滴中的每一者的最佳拟合半径的20％，那么测试所述对以查看它们是否实际上为同一小滴的多个部分。组合两个小滴的外部边界像素，且将像素的组合组拟合到圆。对所考虑的两个小滴的拟合误差进行求和且除以外部边界像素的组合组中的像素的数目。组合组的每个像素的拟合误差必须小于此量的1.5倍且还小于0.12。在那种情况下，两个小滴被组合且此后被视为一个小滴。针对所有对小滴重复此过程。
步骤5。接下来，检查每个像素群组以确定其是否具有小滴以及未指派ROI两者。如果是，那么对于每个小滴，检查未指派ROI，且确定给定ROI的区域的至少85％是否位于与所述小滴相关联的最佳拟合圆内部。如果是，那么所述未指派ROI是添加到小滴的候选者。接下来，通过将小滴的外部像素与ROI的外部边界像素进行组合而形成组合的外部边界像素组。随后将所述组合组拟合到圆。存在需要在得出应将ROI指派给小滴的结论之前满足的若干准则，这些准则包含：(i)组合组的最佳拟合圆的位置与小滴的最佳拟合圆的位置之间的距离必须小于3个像素(这取决于若干考虑因素，主要是图像中的像素的大小)；(ii)组合组的最佳拟合圆的位置与ROI的最佳拟合圆的位置之间的距离必须小于ROI的最佳拟合圆的半径的20％；(iii)组合组的每个像素的拟合误差必须小于ROI的每个像素的拟合误差的两倍；(iv)组合组的每个像素的拟合误差必须小于0.12；以及(v)组合拟合的均方误差必须小于到ROI的最佳拟合圆的均方误差的1.5倍。如果满足所有这些准则，那么将ROI指派给小滴。
步骤6。在此步骤中，检查多对小滴以确定它们是否为同一小滴的多个部分。在一些方面中，构成所述多对的小滴可具有不同的直径。计算一对小滴的最佳拟合中心之间的距离，且如果其小于小滴中的每一者的最佳拟合半径的50％，那么计算两个小滴区域的重叠量。如果每个最佳拟合圆的多于60％的区域位于另一最佳拟合圆内部，那么将两个小滴的外部边界像素进行组合，且将像素的组合组拟合到圆。拟合必须满足的准则列表比在前一步骤中的长。将乘数Merr界定为1.5。随后，对所考虑的两个小滴的拟合误差进行求和且除以外部边界像素的组合组中的像素的数目。组合组的每个像素的拟合误差必须小于此量的Merr倍且还小于0.12。接下来，计算组合拟合的均方误差MSEcombined。另外，针对被检查的两个小滴中的每一者计算新均方误差，但代替使用每个小滴的最佳拟合圆，通过比较像素的组合组的最佳拟合圆与指派给每个小滴的外部边界像素来计算每个小滴的均方误差。MSEcombined必须小于每个小滴的新均方误差的Merr倍。最终，使像素的组合组的最佳拟合位置从被检查的两个小滴中的每一者的最佳拟合位置不变地移位。确定从第一小滴的最佳拟合位置到组合组的最佳拟合位置的距离。差必须小于第一小滴的最佳拟合半径的20％。确定从第二小滴的最佳拟合位置到组合组的最佳拟合位置的距离。差必须小于第二小滴的最佳拟合半径的20％。针对图像中的所有对小滴重复此过程。如果一对小滴被发现为已满足所有这些准则，那么将那些小滴组合且此后看作单个小滴。在已检查所有小滴之后，将0.35加到Merr且重复此整个步骤。逐渐地增加Merr会导致小滴缓慢地被组合且减小不正确的组合的可能性。继续此过程以用于将Merr的值增加直到2.9。
步骤7。此步骤涉及检查具有显著重叠的多对小滴，而不管它们是否具有类似大小。将乘数Merr界定为1.5，且将最小分数Fmin界定为50％。按外部边界像素的数目对最佳拟合圆的圆周的比率从最大到最小而对图像的小滴进行排序。检查多对小滴(i，j)，其中i是指具有较大半径的小滴，且j是指具有较小半径的小滴。如果小滴j的区域的至少Fmin被小滴i的区域重叠，那么检查所述对以查看所述小滴是否应组合。将两个小滴的外部边界像素组合为拟合到圆的组。必须满足若干准则以便得出应组合两个小滴的结论，包含以下各者：(i)组合拟合的每个像素的拟合误差必须小于0.12；(ii)组合拟合的每个像素的拟合误差必须小于小滴j的最佳拟合圆的每个像素的拟合误差的Merr倍；(iii)组合拟合的均方误差必须小于小滴j的最佳拟合圆的均方误差的Merr倍；以及(iv)组合拟合的圆的中心的最佳拟合位置与小滴j的最佳拟合圆的中心的最佳拟合位置之间的距离必须小于小滴j的最佳拟合半径的20％。如果满足所有这些准则，那么小滴i和j被组合且被视为一个小滴。
步骤8。在此步骤中，检查每个像素群组且确定其是否具有小滴以及未指派ROI两者。如果是，那么对于每个小滴，其检查每个未指派ROI，且确定所述ROI的区域的至少85％是否位于与所述小滴相关联的最佳拟合圆内。如果是，那么所述未指派ROI是添加到小滴的候选者。接下来，通过将小滴的外部像素与ROI的外部边界像素进行组合而形成组合的外部边界像素组。将所述组合组拟合到圆。此步骤具有在将把ROI添加到小滴的情况下必须满足的一组准则，包含以下各者：(i)组合拟合的每个像素的拟合误差必须小于ROI的拟合误差的每个像素的拟合误差的1.2倍；以及(ii)到组合组的最佳拟合圆的中心的位置与到ROI的最佳拟合圆的中心的位置之间的距离必须小于1.4个像素或小于到ROI的最佳拟合圆的半径的20％。如果满足这些准则，那么将ROI指派给小滴。
步骤9。在此阶段，仍有可能的是，指派给小滴的ROI未完全地描述小滴的圆周。按外部边界像素的数目对最佳拟合圆的圆周的比率从最大到最小而对图像的小滴进行排序。对于每个像素群组，检查其中的每一者具有小于0.5的比率的多对小滴。此步骤具有需要在进一步考虑小滴以供合并之前满足的一些准则。计算两个小滴的最佳拟合圆之间的重叠量。计算两个最佳拟合圆的中心之间的距离。所述准则包含以下各者：(i)重叠区的大小必须超过两个圆的区域的30％；(ii)两个圆之间的距离必须小于无论哪个最佳拟合圆较大的最佳拟合半径的20％；以及(iii)两个最佳拟合圆之间的最佳拟合半径的差必须小于30％。如果满足这些准则，那么对两个小滴的外部边界像素进行组合，且将圆拟合到组合组。针对所有对小滴重复此程序。
步骤10。对于每个小滴，随后计算外部像素的数目对最佳拟合圆的圆周的比率，且不考虑此比率不超过0.65的任何小滴。
步骤11。对于每个像素群组，制备仍未指派给小滴的所有ROI的列表。随后对于每个未指派ROI，所述方法搜索与其具有最大重叠的小滴。如果重叠区的大小超过ROI内的区域的50％，那么所述方法检查是否应将所述ROI指派给小滴。其计算小滴的最佳拟合圆内部的未被指派给小滴的ROI占据的区域。如果未指派ROI的区域小于小滴的最佳拟合圆内部的未被占据区域的区域的1.05倍，那么对小滴和未指派ROI的外部边界像素进行组合以形成外部边界像素的组合组。随后将此组合组拟合到圆。此步骤具有在可将ROI添加到小滴之前必须满足的一组准则，包含以下各者：(i)组合拟合的每个像素的拟合误差必须小于ROI的拟合误差的每个像素的拟合误差的1.2倍；(ii)到组合组的最佳拟合圆的中心的位置与到ROI的最佳拟合圆的中心的位置之间的距离必须小于1.4个像素或小于到ROI的最佳拟合圆的半径的20％；或(iii)组合组的每个像素的拟合误差的每个像素的拟合误差必须小于0.12。如果满足这些准则，那么将ROI指派给小滴。
步骤12。如果不具有任何外部边界像素的任何ROI在小滴的最佳拟合圆内部，那么随后将它们指派给那个小滴。
图5B示出通过此实例中的方法制备的最终的经处理图像。图5B中的图像对应于图1和图5A，且包含可被识别为小滴的那些小滴的最佳拟合边界。随后可使用图5B的图像来确定每个给定所识别的小滴的小滴大小和目标分子存在。
实例5
用于识别小滴的圆检测方法
此实例描述根据本公开的一方面的用于执行圆检测方法的示范性过程。
根据此方面，如上文在实例4中针对反向分水线方法所描述而计算SCT，不同之处在于信噪比是2.5(而不是实例4中的3.2)。将此SCT应用于图像来界定所述图像内的像素群组。SCT的值还用于识别每个像素群组内的孔。检查像素群组以寻找像素群组内部的其强度低于SCT的8连接组的像素。如果所述组含有9个或多于9个像素，那么将其标示为孔。将像素群组内的邻近于孔的任何像素的列表添加到像素群组的外部边界的列表。对像素群组的外部边界进行修整以消除噪声像素。经修整的外部边界像素的列表仅包含像素群组的邻近于至少一个内部像素的那些外部边界像素。在此实例中，经修整的外部边界像素还将被称作特征像素。将圆Hough变换应用于每个群组的特征像素的列表。
针对每个像素群组的范围为从3个像素到60个像素的圆半径执行所述变换。根据此方面，对标准变换方法进行修改以考虑图像中的显著噪声水平。可任选地执行此修改，这取决于所使用的图像的噪声特性。指派给像素的投票的数目是指派给像素是半径R的圆的中心的可能性的权重。一般来说，对于给定半径R，此值仅为像素的距离R内的特征像素的数目。在此方法中，其为圆的中心的距离R-1到R+1内的特征像素的数目。针对R的每个值来计算特定中心位置的投票的数目以及投票给每个中心位置的特征像素的列表。在此实例中，通过圆Hough变换找到的圆将被称作“H圆”，以将其与在将外部像素的列表拟合到圆时所获得的最佳拟合圆区别开。后者被称作“圆”。
如下减少针对每个像素群组而产生的H圆的列表。丢弃具有少于9个投票的H圆。还丢弃投票的数目对H圆的圆周的比率小于0.40的H圆。丢弃含有任何孔像素的H圆。接下来，识别包括H圆的圆周的像素，且对处于图像中的像素的数目进行计数(H圆可延伸到所述图像之外)。此时应用的准则如下：(i)图像中的圆周像素的数目NCI必须超过14；(ii)NCI对圆周中的像素的数目的比率必须超过0.60；以及(iii)H圆的投票的数目对NCI的比率必须超过0.50。如果H圆通过这些准则，那么检查处于图像的背景中的圆周的分数。如果那个分数小于0.15，那么在此阶段接受H圆。如果所述分数不小于0.15，但半径是5或更小，那么计算与群组中的像素相距多于1个像素的H圆的区域的分数。如果H圆的半径是4或5且分数是0.15或或更小，那么在此阶段接受H圆。如果H圆的半径是3且分数是0.20或或更小，那么在此阶段接受H圆。
针对仍在此阶段接受的H圆来计算H圆的投票的数目对图像中的圆周像素的数目的比率。按此比率对H圆进行分类，开始于最大者且随后在大小上递减。比较每个H圆与具有那个比率的较小值的所有H圆。如果H圆的中心在彼此的个像素内，且H圆的半径相差小于四，那么拒绝具有所述比率的较小值的H圆。通过此方法来分析图1中的图像，且在图6A中示出到此阶段的结果。在此阶段存在重叠的H圆。
在此实例中，下一步骤是拒绝作为任何小滴的不良表示的H圆，且随后将被判断为表示同一小滴的多个部分的圆进行组合。每个H圆与投票给那个H圆的一组外部边界像素相关联。将每个H圆的特征像素的列表拟合到圆，且计算所述拟合的均方误差。在此时，每个H圆界定经拟合以获得最佳拟合圆(BF圆)的一组像素。对于此实例中的额外分析，如果拒绝BF圆，那么也拒绝与其相关联的H圆。如果将BF圆指派给小滴，那么将关联H圆指派给同一小滴。如果均方误差超过0.70，那么拒绝BF圆。观察到，样本中的一些较大小滴具有极不规则的外部边界。这归于小滴的内含物与环绕小滴的连续媒介之间的折射率失配。位于大的小滴与显微镜物镜之间的小的小滴能够充当透镜，且因此使大的小滴的边界的图像失真。为了防止此情形造成过早地拒绝较大BF圆，针对较大BF圆放宽以上准则。如果投票的数目(即，NF个外部边界像素拟合到圆)大于30，那么在拟合的均方误差超过0.70+0.03x(NF-30)的情况下拒绝BF圆。
接下来，计算多对BF圆的区域重叠的量，且编译重叠区域大于两个BF圆中的一者的65％的区域的多对BF圆的列表。对于每一对，计算圆内部的作为像素群组的部分的区域的分数，且计算每个圆的唯一(并非还投票给其他圆)的投票的分数。如果针对一个BF圆计算的分数都小于针对另一个BF圆的对应分数，那么拒绝第一BF圆。
对于任何BF圆尚未被拒绝且具有不同区域的多对BF圆，应用另一测试。计算在较小BF圆内部但不在较大BF圆内部的像素的数目。如果所述数目小于较小BF圆的投票的数目的一半，那么拒绝较小BF圆。
对于此时任何BF圆尚未被拒绝的多对BF圆，计算BF圆的中心之间的距离，且计算两个BF圆的半径之间的差。如果所述中心之间的距离小于2.1个像素，且半径之间的差小于2.1个像素，那么拒绝具有较小数目个投票的BF圆。
接下来，对于每个BF圆，计算唯一投票的数目。唯一投票是并非也是先前自身尚未被拒绝的任何其他BF圆的投票的投票。如果唯一投票的数目小于10或唯一投票对投票总数的比率小于0.40，那么拒绝那个BF圆。
对于每个像素群组，编译未指派给任何H圆(未指派)的外部像素群组边界像素的列表。如果未指派像素的分数小于外部像素群组边界像素的总数的10％，那么重新检查被拒绝的H圆。对于其中的每一者，编译唯一投票(不是任何被接受的H圆的部分的投票)的列表。如果此类投票的数目超过被拒绝的H圆的圆周的60％，那么将被拒绝的H圆恢复到被接受的H圆的列表。此时接受的所有H圆暂时被视为小滴。
接下来，检查像素群组中的每一对可能小滴，这些小滴在下文分别被称作“小滴1”和“小滴2”。针对每对中的每个小滴来计算唯一投票(即，一个小滴的不是其他小滴的投票的投票)的数目。针对小滴1和小滴2的唯一投票的数目分别被标示为NU1和NU2。如果这些数目中的任一者小于9，那么使所述对经受额外测试。对于这些测试，计算小滴的最佳拟合中心之间的距离(d)。而且，对于这些测试，内部区域标示位于最佳拟合圆内部并且还位于像素群组中的像素。随后计算四个额外量。这些量是d对小滴1的最佳拟合半径的比率(D1)、d对小滴2的最佳拟合半径的比率(D2)、不在小滴2内部的小滴1内部区域的分数(F1)，以及不在小滴1内部的小滴2内部区域的分数(F2)。应注意，此实例中使用的术语仅适用于此实例。
应用以下额外条件和测试：
条件A：如果NU1和NU2两者都小于9，那么执行测试A。测试A。如果D1和D1两者都小于0.3，那么拒绝具有较小的最佳拟合半径的小滴。
条件B：如果条件A不适用且NU1小于9，那么执行测试B。测试B：如果F1小于0.4，那么拒绝小滴1。
条件C：如果条件A和B不适用且NU2小于9，那么执行测试C。测试C：如果F2小于0.4，那么拒绝小滴2。
条件D：如果条件A、B或C都不适用，那么应用两部分测试D。测试D，部分1：如果NU1小于NU2，且如果D1、D2和F1都小于0.3，那么拒绝小滴1。如果否，那么应用测试D，部分2。测试D，部分2：如果NU2小于NU1，且如果D1、D2和F2都小于0.3，那么拒绝小滴2。
条件E：如果条件A、B、C或D都不适用，那么应用测试E。测试E：计算唯一区域像素的分数，出于此测试的目的，所述分数被界定为在一小滴内部的不在像素群组中的任何其他小滴内部的区域的分数。计算全部唯一投票的分数，出于此测试的目的，所述分数被界定为一小滴的不是像素群组中的任何其他小滴的投票的投票的分数。如果小滴1的两个分数小于小滴2的对应分数，那么拒绝小滴1。如果小滴2的两个分数小于小滴1的对应分数，那么拒绝小滴2。
接下来，个别地检查像素群组中的每个小滴。构建作为小滴的最佳拟合圆周的部分且在图像内的像素的列表。计算在像素群组内部但不与外部边界像素重合或邻近的那些像素的分数(FC)。如果FC超过60％，那么拒绝小滴。
如果FC超过0.3且在像素群组内部但不与外部边界像素重合或邻近的像素的数目大于2，那么执行不同的测试。从作为小滴的最佳拟合圆周的部分的像素的列表创建两个组。第一组(组1)是由与指派给小滴的投票重合或邻近的那些像素组成。第二组(组2)是由在像素群组内部但不在组1中的那些像素组成。计算组1中的像素的强度的平均值(A1)和标准偏差(S1)。计算组2中的像素的强度的平均值(A2)。如果A1+(2-FC)xS1＜A2，那么拒绝小滴。在一些情况下，使小滴的外部边界失真的噪声产生显著地小于小滴的H圆。在那些情况下，位于小滴的内部中的BF圆的圆周的部分可具有显著地大于位于像素群组的外部边界附近的部分的平均强度。此测试用于识别和拒绝那些H圆。
接下来，对于每个小滴，构建内部像素(即，在最佳拟合圆内部且在小滴内部的像素)的列表，且分析那些像素的强度。如果那些强度的百分之九十小于平均背景强度加上背景强度的标准偏差的5倍，那么拒绝小滴。如果具有大于平均背景强度加上背景强度的标准偏差的3.5倍的强度的内部像素的数目(N3.5)小于4，那么拒绝小滴。还计算其强度高于平均背景强度加上3.5的内部像素的分数(F3.5)。如果F3.5小于0.10，那么拒绝小滴。如果F3.5小于0.15且N3.5小于20，那么拒绝小滴。
