CN106386490A - 一种狭叶红景天种苗的快速培育方法 - Google Patents

一种狭叶红景天种苗的快速培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种狭叶红景天种苗的快速培育方法，该方法以狭叶红景天的子叶柄为外植体，通过对外植体的胚性细胞和胚状体的诱导培养，成功培育出狭叶红景天的优质种苗，为狭叶红景天优质种苗的大量快速培育提供了一条新途径。

Description

一种狭叶红景天种苗的快速培育方法
技术领域
本发明涉及一种狭叶红景天种苗的快速培育方法，特别是涉及一种通过诱导狭叶红景天胚状体而实现狭叶红景天植株快速繁育的方法。
背景技术
狭叶红景天Rhodiola kirilowii(Regel)Maxim.系蔷薇目景天科红景天，属(Rhodiola L.)多年生草本。分布于我国西藏、青海、四川、云南等地海拔2000～5600m的高寒地区，为我国著名的高寒中藏医药材。狭叶红景天具有清热退烧、解毒和防瘟作用，可治疗肺炎、发烧、腹泻和四肢肿胀等症。现代药理研究表明，红景天具有消热解毒、抗疲劳、抗缺氧、抗衰老等功效。狭叶红景天为雌雄异株植物，其种子微小，不易得到，且难以人工栽培，目前狭叶红景天植物主要以野生资源为药源。由于其特殊的功效和需求量急剧加大，使得野生资源也日益减少。另外，狭叶红景天植物具有能在贫瘠的沙漠地带很好生长的特性，同时兼有保持水土和保护生态环境的效果；因此狭叶红景天又可作为治理土壤沙化的优质树种。因此积极开展对狭叶红景天的种苗大量培育具有十分重要的意义。
目前已有人对狭叶红景天种苗快速培育进行了研究，如李建民等人采用狭叶红景天的顶芽为外植体，经不定芽增殖培养和生根培养获得了狭叶红景天再生植株。本专利是以狭叶红景天的子叶柄为外植体，通过诱导胚状体来获得狭叶红景天再生植株，目前该方法还未见有任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狭叶红景天种苗的快速培育方法，该方法以狭叶红景天的子叶柄为外植体，通过诱导胚状体进而获得狭叶红景天的再生植株。
本发明提供的狭叶红景天种苗的快速培育方法包括如下步骤：
(1)外植体的获得
a.选取已成熟的狭叶红景天种子，将其消毒处理后接入MS+酵母提取物50～100mg·L-1培养基中，在每天光照10～14小时、光照强度为700～1200lx和每天在5～8℃和20～25℃各培养12小时的条件下进行种子的萌发生长培养；
b.取已萌发的狭叶红景天种子，转接入MS+川荞一号种子50～100g·L-1培养基中培养，在培养温度为15～25℃、每天光照8～12小时、光照强度为1500～2000lx的条件下培养20天后，选取直径在1mm以上、长度为0.5～1.5cm的子叶柄作为外植体；
(2)胚性组织细胞的培养：将子叶柄外植体靠近胚轴端部分插入到培养基B5+2,4-D 1.0～3.0mg.L-1+NAA 0.1～0.5mg+酵母多糖80～200mg·L-1中，在培养温度为12～28℃、每天光照10～18小时、光照强度为1000～1500lx的条件下培养15～25天后，插入培养基中的子叶柄产生胚性组织细胞；
(3)胚状体的产生：切取步骤(2)中产生的胚性组织细胞，以50～100g·L-1的接种量接入液体培养基1/2MS+TDZ1.0～3.0mg·L-1+NAA0.5～2.0mg·L-1+酵母提取物100～300mg·L-1中，在摇床转速为80～100r·min-1、培养温度18～25℃、每天光照8～16小时和光照强度为1000～2000lx的条件下培养15～20天后，再转入1/2MS+6BA1～3.0mg·L-1+NAA0.5～2mg·L-1+酵母多糖200～400mg·L-1固体培养基中进行培养，培养温度和光照条件与液体培养基中培养相同，培养25～35天后在胚性组织细胞表面产生胚状体；
(4)种苗的获得：将步骤(3)中产生的胚状体切割后接入1/2MS培养基中，在培养温度为18～30℃、每天光照12～24小时和光照强度为1800～3000lx的条件下培养30～45天，即获得生长健壮的狭叶红景天种苗；
上述所有培养基的蔗糖20～40g·L-1、pH值为5.8～6.6、琼脂为5～6.5g·L-1。
进一步地，步骤(1)a中所述消毒处理是指将狭叶红景天种子放入0.1％的升汞溶液中消毒3～7分钟后，再用无菌水清洗3～6分钟，所述种子与升汞溶液的体积比为1：20。
进一步地，步骤(2)中子叶柄外植体插入培养基部分占整个子叶柄外植体的1/3。
进一步地，步骤(3)中所述胚性组织细胞为分裂能力强、颜色为黄绿色的胚性组织细胞。
进一步地，步骤(4)中所述胚状体按2～3个为1组进行切割。
本发明通过对狭叶红景天子叶柄外植体的胚性细胞和胚状体的诱导培养，成功培育出狭叶红景天的优质种苗，为狭叶红景天优质种苗的大量快速培育提供了一条新途径。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的狭叶红景天种苗的快速培育方法包括如下步骤：
