CN106350577B - 基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：1）在缓冲溶液中加入端粒酶识别序列作为引物；2）端粒酶对引物进行扩增，形成的富G序列；3）在钾离子的作用下富G序列形成G‑四链体；4）加入水溶性阳离子聚合物发生荧光能量共振转移；5）利用紫外可见灯观察颜色变化，并用荧光分光光度计对溶液的荧光强度进行检测。本发明利用阳离子聚合物和G‑四链体上标记的荧光素FAM发生荧光能量共振转移，在紫外灯下溶液颜色由蓝色变为绿色，颜色变化明显，可对端粒酶活性进行半定量检测；用荧光分光光度计精确测量FAM荧光强度变化，实现对端粒酶活性的准确定量，方法灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于定量检测端粒酶活性的生物传感技术，具体涉及基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒位于真核生物细胞的染色体末端，它是由短的多重复的非转录序列(TTAGGG)与蛋白质构成的复合物。端粒在细胞染色体中起重要作用,主要是维持染色体完整与稳定，端粒的长度反映了细胞继续复制的潜在可能性。随着细胞分裂的持续进行,正常细胞的端粒会不断缩短,端粒缩短后会导致细胞无法继续分裂，最终过短的端粒会使细胞无法继续分裂,从而使细胞寿命受到限制。端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶，是一种核蛋白逆转录酶,由模板和蛋白催化亚基组成，端粒酶自身带有一段模板,利用这段,端粒酶能够在端粒末端逆转录合成端粒的重复序列,以此维持端粒长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85％。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
传统的端粒酶活性检测方法主要有端粒重复序列延伸法、端粒重复序列扩增法(TRAP)、荧光实时定量法(RT-PCR)。虽然类方法具有较高的灵敏度,但操作复杂,反应步骤多,耗时长,需要配备价格昂贵的热循环设备此外,技术中聚合酶的活性容易受到复杂体系的抑制,产生假阴性结果,而引物二聚体又容易引起假阳性信号,对端粒酶的检测形成严重的干扰。因此类方法不适用于临床肿瘤细胞端粒酶的实时、快速检测。近年来，为替代传统的TRAP分析法，研究者们已经开发了许多PCR-free分析方法并将之应用到端粒酶活性的检测中，例如光学传感器、表面等离子共振、电致化学发光、电化学检测和指数等温扩增分析等。然而，上述大多数策略因为端粒酶引物的固定化、成本高、灵敏度低和操作复杂等问题在应用时或多或少受到了限制。
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加。近半个世纪以来，膀胱癌的发病率及死亡率均在逐年增加。世界各国都投入大量的人力物力研究膀胱癌的早期检测和治疗。端粒酶活性的检测对癌症的早期诊断具有重要的生物学意义，在泌尿外科肿瘤领域,由于患者的尿液中含有脱落细胞,对新鲜尿液中细胞的端粒酶的检测,可以对泌尿肿瘤的诊断起到参考作用。作为一种无创检查手段,在膀胱癌等泌尿肿瘤的早期诊断中有着重要意义。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，即一种基于水溶性阳离子聚合物探针发生荧光能量共振转移可视化荧光法检测端粒酶的方法。本发明中针对端粒酶作用于端粒产生G-四链体而产生的构型的变化而导致表面负电荷密度的变化，从而使连接在G-四链体上的有机荧光染料FAM与带正电荷的水溶性阳离子聚合物CCP的距离拉近，由于两者的荧光发射谱图和荧光激发谱图伴有重叠，距离的拉近使得二者之间发生有效的荧光能量共振转移，使得FAM荧光信号增强，在紫外灯下观察到溶液颜色由蓝色变为绿色。通过得到的荧光强度信号的变化测定端粒酶活性，它具有灵敏度高、准确性好、简便特异性高等优点。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞；
2)在含有5’端接有FAM的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液；CCP与形成的5’端接有FAM的G-四链体由于静电吸附发生荧光能量共振转移；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测。
其中，上述步骤1)的细胞为HeLa细胞。
步骤1)细胞培养和端粒酶提取：HeLa细胞，A549细胞，MCF-7细胞，细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl,pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
其中，上述步骤2)中所述的5’端接有FAM的端粒酶引物序列为5′-FAM-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，其中，5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’为端粒酶进行扩增的特异性识别序列。本发明的FAM为6-羧基荧光素。
其中，上述步骤2)中的具体步骤如下：首先将裂解后的细胞用缓冲液进行不同程度的稀释，然后取2μL稀释液加入48μL的含有5’端修饰了FAM的端粒酶引物的端粒酶扩增液中，在25～37℃下反应15～120分钟得到富G序列，加入50μL浓度为100mM的钾离子，25～37℃，反应30～120分钟，形成了端接有FAM的G-四链体。
其中，上述步骤2)的缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HNO3溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM。
其中，上述步骤2)的5’端接有FAM的端粒酶引物在缓冲溶液为pH＝8.3的20mMTris-HNO3缓冲溶液中的终浓度为1～200nM。
其中，上述HeLa细胞有30～4000个细胞。
其中，上述步骤3)CCP的终浓度为1μM。步骤3)所述的CCP为PFP(聚苯撑(9,9-二(6’-N,N,N-三甲基铵基)己基)芴)，其结构式如下所示：
上述步骤3)中的阳离子聚合物CCP的发射波长在424nm左右。
上述步骤4)利用荧光仪进行检测的具体步骤为：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测。仪器参数设置为激发波长380nm,发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。