在那时重新检查小滴。如果唯一投票(一小滴的并非也是不同小滴的投票的投票)的数目小于5，那么拒绝小滴。如果唯一投票的数目小于9且拟合的均方误差多于0.25且拟合误差多于0.4，那么拒绝小滴。
随后尝试将任何外部像素群组边界像素指派给小滴。对于每个小滴，在小滴的最佳拟合圆内部或邻近处的任何外部像素群组边界像素被暂时添加到那个小滴的投票(用于获得最佳拟合圆的像素)的列表。从指派给那些小滴的投票的列表移除通过此程序而添加到多于一个小滴的像素。
随后使用每个小滴的投票的经修订列表来获得最佳拟合圆。
接下来，个别地检查像素群组中的每个小滴。编译在小滴的最佳拟合圆内部、是群组的部分但不是另一小滴的部分的像素的列表。如果那些像素的数目小于在小滴的最佳拟合圆内部且在像素群组内的像素的总数的75％，那么应用以下两个测试(测试F和G)。
测试F：构建作为小滴的最佳拟合圆周的部分且在图像内的像素的列表。计算在像素群组内部但不与外部边界像素重合或邻近的那些像素的分数(FC)。如果FC超过60％，那么拒绝小滴。
测试G：如果FC超过0.3且在像素群组内部但不与外部边界像素重合或邻近的像素的数目大于2，那么执行不同的测试。从作为小滴的最佳拟合圆周的部分的像素的列表创建两个组。第一组(组1)是由与指派给小滴的投票重合或邻近的那些像素组成。第二组(组2)是由在像素群组内部但不在组1中的那些像素组成。计算组1中的像素的强度的平均值(A1)和标准偏差(S1)。计算组2中的像素的强度的平均值(A2)。如果A1+(2-FC)xS1＜A2，那么拒绝小滴。在一些情况下，使小滴的外部边界失真的噪声产生显著地小于小滴的最佳拟合圆。在那些情况下，位于小滴的内部中的最佳拟合圆的圆周的部分可具有显著地大于位于像素群组的外部边界附近的部分的平均强度。此测试用于识别和拒绝那些小滴。
如果均方误差超过1.0，那么拒绝BF圆。然而，如果投票的数目(NF个外部边界像素拟合到圆)大于30，如果那么放宽此要求，且在拟合的均方误差超过1.0+0.03x(NF-30)的情况下拒绝小滴。
如果每个像素的最大拟合误差超过0.10，那么拒绝小滴。
计算其到最佳拟合圆的距离在最佳拟合半径的±1.16个像素内的小滴的投票的分数(FG)。而且，计算小滴的投票对位于图像中的最佳拟合圆周的那个部分的大小的比率(FVC)。如果FG小于0.5且FVC小于0.575，那么拒绝小滴。
对于每个小滴，构建内部像素(在最佳拟合圆内部且在像素群组内部的像素)的列表，且分析那些像素的强度。如果那些强度的百分之九十小于平均背景强度加上背景强度的标准偏差的5倍，那么拒绝小滴。如果具有大于平均背景强度加上背景强度的标准偏差的3.5倍的强度的内部像素的数目(N3.5)小于4，那么拒绝小滴。还计算其强度高于平均背景强度加上3.5的内部像素的分数(F3.5)。如果F3.5小于0.10，那么拒绝小滴。如果F3.5小于0.15且N3.5小于20，那么拒绝小滴。
将此实例的程序应用于图1中的图像。在图6A中示出此方法的中间结果，且在图6B中示出被接受的小滴的最佳拟合圆。
实例6
用于识别小滴的组合式反向分水线与圆检测方法
此实例描述根据本公开的一方面的用于执行组合式反向分水线与圆检测方法的示范性过程。
根据此方面，使用反向分水线方法确定ROI、像素群组和外部边界像素，此后将圆Hough变换应用于边界像素。通过组合地执行这些方法，应用额外准则来将群组内的ROI分类为小滴。针对此实例界定三个不同截止。如实例4中所描述而计算背景的平均值和标准偏差。这些在此实例中将被称作初始平均值和初始标准偏差。此实例的SCT是初始平均值加上初始标准偏差的2.5倍。孔的截止是初始平均值加上初始标准偏差的2.75倍。应用一另外截止来确定哪些像素是背景的部分。背景截止是初始平均值和背景的初始标准偏差的2.3倍。使用较小截止来界定背景将会消除含有源自样本中的其他焦平面的荧光的图像的区域。其强度小于背景截止的所有像素被视为最终背景的部分。
另外，检查具有大于背景截止的强度的所有4连接组的像素。如果所述组的区域小于10个像素，那么那些像素包含在最终背景中。最终背景中的像素用于计算最终平均背景强度，其用于获得被减去背景的强度。
在此实例中，如实例5中一样，首先应用使用SCT的截止来界定群组。另外，检查每个像素群组以寻找像素群组内部的其强度低于孔截止(HT)的8连接组的像素。如果所述组含有九个或多于九个像素，那么将其标示为孔。将像素群组内的邻近于孔的任何像素的列表添加到像素群组的外部边界的列表。随后将反向分水线方法应用于图像，如实例4中一样。通过首先确定像素群组，随后立即将通过反向分水线方法找到的任何ROI收集到它们所属的像素群组中。这是出于记账目的而进行，且不是必需的。对ROI的外部边界进行修整以消除噪声像素。经修整的外部边界像素的列表仅包含ROI的邻近于至少一个内部像素的那些外部边界像素。内部像素是作为像素群组的部分但不邻近于非群组像素的像素。
经修整的外部边界的列表在下文被称作特征像素的列表。与实例4的反向分水线方法相对比，在此阶段不将每个ROI的经修整的外部边界像素拟合到圆。代替地，将圆Hough变换应用于每个ROI的特征像素的列表。针对每个像素群组的范围为从2个像素到60个像素的圆半径执行所述变换。由于图像中的高噪声水平，在此实例中使用用于执行变换的经修改方法。指派给像素的投票的数目在此方面中是指派给像素是半径R的圆的中心的可能性的权重。一般来说，对于给定半径R，指派给像素的投票的数目将代替地是像素的距离R内的特征像素的数目。在此方法中，其为圆的中心的距离R-1、R或R+1内的特征像素的数目。针对R的每个值来计算特定像素的投票的数目以及投票给每个像素的特征像素的列表。
如下减少针对每个ROI而产生的圆的列表：(i)如果被不是ROI所属的像素群组的部分的像素(非像素群组像素)占据的圆的分数超过30％，那么拒绝圆；(ii)如果圆内部的非群组像素的数目对像素的圆周的比率超过0.40，那么拒绝圆；(iii)如果是非像素群组像素的圆的圆周的分数超过70％，那么拒绝圆；以及(iv)如果圆内部的非像素群组像素对圆内部的像素群组像素的比率超过0.30，那么拒绝圆。
随后检查具有相同半径的多对圆。如果圆的中心之间的距离小于半径的50％(或在半径＜5个像素的情况下小于2个像素)，那么比较投票给两个圆中的每一者的像素的列表。如果存在多于30％的重叠(两个圆共有的投票的数目是两个列表中的任一者的30％或更多)，那么拒绝具有较小数目个投票的圆。
接下来，检查可具有不同半径的多对圆。如果圆的中心之间的距离小于较大圆的半径的50％，那么比较投票给两个圆中的每一者的像素的列表。如果存在多于30％的重叠(两个圆共有的投票的数目是具有较小半径的圆的列表的30％或更多)，那么拒绝具有较小半径的圆。
按投票的数目对在那时与ROI相关联的圆进行分类，开始于最大投票数目。随后比较每个圆与和具有较少投票的ROI相关联的所有其他圆(在下文分别被称作圆A和B)。如果圆B的50％或更多的投票也是圆A的投票，那么针对那对圆执行两个额外检查。如果圆B内的60％或更多的区域也在圆A内部，那么拒绝圆B。如果任一圆与图像的边缘重叠，那么所考虑的区域仅为图像中的圆的区域的那个部分。对于额外查询，计算两个圆的中心之间的距离。如果此距离小于两个圆中较大者的半径的89％，那么拒绝圆B。根据此方面的下一步骤是使用针对ROI而识别的圆将ROI分组为小滴。
如果像素群组此时仅具有单个ROI圆，那么使用那个圆来识别用于对小滴定大小的外部边界像素。
如果存在两个或多于两个圆，那么随后执行一组测试。对于每个圆，计算从其中心到像素群组中的所有其他圆的中心的距离，且随后除以第一圆的半径(ΔCscaled)。创建所有圆对的列表，且按ΔCscaled进行分类，开始于最小者。如果一对圆的ΔCscaled小于0.10且两个圆的半径差对较小圆的半径的比率小于0.20，那么将所述两个圆(以及与它们相关联的ROI)指派给同一小滴的部分。将在此阶段尚未指派给小滴的任何剩余圆各自指派给单独小滴。接下来，创建与小滴相关联的投票的列表。投票的列表包含指派给小滴的圆的所有投票。随后将此列表拟合到圆。
有可能的是，单个ROI可能已被指派给多于一个小滴。对此进行检查，且在那些实例中，计算从每个小滴的最佳拟合中心到与ROI相关联的圆的中心的距离。将此距离为最小的ROI指派给小滴，且从指派给小滴的圆的列表移除此距离为最大的ROI。所述实例的此步骤假设通过反向分水线方法找到的每个ROI都仅为一个小滴的部分。如果此步骤留下不具有指派给其的任何ROI的小滴，那么拒绝那个小滴。创建与像素群组相关联的小滴列表，且按半径进行分类，开始于最大半径。随后比较像素群组内的所有对小滴。如果具有较小半径的最佳拟合圆内部的75％或更多的像素也在具有较大半径的最佳拟合圆内部，那么拒绝具有较小最佳拟合半径的小滴，且将指派给被拒绝的小滴的任何ROI指派给具有较大半径的小滴。
接下来，如果在像素群组中存在任何未指派ROI，那么对其进行检查以查看是否应将它们指派给现有小滴。使用MATLAB的imdilate()函数以及由MATLAB表达strel(‘square’，3)界定的结构化元素以产生掩模来扩大小滴的圆周的像素(通过将圆拟合到小滴的投票而确定)。对于每个未指派ROI，如果50％或更多的其经修整的外部边界像素在那个掩模内，那么将那个ROI指派给小滴。将在掩模内部的ROI的像素添加到那个小滴的投票。将其所指派的ROI的列表通过这些步骤而改变的任何小滴重新拟合到圆。如果随后发现像素群组根本不具有与它们相关联的小滴，那么将经修整的外部边界像素拟合到圆，且将整个像素群组看作一个小滴。
在其他方面中，可使用替代方法来定位图像内的额外小滴。如果像素群组具有不在小滴内部的大量像素，那么可将尚未指派给小滴的任何ROI的外部边界像素拟合到圆。可在其中应用额外约束以作为与非群组像素不具有显著重叠的补充，这些额外圆可被约束为与群组内的现有小滴不具有显著重叠。
通过使用圆Hough变换来减轻具有高像素强度的两个小滴之间的区导致非圆形边界的问题，这是因为其排斥了形成非圆形边界的像素。
图7A示出在将反向分水线方法和圆Hough变换方法应用于图1的图像和被拒绝的非想要的圆之后产生的经处理图像。图7B示出在对那些圆进行分类以识别和定位小滴之后获得的最终结果。
实例7
dPCR扩增和分析
此实例描述用于使用多分散小滴乳剂系统对核苷酸样本进行dPCR扩增和分析的方法。
为了将扩增产物在小滴内的存在可视化，将荧光探测剂添加到特别地辨识扩增子的存在的反应混合物。将小量(1-2μM)的红色荧光染料6-羧基-X-若丹明(ROX)用作反应混合物中的参考染料。ROX的光谱特征容易地与用于报告扩增的绿色荧光探测剂的光谱特征区别开。此外，ROX荧光信号对扩增或其他反应或试剂条件不敏感。两个强度(一个是从参考染料予以测量，且一个是从探测剂予以测量)的比率用于从每个所测量的小滴进行二元测量。所述强度比率不受到由于融合或收缩而引起的小滴体积的改变或光激发功率的非想要的改变影响，这是因为这些改变中的每一者将同等地影响两种染料的荧光强度，从而使所述比率不变。
为了建构小滴大小的分布的轮廓，将乳剂转移到96井板上，其表面被硅烷化，且覆盖有过量的油-表面活性剂混合物。在PLAN APO 20X、0.75NA物镜的情况下，在多跟踪模式中使用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜来使乳剂成像。使用543nm(LP 610)和488nm(BP 500-530)的激光源激发波长以从ROX和FAM染料收集荧光信号。对于每个视场，沿着z轴在不同深度处使一系列光学截面(z栈)成像，以建构小滴尺寸的3D轮廓。
图8A到图8C说明用于在数据获取期间验证PCR扩增产物在小滴中的存在的快速方法。图8A和图8B中的圆指示所识别的小滴。在图8A和图8B右侧的曲线图沿着左侧的图像中所描绘的直线描绘荧光强度。横越穿过红色荧光(ROX)和绿色荧光(FAM)通道(分别在图8A和图8B中)中的具有类似直径的两个小滴的中心的线来测量荧光强度。还使用绿色荧光DNA报告来标记一些但不是全部ROX标记的小滴。两种小滴具有类似的红色荧光强度，而小滴(2)的绿色荧光强度比小滴(1)大大约2.5倍。小滴(1)的较低信号与由包括FAM荧光团的TaqMan探测剂产生的背景强度一致，从而指示在小滴(1)中不存在目标DNA。在FAM通道中所观察的小滴(2)中的较高信号指示在那个小滴中发生扩增。
图8C示出在乳化之后使用ROX荧光信号测量的489个小滴的小滴直径分布。
图9示出针对以dsDNA的三种不同起始浓度(即，直方图10A中的～2×103dsDNA个副本/μL、直方图10B中的～2×106dsDNA个副本/μL，和直方图10C中的～2×107dsDNA个副本/μL)加载的多分散小滴的群体的绿色对红色荧光强度的比率的频率分布。在最低浓度下，在PCR之后，基本上没有小滴含有经扩增DNA样本(直方图10A)。此分布主要由缺少经扩增产物的小滴组成，其中平均FAM/ROX比率为0.35(N＝1701个小滴)。在中等浓度下，在PCR之后，一些小滴含有经扩增DNA样本，而其他小滴不含有经扩增DNA样本(直方图10B)。在此初始目标分子浓度(～2×106个分子/μL)下，可看到两个清楚的分布(直方图10C)，其对应于类似于图10A所示的小滴的非扩增小滴(白条)，和具有大于0.625的FAM/ROX比率的经扩增小滴(黑条)。此值比非扩增小滴的均值大1.5倍以上，使得其为用于区别含有或不含有经扩增样本的小滴的适当阈值。在最高浓度下，在PCR之后，基本上所有小滴都含有经扩增DNA样本(直方图10C)。在甚至更高的初始目标分子浓度(～2×107个分子/μL)下，几乎所有乳剂小滴都具有高于用于检测经扩增样本的阈值的FAM/ROX比率(直方图10C)。
实例8
用于dPCR之后的小滴分析的方法
此实例描述使用连续可变小滴体积的数字扩增分析方法，例如，多分散小滴乳剂系统中的数字PCR。通过使用此方法，可借助多分散小滴而使用数字检定准确地确定目标样本浓度CS。
样本分布成具有可变大小的小滴，且目标分子成为小滴的分布遵循Poisson统计。尽管此实例提供用于计算样本浓度的方法，但应理解，其他合适的方法可用于确定样本浓度。在此实例中，初始样本浓度(CS)被表达为给定体积中的分子数。样本分布成可变体积的离散分区或“小滴”，其中目标分子成为小滴的分布遵循Poisson统计。对于数字检定中的每个小滴，且如方程式(5)中所示，目标的平均数取决于其体积Vi以及初始样本浓度CS：
P(n，CSVi)是针对溶液中的目标分子的给定浓度CS在体积Vi的小滴中找到n个分子的概率。扩增反应将致使含有一或多个分子的小滴可通过报告(例如，实例7中所描述的荧光报告)而与空白小滴区别开。在此方法中，仅知晓小滴是空白(n＝0)还是被占据(n＞0)。在以下方程式(6)和(7)中示出关联概率：
为了确定目标分子的浓度CS，可遍及具有相应体积Vi的大量小滴而对P(n＞0，CSVi)进行求和。
对于每个分析步骤，存在小滴的固定数目Nd，且那些小滴具有目标分子的给定浓度CS。小滴直径随机地变化且在图10中示出那些小滴的大小分布。此分布可与在图8C中所测量的实验分布相当。所述分布是对数正态分布，其中仅包含介于8微米与64微米之间的直径。
各种小滴具有目标分子的浓度CS，且在一些情况下，浓度CS可以为零，这指示在给定小滴中缺少目标分析物。对被确定为含有目标分析物的小滴的总数NS进行计数，且随后与被占据小滴的预期数目NE进行比较，如以下方程式(8)中所描述：
对于C＝CS，获得NE的最可能值。通过使用Nd个小滴的体积，可将方程式(8)拟合到NS以获得浓度的最佳拟合值，其中C是唯一可调整参数。使用Newton-Rhapson算法以找到NS-NE的零点。通过用分布的中值体积替换方程式(8)中的Vi且求解C而获得C的初始值。所述算法随后通常进行5至11次迭代以使C的改变下降到低于十万分之一。那时C的值被看作C的最佳拟合值。
这些计算设法确定此程序估计给定CS的准确程度，且如果两个不同样本得到C的不同最佳拟合值，那么尝试计算样本具有不同浓度的置信度。
