CN114315829B - 一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一类具有硝基还原酶响应的β‑咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐及其制备方法和应用,具有通式Ⅰ所示结构:本发明提供的β‑咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐可被肿瘤细胞内过表达的硝基还原酶还原从而产生显著单光子和/或双光子激发荧光,从而发挥线粒体靶向和硝基还原响应的荧光作用。本发明根据癌细胞内硝基还原酶过表达,开发新型具有肿瘤细胞和组织选择性荧光成像的β‑咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐的荧光探针,通过线粒体靶向和硝基还原酶响应进行肿瘤组织体内外荧光成像诊断应用,指导临床术中肿瘤切除,将具有重要的医药用途前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤组织快速生长需要消耗大量的氧气,同时其异常的微血管又导致了有限的氧气供应,因此,缺氧是实体肿瘤的共同特征。迄今为止,已经有许多方法在临床上用于缺氧检测,其中缺氧生物标志物检测法在近些年来得到了快速发展。硝基还原酶(Nitroreductase,NTRs)在缺氧肿瘤微环境过度表达,可作为一种肿瘤诊断指示性的生物标志物,并与实体肿瘤的缺氧程度直接相关而此备受关注。NTRs能够以NADH或NADPH作为电子供体,将硝基芳基化合物转变成相应的芳基胺。基于此,利用肿瘤组织内过表达的硝基还原酶来开发在肿瘤疾病检测的荧光探针具有重要意义。
线粒体是细胞中制造ATP的工厂,是细胞中关键的细胞器,尤其对于肿瘤细胞这一需要大量能量的细胞更为重要。但是,肿瘤细胞由于线粒体的功能障碍,使得其线粒体比正常细胞具有更高的线粒体膜电位,从而使得亲脂性阳离子对肿瘤更具有选择性。因此,线粒体靶向亦可被开发用于癌症疾病的诊断和治疗,并研究肿瘤细胞或组织内线粒体生理学和功能。
一般而言,激发光源的波长越长,组织穿透能力越强。目前大多数荧光探针仅适用于单光子激发,而不适用于双光子激发。具有双光子吸收能力的荧光探针可被两个近红外光子同时激发。因此,与单光子激发的荧光探针相比,具有双光子吸收能力的荧光探针具有更深的组织穿透能力,因而可用于较深处肿瘤成像,同时避免组织自身荧光的干扰。
发明内容
针对以上问题,本发明提供了一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐及其制备方法和应用,该β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐通过具有通过单光子和/或双光子激发进行体内外肿瘤细胞线粒体靶向和硝基还原酶响应荧光成像的医药用途,特别是在制备肿瘤荧光成像诊断试剂中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐,具有通式Ⅰ所示结构:
其中,R1表示H、C1-C6烷基、炔基取代的C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、甲氧基取代的C1-C6烷基、吗啉取代的C1-C6烷基和含氧C1-C6烷基中的一种;R2表示H、C1-C6烷基和甲氧基取代的苯基中的一种;R3表示C1-C6烷基、炔基取代的C1-C6烷基和卤代C1-C6烷基中的一种;Y-表示卤负离子和六氟磷酸根负离子的一种。
优选的,所述R1表示H、CH3、吗啉乙基、甲氧基乙氧基乙基;R2表示H、CH3、CH2CH3;R3表示CH3、CH2CH3、炔丙基;Y-代表卤负离子或六氟磷酸根负离子。
优选的,所述β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐的通式Ⅰ部分化合物代号及其对应的结构如下:
表1通式Ⅰ部分化合物代号及其对应的结构
I1:(E)-4-(2-(1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐;
I2:(E)-2-(2-(9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]-1-鎓碘盐;
I3:(E)-1-甲基-2-(2-(1-甲基-9-(2-吗啉乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓六氟磷酸盐;
I4:(E)-2-(2-(1-乙基-9-甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-(丙基-2-炔-1-基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓溴盐。
本发明的另一目的是提供一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐的制备方法,将9-R1-6-硝基-1-R2-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛与苯并[c,d]吲哚鎓盐在加热条件下发生Knoevenagel缩合反应得到β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐。