本发明提供的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，即一种基于水溶性阳离子聚合物探针发生荧光能量共振转移可视化荧光法检测端粒酶的方法的原理为：本发明通过在端粒酶5’端修饰了-FAM的，利用端粒酶与端粒酶引物之间的作用对端粒酶引物进行扩增延伸，在钾离子的存在下扩增出来的序列形成G-四链体，发生了构型上的变化，导致了端粒酶引物表面负电荷空间密度发生变化，使得其表面负电荷空间密度增大，从而导致其与带正电的水溶性阳离子聚合物之间的静电作用增强，由于FAM和PFP的激发和发射光谱本身是重叠的，强静电作用将二者之间距离拉的足够近，就满足了荧光能量共振转移的条件，使得FAM的荧光信号大大增强，可以在荧光仪上检测到FAM的强发射信号。上述方法中，端粒酶可以与连接有FAM端粒酶引物相结合，并在端粒酶引物的3’端扩增延伸形成重复的富G序列(TTAGGG)，之后四个鸟嘌呤会以分子内氢键的形式形成G-四分体，每个相邻G-四分体之间通过π-π堆积作用形成G-四链体；这种四链体的DNA本身是负电性的，在四个鸟嘌呤中心形成一个空的离子通道，如果有K+或者Na+，它们就会占据到这些位置，起到稳定G-四链体的作用。在碱基数目相同的情况下，单链的DNA与G-四链体结构DNA的负电荷空间密度是不同的，由于G-四链体是通过单链折叠得到，它的负电荷空间电荷密度比相同碱基数的单链要大很多，其与带有正电荷的水溶性阳离子聚合物PFP之间的静电吸引作用更强，将二者距离拉近。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：
(1)本发明利用PFP和FAM之间发生荧光能量共振转移，在紫外灯下溶液颜色由蓝色变为绿色，颜色变化明显，因此可用于可视化检测端粒酶活性。
(2)本发明利用端粒酶对其引物的特异性识别进行扩增延伸来提高其特异性。
(3)本发明在实验过程中，PFP和5’端修饰了-FAM的G-四链体之间的作用是通过静电吸附，不需要借助外力就可以反应，且反应条件温和，在室温下就可以反应，反应迅速，5分钟反应完全，实验操作非常简单。
(4)可视化荧光检测具有高灵敏度、简单和成本低廉等优点，降低了实验的检测限。
(5)该方法可用于实际样品的检测，具有一定的临床意义。
附图说明
图1显示了基于水溶性阳离子聚合物探针发生荧光能量共振转移可视化荧光法检测端粒酶的流程图；
图2显示了端粒酶活性检测实验验证图。a：10nM 5’端修饰了-FAM的端粒酶引物的荧光强度；b：1μM阳离子聚合物PFP单独存在时的荧光荧光强度；c：10nM的5’端修饰了-FAM的端粒酶引物和1μM阳离子聚合物PFP混合时的荧光强度；d：10nM的5’端修饰了-FAM的端粒酶引物和1μM阳离子聚合物PFP以及800个细胞端粒酶混合时的荧光强度。
图3显示了检测端粒酶活性的荧光变化图；A：在不同量的端粒酶作用下，得到的荧光图(端粒酶的浓度：(a)0、(b)30、(c)200、(d)400、(e)800、(f)1000、(g)2000、(h)4000、cells/mL)；B：荧光强度与端粒酶浓度的标准曲线；插图：荧光强度与端粒酶之间的线性关系；从图中可以看出端粒酶在30cells/mL到1000cells/mL呈良好的线性关系。
图4(A)显示了不同的酶(凝血酶，Phi 29DNA聚合酶，牛血清蛋白，葡萄糖氧化酶，谷胱甘肽，端粒酶，)与端粒酶引物作用后荧光强度。图4(B)为不同细胞中的端粒酶活性及端粒酶的特异性检测结果。显示了从不同细胞中(加热后的HeLa细胞，HeLa细胞，MCF-7细胞，A549细胞，)提取出的端粒酶的活性。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器：
HeLa细胞，A549细胞、MCF-7细胞等其他细胞购买于上海复祥生物科技有限公司，水溶性阳离子聚合物(PFP)，端粒酶(telomerase)，牛血清蛋白(BSA)，葡萄糖氧化酶(GOD)，凝血酶(Thrombin)，Phi29DNA聚合酶，谷胱甘肽(GSH)，数码相机(Canon IXUS 115，Japan)、荧光光谱仪(Fluoromax-4,Horiba JobinYvon,Japan)等均为市面上购买。
5’端修饰了-FAM的端粒酶引物序列：5′-FAM-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)
端粒酶引物来自上海生物工程技术服务有限公司合成；
实施例1：
基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞：HeLa细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl,pH 7.5，1mMMgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中分别得到裂解后的HeLa细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
2)在含有5’端接有FAM的的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的HeLa细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体：将5’端接有FAM的端粒酶引物置于1.5mL PP管中，用端粒酶缓冲溶液将裂解后的HeLa细胞配制成不同浓度(HeLa细胞浓度：0、15、100、200、400、500、1000、2000cells/μL)，在pp管中加入2μL400cells/μL的裂解后的HeLa细胞，对其引物进行扩增延伸，最终溶液体积为50μL，于25℃下反应120分钟后，于95℃下灭活5分钟，使得延伸反应停止反应结束后，加入50μL的浓度为100mM KNO3并于25℃反应120分钟，形成G-四链体；其中，上述端粒酶缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HNO3缓冲溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液：向上述反应后的溶液即5’端接有FAM的G-四链体中加入一定量的阳离子聚合物PFP，用缓冲溶液和KNO3稀释到1mL，震荡混匀后在室温下反应5～10分钟，溶液中最终阳离子聚合物PFP浓度为1μM，钾离子浓度为50mM；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长荧光曲线，得到FAM的荧光发射光谱。仪器参数设置为激发波长380nm，发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。检测结束后的到了图3A中的e曲线。
实施例2：基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞：HeLa细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5,1mMMgCl2，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol,0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中分别得到裂解后的HeLa细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
2)在含有5’端接有FAM的的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的HeLa细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体：将5’端接有FAM的的端粒酶引物置于1.5mL PP管中，用端粒酶缓冲溶液将裂解后的HeLa细胞配制成不同浓度(HeLa细胞浓度：0、15、100、200、400、500、1000、2000cells/μL)，在pp管中加入2μL500cells/μL)的裂解后的HeLa细胞，对其引物进行扩增延伸，最终溶液体积为50μL，于37℃下反应60分钟后，于95℃下灭活10分钟，使得延伸反应停止反应结束后，加入50μL的浓度为100mM KNO3并于37℃反应30分钟，形成G-四链体；其中，上述缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HNO3缓冲溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液：向上述反应后的溶液中加入一定量的阳离子聚合物PFP，用缓冲溶液和KNO3稀释到1mL，震荡混匀后在室温下反应5～10分钟，溶液中最终阳离子聚合物PFP浓度为1μM，钾离子浓度为50mM；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长荧光曲线，得到FAM的荧光发射光谱。仪器参数设置为激发波长380nm，发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。检测结束后的到了图3A中的f曲线。
实施例3
基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞：HeLa细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl,pH 7.5，1mMMgCl2，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的HeLa细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
2)在含有5’端接有FAM的的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的HeLa细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体：将5’端接有FAM的的端粒酶引物置于1.5mL PP管中，用端粒酶缓冲溶液将裂解后的HeLa细胞配制成不同浓度(HeLa细胞浓度：0、15、100、200、400、500、1000、2000cells/μL)，在pp管中加入2μL1000cells/μL)的裂解后的HeLa细胞，对其引物进行扩增延伸，最终溶液体积为50μL，于30℃下反应120分钟后，于95℃下灭活10分钟，使得延伸反应停止反应结束后，加入50μL的浓度为100mM KNO3并于30℃反应120分钟，形成G-四链体；其中，上述缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HNO3缓冲溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液：向上述反应后的溶液中加入一定量的阳离子聚合物PFP，用缓冲溶液和KNO3稀释到1mL，震荡混匀后在室温下反应5～10分钟，溶液中最终阳离子聚合物PFP浓度为1μM，钾离子浓度为50mM，HeLa细胞浓度为(0、30、200、400、800、1000、2000、4000cells/mL)；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长荧光曲线，得到FAM的荧光发射光谱。仪器参数设置为激发波长380nm，发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。检测结束后的到了图3A中的g曲线。实验结果见图3：端粒酶浓度在30～1000个细胞范围内呈良好的线性关系，计算得到最低检测限为5个细胞。
实施例4
基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞：HeLa细胞，A549细胞，和MCF-7细胞分别接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl,pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
2)在含有5’端接有FAM的的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体：将5’端接有FAM的的端粒酶引物置于1.5mL PP管中，用端粒酶缓冲溶液将加热后的HeLa细胞，HeLa细胞，MCF-7细胞，以及A549细胞配制为1000cells/μL)，在不同的pp管中加入2μL上述各细胞，加入含有端粒酶引物的端粒酶缓冲溶液48μL，对其引物进行扩增延伸，最终溶液体积为50μL，于37℃下反应15分钟后，于95℃下灭活10分钟，使得延伸反应停止反应结束后，加入50μL的浓度为100mM KNO3并于37℃反应90分钟，形成G-四链体；其中，上述缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HNO3缓冲溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液：向上述反应后的溶液中加入一定量的阳离子聚合物PFP，用缓冲溶液和KNO3稀释到1mL，震荡混匀后在室温下反应5～10分钟，溶液中最终阳离子聚合物浓度为1μM，钾离子浓度为50mM，各细胞浓度均为2000cells/mL；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长荧光曲线，得到FAM的荧光发射光谱。仪器参数设置为激发波长380nm，发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。检测结束后的到了图3A中的g曲线。
实验结果见图4A，从图中可以看出，利用A549和HeLa细胞所产生的荧光信号轻强度较大，这说明A549和HeLa细胞中的端粒酶活性较高，MCF-7中的端粒酶活性与这两种细胞中的端粒酶活性相比偏低，而加热的HeLa细胞由于加热导致酶失活，荧光信号的变化非常微弱。
实施例5：基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞：HeLa细胞，MCF-7，以及A549接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.5％(w/v)CHAPS，10％(v/v)glycerol，0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
2)在含有5’端接有FAM的的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体：将5’端接有FAM的的端粒酶引物置于1.5mL PP管中，用端粒酶缓冲溶液将细胞配制成浓度为1000cell/μL，对其引物进行扩增延伸，在钾离子的存在下得到含有G-四链体的扩增溶液：在48μL含有端粒酶引物的端粒酶缓冲溶液中分别加入2μL稀释后的HeLa细胞，约2000个，BSA，GOD，Thrombin，Phi29DNA聚合酶，GSH约100μg在37℃下进行扩增反应90分钟后，于95℃下灭活10分钟，使得延伸反应停止，加入50μL的浓度为100mM KNO3并,37℃反应90分钟，形成G-四链体；其中，上述缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH＝8.3的20mMTris-HNO3缓冲溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；
3)在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液：向上述反应后的溶液中加入一定量的阳离子聚合物PFP，用缓冲溶液和KNO3稀释到1mL，震荡混匀后在室温下反应5～10分钟，溶液中最终阳离子聚合物PFP浓度为1μM，钾离子浓度为50mM，HeLa细胞浓度为2000cells/mL)；
4)对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测：将反应后的溶液置于四面通透的石英比色皿中，将其置于荧光仪器的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长荧光曲线，得到FAM的荧光发射光谱。仪器参数设置为激发波长380nm，发射波长527nm，狭缝宽度为5nm。检测结束后得到了图4B，从图中可以看出，其他干扰物不会引起信号发生较大的改变，说明该方法具有很好的特异性。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞；所述细胞为HeLa细胞；
2）在含有5’端接有FAM的端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的细胞进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到5’端接有FAM的G-四链体；
3）在5’端接有FAM的G-四链体中加入水溶性阳离子聚合物CCP得到反应后的溶液；
4）对反应后的溶液利用紫外可见灯进行可视化检测，同时利用荧光分光光度计对产生的荧光信号进行定量检测；
所述步骤2）中的具体步骤如下：首先将裂解后的细胞用缓冲液进行不同程度的稀释，然后取2μL稀释液加入48μL的含有5’端修饰了FAM的端粒酶引物的浓度为0.02 ~ 4.2 mM端粒酶扩增液中，在25 ~ 37℃下反应15 ~ 120分钟得到富G序列，在钾离子的作用下形成5’端接有FAM的G-四链体。
2.根据权利要求1所述的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2）的缓冲溶液为含有Mg(NO3)2、KNO3、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH =8.3的20mM Tris-HNO3溶液，所述Mg(NO3)2初始浓度为1.5 mM，KNO3初始浓度为0.63mM，Tween 20初始浓度为0.005%(v/v)，EGTA初始浓度为1 mM，dNTPs初始浓度为1 mM。
3.根据权利要求2所述的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2）的5’端接有FAM的端粒酶引物在缓冲溶液中的终浓度为1~200nM。
4.根据权利要求1所述的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述HeLa细胞有30~4000个细胞。
5.根据权利要求1所述的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤3）CCP的终浓度为1μM。
6.根据权利要求5所述的基于水溶性阳离子聚合物的荧光可视化定量检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述CCP为PFP。
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| A simple "add and measure"FRET-based telomeric tandem repeat sequence detection and telomerase assay method;Koji等;《Organic&Biomolecular Chemistry》;20140214(第12期);第936-941页 |
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