此方法包含每个小滴的体积以及其关联误差的测量。小滴直径的误差可由高斯分布误差近似，这适用于任何给定直径测量。小滴直径用于计算小滴体积，且因此小滴直径的误差引起小滴体积的对应误差将所述对应误差代入方程式(9)中以基于所测量的体积而得到被占据小滴的预期数目。
在此实例中，通过显微术确定小滴直径。此方法的准确性可取决于所使用的接物镜的数值孔径(NA)以及成像系统的其他组件。为了将大量静止小滴成像在表面上，NA将很可能小于1且直径测量的误差通常为0.5微米至1.0微米，而独立于小滴的大小。考虑测量误差的两个不同量值且将其标示为E1和E2。对于E1，加到小滴直径的高斯分布误差的标准偏差是1微米或所述小滴直径的8％中的较大者。包含相对误差，使得计算包含最大小滴的不可忽略的测量误差。对于E2，加到小滴直径的高斯分布误差的标准偏差是2微米或所述小滴直径的15％中的较大者。在这两种情况下，对于所测量的直径存在一个极限。如果具有测量误差的特定小滴直径引起直径小于0.5微米，那么丢弃所述测量误差且针对所述小滴产生新直径。结果是无偏测量误差。
CS是程序正尝试确定的实际未知浓度，且s是由实验者测量的体积。C变化，直到方程式(9)中的等于被占据小滴的所测量的数目以获得最佳拟合浓度。
执行计算，其中CS＝4.4×10-5个分子/fL且Nd在500到10000的范围内。从图10所示的直径分布中获得小滴大小，图10描绘用于验证用于执行数字检定的方法的小滴直径的截尾对数正态分布。对于小滴直径的无测量误差(“0误差”)以及E1和E2测量误差的情况重复计算。对于每个小滴数目以及误差量，执行1000次计算，且计算平均最佳拟合浓度以及最佳拟合浓度的分布的标准偏差。
标准偏差对平均最佳拟合浓度的比率被称为“测量可变性”且在图11中针对小滴数目的范围以及测量误差的量予以标绘。图11示出测量可变性受到样本大小(即，小滴的数目)的影响程度。针对以被设置为4.4×10-5个分子/fL的样本浓度执行的数字检定而产生数据。测量可变性反映数字检定在估计样本的实际浓度方面的准确性，其中较多测量可变性暗示较低准确性。对于此模拟，测量可变性(垂直轴)被定义为标准偏差除以估计浓度分布的均值的比率。针对不同小滴数目(从图10所示出的小滴直径分布获得)以及针对小滴直径的模拟测量中的三个不同误差量计算测量可变性。在一组计算中，小滴直径的测量无误差(“0误差”)。在另一组计算中，小滴直径误差分布的标准偏差是1μm或实际小滴直径的8％中的较大者(“E1误差”)。在第三组计算中，小滴直径误差分布的标准偏差是2μm或实际小滴直径的15％中的较大者(“E2误差”)。对于三个不同小滴直径测量误差量的测量可变性中的相似性表明任何给定样本的测量可变性是由Poisson统计支配，这会控管目标分子在小滴之中的分布。结果，由于小滴大小测量误差引起的最佳拟合浓度的任何可变性对浓度确定具有小或可忽略的影响，只要所述可变性无偏即可。
可在置信度和功效方面描述能够区别浓度差异的方法。此方面由Lieber，R.L.(1990年)的“假设测试中的统计显著性和统计功效(Statistical Significance andStatistical Power in Hypothesis Testing)”(《整形外科研究杂志(J.OrthopaedicResearch)》第8期，第304至309页)描述。本发明的方法使能够确定给定测量的置信水平，这在对两个不同样本的测量得到两个不同最佳拟合浓度(C1和C2)时特别相关。因此，将有用的是了解断定两个样本的浓度不同的置信度以及在得出浓度并非不同的结论时出现错误的概率。通过要求结果具有所需最小置信度来控制错误肯定结果(类型I误差)的风险，且通过要求方法具有所需功效来控制错误否定结果(类型II误差)的风险。
对于来自两个不同样本的两个最佳拟合浓度的比较，虚假设将是两个样本具有相同(未知)浓度。如果α是具有相同浓度的两个样本可引起量值相差大于|C1和C2|的最佳拟合浓度的概率，那么(1-α)是与拒绝虚假设相关联的置信度。选择(1-α)的可接受最小值以限制错误肯定结果。下文描述防止错误否定的功效的使用。
一种用于估计置信水平的方法是如方程式(10)中所示的Z测试：
95％的置信水平是常见选择且要求Z＞1.96。从方程式(9)的最佳拟合结果中导出Cn的值，且是与Cn的测量相关联的方差。在此实例中，估计这是因为相信不存在此项的易处理分析表达式。执行用于估计置信度的第二模拟方法且与Z方法结果进行比较。在下文中，将两种方法标示为Z方法和对方法(或P方法)。
对于置信度的Z方法估计，使用CS的两个不同值(CS1和CS2)。对于CS1，从截尾对数正态分布中随机地选择一组5000个小滴，且使用方程式(6)来计算被占据小滴的数目。使用测量误差的E1大小来产生体积使用如上文所描述的方程式(8)来获得浓度C1的最佳值。通过执行NZ＝1000个额外计算来估计标准偏差。对于每一者，通过获取一组所测量的体积且使用方程式(6)以确定其中的被占据者来确定由于Poisson统计引起的可变性的量。随后使用方程式(8)来拟合被占据数目以获得每个额外计算的最佳拟合浓度。额外NZ个计算的标准偏差用于方程式(9)中的 1。随后针对CS2重复此过程。可使用方程式(9)从最佳拟合浓度Cn以及所测量的小滴体积计算置信度的估计。
对于置信度的P方法估计，虚假设是各自从其实际浓度是两个最佳拟合浓度的平均值的样本获得两个最佳拟合结果(C1和C2)。确定小滴直径的Np＝500个额外组，且对于每一者，针对浓度确定被占据小滴的数目且使用测量误差的E1大小来产生所测量的体积。针对每个组获得最佳拟合浓度随后随机地选择Mp＝500对值，其中从均组进行替换，且比较所述值的差的绝对值与ΔC＝C2-C1。均大于ΔC的分数提供α的估计，即，从具有浓度均样本进行的两个测量将彼此相差大于ΔC的概率。α的P方法估计用于计算置信度，其等于(1-α)。
对于多对CS值重复100次用于获得置信度的两个估计的整个程序。对于每次重复，产生每个CS的一组新体积，且使用方程式(6)和(7)来产生每个CS的被占据小滴的数目。在方程式(9)中产生和使用所测量的体积以拟合结果且获得一对新最佳拟合浓度(C1和C2)。针对一对给定测量通过Z方法和P方法计算的置信度之间的差通常小于1％，因此任一方法可用于计算功效。用于分析测量的Z方法的一个优点是其不需要用于产生小滴分布的数值法。
P方法也可用于分析测量值。对于两个不同浓度，功效是超过置信度(1-α)的所需值的结果的分数。使用Nd＝5000个小滴和E1测量误差执行在区别相差50％的两个浓度时的功效的确定。在图12中根据两个浓度中的较小者而标绘结果。在图12中，小滴直径测量误差的标准偏差是1μm或小滴直径的8％中的较大者(“E1误差”)。虚线标记0.95的功效，其对应于未能检测两个样本浓度的差的5％可能性(错误否定，或类型II误差)。实线是用于在置信水平(1-α)等于0.95时区别相差50％的两个浓度的情况的功效。对于95％的置信水平(其排斥错误肯定或类型I误差)，将动态范围定义为最大和最小浓度的比率，对于所述动态范围，类型2误差(即，错误否定)为5％或更小(功效＞0.95)。在图12中在实线和虚线相交位置的较大浓度除以实线和虚线相交位置的较小浓度的比率处看到这一点。
图13是描绘当在具有小滴直径测量误差(“E1误差”)的多分散小滴(灰色圆，从图10中的分布获得的直径)上或在不具有小滴直径测量误差的单分散小滴(黑色三角形，所有直径恰好是30μm)上执行时样本大小(小滴的数目，在水平轴上示出)与数字检定的动态范围(在垂直轴上示出)之间的关系的曲线图。所述动态范围描述可有效地使用检定的浓度范围的广度。具体来说，在假设95％的置信水平(错误肯定或类型I误差的5％可能性)的情况下，将动态范围定义为最大和最小浓度的比率，对于所述动态范围，统计功效大于0.95。与单分散小滴相比较，当在多分散小滴上执行时，数字检定对广得多的浓度范围有效。如图13所示，对于相同数目个小滴，当使用多分散小滴的分布时数字检定具有显著地大于使用单分散小滴的分布可获得的动态范围。出于此原因，多分散小滴的使用在分析上优于单分散小滴的使用。
图1是使用共聚焦荧光显微术获得的示范性多分散小滴乳剂系统的灰度图像。
图5A和图5B描绘如应用于图1中的图像的反向分水线方法的初始步骤的结果，包含如图5A所示的所关注区(ROI)的识别，以及如图5B所示的具有优化的圆形区的最终的经处理图像，可从其确定关于小滴大小和目标分子存在的信息。
图6A示出在执行如应用于图1的图像的圆检测方法的初始步骤之后所产生的经处理图像。图6B示出在对图6A中的圆进行分类以识别和定位小滴之后所获得的最终结果。
实例9
小滴直径改变的特性化
此实例描述在PCR条件下对多分散小滴乳剂系统中的小滴大小分布改变的分析以及用于最小化此类改变的影响的方法。
小滴大小可出于多个原因而改变，包含由于蒸发和小滴融合。乳剂系统中的小滴可经历显著温度波动，例如，在PCR热循环中发生的温度波动。蒸发可遍及热循环的过程而在小滴内发生，这可更改小滴直径和体积的分布。此外，在一些情况下，位于彼此附近的小滴可由于减小含小滴系统的总表面张力的倾向而彼此融合。遍及数字检定的过程的小滴直径和体积的改变可在所述改变显著的情况下导致测量误差。此实例阐述用于特性化和优化测量系统且确保大小分布测量的准确性的步骤，包含调查加热和机械操纵对小滴大小的影响。
小滴融合。使用一般PCR试剂的混合物制备两种乳剂。第一乳剂排除DNA模板和绿色荧光探测剂(FAM)两者，而另一乳剂排除DNA模板和红色荧光染料(ROX)两者。在后者中，将绿色荧光探测剂(FAM)的最终浓度增加到1.4μM。允许两种乳剂均安定和稳定10分钟。随后使两种乳剂轻轻地重新悬浮且与管的缓慢倾斜运动进行组合。最后，将组合的混合物等分到三个PCR管中。将第一管分到一侧作为未加热(对照)样本。使剩余两个管在标准条件下热循环以下循环时间(包含热启动)：1或50个循环。同时地运行复制品组。
图14示出在多分散小滴乳剂中自发地或由于热循环而发生的小滴融合事件的频率。乳剂混合物的ROX和FAM荧光强度用于识别融合事件。以含有ROX和绿色荧光探测剂两者的小滴的百分比反映小滴融合事件的频率。使用圆标示的小滴含有两种染料(图像14A和图像14B)。仅由于后乳化小滴不稳定性、样本处置和移液引起的FAM和ROX融合事件被示出为最小，即，处于6.2±2.1％的速率(图表14C)。应注意，此测量不包含含有相同染料的小滴之间的融合事件，但其将被预期为值是相当的。在热启动和一个热循环之后，施加到乳剂样本上的加热引起6.1±1.4％的相当的融合事件(图表14C)。针对50个循环检测到的FAM-ROX融合事件(5.8±1.5％)还类似于一个循环的融合事件(图表14C)。两个加热条件正好在对照小份的误差范围内。
重要的是应注意，融合事件不会表现为相对于热循环持续时间逐渐地增加。这表明热循环加热几乎不会诱发小滴融合，且促成小滴不稳定性的主要因素与两种颜色乳剂的混合和样本处置相关。这由于在热循环之前或在热循环期间早期出现的融合事件将不会使检定的结果偏斜而显著，这是因为含有至少一个目标分子的合并小滴将经历扩增且提供肯定信号，而不经历扩增的合并小滴将提供否定信号。与此对比，在热循环期间较晚发生的融合事件可引起合并小滴下降到低于检定的二元检测阈值，从而引起不正确地特性化小滴。实验的结果指示融合使用此方法应对样本量化产生最小影响。另外，如果通过全部在同一装置上执行乳化和热循环来从过程完全地消除样本处置，那么融合可对检定的结果产生甚至更小的影响。图4中示出消除样本处置后乳化的潜在工作流的实例。
小滴收缩。通过比较否定对照与热循环乳剂样本的小滴大小分布来执行小滴收缩的分析。使用标准PCR混合物和乳化过程来制备乳剂。检查与融合实验相同的热条件。将乳剂样本的小滴直径分布标准化且在图15中予以标绘，图15比较经受无加热、1个或50个热循环的多分散小滴乳剂中的小滴直径分布。进行此实验以将由反复热循环引起的小滴大小改变量化。对照组具有15.4±0.1μm的平均直径(测量1857个小滴)。经受一个热循环的多分散小滴乳剂(图15中的三角形)具有14.9±0.4μm的平均直径(测量1952个小滴)。经受50个热循环的多分散小滴乳剂(图14中的圆)具有15.8±0.5μm的平均直径(测量1660个小滴)。三种条件的小滴直径分布是不可区别的，此指示热循环不会引起小滴体积的可观改变。
实例10
最佳拟合浓度与通过UV吸收确定的浓度之间的比较
此实例描述在通过本公开的最佳拟合方法确定的样本浓度与通过UV吸收测量的样本浓度之间观察到的良好一致性。
比较erbB2 dsDNA的连续稀释的最佳拟合浓度与通过在260nm处的吸收测量确定的浓度。浓度跨越四个数量级的范围(即，2×103、2×104、2×105和2×106dsDNA副本/μL)，其中每个浓度下有多个样本。使用如本文中所描述的简单边界方法确定小滴直径，且所述分析包含直径在7到50μm(1到500pL体积)的范围内的小滴。额外PCR参数与实例7中所描述的参数一致。使用以下方程式(8)获得最佳拟合浓度：
图18是描绘针对上述erbB2 dsDNA样本的在如通过最佳拟合方法(在垂直轴上示出)所确定的样本浓度值与如通过在260nm处的吸收测量(在水平轴上示出)所确定的样本浓度值之间的关系的曲线图。图18中的比较示出两种方法之间的良好一致性，如通过两者之间的线性关系所指示。
实例11
使用最大可能数方法的小滴分析
此实例描述使用最大可能数(MPN)方法来确定目标样本的浓度(与使用如实例8中所描述的方程式(8)相对比)。通过使用此方法，在不识别、定大小或枚举未被占据小滴的情况下准确地确定目标样本的浓度CS。
对于涉及腔室和井的特定情况，首先确定含有目标样本的腔室或井的数目。在执行检定之前预确定腔室的数目。每个腔室的体积是一组离散大小中的一者，所述大小也是在执行检定之前预确定。
对于涉及腔室和井的特定情况，下文将方程式(8)的MPN等效者示出为方程式(11)：
在方程式(11)中，存在m个不同大小的腔室。对于第i个大小，每个腔室的体积是Vi，且存在那个大小的ni个腔室。在运行反应之后，bi是未被占据的第i个大小的腔室的数目。方程式随后经拟合以获得C(溶液的浓度)。
在涉及小滴的此方法中，方程式(11)中的左边项是所有小滴的总体积。所述小滴全部具有不同大小，因此，ni中的每一者等于1且所有ni的总和等于小滴的总数。存在m个不同大小，且针对所有小滴执行求和。因为bi对于未被占据小滴是1且对于被占据小滴是0，所以(ni-bi)项致使方程式(11)左边的总和等于遍及仅被占据小滴的总和，且因此方程式(11)可被简化和标示为以下方程式(12)：
其中Oi对于被占据小滴是1，且否则为0。还可针对C迭代地求解此方程式。使用方程式(12)和方程式(8)执行的模拟得到几乎相等的结果，其中差小于拟合中的统计误差。
如上文所提及，方程式(12)的总和中的项对于未被占据小滴是0。因此，如果知晓样本的总体积，那么有可能识别和确定样本中的被占据小滴的大小，此后可使用方程式(12)来确定样本浓度。根据此方法，不需要识别未被占据小滴的存在或大小。
在需要对被占据小滴和未被占据小滴两者定大小的方法中使用两种不同荧光染料。举例来说，在所有小滴中为荧光的染料1用于对小滴定大小，且仅在被占据小滴中显著地发荧光的染料2用于确定小滴是否被占据。然而，在所述实例的另外方面中，通过使用方程式(12)，有可能仅使用染料2来执行此实例中所描述的方法。因此，染料2的荧光用于识别被占据小滴的存在和大小两者。
当浓度小时，被占据小滴的数目对应地小。在那种情况下，扫描大量乳剂以寻找适度数目个被占据小滴。因为此方法仅要求需要对被占据小滴定大小，所以存在需要分析的显著较少的小滴，这又显著地减少所述方法的分析时间。另外，在低浓度下，两个被占据小滴将不可能彼此触碰。因为很少的被分析小滴会触碰，所以需要区别那些小滴的较少计算。因此，使用此方法显著地减少了计算要求，由此简化了扫描较大的样本体积以寻找小滴的过程。更容易地扫描较大体积的能力简化了对低浓度样本的分析，由此增加了所述方法的敏感性。
此实例中所描述的最大可能数(MPN)方法可与本文中所描述的其他方法进行组合，其中修改如下：当使用MPN方法时，不需要分析未被占据小滴的图像。举例来说，通过将阈值像素强度设置成排除缺少目标样本的小滴且仅分析含有目标样本的小滴，本公开中所描述的图像处理算法中的任一者可与此实例的MPN方法组合地使用。
实例12
用于改进成像深度的折射率匹配
