CN106405119A - 凝固时间测定方法及装置、凝固时间测定用试剂及试剂盒 - Google Patents

凝固时间测定方法及装置、凝固时间测定用试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供即使使用含有肝素的待测样品时，也可高灵敏度测定凝固时间的新的手段。在凝固时间的测定时，通过将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合得到样品，将得到的样品和钙盐混合而调制测定样品，测定测定样品的凝固时间。

Description

凝固时间测定方法及装置、凝固时间测定用试剂及试剂盒
【技术领域】
本发明涉及凝固时间的测定方法及其装置、凝固时间测定用试剂以及试剂盒。
【背景技术】
活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)在作为抗凝固药剂的肝素的浓度的监测中使用(参照美国专利No.5705396)。在美国专利No.5705396中记载，在APTT测定时，如果采用含铜盐或锌盐的APTT测定用试剂，则肝素的活性降低。
但是，即使在使用含有肝素的待测样品时，也期望高灵敏度测定凝固时间。
【发明概述】
本发明的范围仅由随附的权利要求确定，而不受此发明概述部分的任何影响。
本发明提供以下技术方案。
(1)凝固时间的测定方法，其包括：
(A)将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合而得到样品的工序、及
(B)将上述工序(A)中得到的样品和钙盐混合而调制测定样品，测定测定样品的凝固时间的工序。
(2)(1)所述的方法，其中上述工序(A)包括：
(A1-1)将血液待测样品和活化剂和磷脂混合的工序、及
(A1-2)将上述工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物混合的工序。
(3)(1)或(2)所述的方法，其中上述工序(A)中得到的样品中的上述镍离子形成化合物的终浓度是0.1μM以上、不足10mM。
(4)(1)～(3)之任一项所述的方法，其中上述工序(A)中得到的样品中的上述镍离子形成化合物的终浓度是0.1mM以上、不足5mM。
(5)(1)～(4)之任一项所述的方法，其中在上述工序(B)中，将上述工序(A)中得到的样品在指定条件下温育后，向上述样品混合钙盐。
(6)(5)所述的方法，其中上述指定条件是以30℃以上45℃以下的温度温育的条件。
(7)(5)所述的方法，其中上述指定条件是以36℃以上38℃以下的温度温育的条件。
(8)(5)～(7)之任一项所述的方法，其中上述指定条件是以1分钟以上6分钟以下的加温时间温育的条件。
(9)(5)～(7)之任一项所述的方法，其中上述指定条件是以2分钟以上5分钟以下的加温时间温育的条件。
(10)(5)所述的方法，其中上述指定条件是以36℃以上38℃以下的温度温育2分钟以上5分钟以下的条件。
(11)(1)～(10)之任一项所述的方法，其中上述镍离子形成化合物是选自醋酸镍、磷化镍、硫化镍、氯化镍、硫酸镍及安息香酸镍的化合物。
(12)凝固时间的测定装置，其具备：
将血液待测样品、活化剂、磷脂、镍离子形成化合物和钙盐混合而调制测定样品的样品调制部，
从上述样品调制部中得到的测定样品取得显示伴随凝固反应的变化的凝固信息的检测部，
基于由上述检测部取得的光学信息，算出上述测定样品的凝固时间的算出部，及
收容活化剂、磷脂、镍离子形成化合物和钙盐的试剂收容部，
其中上述样品调制部
从上述试剂收容部取得上述活化剂、上述磷脂及上述镍离子形成化合物，将上述活化剂、上述磷脂、上述镍离子形成化合物和血液待测样品混合而调制样品，
从上述试剂收容部取得上述钙盐，将上述钙盐和上述样品混合而得到测定样品。
(13)(12)所述的凝固时间的测定装置，其中上述样品调制部将上述样品在指定条件下温育后，向上述样品混合钙盐。
(14)(13)所述的凝固时间的测定装置，其中上述样品调制部是，作为上述指定条件，以30℃以上45℃以下的温度温育。
(15)(13)或(14)所述的凝固时间的测定装置，其中上述样品调制部是，作为上述指定条件，以1分钟以上6分钟以下的加温时间温育。
(16)用于在(1)～(11)之任一项所述的凝固时间的测定方法中使用的凝固时间测定用试剂，其含有镍离子形成化合物。
(17)(16)所述的凝固时间测定用试剂，其中上述镍离子形成化合物是选自醋酸镍、磷化镍、硫化镍、氯化镍、硫酸镍及安息香酸镍的化合物。
(18)试剂盒，其含：
第1试剂容器中收容的含活化剂和磷脂的第1试剂，
第2试剂容器中收容的含镍离子形成化合物的第2试剂，及
第3试剂容器中收容的含钙盐的第3试剂。
(19)(18)所述的试剂盒，其中上述试剂盒是用于在(1)～(11)之任一项所述的凝固时间的测定方法中使用的试剂盒。