(1)外植体的获得：
a.选取已完全成熟的狭叶红景天种子，将其按种子与升汞溶液的体积比为1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒4分钟后，再用无菌水清洗5分钟，然后接入MS+酵母提取物80mg·L-1培养基中，在每天光照12小时、光照强度为1000lx和每天在7℃和22℃各培养12小时的条件下进行种子的萌发生长培养，培养5天统计，狭叶红景天种子的染菌率为0％，萌发率为100％；
b.取已萌发的狭叶红景天种子，转接入MS+川荞一号种子80g·L-1培养基中，在培养温度为20℃、每天光照10小时、光照强度为1800lx的条件下培养20天后，选取直径在1mm以上、长度为1.0cm的子叶柄作为外植体，
(2)胚性组织细胞的培养：将子叶柄外植体靠近胚轴端(即非着生子叶端)部分插入到培养基B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.3mg+酵母多糖120mg·L-1中，插入部分占整个子叶柄外植体的1/3，在培养温度为22℃、每天光照14小时、光照强度为1200lx的条件下培养20天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为100％；
(3)胚状体的产生：切取步骤(2)中产生的分裂能力强、颜色为黄绿色的胚性组织细胞，以80g·L-1的接种量接入液体培养基1/2MS+TDZ2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+酵母提取物200mg·L-1中，在摇床转速为90r·min-1、培养温度23℃、每天光照12小时和光照强度为1500lx的条件下培养18天后，再转入1/2MS+6BA2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+酵母多糖300mg·L-1固体培养基中进行再培养，再培养温度和光照条件与液体培养基中培养相同，再培养30天后统计，胚状体的诱导率为100％，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
(4)种苗的获得：将步骤(3)中产生的胚状体按2个为1组切割后接入1/2MS培养基中，在培养温度为25℃、每天光照18小时和光照强度为2500lx的条件下培养40天后，狭叶红景天种苗诱导率为100％；
上述所有培养基的蔗糖30g·L-1、pH值为6.0、琼脂为5.5g·L-1。
实施例2
本实施例提供的狭叶红景天种苗的快速培育方法包括如下步骤：
(1)外植体的获得
a.选取已完全成熟的狭叶红景天种子，将其按种子与升汞溶液的体积比为1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒3分钟后，再用无菌水清洗3分钟，然后接入MS+酵母提取物50mg·L-1培养基中，在每天光照10小时、光照强度为700lx和每天在5℃和20℃各培养12小时的条件下进行种子的萌发生长培养，培养5天统计，狭叶红景天种子的染菌率为5.56％，萌发率为95.15％；
b.取已萌发的狭叶红景天种子，转接入MS+川荞一号种子50g·L-1培养基中，在培养温度为15℃、每天光照8小时、光照强度为1500lx的条件下培养20天后，选取直径在1mm以上、长度为0.5cm的子叶柄作为外植体；
(2)胚性组织细胞的培养：将子叶柄外植体靠近胚轴端部分插入到培养基B5+2,4-D 1.0mg.L-1+NAA 0.1mg+酵母多糖80mg·L-1中，插入部分占整个子叶柄外植体的1/3，在培养温度为12℃、每天光照10小时、光照强度为1000lx的条件下培养15天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为82％；
(3)胚状体的产生：切取步骤(2)中产生的分裂能力强、颜色为黄绿色的胚性组织细胞，以50g·L-1的接种量接入液体培养基1/2MS+TDZ1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+酵母提取物100mg·L-1中，在摇床转速为80r·min-1、培养温度18℃、每天光照8小时和光照强度为1000lx的条件下培养15天后，再转入1/2MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+酵母多糖200mg·L-1固体培养基中进行再培养，再培养温度和光照条件与液体培养基中培养相同，培养25天后统计，胚状体的诱导率为81％，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
(4)种苗的获得：将步骤(3)中产生的胚状体按2个为1组切割后接入1/2MS培养基中，在培养温度为18℃、每天光照12小时和光照强度为1800lx的条件下培养30天，狭叶红景天种苗诱导率为80.21％；
上述所有培养基的蔗糖20g·L-1、pH值为5.8、琼脂为5g·L-1。