在此实例中，描述出于对乳剂系统进行光学成像的目的而匹配两种或多于两种不混溶流体的折射率的益处。
用于匹配构成离散相和连续相的流体的折射率的能力可增强数据获取能力。当折射率不匹配时，可使照明(或成像)路径偏转或失真，从而导致在数据获取期间丢失信号。乳剂小滴的弯曲表面变为衍射和散射照明的微透镜，且较深地成像到溶液中会增加所获取的数据中的像差的严重度。实际上，随着观看平面较深地聚焦(Z维度)到样本中，小滴边界由于照明源必须行进穿过的重叠小滴的数目增加而变得较不可辨别(图16的A1到A5)。
图16示出使用构成多分散小滴乳剂的流体的折射率匹配实现的数据获取能力的改进。使用共聚焦显微镜从两种不同乳剂(分别在图16的A1到A5和图16的B1到B5中描绘)在逐渐较深(从左到右)的焦平面处获取荧光图像。使用73％的Tegosoft DEC、20％的轻矿物油和7％的Abil WE09油混合物(折射率≈1.4)作为连续载体相来制成所述两种乳剂。对于图16的A1到A5，小滴是由溶解在含水溶液(折射率＝1.33)中的PCR试剂构成。对于图16的B1到B5，小滴是由溶解在水(50重量％)和甘油(50重量％)混合物(折射率＝1.398)中的PCR试剂构成。在含水样本(图16的A1到A5)中，两种不混溶流体组分的折射率不同，且小滴边界在较深的焦平面处获取的图像中变得越来越不清楚，如图16的A5中。在一个方面中，油混合物与水(n＝1.33)相比较的显著较高的折射率(n≈1.4)导致涉及向PCR混合物添加高折射率组分(例如，甘油(100％(w/w)，n＝1.474)和蔗糖(65％(w/w)，n＝1.4532))的一系列折射率匹配测试。在混合的水和甘油样本(图16的B1到B5)中，两种不混溶流体组分的折射率类似，且小滴边界甚至在较深的焦平面处获取的图像中也仍然清楚，如图16的B5中。
还调查碳氟油乳剂系统以尝试更好地匹配它们的折射率。虽然矿物油系统具有显著地高于水的折射率，但碳氟系统通常具有略微低于水的折射率(例如，全氟萘烷、全氟三丁胺FC-40、全氟三丁胺FC-70、Krytox，-参见上表1)。含有芳基的全氟化合物通常具有高于水的折射率，因此，在此系统中，可更改油的组成来改进折射率匹配。调查含有45％(v/v)的全氟三丁胺FC-40与5％的Pico-Surf 1和55％(v/v)的与PCR水相混合的八氟甲苯的油相。在3000rpm下将所述混合物涡旋30s。由于水与碳氟油相相比较的较低密度(参见表1)，w/o小滴漂浮在油相上方。虽然这需要移除多余的油以在显微镜的工作距离内使w/o小滴成像，但此组合改进了在样本中较深地获取的z截面的图像质量。小滴的边界失真得到了很大的减少，且在建构小滴尺寸的3D轮廓时被允许较大范围。
尝试最小化任何油相组分的沸点的改变，所述组分应在95℃的温度下保持惰性。还努力减少或消除乳剂系统添加物对样本或PCR试剂的影响。
实例13
用于控制密度和间距的多种乳剂
此实例描述使用多种乳剂以用于数字检定的益处。
当在乳剂系统组分之间存在折射率失配时，可需要在成像期间将小滴定位成尽可能地靠近显微镜物镜。对于倒置显微镜，有可能允许将小滴安定在容器的底部上(假设小滴密度大于周围流体的密度)。当将矿物油用作连续载体相时，含水小滴比连续相更密集，这致使它们安定在底部上。然而，当将碳氟基油用作连续载体相时，含水小滴将漂浮到流体的顶部。
可通过使用双面乳剂来控制样本小滴的位置。在水/油/水双面乳剂系统中，可将碳氟油用作中间层，这致使含水小滴下沉到外部水相的底部。
针对次级水层的产生来测试两种表面活性剂(例如，Tween 20和Span 80)。包含1％的Span 80的系统被发现为有效地得到次级水层。观察到，为了折射率匹配而与纯碳氟油(例如，FC-40)一起或与碳氟溶剂以某一组合形成的水/油/水乳剂具有在次级小滴中群聚的大量水/油小滴。添加例如Krytox GPL-107等高粘性碳氟油以增加FC-40的粘度，使得水/油乳剂不会立即上升且一起群聚在大块油相上方。通过此方法，所产生的水/油/水乳剂不大可能具有群聚在次级小滴内部的大量水/油小滴(图17)。可通过变化油相的粘度来控制含水小滴的间距。
图17示出在两步骤乳化过程中制成的水/油/水双面乳剂的荧光图像：首先，使含有PCR试剂的含水溶液在由Krytox GPL-107、全氟三丁胺FC-40和Pico-Surf 1表面活性剂构成的油混合物中乳化。随后进一步将所得的水/油乳剂乳化为由水和Span 80表面活性剂构成的含水溶液，以产生水/油/水双面乳剂。因为在此情况下油相比任一水相更密集，所以重力使双面乳化的小滴降低成较紧密地接近成像物镜。使用共聚焦显微镜在逐渐较深(从左到右)的焦平面(以3μm间隔)处获取图像。除了提供可引起改进成像的更好地分离小滴的优点之外，这些结果还证明双面乳剂可有助于通过修改小滴的密度来最小化折射率失配的影响。
虽然本文中已示出和描述了本发明的优选方面，但本领域的技术人员将清楚，仅作为实例而提供此类方面。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到众多变化、改变和取代。应理解，可在实践本发明的过程中采用对本文中所描述的本发明的各方面的各种替代方案。期望所附权利要求书界定本发明的范围且由此涵盖在这些权利要求书及其等效者的范围内的方法和结构。
Claims (189)
1.一种用于执行数字检定的方法，其包括：
产生多个多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括样本；
扩增所述样本；
使用可检测剂标记所述样本；
获得小滴的图像栈；
从所述图像栈确定所述小滴的体积；
从所述图像栈确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在；以及
基于所述可检测剂在所述多个小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述图像栈包括光学成像。
3.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述可检测剂包括光学成像。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中通过以下各者执行所述光学成像：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述图像栈包括从穿过单个小滴的单独焦深取得的多个图像。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述图像栈包括从针对小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中对所述多个小滴同时地执行所述方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多个多分散小滴包括多分散小滴阵列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多分散小滴阵列安置在多井板中。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中通过以下各者从所述图像栈确定所述小滴的所述体积：行扫描方法、简单边界方法、反向分水线方法、圆检测方法、组合式反向分水线与圆检测方法，或其组合。
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定所述可检测剂的所述浓度。
12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其中所述多个多分散小滴包括第一流体和第二流体，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中。
13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其包括通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中。
14.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其包括：
通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中；以及
在第三流体中搅拌所述乳剂，其中所述第三流体不混溶于所述第二流体中，由此形成双面乳剂。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述搅拌是选自摇动、涡旋、声波处理、与磁体混合、挤压、流聚焦或其组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述搅拌足以形成乳剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述挤压包括对所述流体进行移液，其中所述移液足以产生乳剂。
18.根据权利要求13到16中任一权利要求所述的方法，其中所述搅拌发生在微流体装置中。
19.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述搅拌包括涡旋。
20.根据权利要求13到19中任一权利要求所述的方法，其中所述乳剂包括水相和非水相。
21.根据权利要求12到20中任一权利要求所述的方法，其中所述第一流体包括水，且所述第二流体包括油。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一流体包括水，所述第二流体包括油且所述第三流体包括水。
23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的方法，其中所述多个多分散小滴包括多种乳剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备所述多种乳剂。
25.根据权利要求12到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一流体是含水的。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一流体包括所述样本。
27.根据权利要求12到26中任一权利要求所述的方法，其中所述第二流体是油。
28.根据权利要求14到26中任一权利要求所述的方法，其中所述第二流体是油，且其中所述第二流体与所述第一流体和所述第三流体不混溶。
29.根据权利要求14到28中任一权利要求所述的方法，其中所述第一流体不同于所述第三流体。
30.根据权利要求14到29中任一权利要求所述的方法，其中所述第三流体是油，且其中所述第三流体与所述第一流体和所述第二流体不混溶。
31.根据权利要求1到30中任一权利要求所述的方法，其中所述多个多分散小滴进一步包括流体界面改性元素。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述流体界面改性元素是表面活性剂。
33.根据权利要求31到32中任一权利要求所述的方法，其中所述流体界面改性元素是选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
34.根据权利要求1到33中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将所述不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中在扩增所述样本之前、在扩增所述样本期间或在扩增所述样本之后将所述不混溶流体转化成凝胶或固体。
36.根据权利要求1到35中任一权利要求所述的方法，其中所述可检测剂是荧光的或冷光的。
37.根据权利要求1到36中任一权利要求所述的方法，其中所述可检测剂是荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
38.根据权利要求1到37中任一权利要求所述的方法，其中所述样本包括核苷酸。
39.根据权利要求1到38中任一权利要求所述的方法，其中扩增所述样本包括执行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。
40.根据权利要求1到39中任一权利要求所述的方法，其中扩增所述样本包括核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增。
41.根据权利要求1到40中任一权利要求所述的方法，其中小滴直径分布具有比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
42.根据权利要求1到40中任一权利要求所述的方法，其中所述小滴直径分布具有比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
43.根据权利要求1到40中任一权利要求所述的方法，其中所述多分散小滴中的所述体积可变化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大约2倍、多于大约10倍、多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。
44.根据权利要求1到43中任一权利要求所述的方法，其中所述多分散小滴具有以下范围的体积分布：从100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、从10nL到10fL、从1nL到100fL、从100nL到1pL、从10nL到10pL，或从1nL到1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。
45.根据权利要求1到44中任一权利要求所述的方法，其中所述多分散小滴的平均体积在扩增所述样本期间改变少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
46.根据权利要求1到45中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增所述样本包括第一扩增循环，且其中少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的所述多分散小滴在所述第一扩增循环之后融合。
47.根据权利要求12到46中任一权利要求所述的方法，其中所述第一流体的折射率与所述第二流体的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
48.一种用于执行数字检定的方法，其包括：
产生多个多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括样本；
扩增所述样本；
使用可检测剂标记所述样本；
使所述多个多分散小滴流动穿过流式细胞仪通道；
随着小滴流动穿过所述流式细胞仪通道而确定所述小滴的体积；
确定所述可检测剂在所述小滴中的存在或不存在；以及
基于所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的所述存在或不存在而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
49.根据权利要求48所述的方法，其中确定所述样本的所述浓度包括检测从所述小滴散射的光。
50.一种用于执行数字检定的组合物，其包括：
第一流体；
第二流体，其中所述第一流体和所述第二流体彼此不混溶且能够在被搅拌时形成乳剂；
表面活性剂；以及
扩增试剂。
51.根据权利要求50所述的组合物，其进一步包括样本。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述样本是核苷酸。
53.根据权利要求50到52中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括可检测剂，其中所述可检测剂能够标记样本。
54.根据权利要求51到53中任一权利要求所述的组合物，其中使用可检测剂标记所述样本。