(20)下列物质用于制造试剂盒的用途：第1试剂容器中收容的含活化剂和磷脂的第1试剂、第2试剂容器中收容的含镍离子形成化合物的第2试剂、及第3试剂容器中收容的含钙盐的第3试剂。
【发明的效果】
由本发明可提供，即使在使用含有肝素的待测样品时，也可高灵敏度测定凝固时间的凝固时间的测定方法及其装置、凝固时间测定用试剂以及试剂盒。
【附图说明】
图1是凝固时间的测定装置的构成图。
图2是显示由测定装置的凝固时间的测定的处理顺序的流程图。
图3是显示样品的调制工序的处理顺序的流程图。
图4是显示样品的调制工序的处理顺序的流程图。
图5是显示向样品的钙盐的添加工序及光学信息的取得工序的处理顺序的流程图。
图6是试剂盒的构成图。
图7是显示将由实施例1的测定方法测得的凝固时间与由比较例1的测定方法测得的凝固时间对比的结果的坐标图。
图8是显示在实施例2及比较例2～5中研究肝素浓度和APTT比的关系的结果的坐标图。
【实施方式】
【1.凝固时间的测定方法】
本实施方式涉及的凝固时间的测定方法(以下，也简称为“测定方法”)的特征在于包括(A)将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合而得到样品的工序、及(B)将工序(A)中得到的样品和钙盐混合而调制测定样品，测定测定样品的凝固时间的工序。本实施方式涉及的测定方法，在工序(A)中，在得到样品时，将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合。从而，由本实施方式中涉及的测定方法，即使在使用含有肝素的待测样品时，也能高灵敏度测定凝固时间。
再者，在本说明书中，“样品”是指血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物的混合物。另外，“测定样品”是指血液待测样品、活化剂、磷脂、镍离子形成化合物和钙盐的混合物。
作为血液待测样品，例如，可举出血浆等，但不特别限定。在本说明书中，“正常血浆”是指从健康者的血液得到的血浆。正常血浆也可为市售的正常血浆。作为被检血浆，例如，可举出从被检者得到的血浆、从被检者得到且含肝素的血浆等，但不特别限定。
活化剂是有使与内源性凝固途径相关的接触因子活化的作用的物质即可。作为接触因子，例如，可举出前激肽释放酶、高分子激肽原、第XII因子、第XI因子等，但不特别限定。作为活化剂，例如，可举出鞣花酸化合物、氧化硅、高岭土、硅藻土(例如，硅藻土公司制、商品名：硅藻土(注册商标)等)等，但不特别限定。这些活化剂可单独使用，也可将2种以上混合使用。鞣花酸化合物是指含鞣花酸、鞣花酸的盐及鞣花酸的金属络合物的概念。
磷脂促进血液的凝固反应。磷脂是分子结构中有磷酸酯部位的脂质。磷脂可为天然来源磷脂，也可为合成磷脂。作为天然来源磷脂，例如，可举出兔、牛、猪、鸡、人等的动物、大豆等的植物来源的磷脂等，但不特别限定。作为动物来源的磷脂，例如，可举出兔脑、牛脑、卵黄、人胎盘等来源的磷脂等，但不特别限定。作为磷脂，具体而言，例如，可举出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等的甘油磷脂等，但不特别限定。在这些磷脂之中，为了血液的凝固反应有效率地进行，优选为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。这些磷脂可单独使用，也可将2种以上混合使用。作为磷脂所具有的脂肪酸侧链，例如，可举出棕榈酰基、油酰基、硬脂酰基等，但不特别限定。这些脂肪酸侧链可在不妨碍血液的凝固反应的范围适宜选择。
镍离子形成化合物是在血液待测样品中形成镍离子的化合物即可。镍离子形成化合物优选为形成2价阳离子的化合物。作为镍离子形成化合物，例如，可举出醋酸镍、磷化镍、硫化镍、氯化镍、硫酸镍等，但不特别限定。这些镍离子形成化合物之中，优选为醋酸镍。这些镍离子形成化合物可单独使用，也可将2种以上混合使用。
钙盐是在测定样品中形成钙离子的盐即可。作为钙盐，可举出氯化钙、硫酸钙、亚硝酸钙、碳酸钙、乳酸钙、酒石酸钙等，但不特别限定。这些钙盐可单独使用，也可将2种以上混合使用。
在工序(A)中，将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合而得到样品。在工序(A)之前，也可将血液待测样品加温到对于进行凝固反应适宜的温度。血液待测样品的加温温度通常，优选为30～45℃、更优选为36～38℃。
在工序(A)中，将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物的混合的顺序不特别限定。工序(A)，例如，分为以下的实施方式。
(实施方式1)将血液待测样品、活化剂和磷脂混合后，添加镍离子形成化合物的工序
(实施方式2)将血液待测样品和镍离子形成化合物混合后，添加活化剂及磷脂的工序