实施例3
本实施例提供的狭叶红景天种苗的快速培育方法包括如下步骤：
(1)外植体的获得
a.选取已完全成熟的狭叶红景天种子，将其按种子与升汞溶液的体积比为1：20放入0.1％的升汞溶液中消毒7分钟后，再用无菌水清洗6分钟，然后接入MS+酵母提取物100mg·L-1培养基中，在每天光照14小时、光照强度为1200lx和每天在8℃和25℃各培养12小时的条件下进行种子的萌发生长培养，培养5天统计，狭叶红景天种子的染菌率为0％，萌发率为81.24％；
b.取已萌发的狭叶红景天种子，转接入MS+川荞一号种子100g·L-1培养基中，在培养温度为25℃、每天光照12小时、光照强度为2000lx的条件下培养20天后，选取直径在1mm以上、长度为1.5cm的子叶柄作为外植体；
(2)胚性组织细胞的培养：将子叶柄外植体靠近胚轴端部分插入到培养基B5+2,4-D 3.0mg.L-1+NAA 0.5mg+酵母多糖200mg·L-1中，插入部分占整个子叶柄外植体的1/3，在培养温度为28℃、每天光照18小时、光照强度为1500lx的条件下培养25天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为95.41％；
(3)胚状体的产生：切取步骤(2)中产生的分裂能力强、颜色为黄绿色的胚性组织细胞，以100g·L-1的接种量接入液体培养基1/2MS+TDZ3.0mg·L-1+NAA 2.0mg·L-1+酵母提取物300mg·L-1中，在摇床转速为100r·min-1、培养温度25℃、每天光照16小时和光照强度为2000lx的条件下培养20天后，再转入1/2MS+6BA3.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+酵母多糖400mg·L-1固体培养基中进行再培养，再培养温度和光照条件与液体培养基中培养相同，培养35天后统计，胚状体的诱导率为96％，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
(4)种苗的获得：将步骤(3)中产生的胚状体按3个为1组切割后接入1/2MS培养基中，在培养温度为30℃、每天光照24小时和光照强度为3000lx的条件下培养45天，狭叶红景天种苗诱导率为98％；
上述所有培养基的蔗糖40g·L-1、pH值为6.6、琼脂为6.5g·L-1。
实施例4
将实施例1步骤(1)a中狭叶红景天种子的消毒时间改为7分钟，其它步骤同实施例1，培养5天统计狭叶红景天种子的染菌率为0％，萌发率为92.45％。
实施例5
将实施例1步骤(1)a中狭叶红景天种子的消毒时间改为3分钟，其它步骤同实施例1，培养5天统计狭叶红景天种子的染菌率为5.13％，萌发率为97.65％。
实施例6
将实施例1步骤(2)中诱导胚性细胞的培养基改为B5+2,4-D 1.0mg.L-1+NAA 0.1mg+酵母多糖80mg·L-1，其它步骤同实施例1，培养20天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为91.89％。
实施例7
将实施例1步骤(2)中诱导胚性细胞的培养基改为B5+2,4-D 3.0mg.L-1+NAA 0.5mg+酵母多糖200mg·L-1，其它步骤同实施例1，培养20天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为94.09％。
实施例8
将实施例1步骤(3)中的液体培养基改为1/2MS+TDZ 1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+酵母提取物100mg·L-1，其它步骤同实施例1，再培养30天后统计，胚状体的诱导率为93.28％。
比较实施例1
将实施例1步骤(1)a中狭叶红景天种子的消毒时间改为10分钟，其它步骤同实施例1，培养5天统计，狭叶红景天种子的染菌率为0％，萌发率为41.15％。
比较实施例2
在实施例1步骤(1)b中，将消毒后的种子改接入MS基本培养基中，其它步骤同实施例1，培养20天后统计，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为0％。
比较实施例3
将实施例1步骤(1)a中狭叶红景天种子的萌发生长条件改为在无光照条件下培养，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为30.36％。
比较实施例4
将实施例1步骤(1)a中狭叶红景天种子的萌发生长条件改为全天在25°的条件下培养，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为48.32％。
比较实施例5
在实施例1步骤(1)b中，取消将已萌发的狭叶红景天种子转接入MS+宁荞一号种子80g·L-1培养基中培养的步骤，其它步骤同实施例1，所得到的狭叶红景天种苗的子叶柄生长直径在1mm以下，采用直径在1mm以下的子叶柄作为外植体进行胚性组织细胞的诱导，其诱导率为12.54％。
比较实施例6
在实施例1步骤(2)中，改用将子叶柄外植体靠近子叶端部分插入到培养基中，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性细胞的诱导率为43.09％。
比较实施例7
在实施例1步骤(2)中，改用将子叶柄平放在培养基表面，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性细胞的诱导率为33.59％。
比较实施例8
在实施例1步骤(2)中，将培养基中的基本培养基由“B5”改为“MS”，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率仅为45.24％。
比较实施例9
在实施例1步骤(2)中，将培养基由“B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.3mg+酵母多糖120mg·L-1”改为“B5+2,4-D 2.0mg.L-1+NAA 0.2mg”，其它步骤同实施例1，狭叶红景天胚性组织细胞的诱导率为40.64％。
比较实施例10
将实施例1步骤(3)中胚性组织的接种量改为200g·L-1，其它步骤同实施例1，胚状体的诱导率为36.14％。
比较实施例11
将实施例1步骤(3)中的摇床转速改为180r·min-1，其它步骤同实施例1，胚状体的诱导率为29.74％。
比较实施例12
在实施例1步骤(3)中，取消将黄绿色的胚性组织细胞转入液体培养基中培养的步骤，而直接接入1/2MS+6BA2.0mg·L-1+NAA1mg·L-1+酵母多糖300mg·L-1固体培养基中进行培养，其它步骤同实施例1，胚状体的诱导率为23.18％。
比较实施例13
在实施例1步骤(4)中，将胚状体改接入MS培养基中，其它步骤同实施例1，狭叶红景天种苗的诱导率为67.18％。

Claims (5)

1.一种狭叶红景天种苗的快速培育方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)外植体的获得
a.选取已成熟的狭叶红景天种子，将其消毒处理后接入MS+酵母提取物50～100mg·L-1培养基中，在每天光照10～14小时、光照强度为700～1200 lx和每天在5～8℃和20～25℃各培养12小时的条件下进行种子的萌发生长培养；
b.取已萌发的狭叶红景天种子，转接入MS+川荞一号种子50～100g·L-1培养基中，在培养温度为15～25℃、每天光照8～12小时、光照强度为1500～2000 lx的条件下培养20天后，选取直径在1mm以上、长度为0.5～1.5cm的子叶柄作为外植体；
(2)胚性组织细胞的培养：将子叶柄外植体靠近胚轴端部分插入到培养基B5+2,4-D 1.0～3.0mg.L-1+NAA 0.1～0.5mg+酵母多糖80～200mg·L-1中，在培养温度为12～28℃、每天光照10～18小时、光照强度为1000～1500lx的条件下培养15～25天后，插入培养基中的子叶柄产生胚性组织细胞；
(3)胚状体的产生：切取步骤(2)中产生的胚性组织细胞，以50～100g·L-1的接种量接入液体培养基1/2MS+TDZ1.0～3.0mg·L-1+NAA0.5～2.0mg·L-1+酵母提取物100～300mg·L-1中，在摇床转速为80～100r·min-1、培养温度18～25℃、每天光照8～16小时和光照强度为1000～2000lx的条件下培养15～20天后，再转入1/2MS+6BA1～3.0mg·L-1+NAA0.5～2mg·L-1+酵母多糖200～400mg·L-1固体培养基中进行培养，培养温度和光照条件与液体培养基中培养相同，培养25～35天后在胚性组织细胞表面产生胚状体；
(4)种苗的获得：将步骤(3)中产生的胚状体切割后接入1/2MS培养基中，在培养温度为18～30℃、每天光照12～24小时和光照强度为1800～3000 lx的条件下培养30～45天，即获得生长健壮的狭叶红景天种苗；
上述所有培养基的蔗糖20～40g·L-1、pH值为5.8～6.6、琼脂为5～6.5g·L-1。
2.根据权利要求1所述的狭叶红景天种苗的快速培育方法，其特征在于：步骤(1)a中所述消毒处理是指将狭叶红景天种子放入0.1％的升汞溶液中消毒3～7分钟后，再用无菌水清洗3～6分钟，所述种子与升汞溶液的体积比为1：20。
3.根据权利要求1所述的狭叶红景天种苗的快速培育方法，其特征在于：步骤(2)中子叶柄外植体插入培养基部分占整个子叶柄外植体的1/3。
4.根据权利要求1所述的狭叶红景天种苗的快速培育方法，其特征在于：步骤(3)中所述胚性组织细胞为分裂能力强、颜色为黄绿色的胚性组织细胞。
5.根据权利要求1所述的狭叶红景天种苗的快速培育方法，其特征在于：步骤(4)中胚状体按2～3个为1组进行切割。
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