55.根据权利要求50所述的组合物，其进一步包括能够结合核酸样本的可检测剂。
56.根据权利要求50到55中任一权利要求所述的组合物，其中所述扩增试剂是选自聚合酶链反应(PCR)试剂、滚环扩增(RCA)试剂、基于核酸序列的扩增(NASBA)试剂、环介导扩增(LAMP)试剂，或其组合。
57.根据权利要求50所述的组合物，其中所述扩增试剂是PCR试剂。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述PCR试剂是选自热稳定DNA聚合酶、核苷酸、引物、探测剂或其组合。
59.根据权利要求50到58中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括第三流体，其中所述第三流体不混溶于所述第二流体中。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述组合物能够形成双面乳剂。
61.根据权利要求50到60中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一流体是含水的。
62.根据权利要求50到61中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一流体包括所述扩增试剂。
63.根据权利要求50到62中任一权利要求所述的组合物，其中所述第二流体是油。
64.根据权利要求59到63中任一权利要求所述的组合物，其中所述第二流体是油，且其中所述第二流体与所述第一流体和所述第三流体不混溶。
65.根据权利要求59到64中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一流体不同于所述第三流体。
66.根据权利要求59到65中任一权利要求所述的组合物，其中所述第三流体是油，且其中所述第三流体与所述第一流体和所述第二流体不混溶。
67.根据权利要求50到66中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括流体界面改性元素。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述流体界面改性元素包括表面活性剂。
69.根据权利要求67到68中任一权利要求所述的组合物，其中所述流体界面改性元素是选自脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
70.根据权利要求50到69中任一权利要求所述的组合物，其进一步包括能够将所述不混溶流体中的一或多者转化成凝胶或固体的固化或胶凝剂。
71.一种用于执行数字检定的套件，其包括根据权利要求50到70中任一权利要求所述的组合物。
72.一种用于确定至少一个小滴的体积的系统，所述系统包括：
容器，其被配置成用于保持所述至少一个小滴；
成像源，其被配置成获得所述容器中的所述至少一个小滴的图像；以及
计算装置，其被配置成操作所述成像源，所述计算装置包括处理器和非暂时性有形计算机可读存储媒体，所述存储媒体存储一组指令，所述一组指令在由所述处理器执行时致使(i)所述成像源获得所述至少一个小滴的图像栈以及(ii)所述处理器基于所述所获得的图像栈而确定样本中的所述至少一个小滴的所述体积。
73.根据权利要求72所述的系统，其中所述至少一个小滴包括多个小滴。
74.根据权利要求73所述的系统，其中所述多个小滴是多分散的。
75.根据权利要求72所述的系统，其中所述容器包括多井板。
76.根据权利要求72所述的系统，其中所述成像源包括光学成像源。
77.根据权利要求76所述的系统，其中所述光学成像源被配置成执行共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
78.根据权利要求72所述的系统，其中所述小滴的所述图像栈包括从穿过所述至少一个小滴的单独焦深取得的多个图像。
79.根据权利要求78所述的系统，其中所述图像栈包括从针对所述至少一个小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
80.根据权利要求72所述的系统，其中所述一组指令在由所述处理器执行时致使所述处理器通过以下操作来确定所述至少一个小滴的所述体积：(i)识别所述图像栈的个别图像中的至少一个像素组；(ii)将所述至少一个像素组识别为对应于所述至少一个小滴的至少一部分；(iii)基于所述对应而从所述至少一个像素组识别至少一个个别小滴；以及(iv)基于所述至少一个像素组而确定所述所识别的至少一个个别小滴的所述体积。
81.根据权利要求80所述的系统，其中所述至少一个小滴的所述至少一部分包括单个小滴、多个小滴的多个部分、单个整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
82.根据权利要求72所述的系统，其中所述一组指令在由所述处理器执行时致使所述处理器基于所述所获得的图像栈而确定多个小滴的多个体积。
83.根据权利要求82所述的系统，其中所述一组指令在由所述处理器执行时进一步致使所述处理器确定可检测剂在所述多个小滴中的至少一些小滴中的存在或不存在。
84.根据权利要求83所述的系统，其中所述一组指令在由所述处理器执行时进一步致使所述处理器基于所述可检测剂在所述多个小滴中的所述存在或不存在以及所述多个小滴的所述所确定的多个体积而确定所述多个小滴中的样本的浓度。
85.根据权利要求84所述的系统，其中所述样本包括核苷酸。
86.根据权利要求83所述的系统，其中所述可检测剂是荧光的或冷光的。
87.根据权利要求83所述的系统，其中所述可检测剂包括荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
88.根据权利要求72所述的系统，其中所述至少一个小滴包括样本，所述样本包括核苷酸。
89.根据权利要求88所述的系统，其中所述至少一个小滴中的所述样本已被扩增。
90.根据权利要求89所述的系统，其中通过执行以下各者来扩增所述至少一个小滴中的所述样本：聚合酶链反应(PCR)、数字聚合酶链反应(dPCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。
91.根据权利要求90所述的系统，其中通过核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增来扩增所述样本。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述一组指令在由所述处理器执行时致使遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定所述可检测剂的浓度。
93.一种用于确定小滴的体积的方法，所述方法包括：
获得所述小滴的图像栈；
识别所述图像栈的个别图像中的至少一个像素组；
将所述至少一个像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分；
基于所述对应而从所述至少一个像素组识别至少一个个别小滴；以及
基于所述至少一个像素组而确定所述所识别的至少一个个别小滴的所述体积。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述至少一个小滴的所述至少一部分包括单个小滴的一部分、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
95.根据权利要求93所述的方法，其中获得所述小滴的所述图像栈包括获得从穿过所述小滴的单独焦深取得的多个图像。
96.根据权利要求94所述的方法，其中从针对所述小滴的单独焦深取得2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
97.根据权利要求93所述的方法，其中确定所述所识别的至少一个小滴的所述体积包括确定所述所识别的至少一个小滴的直径。
98.根据权利要求97所述的方法，其中确定所述所识别的至少一个小滴的所述直径包括以下各者中的至少一者：
(i)使所述所识别的至少一个小滴在所述图像栈的多个图像之间相关，且测量所述多个图像中的所述所识别的至少一个小滴的最大直径；
(ii)使曲线拟合到所述所识别的至少一个小滴的边界，且基于所述所拟合的曲线而内插所述所识别的至少一个小滴的所述直径；
(iii)使所述所识别的至少一个小滴在所述图像栈的多个图像之间相关，在每个图像中确定所述所识别的至少一个小滴的所述直径，且从所述图像栈的所述多个图像中的所述所识别的至少一个小滴的直径确定所述所识别的至少一个小滴的所述直径；或
(iv)使所述所识别的至少一个小滴在所述图像栈的多个图像之间相关，在每个图像中确定所述所识别的至少一个小滴的所述直径，且从所述图像栈的所述多个图像中的所述所识别的至少一个小滴的直径以及所述多个图像之间的图像深度差确定所述所识别的至少一个小滴的所述直径。
99.根据权利要求93所述的方法，其进一步包括确定多个小滴的所述体积。
100.根据权利要求99所述的方法，其进一步包括从所述图像栈确定可检测剂在所述多个小滴中的存在或不存在。
101.根据权利要求100所述的方法，其进一步包括基于所述可检测剂在所述多个小滴中的所述存在或不存在以及所述多个小滴的所述所确定的体积而确定所述多个小滴中的样本的浓度。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述样本包括核苷酸。
103.根据权利要求101所述的方法，其进一步包括扩增所述多个小滴中的所述样本。
104.根据权利要求103所述的方法，其中扩增所述样本包括执行聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导扩增(LAMP)，或其组合。
105.根据权利要求103所述的方法，其中扩增所述样本包括核苷酸的等温扩增或核苷酸的变温扩增。
106.根据权利要求100所述的方法，其中遍及至少三个数量级的动态范围或遍及至少六个数量级的动态范围确定所述可检测剂的浓度。
107.根据权利要求100所述的方法，其中所述可检测剂是荧光的或冷光的。
108.根据权利要求100所述的方法，其中所述可检测剂包括荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物，或半导电聚合物。
109.根据权利要求93所述的方法，其中获得所述图像栈包括光学成像。
110.根据权利要求109所述的方法，其中通过以下各者执行所述光学成像：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
111.根据权利要求93所述的方法，其中获得所述至少一个小滴的所述图像栈包括获得多个多分散小滴的所述图像栈。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述多个多分散小滴包括第一流体和第二流体，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中。
113.根据权利要求111所述的方法，其进一步包括通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中。
114.根据权利要求113所述的方法，其中获得所述图像栈包括使所述所形成的乳剂成像。
115.根据权利要求113所述的方法，其中所述第一流体包括水，且所述第二流体包括油。
116.根据权利要求111所述的方法，其进一步包括：
通过搅拌包括第一流体和第二流体的溶液而形成多分散小滴的乳剂，其中所述第一流体不混溶于所述第二流体中；以及
在第三流体中搅拌所述乳剂，其中所述第三流体不混溶于所述第二流体中，由此形成双面乳剂。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述第一流体包括水，所述第二流体包括油且所述第三流体包括水。
118.根据权利要求113或116所述的方法，其中搅拌是选自摇动、涡旋、声波处理、与磁体混合、挤压、流聚焦或其组合。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述搅拌足以形成乳剂。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述挤压包括对所述流体进行移液，其中所述移液足以产生乳剂。
121.根据权利要求116到118中任一权利要求所述的方法，其中所述搅拌发生在微流体装置中。
122.根据权利要求113或116所述的方法，其中所述乳剂包括水相和非水相。
123.根据权利要求113或116所述的方法，其中所述多分散小滴包括多种乳剂。
124.根据权利要求111所述的方法，其中所述多分散小滴包括多种乳剂。
125.根据权利要求124所述的方法，通过组合三种或多于三种不混溶流体来制备所述多种乳剂。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述三种或多于三种不混溶流体包括第一流体、第二流体和第三流体。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述第一流体是含水的。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述第二流体是油。
129.根据权利要求127所述的方法，其中所述第二流体与所述第一流体和所述第三流体不混溶。
130.根据权利要求127所述的方法，其进一步包括将所述不混溶的第一、第二或第三流体中的至少一者转化成凝胶或固体。
131.根据权利要求126所述的方法，其中所述第一流体不同于所述第三流体。
132.根据权利要求126所述的方法，其中所述第三流体是油，且其中所述第三流体与所述第一流体和所述第二流体不混溶。
133.根据权利要求132所述的方法，其进一步包括将所述不混溶的第三流体转化成固体或凝胶。
134.根据权利要求126所述的方法，其中所述第一流体包括用于检测的样本。
135.根据权利要求126所述的方法，其中所述第一流体的折射率与所述第二流体的折射率相差少于200％、少于100％、少于60％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
136.根据权利要求111所述的方法，其中所述多个多分散小滴进一步包括流体界面改性元素。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述流体界面改性元素包括表面活性剂。
138.根据权利要求136所述的方法，其中所述流体界面改性元素包括以下各者中的至少一者：脂类、磷脂、糖脂、蛋白质、肽、纳米粒子、聚合物、沉淀物、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子，或其组合。
139.根据权利要求111所述的方法，其中小滴直径分布具有比中值小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
140.根据权利要求111所述的方法，其中所述小滴直径分布具有比平均小滴直径大1000％、大500％、大100％、大50％、大30％、大20％、大15％、大10％、大9％、大8％、大7％、大6％或大5％的标准偏差。
141.根据权利要求111所述的方法，其中所述多分散小滴中的所述体积可变化多于2倍、多于10倍、多于100倍、多于1000倍、多于10000倍、多于100000倍、多于1000000倍、多于大约2倍、多于大约10倍、多于大约100倍、多于大约1000倍、多于大约10000倍、多于大约100000倍或多于1000000倍。
142.根据权利要求111所述的方法，其中所述多分散小滴具有以下范围的体积分布：从100毫微升(nL)到1毫微微升(fL)、从10nL到10fL、从1nL到100fL、从100nL到1pL、从10nL到10pL，或从1nL到1pL、从大约500pL到大约50fL、从大约100pL到大约100fL。