(实施方式3)向血液待测样品同时添加活化剂、磷脂和镍离子形成化合物的工序
在实施方式1中，工序(A)，例如，含以下的工序(A1-1)及(A1-2)。
(A1-1)将血液待测样品、活化剂和磷脂混合的工序、及
(A1-2)将工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物混合的工序。
以下，举实施方式1为例进行说明，但本实施方式涉及的测定方法不特别限定。在工序(A1-1)中，将血液待测样品、活化剂和磷脂混合而得到混合物。血液待测样品、活化剂和磷脂的混合的顺序不特别限定。也可将活化剂及磷脂同时与血液待测样品混合。另外，也可将活化剂及磷脂在不同的时机与血液待测样品混合。此时，可在向血液待测样品的活化剂的添加后添加磷脂，也可在向血液待测样品的磷脂的添加后添加活化剂。
在工序(A1-1)中，与血液待测样品混合的活化剂的量是测定样品中的活化剂的浓度成为指定浓度的量即可。测定样品中的活化剂的浓度可根据活化剂的种类适宜设定。当活化剂是鞣花酸化合物时，测定样品中的活化剂的浓度通常优选为3.5～150μM、更优选是10～50μM。活化剂是氧化硅时，测定样品中的活化剂的浓度通常优选为0.04～0.4mg/mL、更优选是0.07～0.2mg/mL。
在工序(A1-1)中，与血液待测样品混合的磷脂的量是测定样品中的磷脂的浓度成为指定浓度的量即可。测定样品中的磷脂的浓度可根据磷脂的种类适宜设定。磷脂是磷脂酰乙醇胺时，测定样品中的磷脂的浓度通常优选为1～150μg/mL、更优选是5～50μg/mL。磷脂是磷脂酰胆碱时，测定样品中的磷脂的浓度通常优选为1～100μg/mL、更优选是5～80μg/mL。磷脂是磷脂酰丝氨酸时，测定样品中的磷脂的浓度通常优选为0.1～50μg/mL、更优选是1～10μg/mL。磷脂是2种以上的磷脂的混合物时，测定样品中的各磷脂的浓度的合计通常优选为5～400μg/mL、更优选是20～100μg/mL。
血液待测样品和活化剂及/或磷脂的混合时的加温温度是对于进行血液的凝固反应适宜的温度即可。加温温度通常优选为30～45℃、更优选为于36～38℃。另外，加温时间通常优选为10～150秒钟、更优选是30～90秒钟。
在工序(A1-2)中，将工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物混合而得到样品。
在工序(A1-2)中，与工序(A1-1)中得到的混合物混合的镍离子形成化合物的量是测定样品中的镍离子形成化合物的终浓度成为指定浓度的量即可。测定样品中的镍离子形成化合物的终浓度优选为0.1μM以上、更优选是0.1mM以上，优选不足10mM、更优选是5mM以下。
工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物的混合时的加温温度是对于进行血液的凝固反应适宜的温度即可。温度通常优选为30～45℃、更优选为36～38℃。另外，加温时间通常优选为30～420秒钟、更优选是100～350秒钟。
从有效抑制凝固时间的测定时凝固时间变得过长的观点来看，最好是在工序(A1-1)中的血液待测样品、活化剂和磷脂的混合结束时起150秒钟以内、优选为60秒钟以内，在工序(A1-2)中将工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物混合。
在工序(B)中，将工序(A)中得到的样品和钙盐混合而调制测定样品，测定测定样品的凝固时间。
与样品混合的钙盐的量是测定样品中的钙盐的浓度成为指定浓度的量即可。测定样品中的钙盐的浓度优选为2～20mM、更优选是4～10mM。
在工序(B)中，在向样品添加钙盐之前，也可将样品加温到对于进行凝固反应适宜的温度。样品的加温温度，从凝固反应的反应性的观点来看，优选为30℃以上、更优选是36℃以上，从蛋白质的稳定性观点来看，优选为45℃以下，更优选是38℃以下。此时，加温时间，从凝固反应的反应性的观点来看，优选为1分钟以上、更优选是2分钟以上，从蛋白质的稳定性观点来看，优选为6分钟以下，更优选是5分钟以下。
测定样品的凝固时间可基于凝固信息研究。作为凝固信息，例如，可举出向测定样品照射光时的透射光或散射光的变化、测定样品的粘度的变化等，但不特别限定。此时，测定样品的凝固时间可通过向测定样品照射光，由监测透过测定样品的透射光或来自测定样品散射光的变化、监测测定样品的粘度的变化等研究。其中，在本说明书中，“凝固时间”是指活化部分促凝血酶原激酶时间。凝固时间是向样品的钙盐的添加开始时起至血浆凝固的时间。
血浆的凝固，例如，可以来自照射光的测定样品光的变化消失，测定样品的粘度的变化消失等作为指标进行判断。
【2.凝固时间的测定装置】
[测定装置的整体构成]
基于附图说明在前述的测定方法中使用的凝固时间的测定装置(以下，也简称为“测定装置”)的一例。如图1所示，测定装置10含测定单元20和处理装置30。测定单元20和处理装置30能通信地连接。