优选的,所述制备方法具体为:
将9-R1-6-硝基-1-R2-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛(化合物1)与苯并[c,d]吲哚鎓盐(化合物2)溶于无水乙醇中,滴加催化量的哌啶,回流反应,经重结晶或柱分离纯化得到β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐化合物Ⅰ;合成路线如下所示:
其中,R1表示H、C1-C6烷基、炔基取代的C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、甲氧基取代的C1-C6烷基、吗啉取代的C1-C6烷基和含氧C1-C6烷基中的一种;R2表示H、C1-C6烷基和甲氧基取代的苯基中的一种;R3表示C1-C6烷基、炔基取代的C1-C6烷基和卤代C1-C6烷基中的一种;Y-表示卤负离子和六氟磷酸根负离子的一种。
本发明还提供了一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉喹啉鎓盐在制备线粒体靶向和硝基还原酶响应荧光探针中的应用。
优选的,所述线粒体靶向和硝基还原酶响应荧光探针可通过单光子和/或双光子激发实现线粒体靶向和硝基还原酶响应产生荧光。
本发明还提供了一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉喹啉鎓盐在制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像诊断试剂中的应用。
优选的,所述β-咔啉喹啉鎓盐通过硝基还原酶响应发挥肿瘤细胞选择性荧光成像。
优选的,所述肿瘤为肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和宫颈癌中的一种。
本发明有益效果:
1、本发明将β-咔啉母环的3位通过Knoevenagel缩合反应引入亲脂性阳离子,从而形成具有D-π-A型的结构,进一步延长β-咔啉母环共轭体系和红移荧光波长,同时在β-咔啉母环的6位引入吸电子基团硝基获得具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐,利用可被肿瘤细胞内硝基还原酶还原从而产生显著近红外荧光,发挥线粒体靶向和硝基还原响应的荧光成像作用。
2、本发明根据癌细胞内硝基还原酶过表达,开发新型具有肿瘤细胞和组织选择性荧光成像功能的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐,具有较好的双光子吸收性质,实现深层次肿瘤组织选择性荧光成像应用,指导临床手术过程中肿瘤有效切除,将具有重要的医药用途前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的化合物经硝基还原酶还原机制;
图2为本发明实施例提供的化合物I1、I2和I4经硝基还原酶激活响应的荧光发射光谱;
图3为本发明实施例提供的化合物I1在硝基还原酶激活响应的不同波长下的双光子吸收截面;
图4为本发明化合物在肿瘤细胞中的荧光成像;
图5为本发明化合物在正常细胞中的荧光成像。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明,下面给出一系列实施例,这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1:(E)-4-(2-(1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐(I1)的制备;
将1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛(2.69g,10mmol)和1,2-二甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐(3.09g,10mmol)加入单口瓶中,加入5ml无水乙醇,随后加入1滴哌啶,回流过夜。TLC监测反应至完全,冷却至室温,减压浓缩,经柱层析纯化,得到β-咔啉喹啉鎓盐化合物蓝黑色固体(I1),产率为63.2%。
(I1)谱图数据为:ESI-MS(m/z):433[M]+;1H NMR(d6-DMSO,400MHz):δ9.37(d,J=7.4Hz,1H,Ar-H),9.13(s,1H,Ar-H),9.07(d,J=15.7Hz,1H,Ar-H),8.67(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H),8.40(d,J=9.0Hz,1H,Ar-H),8.17(m,1H,Ar-H),8.03(d,J=15.7Hz,1H,Ar-H),7.94(m,1H,Ar-H),7.87(d,J=8.7Hz,1H,CH=),7.75(d,J=8.2Hz,1H,CH=),7.60(m,1H,Ar-H),7.39(m,1H,Ar-H),4.32(s,3H,CH3),3.45(s,3H,CH3),1.39(s,3H,CH3).
实施例2:(E)-2-(2-(9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]-1-鎓碘盐(I2)的制备;
参照实施例1中(I1)的合成方法,由(2-甲氧乙氧基)乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛代替方法中的1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛,最后得到蓝黑色固体(I2),产率为55.5%。
(I2)谱图数据为:ESI-MS(m/z):507[M]+;1H NMR(d6-DMSO,400MHz):δ9.42(d,J=7.2Hz,1H,Ar-H),9.11(s,1H,Ar-H),9.01(d,J=15.4Hz,1H,Ar-H),8.92(s,1H,Ar-H),8.72(d,J=8.1Hz,1H,Ar-H),8.32(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.11(m,1H,Ar-H),8.00(d,J=15.7Hz,1H),7.84(m,1H,Ar-H),7.75(d,J=8.5Hz,1H,CH=),7.50(d,J=8.0Hz,1H,CH=),7.40(m,1H,Ar-H),7.11(m,1H,Ar-H),4.42(s,3H,OCH3),3,92(m,6H,CH2)3.12(m,2H,CH2),1.65(m,2H,CH2),1.50(s,3H,CH3).
实施例3:(E)-1-甲基-2-(2-(1-甲基-9-(2-吗啉乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓六氟磷酸盐(I3)的制备;
参照实施例1中(I1)的合成方法,由1-甲基-9-(2-吗啉乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛代替方法中的1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛,由1,2-二甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓六氟磷酸盐代替方法中的1,2-二甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐,最后得到蓝黑色固体(I3),产率为60.0%。
(I3)谱图数据为:ESI-MS(m/z):532[M]+,;1H NMR(d6-DMSO,400MHz):δ9.62(m,1H,Ar-H),9.32(s,1H,Ar-H),9.11(d,J=15.4Hz,1H,Ar-H),8.86(d,J=8.0Hz,1H,Ar-H),8.17(m,2H,2Ar-H),8.00(d,J=15.4Hz,1H,Ar-H),7.88(m,1H,Ar-H),7.72(d,J=8.3Hz,1H,CH=),7.75(d,J=8.9Hz,1H,CH=),7.40(m,1H,Ar-H),7.32(m,1H,Ar-H),4.42(m,4H,2CH2),4.11(m,2H,CH2),3.45(s,3H,CH3),2.72(m,6H,3CH2),1.45(s,3H,CH3).
实施例4:(E)-2-(2-(1-乙基-9-甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-(丙基-2-炔-1-基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓溴盐(I4)的制备;
参照实施例1中(I1)的合成方法,由1-乙基-9-甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛代替方法中的1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛,由2-甲基-1-(丙基-2-炔-1-基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓溴盐代替方法中的1,2-二甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐由最后得到蓝黑色固体(4),产率为53.9%。
(I4)谱图数据为:ESI-MS(m/z):471[M]+;1H NMR(d6-DMSO,400MHz):9.44(d,J=7.2Hz,1H,Ar-H),9.32(s,1H,Ar-H),8.88(m,2H,Ar-H),8.42(d,J=9.2Hz,1H,Ar-H),8.00(m,3H,3Ar-H),7.72(d,J=8.9Hz,1H,CH=),7.64(d,J=9.4Hz,1H,CH=),7.53(m,1H,Ar-H),7.22(m,1H,Ar-H),4.22(s,2H,CH2),3.72(m,2H,CH2)3.54(s,3H,CH3),3.10(m,1H,CH≡),1.52(m,3H,CH3)
实施例5:本发明化合物硝基还原酶响应荧光发射光谱测试
将本发明化合物I1,I2,I4溶于含1%DMSO的水溶液中,可以经硝基还原酶响应还原,生成相应的氨基还原产物,还原机制如图1所示,I1,I2,I4的还原产物已经质谱确证分别为403,477,431[M]+。并且本发明化合物I1,I2,I4在680-750nm左右的荧光峰值在硝基还原酶激活后明显增强,其峰值与酶响应之前相差5~10倍(图2),结果表明本发明化合物具有硝基还原酶响应的近红外荧光。
实施例7:采用飞秒荧光测量技术检测本发明化合物在硝基还原酶响应下的双光子吸收截面;
将本发明化合物I1溶于PBS缓冲液中(5μM),经硝基还原酶响应还原后,检测其经酶响应溶液和对照化合物Ru(bpy)3 2+从900nm到1060nm的双光子激发下的荧光强度。利用公式:δ=δr×(Fs×фr×nr)/(Fr×фs×ns),其中,δ,F,ф和n分别是双光子吸收截面,光谱积分面积,量子产率和浓度;s和r分别代表了本发明化合物经酶响应溶液和对照化合物。计算不同波长下本发明化合物的双光子吸收截面,计算结果表明,本发明化合物经酶响应后,在980nm具有最大的双光子吸收截面(δmax=98.2GM)(图3),而在未经酶响应的双光子吸收截面仅有29.2GM,由此说明本发明化合物具有硝基还原酶响应的双光子激发的荧光特性。
实施例8:采用共聚焦显微镜进行线粒体定位实验;
采用共聚焦显微镜进行线粒体定位实验,将结肠肿瘤细胞HT29、乳腺癌细胞McF-7、肝肿瘤细胞HepG2和人正常肝细胞LO2、人正常结肠上皮细胞CCD841分别由DEME培养液在激光共聚焦皿中培养12~24h,再向细胞中加入1~25μM的受试化合物(I1,I2或I3),将其放置置于37℃、含5%CO2缺氧下的细胞培养箱中孵育半小时。接着用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后,再加入1μM的线粒体染色剂MitoTracker green溶液并继续孵育半小时后用pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次,将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上进行共聚焦荧光成像,设置MitoTracker green:λex=488nm,λem=500-550nm;设置受试化合物激发波长:λex=600nm,λem=560-750nm。结果表明本发明所述化合物(红)能选择性的点亮肿瘤细胞(图4),并在肿瘤细胞中与线粒体染色剂MitoTracker green(绿)荧光共定位图像重叠良好,皮尔森系数均比较高,且在正常细胞中荧光很弱(图5)。由此表明本发明化合物具有线粒体靶向作用,并通过硝基还原酶响应对肿瘤细胞具有选择性的荧光成像。
实施例9:将本发明化合物通过双光子激发对组织进行成像
从HT29荷瘤裸鼠制备肿瘤组织切片,将组织切片与本发明化合物I1共培养3h,然后使用DPBS缓冲液洗涤,随后将切片转移到玻璃培养皿中,利用双光子荧光显微镜在960~1080nm激发波长下对组织进行深度成像,结果表明本发明化合物I1经双光子激发的成像深度可达210~260μm,远超过其在单光子激发下对肿瘤组织成像深度。
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (8)
1.一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐,其特征在于,具有通式Ⅰ所示结构:
其中,R1表示H、CH3、吗啉乙基和甲氧基乙氧基乙基中的一种;R2表示H、CH3和CH2CH3中的一种;R3表示CH3、CH2CH3和炔丙基中的一种;Y-代表卤负离子或六氟磷酸根负离子。
2.权利要求1所述的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐,其特征在于:所述β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐选自以下任一化合物:
I1:(E)-4-(2-(1,9-二甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]吲哚-1-鎓碘盐;
I2:(E)-2-(2-(9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-甲基苯并[c,d]-1-鎓碘盐;
I3:(E)-1-甲基-2-(2-(1-甲基-9-(2-吗啉乙基)-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓六氟磷酸盐;
I4:(E)-2-(2-(1-乙基-9-甲基-6-硝基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-基)乙烯基)-1-(丙基-2-炔-1-基)苯并[c,d]吲哚-1-鎓溴盐。
3.一类具有硝基还原酶响应的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐的制备方法,其特征在于,将化合物1和化合物2溶于无水乙醇中,滴加催化量的哌啶,回流反应,经重结晶或柱分离纯化得到β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐化合物Ⅰ;其中,化合物1为9-R1-6-硝基-1-R2-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲醛,化合物2为苯并[c,d]吲哚鎓盐;
所述制备方法的合成路线如下所示:
其中,R1表示H、CH3、吗啉乙基和甲氧基乙氧基乙基中的一种;R2表示H、CH3和CH2CH3中的一种;R3表示CH3、CH2CH3和炔丙基中的一种;Y-表示卤负离子和六氟磷酸根负离子的一种。
4.权利要求1或2所述的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐或权利要求3所述的制备方法制备得到的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐在制备线粒体靶向和硝基还原酶响应的荧光探针中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述线粒体靶向和硝基还原酶响应的荧光探针可通过单光子和/或双光子激发实现线粒体靶向和硝基还原酶响应产生荧光。
6.权利要求1或2所述的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐或权利要求3所述的制备方法制备得到的β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐在制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像诊断试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述β-咔啉苯并[c,d]吲哚鎓盐通过硝基还原酶响应发挥肿瘤细胞选择性荧光成像。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和宫颈癌中的一种。
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