143.根据权利要求111所述的方法，其进一步包括扩增所述多个多分散小滴中的用于检测的样本。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述多分散小滴的平均体积在扩增所述样本期间改变少于50％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％，或少于1％。
145.根据权利要求143所述的方法，其中所述扩增所述样本包括第一扩增循环，且其中少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于19％、少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的所述多分散小滴在所述第一扩增循环之后融合。
146.根据权利要求93所述的方法，其中识别所述图像栈的所述个别图像中的所述至少一个像素组包括：在所述个别图像内获得多个扫描；设置阈值水平；以及将所述阈值水平之外的所述多个所述扫描中的区域识别为所述像素组。
147.根据权利要求93所述的方法，其中将所述至少一个像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分包括：确定所述至少一个像素组的纵横比。
148.根据权利要求147所述的方法，其中在所述至少一个像素组的所述纵横比小于或等于阈值时将所述至少一个像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述阈值是1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2。
150.根据权利要求148所述的方法，其中所述阈值足以排除不含有所述样本的至少一部分的小滴。
151.根据权利要求93所述的方法，其中将所述像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分包括：执行反向分水线方法。
152.根据权利要求151所述的方法，其中执行所述反向分水线方法包括：
基于所述图像栈的所述个别图像的像素强度而产生地图；
识别所述地图中的一或多个像素组；
将个别像素组识别为所关注区；以及
使所述所关注区的边界与至少一个最佳拟合圆拟合。
153.根据权利要求152所述的方法，其进一步包括将所述至少一个最佳拟合圆识别为至少一个小滴。
154.根据权利要求152所述的方法，其进一步包括在产生所述地图之前使所述图像栈的所述个别图像平滑。
155.根据权利要求152所述的方法，其中基于所述图像栈的所述个别图像的像素强度而产生的所述地图包括拓扑地图。
156.根据权利要求152所述的方法，其中识别所述一或多个像素组包括：基于个别像素的所述像素强度以及一或多个阈值而确定所述个别像素是否包括背景像素或小滴像素。
157.根据权利要求152所述的方法，其中在所述个别像素组具有高于最小所需区域的区域时将所述个别像素组识别为所关注区。
158.根据权利要求152所述的方法，其进一步包括确定所述个别像素组是否包括多个所关注区，且将所述多个所关注区组合为单个所关注区。
159.根据权利要求93所述的方法，其中将所述像素组识别为至少一个小滴的至少一部分包括：执行圆检测方法。
160.根据权利要求159所述的方法，其中执行所述圆检测方法包括：
识别阈值之外的所述图像栈的所述个别图像的一或多个区域；
将多个圆叠加在所述所识别的一或多个区域上方；
在所述所叠加的多个圆中的一或多个圆不满足至少一个预定准则时拒绝所述一或多个圆；以及
将一或多个剩余圆识别为对应于至少一个小滴的所述至少一部分。
161.根据权利要求93所述的方法，其中将所述至少一个像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分包括：执行组合式反向分水线与圆检测方法。
162.根据权利要求161所述的方法，其中执行所述组合式反向分水线与圆检测方法包括：
基于所述图像栈的所述个别图像的像素强度而产生地图；
识别所述所产生的地图中的一或多个像素组；
将个别像素组识别为所关注区；
将多个圆叠加在所述所关注区上方；
在所述所叠加的多个圆中的一或多个圆不满足至少一个预定准则时拒绝所述一或多个圆；以及
将一或多个剩余圆识别为对应于至少一个小滴的所述至少一部分。
163.根据权利要求162所述的方法，其进一步包括在产生所述地图之前使所述图像栈的所述个别图像平滑。
164.根据权利要求162所述的方法，其中基于所述图像栈的所述个别图像的像素强度的所述地图包括拓扑地图。
165.根据权利要求162所述的方法，其中识别所述一或多个像素组包括：基于个别像素的所述像素强度以及一或多个阈值而将所述个别像素识别为背景像素或小滴像素。
166.根据权利要求162所述的方法，其中在所述个别像素组具有高于最小所需区域的区域的情况下将所述个别像素组确定为包括所关注区。
167.根据权利要求162所述的方法，其中所述至少一个预定准则包括以下各者中的一或多者：(i)选择包含所述所关注区的外部边界像素的最大分数的一或多个圆；(ii)选择包含所述所关注区的区域的最大分数的一或多个圆；(iii)拒绝包含来自与所述所关注区不同的像素群组的像素的一或多个圆；(iv)拒绝包含大量非群组像素的一或多个圆；或(v)排斥在所述像素群组的内部中具有它们的圆周的巨大分数的一或多个圆。
168.根据权利要求162所述的方法，其中拒绝所述一或多个圆包括成对地检查所述多个所叠加的圆。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述被检查的圆包括第一圆和第二圆，且所述方法进一步包括基于投票而拒绝所述第一圆或第二圆中的一者。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述投票是用户定义的。
171.根据权利要求162所述的方法，其中将所述一或多个剩余圆识别为对应于至少一个小滴的所述至少一部分包括：将所述一或多个剩余圆指派给至少一个小滴的所述至少一部分。
172.根据权利要求171所述的方法，其中基于以下各者中的一或多者而将所述一或多个圆指派给所述至少一个小滴：(i)将所述所关注区指派给至少一个小滴，所述至少一个小滴具有与所述至少一个小滴具有最佳拟合优度统计的圆；或(ii)将所述所关注区指派给在区域上与所述一或多个圆具有最大重叠的所述至少一个小滴。
173.根据权利要求162所述的方法，其中基于所述至少一个像素组而确定所述所识别的至少一个个别小滴的所述体积包括：将所述一或多个所识别的圆的一或多个直径确定为对应于所述所识别的至少一个个别小滴。
174.一种用于执行数字检定的系统，所述系统包括：
容器，其被配置成用于保持多个多分散小滴，其中所述小滴中的至少一些小滴包括使用可检测剂标记的样本；
成像源，其被配置成获得所述容器中保持的所述多个多分散小滴的图像栈；以及
计算装置，其被配置成操作所述成像源，所述计算装置包括处理器和非暂时性有形计算机可读存储媒体，所述存储媒体存储一组指令，所述一组指令在由所述处理器执行时致使：
(i)所述成像源获得所述容器中保持的所述多个多分散小滴的所述图像栈，
(ii)所述处理器基于所述所获得的图像栈而确定所述多个多分散小滴的体积，
(iii)所述处理器确定所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的存在或不存在，以及
(iv)所述处理器基于所述可检测剂在所述多个多分散小滴中的所述存在或不存在以及所述多个多分散小滴的所述体积而确定所述多个小滴中的所述样本的浓度。
175.根据权利要求174所述的系统，其中所述容器包括多井板。
176.根据权利要求174所述的系统，其中所述成像源包括光学成像源。
177.根据权利要求176所述的系统，其中所述光学成像源被配置成执行以下各者中的一或多者：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、Bessel光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、落射荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明，或其组合。
178.根据权利要求174所述的系统，其中所述所获得的图像栈包括从穿过单个小滴的单独焦深取得的多个图像。
179.根据权利要求178所述的系统，其中所述图像栈包括从针对所述单个小滴的单独焦深取得的2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个图像。
180.根据权利要求174所述的系统，其中所述一组指令在由所述处理器执行时致使所述处理器通过以下操作来确定所述多个多分散小滴的所述体积：(i)识别所述图像栈的至少一个个别图像中的至少一个像素组；(ii)将所述至少一个像素组识别为对应于至少一个小滴的至少一部分；(iii)基于所述对应而识别至少一个个别小滴；以及(iv)基于所述至少一个像素组而确定所述所识别的至少一个个别小滴的所述体积。
181.根据权利要求180所述的系统，其中至少一个小滴的所述至少一部分包括单个小滴、多个小滴的多个部分、整个小滴、多个整个小滴，或其组合。
182.根据权利要求175所述的系统，其中所述样本包括核苷酸。
183.根据权利要求175所述的系统，其中所述样本已被扩增。
184.根据权利要求175所述的系统，其中所述可检测剂是荧光的或冷光的。
185.根据权利要求174所述的系统，其中所述多个多分散小滴包括第一流体和第二流体，所述第一流体与所述第二流体不混溶。
186.根据权利要求1到47或109到110中任一权利要求所述的方法，其中由自适应光学器件执行所述光学成像。
187.根据权利要求76到77或176到177中任一权利要求所述的系统，其中所述光学成像源是自适应光学器件成像源。
188.根据权利要求1到49、92到173或186中任一权利要求所述的方法，其包括仅在小滴包括样本的情况下才测量所述小滴的体积。
189.根据权利要求188所述的方法，其包括将被确定为不包括所述样本的任何小滴排除在测量之外。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110156648.8A CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201461976918P | 2014-04-08 | 2014-04-08 | |
| US61/976,918 | 2014-04-08 | ||
| US201462047570P | 2014-09-08 | 2014-09-08 | |
| US62/047,570 | 2014-09-08 | ||
| PCT/US2015/024840 WO2015157369A1 (en) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | Methods and apparatus for performing digital assays using polydisperse droplets |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110156648.8A Division CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106414772A true CN106414772A (zh) | 2017-02-15 |
| CN106414772B CN106414772B (zh) | 2021-02-19 |
Family
ID=54288355
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110156648.8A Pending CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
| CN201580029257.2A Active CN106414772B (zh) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110156648.8A Pending CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2015-04-08 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10619192B2 (zh) |
| EP (2) | EP3653727A1 (zh) |
| JP (4) | JP6635939B2 (zh) |
| CN (2) | CN113215221A (zh) |
| WO (1) | WO2015157369A1 (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107978018A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-01 | 广州视源电子科技股份有限公司 | 立体图形模型的构建方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN109182469A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-01-11 | 暨南大学 | 基于数字lamp技术检测阪崎肠杆菌的引物及试剂盒与方法 |
| CN110176277A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-27 | 福州大学 | 一套基于图像识别技术的智能qPCR仪检测系统 |
| CN110218776A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 苏州叠代生物科技有限公司 | Pcr油相组合物及其制备方法 |
| CN110689926A (zh) * | 2018-06-19 | 2020-01-14 | 上海交通大学 | 一种高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法 |
| WO2021102942A1 (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-03 | 深圳华大智造科技有限公司 | 随机乳化数字绝对定量分析方法及装置 |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2665995B1 (en) | 2011-01-20 | 2018-08-29 | University of Washington through its Center for Commercialization | Methods and systems for performing digital measurements |
| CA2881783A1 (en) | 2012-08-13 | 2014-02-20 | The Regents Of The University Of California | Methods and systems for detecting biological components |
| GB2516684A (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-04 | Sphere Fluidics Ltd | Microfluidic devices and systems |
| CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2021-08-06 | 华盛顿大学商业中心 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