[测定单元的构成]
如图1所示，测定单元20含样品调制部100、检测部200、试剂收容部300、收容血液待测样品的待测样品收容部400和控制部500。
样品调制部100从试剂收容部300取得试剂的同时，从待测样品收容部400取得血液待测样品。另外，样品调制部100通过将取得的试剂和血液待测样品以指定的处理顺序混合调制测定样品。样品调制部100含待测样品搬送部111、第1试剂搬送部112、第2试剂搬送部113、第3试剂搬送部114、第4试剂搬送部115和比色杯搬送部131。待测样品搬送部111有第1喷嘴101。待测样品搬送部111取得待测样品收容部400内收容的血液待测样品。另外，待测样品搬送部111将取得的血液待测样品吐出到比色杯90内。第1试剂搬送部112有第2喷嘴102。第1试剂搬送部112由第2喷嘴102，取得试剂收容部300的第1容器301内收容的试剂。另外，第1试剂搬送部112将取得的试剂吐出到比色杯90内。第2试剂搬送部113有第3喷嘴103。第2试剂搬送部113由第3喷嘴103，取得试剂收容部300的第2容器302内收容的试剂。另外，第2试剂搬送部113将取得的试剂吐出到比色杯90内。第3试剂搬送部114由第4喷嘴104，取得试剂收容部300的第3容器303内收容的试剂。另外，第3试剂搬送部114将取得的试剂吐出到比色杯90内。第4试剂搬送部115由第5喷嘴105，取得试剂收容部300的第4容器304内收容的试剂。另外，第4试剂搬送部115将取得的试剂吐出到比色杯90内。比色杯搬送部131将收容调制的测定样品的比色杯90搬送到检测部200。
检测部200含光照射部201、光接收部202和第2比色杯装载部203。光照射部201有对测定样品的照射光的光源。照射光的波长是对于监测伴随血液的凝固反应的进行的变化适宜的波长即可。光接收部202接收来自测定样品的光。另外，来自测定样品光可为透射光，也可为散射光。光接收部202将对应于接收的光的量的电信号输出到处理装置的算出部31。第2比色杯装载部203设在光照射部201和光接收部202之间。在第2比色杯装载部203装载有从样品调制部100搬送的比色杯90。
试剂收容部300收容凝固时间的测定中使用的试剂。在本实施方式中，试剂收容部300含收容活化剂的第1容器301、收容磷脂的第2容器302、收容镍离子形成化合物的第3容器303及收容钙盐的第4容器304。在第1～第4容器各自设有用于识别各容器内收容的试剂的种类的识别子。作为识别子，例如，可举出条码等，但不特别限定。再者，在本实施方式中，第1容器301和第2容器302作为不同的容器试剂设在收容部300。但是，由于活化剂和磷脂可同时与血液待测样品混合，因此也可代替第1容器及第2容器而在同一容器中收容活化剂及磷脂。此时，第1试剂搬送部112和第2试剂搬送部113是共同的搬送部。
待测样品收容部400收容血液待测样品。在本实施方式中，待测样品收容部400具备多个待测样品容器401。另外，待测样品收容部400将收容期望的血液待测样品的待测样品容器401搬送到指定的待测样品抽引位置。在多个待测样品容器401中各自设有用于识别各容器内收容的血液待测样品的种类的识别子。作为识别子，例如，可举出条码等，但不特别限定。
控制部500含CPU(中央处理器)501和存储部502。控制部500由计算机构成。CPU501实行存储部502中存储的计算机程序。由此，CPU501进行样品调制部100中的样品调制的处理以及检测部200中的关于测定样品的光学信息的取得的处理。作为计算机程序，例如，可举出用于测定样品的调制的计算机程序、用于取得关于测定样品的光学信息的计算机程序等，但不特别限定。另外，存储部502还存储用于识别试剂收容部300内收容的试剂的试剂识别信息、关于调制测定样品时的处理顺序的样品调制信息、及用于识别待测样品收容部400内收容的血液待测样品的待测样品识别信息。作为样品识别信息，例如，可举出试剂的种类和收容容器的位置和识别子关联的信息等，但不特别限定。另外，作为待测样品识别信息，例如，可举出血液待测样品的种类和收容容器的位置和识别子的关联的信息等，但不特别限定。CPU501使用存储部502中存储的试剂识别信息及样品调制信息，实行测定样品的调制用的计算机程序。由此，CPU501使测定单元20的样品调制部10进行测定样品的调制。
[处理装置的构成]
处理装置30，如图1所示，含算出部31、显示部32和输入部33。在本实施方式中，处理装置30由计算机系统构成。算出部31含CPU601和存储部602。CPU601实行存储部602中存储的计算机程序。由此，CPU601进行凝固时间的算出的处理。作为显示部32，例如，可举出显示屏等，但不特别限定。显示部32，例如，显示算出的凝固时间的信息等。作为输入部33，例如，可举出键盘、鼠标等，但不特别限定。
存储部602安装有用于使CPU601实行的操作系统、应用程序等的计算机程序及在计算机程序的实行中使用的数据。作为应用程序，例如，可举出用于凝固时间的测定的计算机程序等，但不特别限定。CPU601实行存储部602中存储的凝固时间的测定用的计算机程序。由此，CPU601使测定装置10进行凝固时间的测定。
[测定装置的变形例]
待测样品搬送部111、第1试剂搬送部112、第2试剂搬送部113、第3试剂搬送部114及第4试剂搬送部115也可为用于使待测样品或试剂流动的流路。作为流路，可举出管等，但不特别限定。
另外，凝固时间也可基于随血液的凝固的粘度的增加及其他的凝固信息测定。在基于随血液的凝固的粘度的增加测定凝固时间时，检测部200具备高频率发送线圈、高频率接收线圈、高频率发送线圈和高频率接收线圈之间的装载收容钢球的比色杯的比色杯装载部、及在比色杯装载部的两端设的电磁铁。比色杯内的钢球由电磁铁发生的磁力左右简谐振动。此简谐振动随着粘度增加而减少。如果测定样品的凝固开始，则测定样品的粘度增加，从而钢球的振幅减小。从而，检测部200通过高频率接收线圈接收高频率发送线圈发送的高频率，检测振幅的变化。另外，处理装置30的算出部31基于检测的振幅的变化，算出凝固时间。
[凝固时间的测定装置的处理顺序]
接下来，基于图2，说明由测定装置10的凝固时间的测定的处理顺序的概要。在以下的处理顺序中，测定单元20的控制部500使用从存储部502取得的试剂识别信息及样品调制信息，实行存储部502中存储的测定样品的调制用的计算机程序。另外，控制部500实行存储部502中存储的关于测定样品的光学信息的取得用的计算机程序。处理装置30的算出部31使用取得的光学信息，实行存储部602中存储的凝固时间的测定用的计算机程序。
首先，在步骤S1中，测定单元20的控制部500使样品调制部100实行样品的调制。步骤S1的样品的调制根据后述的图3及图4所示的处理顺序实行。
其后，在步骤S2中，控制部500使样品调制部100实行向样品的钙盐的添加。另外，在步骤S3中，控制部500使检测部200实行关于测定样品的光学信息的取得。步骤S2的向样品的钙盐的添加和步骤S3的光学信息的取得根据图5所示的处理顺序实行。
其后，在步骤S4中，处理装置30的算出部31通过实行凝固时间的算出用的计算机程序，算出凝固时间。
[样品的调制的处理顺序]
接下来，基于图3及图4，说明由测定装置10的样品的调制的处理顺序的概要。
首先，在步骤S101中，控制部500使样品调制部100实行向图1中的样品调制位置62的比色杯90的配置。具体而言，控制部500在样品调制部100中将比色杯90装载至位于图1中的第1比色杯装载部61。由此进行向样品调制位置62的比色杯90的配置。
接下来，在步骤S102中，控制部500使待测样品收容部400实行向图1中的待测样品抽引位置81的待测样品容器401的搬送。此时，控制部500基于存储部502中存储的待测样品识别信息，使待测样品收容部400选择收容期望的血液待测样品的待测样品容器401。进而，控制部在待测样品收容部400，将选择的待测样品容器401搬送至位于待测样品抽引位置81。
接下来，在步骤S103中，控制部500使样品调制部100实行向待测样品抽引位置81的第1喷嘴101的移动。其后，在步骤S104中，控制部500使样品调制部100实行自待测样品容器401抽引血液待测样品。具体而言，控制部500使样品调制部100经第1喷嘴101抽引待测样品容器401中收容的血液待测样品。
接下来，在步骤S105中，控制部500使样品调制部100实行向样品调制位置62的第1喷嘴101的移动。其后，在步骤S106中，控制部500使样品调制部100实行向比色杯90的血液待测样品的吐出。具体而言，控制部500使样品调制部100将用第1喷嘴101抽引的血液待测样品吐出到比色杯90。
接下来，在步骤S107中，控制部500使样品调制部100实行向活化剂抽引位置71的第2喷嘴102的移动。其后，在步骤S108中，控制部500使样品调制部100实行自第1容器301抽引活化剂。具体而言，控制部500使样品调制部100经第2喷嘴102抽引第1容器301中收容的活化剂。
接下来，在步骤S109中，控制部500使样品调制部100实行向样品调制位置62的第2喷嘴102的移动。其后，在步骤S110中，控制部500使样品调制部100实行向比色杯90的活化剂的吐出。具体而言，控制部500使样品调制部100将用第2喷嘴102抽引的活化剂吐出到比色杯90。
接下来，在图4的步骤S111～步骤S114的各步骤中，控制部500使样品调制部100实行向磷脂抽引位置72的第3喷嘴103的移动、自第2容器302抽引磷脂、向样品调制位置62的第3喷嘴103的移动及向比色杯90的磷脂的吐出。步骤S111～步骤S114的各步骤除由第3喷嘴103进行磷脂的抽引及吐出的一系列的处理之外，与图3的步骤S107～步骤S110的各步骤相同。
接下来，在步骤S115至步骤S118的各步骤中，控制部500使样品调制部100实行向镍离子形成化合物抽引位置73的第4喷嘴104的移动、自第3容器303抽引镍离子形成化合物、向样品调制位置62的第4喷嘴104的移动及向比色杯90的镍离子形成化合物的吐出。步骤S115至步骤S118的各步骤除由第4喷嘴104进行镍离子形成化合物的抽引及吐出的一系列的动作之外，与图3的步骤S107至步骤S110相同。由此，得到样品。
再者，在本实施方式中，以活化剂的添加及磷脂的添加的顺序进行向血液待测样品的活化剂及磷脂的添加。但是，活化剂及磷脂的添加也可同时进行。
[向样品的钙盐的添加及光学信息的取得的处理顺序]
接下来，基于图5，说明由测定装置10的向样品的钙盐的添加及光学信息的取得的处理顺序的概要。
在图5的步骤S201～步骤S204的各步骤中，控制部500使样品调制部100实行向钙盐抽引位置74的第5喷嘴105的移动、自第2容器302抽引钙盐、向样品调制位置62的第5喷嘴105的移动及向比色杯90的钙盐的吐出。由此，得到测定样品。步骤S201～步骤S204的各步骤除由第5喷嘴105进行钙盐的抽引及吐出的一系列的处理之外，与图3的步骤S107～步骤S110的各步骤相同。
与步骤S204同时，在步骤S301中，控制部500使样品调制部100经比色杯搬送部131将比色杯90搬送到检测部200的第2比色杯装载部203。另外，在步骤S301中，控制部500使检测部200实行向测定样品的光照射。具体而言，控制部500使检测部200的光照射部201对于第2比色杯装载部203中装载的比色杯90照射光。由此，向比色杯90内的测定样品照射光。
接下来，在步骤302中，控制部500使检测部200实行来自测定样品的光的测定。具体而言，控制部500使检测部200的光接收部202将对应于接收的透射光的量的电信号输出到处理装置的算出部31。
其后，处理进行至图2的步骤S4中的凝固时间的算出。
[处理顺序的变形例]
步骤S107～步骤S110的一系列的步骤和步骤S111～步骤S114的一系列的步骤可并行进行。另外，步骤S115～步骤S118的一系列的步骤也可先于步骤S107～步骤S110的一系列的步骤及步骤S111～步骤S114的一系列的步骤这两者进行。
另外，在基于随血液的凝固的粘度的增加测定凝固时间时，作为检测部200，可使用具备高频率发送线圈、高频率接收线圈、装载收容钢球的比色杯的比色杯装载部和电磁铁的检测部。其中，控制部500通过由高频率接收线圈接收检测部200的高频率发送线圈发送的高频率检测振幅的变化。接下来，控制部500使检测部200将关于振幅的变化的信息输出到处理装置30。其后，处理装置30的算出部31使用关于取得的振幅的变化的信息，通过实行存储部602中存储的凝固时间的测定用的计算机程序，算出凝固时间。
【3.凝固时间测定用试剂】
本实施方式涉及的凝固时间测定用试剂是含有镍离子形成化合物的用于在前述的凝固时间的测定方法中使用的凝固时间测定用试剂。镍离子形成化合物与前述的测定方法中的镍离子形成化合物相同。
本实施方式涉及的凝固时间测定用试剂可为基本上由镍离子形成化合物组成的试剂，也可为除镍离子形成化合物外还含有适宜的溶剂、助剂等的试剂。再者，本实施方式涉及的凝固时间测定用试剂基本上不含有磷脂和活化剂。
凝固时间测定用试剂可以固体的状态提供。此时，作为凝固时间测定用试剂的剂型，例如，可举出粒剂、粉剂等，但不特别限定。
凝固时间测定用试剂可为使镍离子形成化合物溶解于适宜的溶剂的状态。此时，作为溶剂，例如，可举出脱盐纯化水、生理盐水等，但不特别限定。
在凝固时间测定用试剂是使镍离子形成化合物溶解于适宜的溶剂的状态的试剂时，凝固时间测定用试剂中的镍离子形成化合物的含量优选为1μM以上、更优选是0.1mM以上，优选为50mM以下，更优选是10mM以下。
在凝固时间测定用试剂还含有助剂时，作为助剂，例如，可举出镍离子形成化合物的稳定化剂、保存剂等，但不特别限定。
【4.试剂盒】
本实施方式涉及的试剂盒是含第1试剂容器中收容的含活化剂和磷脂的第1试剂、第2试剂容器中收容的含镍离子形成化合物的第2试剂及第3试剂容器中收容的含钙盐的第3试剂的试剂盒。作为本实施方式涉及的试剂盒的一例，可举出图6所示的试剂盒800等，但不特别限定。图6所示的试剂盒800含第1试剂容器801、第2试剂容器802和第3试剂容器803。第1试剂容器801收容含活化剂和磷脂的第1试剂。第2试剂容器802收容含镍离子形成化合物的第2试剂。第3试剂容器803收容含钙盐的第3试剂。试剂盒还可含附带文书。附带文书也可含使用本实施方式涉及的试剂盒进行上述的凝固时间的测定方法的操作顺序等的记载。
第1试剂中的活化剂的浓度是可将测定样品中的浓度调整到上述的测定方法中的浓度的范围的范围即可。活化剂是鞣花酸化合物时，第1试剂中的活化剂的浓度通常优选为10～400μM、更优选是50～150μM。活化剂是氧化硅时，第1试剂中的活化剂的浓度通常优选为0.1～1mg/mL、更优选是0.2～0.6mg/mL。
第1试剂中的磷脂的浓度是可将测定样品中的浓度调整到上述的测定方法中的浓度的范围的范围即可。第1试剂中的磷脂的浓度通常优选为30～400μg/mL、更优选是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰乙醇胺时，第1试剂中的磷脂的浓度通常优选为10～100μg/mL、更优选是20～50μg/mL。磷脂是磷脂酰胆碱时，测定样品中的磷脂的浓度通常优选为10～300μg/mL、更优选是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰丝氨酸时，测定样品中的磷脂的浓度通常优选为1～75μg/mL、更优选是2～15μg/mL。
第2试剂可为固体状态的镍离子形成化合物，也可为使镍离子形成化合物溶解于适宜的溶剂的状态。溶剂与上述的凝固时间测定用试剂中的溶剂相同。
在第2试剂是使镍离子形成化合物溶解于适宜的溶剂的状态的试剂时，第2试剂中的镍离子形成化合物的浓度是可将测定样品中的浓度调整到上述的测定方法中的浓度的范围的范围即可。此时，第2试剂中的镍离子形成化合物的浓度优选为1μM以上、更优选是0.1mM以上，优选为50mM以下，更优选是10mM以下。
第3试剂中的钙盐的浓度是可将测定样品中的浓度调整到上述的测定方法中的浓度的范围的范围即可。第3试剂中的钙盐的浓度优选为2.5～40mM、更优选是10～30mM。
在本实施方式涉及的试剂盒中，第2试剂基本上不含有磷脂和活化剂。另外，在本实施方式涉及的试剂盒中，第1试剂基本上不含有镍离子形成化合物。
在试剂盒中使用的活化剂、磷脂、镍离子形成化合物及钙盐与在前述的测定方法中使用的相同。另外，在各试剂容器中，也可适宜地收容有适宜的溶剂、助剂等。溶剂及助剂与凝固时间测定用试剂中使用的溶剂及试剂相同。再者，在本实施方式涉及的试剂盒中，活化剂及磷脂也可在不同的容器中收容。
【实施例】
在下文中，凝固时间的测定由全自动凝固时间测定装置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2000i〕进行。
【实施例1】
在本实施例中，作为血液待测样品，使用正常血浆或被检血浆。作为正常血浆，使用表1所示的正常血浆。另外，作为被检血浆，使用表1所示的肝素添加血浆。
【表1】
将血液待测样品50μL于37℃加热60秒钟。向加热后的血液待测样品添加APTT试剂〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注册商标)〕50μL，混合。将得到的混合物于37℃加热20秒钟。向加热后的混合物添加2.5mM氯化醋酸镍水溶液20μL，混合。将得到的混合物于37℃加热170秒钟。向加热后的混合物添加作为凝固反应促进剂的25mM氯化钙水溶液的同时测定凝固时间。由实施例1的测定方法测得的凝固时间示于图7。
【比较例1】
在本比较例中，作为血液待测样品，使用与实施例1同样的血液待测样品。将血液待测样品50μL于37℃加热60秒钟。向加热后的血液待测样品添加APTT试剂〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注册商标)〕50μL，混合。将得到的混合物于37℃加热170秒钟。向加热后的混合物添加25mM氯化钙水溶液的同时测定凝固时间。由比较例1的测定方法测得的凝固时间示于图7。
【结果】
从图7所示的结果得知，由实施例1的测定方法测得的凝固时间比由比较例1的测定方法测得的凝固时间长。从而得知，由实施例1的测定方法，即使是在使用含有肝素的待测样品血浆时，也能与比较例1的测定方法比更高灵敏度测定凝固时间。
【实施例2及比较例2～5】
作为血液待测样品，除使用表1所示的正常血浆、表1所示的被检血浆之中的HE2、HE4、HE6、HE8及HE10之外，进行与实施例1同样的操作，测定凝固时间(实施例2)。使用由实施例2的测定方法得到的凝固时间，根据式(I)求出APTT比：
[APTT比]＝[被检血浆的凝固时间/正常血浆的凝固时间] (I)
除了代替使用2.5mM醋酸镍水溶液而使用2.5mM氯化钙水溶液(比较例2)、2.5mM氯化镁水溶液(比较例3)、2.5mM硫酸铜水溶液(比较例4)及2.5mM氯化锌水溶液(比较例5)以及作为血液待测样品，使用表1所示的正常血浆、表1所示的被检血浆之中的HE2、HE4、HE6、HE8及HE10之外，进行与实施例1同样的操作，测定凝固时间。再者，氯化钙、氯化镁、硫酸铜及氯化锌是形成2价镍离子以外的2价离子(2价阳离子)的化合物。
使用由比较例1～5各自的测定方法得到的凝固时间，根据式(I)，求出APTT比。研究肝素浓度和APTT比的关系的结果示于图8。图中，白色圆点表示由实施例2的测定方法(有镍离子形成化合物)得到的APTT比、黑色四角形表示由比较例1的测定方法(无形成2价阳离子的化合物)得到的APTT比、白色三角形表示由比较例2的测定方法(有形成钙离子的化合物)得到的APTT比、黑色三角形表示由比较例3的测定方法(有形成镁离子的化合物)得到的APTT比、白色四角形表示由比较例4的测定方法(有形成铜离子的化合物)得到的APTT比、黑色圆点表示由比较例5的测定方法(有形成锌离子的化合物)得到的APTT比。
从图8所示的结果得知，由实施例2的测定方法得到的APTT比比由比较例1～5的测定方法得到的APTT比大。从而得知，如实施例2一样，通过使用镍离子形成化合物，与使用其他形成二价离子的化合物时(比较例2～5)或以往的方法(比较例1)比，对含有肝素的待测样品的灵敏度升高。另一方面得知，如比较例2～5的测定方法一样，使用其他形成二价离子的化合物时，APTT比是与由比较例1的测定方法得到的APTT比同程度以下。
从这些结果得知，在使用APTT试剂的凝固时间的测定中，在添加凝固反应促进剂前，通过将在2价阳离子之中也形成镍离子的化合物添加到血液待测样品，能高灵敏度测定凝固时间。

Claims (20)

1.凝固时间的测定方法，其包括：
(A)将血液待测样品、活化剂、磷脂和镍离子形成化合物混合而得到样品的工序、及
(B)将所述工序(A)中得到的样品和钙盐混合而调制测定样品，测定测定样品的凝固时间的工序。
2.权利要求1所述的方法，其中所述工序(A)包括：
(A1-1)将血液待测样品、活化剂和磷脂混合的工序、及
(A1-2)将所述工序(A1-1)中得到的混合物和镍离子形成化合物混合的工序。
3.权利要求1所述的方法，其中所述工序(A)中得到的样品中的所述镍离子形成化合物的终浓度是0.1μM以上、不足10mM。
4.权利要求1所述的方法，其中所述工序(A)中得到的样品中的所述镍离子形成化合物的终浓度是0.1mM以上、不足5mM。
5.权利要求1所述的方法，其中在所述工序(B)中，在指定条件下温育所述工序(A)中得到的样品后，向所述样品混合钙盐。
6.权利要求5所述的方法，其中所述指定条件是以30℃以上45℃以下的温度温育的条件。
7.权利要求5所述的方法，其中所述指定条件是以36℃以上38℃以下的温度温育的条件。
8.权利要求5所述的方法，其中所述指定条件是以1分钟以上6分钟以下的加温时间温育的条件。
9.权利要求5所述的方法，其中所述指定条件是以2分钟以上5分钟以下的加温时间温育的条件。
10.权利要求5所述的方法，其中所述指定条件是以36℃以上38℃以下的温度温育2分钟以上5分钟以下的条件。
11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中所述镍离子形成化合物是选自醋酸镍、磷化镍、硫化镍、氯化镍、硫酸镍及安息香酸镍的化合物。
12.凝固时间的测定装置，其具备：
将血液待测样品、活化剂、磷脂、镍离子形成化合物和钙盐混合而调制测定样品的样品调制部，
从所述样品调制部中得到的测定样品取得显示伴随凝固反应的变化的凝固信息的检测部，
基于由所述检测部取得的光学信息，算出所述测定样品的凝固时间的算出部，
收容活化剂、磷脂、镍离子形成化合物和钙盐的试剂收容部，
其中所述样品调制部
从所述试剂收容部取得所述活化剂、所述磷脂及所述镍离子形成化合物，将所述活化剂、所述磷脂、所述镍离子形成化合物和血液待测样品混合而调制样品，
从所述试剂收容部取得所述钙盐，将所述钙盐和所述样品混合而得到测定样品。
13.权利要求12所述的凝固时间的测定装置，其中所述样品调制部在指定条件下温育所述样品后，向所述样品混合钙盐。
14.权利要求13所述的凝固时间的测定装置，其中所述样品调制部是，作为所述指定条件，以30℃以上45℃以下的温度温育。
15.权利要求13所述的凝固时间的测定装置，其中所述样品调制部是，作为所述指定条件，以1分钟以上6分钟以下的加温时间温育。
16.用于在权利要求1～11之任一项所述的凝固时间的测定方法中使用的凝固时间测定用试剂，其含有镍离子形成化合物。
17.权利要求16所述的凝固时间测定用试剂，其中所述镍离子形成化合物是选自醋酸镍、磷化镍、硫化镍、氯化镍、硫酸镍及安息香酸镍的化合物。
18.试剂盒，其含：
第1试剂容器中收容的含活化剂和磷脂的第1试剂，
第2试剂容器中收容的含镍离子形成化合物的第2试剂，及
第3试剂容器中收容的含钙盐的第3试剂。
19.权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒是用于在权利要求1～11之任一项所述的凝固时间的测定方法中使用的试剂盒。
20.下列物质用于制造试剂盒的用途：
第1试剂容器中收容的含活化剂和磷脂的第1试剂、
第2试剂容器中收容的含镍离子形成化合物的第2试剂、及
第3试剂容器中收容的含钙盐的第3试剂。
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