| WO2015200717A2 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | The Regents Of The University Of California | Pcr-activated sorting (pas) |
| WO2016065056A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | The Regents Of The University Of California | High definition microdroplet printer |
| US20170022538A1 (en) * | 2015-02-04 | 2017-01-26 | The Regents Of The University Of California | Multiple-emulsion nucleic acid amplification |
| US11111519B2 (en) | 2015-02-04 | 2021-09-07 | The Regents Of The University Of California | Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities |
| US10318845B2 (en) * | 2016-04-14 | 2019-06-11 | Research International, Inc. | Coupon reader |
| FR3050269B1 (fr) * | 2016-04-15 | 2018-05-11 | Ecole Superieure De Physique Et De Chimie Industrielles De La Ville De Paris (Espci) | Procede de selection et de recuperation de produits et systeme associe |
| EP3269444A1 (en) * | 2016-07-14 | 2018-01-17 | Base4 Innovation Ltd | Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer |
| WO2018031691A1 (en) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | The Regents Of The University Of California | Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet |
| JP2019536001A (ja) * | 2016-09-08 | 2019-12-12 | アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ | 自動体液分析 |
| CA3041043A1 (en) * | 2016-10-24 | 2018-05-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Ultra-high throughput detection of fluorescent droplets using time domain encoded optofluidics |
| CN110462053A (zh) | 2016-12-21 | 2019-11-15 | 加利福尼亚大学董事会 | 使用基于水凝胶的液滴进行单细胞基因组测序 |
| JP2019013218A (ja) * | 2017-07-06 | 2019-01-31 | キヤノン株式会社 | 分析システム、分析方法、プログラム、および記憶媒体 |
| JP2019024366A (ja) * | 2017-07-27 | 2019-02-21 | キヤノン株式会社 | 分析システム、分析方法、プログラム、および記憶媒体 |
| JP2019030273A (ja) * | 2017-08-09 | 2019-02-28 | キヤノン株式会社 | 分析システム、分析方法、プログラム、および記憶媒体 |
| WO2019055030A1 (en) * | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | DISTRIBUTION OF DNA CONCENTRATE |
| US20210011045A1 (en) * | 2017-09-15 | 2021-01-14 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Dna concentrate dispensing |
| US10501739B2 (en) | 2017-10-18 | 2019-12-10 | Mission Bio, Inc. | Method, systems and apparatus for single cell analysis |
| US11753681B2 (en) | 2017-11-03 | 2023-09-12 | University Of Washington | Digital nucleic acid amplification using encoded particles |
| DE102017125799A1 (de) * | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Carl Zeiss Industrielle Messtechnik Gmbh | Reduktion von Bildstörungen in Bildern |
| JP6446151B1 (ja) * | 2017-11-13 | 2018-12-26 | 株式会社リコー | 検査デバイス及びデバイス |
| WO2019152216A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-08 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Systems and methods for robust background correction and/or emitter localization for super-resolution localization microscopy |
| KR102099151B1 (ko) * | 2018-03-05 | 2020-04-10 | 서강대학교산학협력단 | 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치 |
| JP7164978B2 (ja) * | 2018-06-29 | 2022-11-02 | キヤノン株式会社 | 粒子測定方法、粒子測定装置及び核酸濃度測定システム |
| GB2578299A (en) * | 2018-10-19 | 2020-05-06 | Institute Of Tech Sligo | Systems for controlling an emulsification process |
| US11305284B2 (en) * | 2018-11-26 | 2022-04-19 | Tokitae, LLC | Determining a bulk concentration of a target in a sample using a digital assay with compartments having nonuniform volumes |
| JP2022532170A (ja) * | 2019-05-10 | 2022-07-13 | インテグレーテッド ナノ－テクノロジーズ，インコーポレイティド | Ｒｎａ転写物の分析システム及び方法 |
| US11423306B2 (en) * | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| EP3973074A4 (en) | 2019-05-22 | 2023-09-06 | Mission Bio, Inc. | METHOD AND DEVICE FOR SIMULTANEOUS TARGETED SEQUENCING OF DNA, RNA AND PROTEIN |
| US11667954B2 (en) | 2019-07-01 | 2023-06-06 | Mission Bio, Inc. | Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments |
| US20210054369A1 (en) * | 2019-08-20 | 2021-02-25 | Fluent Biosciences Inc. | Hairpin primer design for sequential pcr production of targeted sequencing libraries |
| JP2021097648A (ja) * | 2019-12-23 | 2021-07-01 | 横河電機株式会社 | 核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法 |
| US11512337B2 (en) | 2020-01-13 | 2022-11-29 | Fluent Biosciences Inc. | Emulsion based drug screening |
| WO2021146184A1 (en) | 2020-01-13 | 2021-07-22 | Fluent Biosciences Inc. | Single cell sequencing |
| WO2021146166A1 (en) | 2020-01-13 | 2021-07-22 | Fluent Biosciences Inc. | Methods and systems for single cell gene profiling |
| CN114981642A (zh) * | 2020-02-14 | 2022-08-30 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 基于图像分析液滴的方法、计算机装置及存储介质 |
| WO2021188500A1 (en) | 2020-03-16 | 2021-09-23 | Fluent Biosciences Inc. | Multi-omic analysis in monodisperse droplets |
| CN115697561A (zh) | 2020-04-15 | 2023-02-03 | 伊努梅里斯公司 | 用于产生具有合适澄清度的乳剂的系统和方法及其应用 |
| TWI750907B (zh) * | 2020-11-19 | 2021-12-21 | 廣普生物科技股份有限公司 | 微量管組件及微量管操作系統 |
| EP4301499A1 (en) | 2021-03-05 | 2024-01-10 | Enumerix, Inc. | Systems and methods for generating droplets and performing digital analyses |
| EP4351788A1 (en) | 2021-06-04 | 2024-04-17 | Enumerix, Inc. | Compositions, methods, and systems for single cell barcoding and sequencing |
| US11834714B2 (en) | 2021-12-20 | 2023-12-05 | Enumerix, Inc. | Detection and digital quantitation of multiple targets |
| CN114540469A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-05-27 | 深圳大学 | 一种基于非均一体积液滴和图像处理的数字核酸定量方法 |
| CN114549528B (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 浙江大学 | 一种微液滴数字pcr液滴检测方法及系统 |
| WO2023225106A1 (en) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System and method for automated digital polymerase chain reaction |
| CN116930016B (zh) * | 2023-09-18 | 2023-11-28 | 江苏希诚新材料科技有限公司 | 一种纳米浆料沉降特性测试装置 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110261164A1 (en) * | 2008-12-05 | 2011-10-27 | Unisensor A/S | Optical sectioning of a sample and detection of particles in a sample |
| WO2012135667A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Life Technologies Corporation | System and method for determining copies-per-unit-volume using pcr and flow control of droplets |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5665539A (en) * | 1991-07-12 | 1997-09-09 | The Regents Of The University Of California | Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection |
| JPH10253522A (ja) * | 1997-03-10 | 1998-09-25 | Mitsubishi Chem Corp | 画像処理方法 |
| EP1360349A1 (en) * | 2001-01-19 | 2003-11-12 | Chemical Holovoice AB | System and method for screening of nucleation tendency of a molecule in a levitated droplet |
| JP3875653B2 (ja) * | 2003-06-05 | 2007-01-31 | 正昭 川橋 | 小滴の状態計測装置、及び状態計測方法 |
| EP2532745B1 (en) * | 2003-07-05 | 2015-09-09 | The Johns Hopkins University | Method and Compositions for Detection and Enumeration of Genetic Variations |
| US7598033B2 (en) | 2003-12-15 | 2009-10-06 | University Of Pennsylvania | Method and devices for running reactions on a target plate for MALDI mass spectrometry |
| US8289274B2 (en) * | 2004-01-13 | 2012-10-16 | Sliwa John W | Microdroplet-based 3-D volumetric displays utilizing emitted and moving droplet projection screens |
| US20070099288A1 (en) | 2005-11-02 | 2007-05-03 | Affymetrix, Inc. | Microfluidic Methods, Devices, and Systems for Fluid Handling |
| US20100105025A1 (en) | 2006-10-12 | 2010-04-29 | Engelhard Eric K | Devices for generating detectable polymers |
| DE102006053540B3 (de) * | 2006-11-14 | 2008-01-31 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Vorrichtung und Verfahren zur Analyse biologischer Proben |
| WO2008109176A2 (en) * | 2007-03-07 | 2008-09-12 | President And Fellows Of Harvard College | Assays and other reactions involving droplets |
| CN101679932A (zh) | 2007-06-27 | 2010-03-24 | 数字化生物系统 | 用于热交换化学过程的基于数字微流体的装置 |
| CA2639954C (en) | 2008-02-11 | 2017-08-15 | Aaron R. Wheeler | Droplet-based cell culture and cell assays using digital microfluidics |
| US9417190B2 (en) * | 2008-09-23 | 2016-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
| EP2347245B1 (en) | 2008-09-23 | 2021-11-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay method |
| US8586126B2 (en) | 2008-10-21 | 2013-11-19 | Molecular Imprints, Inc. | Robust optimization to generate drop patterns in imprint lithography which are tolerant of variations in drop volume and drop placement |
| US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
| KR101796906B1 (ko) | 2009-03-24 | 2017-11-10 | 유니버시티 오브 시카고 | 반응을 수행하기 위한 방법 |
| US20130288254A1 (en) * | 2009-08-13 | 2013-10-31 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet Actuator and Droplet-Based Techniques |
| US20120184464A1 (en) * | 2010-09-30 | 2012-07-19 | The Regents Of The University Of California | System and method for high density assembly and packing of micro-reactors |
| EP2665995B1 (en) | 2011-01-20 | 2018-08-29 | University of Washington through its Center for Commercialization | Methods and systems for performing digital measurements |
| EP2721177B1 (en) * | 2011-06-17 | 2017-05-24 | Life Technologies Corporation | Flat-field imaging system and methods of use |
| EP3798717B1 (en) * | 2012-02-16 | 2023-07-05 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Extended depth of focus for high-resolution image scanning |
| CN113215221A (zh) | 2014-04-08 | 2021-08-06 | 华盛顿大学商业中心 | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 |
| JP6642360B2 (ja) | 2016-09-23 | 2020-02-05 | ブラザー工業株式会社 | 印刷装置 |
-
2015
- 2015-04-08 CN CN202110156648.8A patent/CN113215221A/zh active Pending
- 2015-04-08 CN CN201580029257.2A patent/CN106414772B/zh active Active
- 2015-04-08 WO PCT/US2015/024840 patent/WO2015157369A1/en active Application Filing
- 2015-04-08 EP EP19214238.8A patent/EP3653727A1/en active Pending
- 2015-04-08 US US15/301,798 patent/US10619192B2/en active Active
- 2015-04-08 EP EP15776098.4A patent/EP3129502B1/en active Active
- 2015-04-08 JP JP2016561834A patent/JP6635939B2/ja active Active
-
2019
- 2019-12-17 JP JP2019227458A patent/JP6985750B2/ja active Active
-
2020
- 2020-03-06 US US16/812,173 patent/US11427857B2/en active Active
-
2021
- 2021-09-07 JP JP2021145212A patent/JP2022008337A/ja active Pending
-
2022
- 2022-07-19 US US17/813,415 patent/US11939626B2/en active Active
-
2023
- 2023-07-18 JP JP2023116662A patent/JP2023156303A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110261164A1 (en) * | 2008-12-05 | 2011-10-27 | Unisensor A/S | Optical sectioning of a sample and detection of particles in a sample |
| WO2012135667A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Life Technologies Corporation | System and method for determining copies-per-unit-volume using pcr and flow control of droplets |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PENFOLD, R.等: "Quantitative Imaging of Aggregated Emulsions", 《LANGMUIR》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107978018A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-01 | 广州视源电子科技股份有限公司 | 立体图形模型的构建方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN107978018B (zh) * | 2017-12-22 | 2022-07-05 | 广州视源电子科技股份有限公司 | 立体图形模型的构建方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN110689926A (zh) * | 2018-06-19 | 2020-01-14 | 上海交通大学 | 一种高通量数字pcr图像液滴的准确检测方法 |
| CN109182469A (zh) * | 2018-08-24 | 2019-01-11 | 暨南大学 | 基于数字lamp技术检测阪崎肠杆菌的引物及试剂盒与方法 |
| CN110176277A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-27 | 福州大学 | 一套基于图像识别技术的智能qPCR仪检测系统 |
| CN110218776A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-10 | 苏州叠代生物科技有限公司 | Pcr油相组合物及其制备方法 |
| WO2021102942A1 (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-03 | 深圳华大智造科技有限公司 | 随机乳化数字绝对定量分析方法及装置 |
| CN114729397A (zh) * | 2019-11-29 | 2022-07-08 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 随机乳化数字绝对定量分析方法及装置 |
| CN114729397B (zh) * | 2019-11-29 | 2024-04-23 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 随机乳化数字绝对定量分析方法及装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017519484A (ja) | 2017-07-20 |
| EP3653727A1 (en) | 2020-05-20 |
| CN113215221A (zh) | 2021-08-06 |
| EP3129502A1 (en) | 2017-02-15 |
| JP6635939B2 (ja) | 2020-01-29 |
| US11939626B2 (en) | 2024-03-26 |
| WO2015157369A1 (en) | 2015-10-15 |
| JP2020060579A (ja) | 2020-04-16 |
| CN106414772B (zh) | 2021-02-19 |
| US20220356512A1 (en) | 2022-11-10 |
| US20170175174A1 (en) | 2017-06-22 |
| JP2022008337A (ja) | 2022-01-13 |
| US20200208202A1 (en) | 2020-07-02 |
| EP3129502A4 (en) | 2017-12-13 |
| EP3129502B1 (en) | 2020-02-12 |
| US11427857B2 (en) | 2022-08-30 |
| US10619192B2 (en) | 2020-04-14 |
| JP2023156303A (ja) | 2023-10-24 |
| JP6985750B2 (ja) | 2021-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106414772A (zh) | 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备 | |
| CN103429997B (zh) | 进行数字测量的方法和系统 | |
| US20230122742A1 (en) | System and method for determining copies-per-unit-volume using pcr and flow control of droplets | |
| JP2017519484A5 (zh) | ||
| CN107407685A (zh) | 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法 | |
| US20220065767A1 (en) | Flat-Field Imaging System and Methods of Use | |
| Kim et al. | Development of on-chip multi-imaging flow cytometry for identification of imaging biomarkers of clustered circulating tumor cells | |
| Zhang et al. | Digital PCR system development accelerator—A methodology to emulate dPCR results | |
| Lin et al. | Practical, microfabrication-free device for single-cell isolation | |
| Wei et al. | Deep‐qGFP: A Generalist Deep Learning Assisted Pipeline for Accurate Quantification of Green Fluorescent Protein Labeled Biological Samples in Microreactors | |
| Wei et al. | Deep Learning Approach for Large-Scale, Real-Time Quantification of Green Fluorescent Protein-Labeled Biological Samples in Microreactors | |
| Gopal | Engineering Principles for Quantitative Measurement Tools for Single-Cell Biology and Pandemic Response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |