CN106344499A - 一种fty720滴眼液及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种FTY720滴眼液及其制备方法和用途。本发明的FTY720滴眼液，每升含FTY720 1‑5g、磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g、苯扎氯铵0.1g和余量的注射用水，pH值为6.0‑7.5，渗透压为280‑320mOsmol/kg；其制备方法为：取适量注射用水，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和苯扎氯铵，使全溶；然后加入FTY720溶解，再加注射用水补足体积；过滤除菌后得到FTY720滴眼液。在角膜移植中，FTY720滴眼液具有很好的延长角膜植片生存期及抗排斥的效果。本发明填补了没有FTY720眼用制剂的空白，扩展了其在眼科临床的应用。

Description

一种FTY720滴眼液及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种FTY720滴眼液及其制备方法和用途。
背景技术
芬戈莫德，又称FTY720，是于1995年由日本学者从中药冬虫夏草(子囊菌亚门赤僵菌)培养液中提取的有效成分多球壳菌素(myriocin，ISP-I)，经过修饰后合成的新型免疫抑制剂。其分子式为C19H33NO2，分子量为343.93。该药的全身口服制剂现已于2010年被美国FDA批准上市，成为治疗复发性多发性硬化的一线用药。
FTY720独特的作用机制，使得其在抗移植排斥反应方面得到广泛研究。在多种动物皮肤、心脏、肝脏和肾移植，FTY720均显示其具有明显的抑制免疫、延长移植物存活的作用。对于不同的器官移植，FTY720的有效剂量不同。对于大鼠，0.1mg/(kg·d)的剂量可以有效抑制皮肤和心脏移植的排斥反应；1.0mg/(kg·d)明显延长肝脏移植物的存活；肾脏的最小有效剂量是0.05mg/(kg·d)；而小肠组织对FTY720不太敏感，8mg/(kg·d)剂量对其仅有中度延长移植物存活的作用。在眼科方面，FTY720也得到了学者广泛关注。Sedláková发现腹腔内注射FTY720可显著延长大鼠-小鼠异种角膜植片的存活期。K Mayer等人研究表明，口服1.2mg/kg/d FTY720可显著延长大鼠同种异体角膜植片生存率。此外，FTY720也被用到葡萄膜炎动物模型、干眼症和神经节细胞保护方面。
FTY720结构式如下：
传统眼科常用免疫抑制剂存在着诸多不足。首先，环孢霉素A分子量为1202.62，他克莫司则为804.02，而较大的分子量使得这两种药物难以透过角膜组织。其次，环孢霉素A等传统免疫抑制剂为脂溶性，较难透过亲水性的角膜基质层，进而难以达到眼内。再次，他克莫司为代表的免疫抑制剂水溶性差，且在水溶液中容易发生异构化，形成不具有免疫抑制功能的两种异构体。最后，传统免疫抑制剂全身及局部不良反应较多，以糖皮质激素为例，无论局部用药还是全身用药，都会引起激素性青光眼、白内障以及持续性角膜上皮糜烂等。
芬戈莫德FTY720目前临床上未有眼用制剂，极大的限制了其在眼科临床的应用。然而，芬戈莫德分子量小，较容易透过角膜，达到较高的前房浓度。此外，其具有良好的亲脂性，和也较为理想亲水性，在水溶液中浓度可达到69g/L(200.63mM)，从而易于穿透角膜的五层结构。且芬戈莫德性质稳定，不会在水溶液中发生异构化。因此，FTY720易于配制成滴眼液，并容易在前房内达到有效的药物浓度。
除上述理、化方面的优势外，FTY720独特的诱导淋巴细胞凋亡和加速外周成熟淋巴细胞归巢作用，使得FTY720与其他免疫抑制剂联合用药成为可能。体内体外实验均证明，FTY720对抗原处理与抗原呈递、淋巴细胞的增殖及效应功能无直接影响。并且，FTY720药动学与环孢素A、雷帕霉素、FK506等不同，这说明FTY720与这些药物之间没有相互作用，这些都决定了两者之间可能存在协同作用，并且在联合使用时，可以大大减少环孢素A的用量，因此，由于传统免疫抑制剂用量的减少而降低其毒副作用。有研究表明减少CsA用量FTY720与CsA联合应用时，CsA的剂量只需达到亚临床剂量(3mg/kg)就可达到满意的治疗效果，从而避免了CsA过量所可能引起的肝、肾毒性。此外，FTY720的毒副作用低，具有高度细胞选择性。有研究表明，FTY720可选择性作用于外周淋巴细胞，特别是CD4+淋巴细胞，骨髓细胞和胸腺细胞等不受影响。口服FTY720的副作用主要常见于贫血、水肿、高血钾、肠胃不适、轻度心动过缓等症状，而无肾毒性。至今尚未发现FTY720的神经毒性、致突变性、基因断裂的作用。
综上所述，FTY720具有分子量低、角膜穿透性好、兼具亲水亲脂性、稳定性较为理想，从而易于制备滴眼液；且FTY720抗排斥效果强、毒副作用低，并具有独特的作用。因此，开发FTY720滴眼液及其它眼用制剂具有显著优势和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有FTY720眼用制剂的不足，提供一种FTY720滴眼液及其制备方法和用途。
一种FTY720滴眼液，含FTY720作为活性成分，还含pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂和注射用水。
优选，所述的FTY720滴眼液，每升含1-5g FTY720作为活性成分，还含pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂和注射用水；所述的FTY720滴眼液pH值为6.0-7.5，渗透压为280-320mOsmol/kg。
优选，所述的pH调节剂为磷酸盐缓冲液，所述的渗透压调节剂为氯化钠，所述的抑菌剂为苯扎氯铵。
优选，所述的FTY720滴眼液每升含FTY720 1-5g、磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g、苯扎氯铵0.1g和余量的注射用水。
进一步优选，所述的FTY720滴眼液每升含FTY720 2-5g、磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g、苯扎氯铵0.1g和余量的注射用水。
所述的FTY720滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
取适量注射用水，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和苯扎氯铵，使全溶；然后加入FTY720溶解，再加注射用水补足体积；过滤除菌后得到FTY720滴眼液。
优选，所述的过滤除菌是用0.2μm过滤网过滤除菌。
FTY720在制备眼部外用制剂中的应用。
优选，FTY720滴眼液在制备眼部外用免疫抑制剂中的应用。
FTY720滴眼液在角膜移植中用于延长角膜植片生存期、抑制免疫反应的药物中的应用。
本发明制备质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液，并观察不同浓度FTY720滴眼液对动物模型眼前段组织结构的刺激性。建立和优化FTY720滴眼液的高效液相色谱(HPLC)检测体系，并以此为基础进行FTY720滴眼液的药物稳定性实验，研究其在不同储存条件下的药物稳定性。
在标准化滴眼液生产平台上，严格按照流程精密配制质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液。使用12只新西兰兔进行经典Draize眼刺激性实验，在不同时间点对角膜、虹膜和结膜的刺激反应进行评分，确定FTY720是否具有眼刺激性及刺激程度。使用HPLC建立FTY720的检测体系，优化和确定重要参数，包括色谱柱类型、流动相、检测波长、流速和进样量等。再根据优化后的检测体系，建立回归曲线、进行日内和日间精密度、回收率和专属性实验，验证FTY720的检测方法准确性。按照经典药物浓度加速实验的方法，分别将三种浓度的FTY720滴眼液放置在避光25±1℃、光照25±1℃和避光40±1℃三个不同储存条件。在0日、1个月、2个月和3个月三个时间点使用HPLC进行FTY720的浓度检测，观察FTY720滴眼液的药物稳定性。
根据Draize实验眼损害评分标准，质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液眼前段刺激性均符合无刺激性物质的标准。方法学实验结果表明FTY720滴眼液的HPLC检测体系具有良好精确性和可重复性。质量分数0.1％FTY720滴眼液在避光25±1℃、光照25±1℃和避光40±1℃三种不同条件下3个月浓度分别为0.938±0.029mg/mL、0.930±0.023mg/mL和0.932±0.057mg/mL。质量分数0.2％FTY720滴眼液在避光25±1℃、光照25±1℃和避光40±1℃三种不同条件下第三个月浓度分别为1.897±2.026mg/mL、1.869±0.019mg/mL和1.858±0.018mg/mL。质量分数0.5％FTY720滴眼液在避光25±1℃、光照25±1℃和避光40±1℃三种不同条件下第三个月浓度分别为4.609±1.039mg/mL、4.542±1.073mg/mL和4.526±1.009mg/mL。以上药物浓度均高于各自初始浓度的90％。此外，三种FTY720滴眼液在不同储存条件下，均未出现任何颜色改变、沉淀等异常。
本发明配制的质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液均无眼前段刺激性。方法学实验所建立的使用HPLC检测FTY720滴眼液药物浓度的系统具有良好精确性、灵敏性和可重复性。稳定性实验的结果表明，质量分数0.1％、0.2％和0.5％三种的FTY720滴眼液，各自均在避光25±1℃、光照25±1℃和避光40±1℃不同储存条件下，在三个月内具有良好的药物稳定性。
利用同种异体大鼠角膜移植模型研究FTY720滴眼液的抗排斥效果，共设六个组：分别为FTY720溶剂组(阴性对照组)、质量分数0.1％FTY720滴眼液组、质量分数0.2％FTY720滴眼液组、质量分数0.5％FTY720滴眼液组、口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)以及质量分数0.05％FK506混悬液组(阳性对照组)。根据Holland’s角膜排斥评分标准，质量分数0.5％FTY720滴眼液组角膜植片平均生存期为25.0±3.0天，与阴性对照组(11.0±1.6天)和质量分数0.1％FTY720滴眼液组(12.9±2.1天)有明显的统计学差异(p值均<0.05)。质量分数0.2％FTY720滴眼液角膜植片平均生存期为17.4±1.8天，优于阴性对照组(p<0.05)，但明显少于质量分数0.5％FTY720滴眼液组(p<0.05)。质量分数0.1％FTY720滴眼液组角膜植片平均生存期同阴性对照组无明显统计学差异(p＝0.078)。口服FTY720治疗组和质量分数0.05％FK506混悬液组角膜植片平均生存期分别为28.6±1.8天和29.1±1.5天，两组均与阴性对照组有统计学差异(p<0.05)。口服FTY720治疗组和质量分数0.05％FK506混悬液组之间无明显统计学差异(p＝0.585)，且两组均优于质量分数0.5％FTY720滴眼液组(p值均<0.05)。角膜植片石蜡切片和HE染色的病理学检查结果均支持上述结果，质量分数0.05％FK506混悬液组、口服FTY720治疗组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组的炎细胞浸润程度、角膜厚度、角膜基质层纤维小板肿胀崩解程度均轻于阴性对照组。
同种异体大鼠角膜移植模型研究结果表明，质量分数0.5％FTY720滴眼液和质量分数0.05％FK506混悬液(阳性对照)、口服FTY720治疗(1.2mg/kg/日)均能明显延长角膜植片生存期、均有较好的抗排斥效果，说明质量分数0.5％FTY720滴眼液的效果非劣于质量分数0.05％FK506混悬液(阳性对照)及口服FTY720治疗(1.2mg/kg/日)的。
本发明填补了没有FTY720眼用制剂的的空白，扩展了其在眼科临床的应用。FTY720滴眼液针对眼睛这一复杂结构器官而研发，滴眼液属眼部外用制剂，与全身口服制剂、注射剂给药途径、作用部位都不同，应用方法也不同。实验表明，本发明的较低浓度(质量分数0.5％)的FTY720滴眼液能达到较大量(1.2mg/kg/日)口服FTY720的基本相同的延长角膜植片生存期及抗排斥的效果，不仅能够避免较大量口服FTY720而带来的对眼部以外的身体其他部位的副作用，而且FTY720滴眼液制备工艺简单、且大大减少了FTY720的使用量，能极大降低药物成本，具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1是FTY720滴眼液在Draize实验第七日各组实验动物眼前段裂隙灯照相图；A：生理盐水组；B：质量分数0.1％FTY720滴眼液组；C：质量分数0.2％FTY720滴眼液组；D：质量分数0.5％FTY720滴眼液组。
图2是FTY720滴眼液溶质浓度标准曲线。
图3是FTY720滴眼液专属性实验HPLC色谱图；A：FTY720溶剂组(阴性对照组)；B-D依次分别为质量分数0.1％、0.2％、0.5％FTY720滴眼液组。
图4是质量分数0.1％FTY720滴眼液3个月稳定性加速实验浓度变化曲线图；Condition1：25℃，避光保存；Condition 2：25℃，光照保存；Condition 3：40℃，避光保存。
图5是质量分数0.2％FTY720滴眼液3个月稳定性加速实验浓度变化曲线图；Condition1：25℃，避光保存；Condition 2：25℃，光照保存；Condition 3：40℃，避光保存。
图6是质量分数0.5％FTY720滴眼液3个月稳定性加速实验浓度变化曲线图；Condition1：25℃，避光保存；Condition 2：25℃，光照保存；Condition 3：40℃，避光保存。
图7是术后第14日各组大鼠术眼眼前段照相；A：FTY720溶剂组(阴性对照组)；B：口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)；C：质量分数0.05％FK506混悬液组(阳性对照组)；D-F：依次分别为质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液组。
图8是各组角膜植片在30日实验期内生存分析曲线图；Control Group、OralFTY720Group、0.05％FK506Group、0.1％FTY720Group、0.2％FTY720Group、0.5％FTY720Group依次分别表示FTY720溶剂组(阴性对照组)、口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)、质量分数0.05％FK506混悬液组、质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液组。
图9是各组总炎症指数评分随时间变化曲线；F＝19.16，P＜0.0001；Control、OralFTY720、0.05％FK506、0.1％FTY720、0.2％FTY720、0.5％FTY720依次分别表示FTY720溶剂组(阴性对照组)、口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)、质量分数0.05％FK506混悬液组、质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液组。
图10是各组角膜植片在术后第14日病理切片及HE染色，放大倍数400X；A：FTY720溶剂组(阴性对照组)；B：口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)；C：质量分数0.05％FK506混悬液组(阳性对照组)；D-F：依次分别为质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液组；Epi：角膜上皮层；Endo：角膜内皮层。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
1.FTY720滴眼液的制备
制备材料：
PBS、NaCl、苯扎氯铵、0.2μm过滤网、5mL无菌滴眼液瓶、真空抽吸瓶、分析天平、FTY720原料(购自湖北康宝泰精细化工有限公司，批号：20110612，CAS No.：162359-56-0)其相关信息如表1所示。
表1制备FTY720滴眼液所用FTY720原料相关信息
质量分数0.1％FTY720滴眼液制备处方：
质量分数0.2％FTY720滴眼液制备处方：
质量分数0.5％FTY720滴眼液制备处方：
质量分数0.5％FTY720滴眼液制备工艺：
1)在量杯中加入700mL注射用水，加入处方量的磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g和苯扎氯铵0.1g，搅拌溶解；
2)在上述溶液中，加入处方量的FTY720 5g，搅拌使其完全溶解，加注射用水至全量1000mL，搅拌混合均匀；
3)使用0.2μm过滤网过滤除菌；
4)过滤好的药液即为质量分数0.5％FTY720滴眼液，将其无菌分装于5mL无菌滴眼液瓶，规格为5mL:25mg，密封，并在4-8℃冰箱中避光保存。
本发明的质量分数0.5％FTY720滴眼液制备工艺的关键点在特定处方下，可将pH严格控制在6.0-7.5范围，渗透压为280-320mOsmol/kg。
质量分数0.1％、0.2％FTY720滴眼液制备工艺与质量分数0.5％FTY720滴眼液制备工艺相同，只是其中FTY720终浓度分别对应为质量分数0.1％(规格为5mL:5mg)、质量分数0.2％(规格为5mL:10mg)。FTY720溶剂(阴性对照)为参照质量分数0.5％FTY720滴眼液制备处方和制备工艺、但是不加入FTY720而制备得到的混合溶剂。
2.FTY720滴眼液眼部安全性实验(Draize实验)
实验动物：
品种品系：新西兰白兔(12只)
等级：清洁普通动物(Clean Conventional Animal，CCV)
规格：体重4.0kg、成年、雌性
动物来源：南方医科大学动物实验中心
环境设施许可证号：SYXK(粤)2010-0058
实验仪器：
兔固定架、眼前段裂隙灯照相系统(Zeiss)、荧光素钠滴眼液。
实验方法：
1)配制质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液，固定新西兰兔，轻轻拉开兔右眼的下眼睑，将相应浓度FTY720滴眼液0.1mL(100mg)分别滴入结膜囊中。
2)使上、下眼睑被动闭合1s，以防止受试物丢失。左眼不处理作自身对照。
3)在滴入受试物后1、24、48、72h以及第4d和第7d对动物眼睛进行检查。如果72h未出现刺激反应，即可终止试验。如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用，7d内不恢复者，为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间，一般不超过21d。
4)除了对角膜、虹膜、结膜进行观察外，其它损害效应均应当记录并报告。每个时间点拍摄眼前段相片，并在钴蓝光下，使用荧光素钠滴眼液观察角膜上皮的情况。
评价指标：
具体评价指标见表2和表3。
表2眼损害的评分标准
表3眼刺激性反应分级
3.FTY720滴眼液HPLC方法学研究
实验仪器、耗材和试剂：
高效液相色谱仪(Agilent 1100)
50μL进样针(Agilent)
Binder稳定性实验箱
高效液相色谱柱(Phenomenex C18)
光照箱：上海南荣实验室设备有限公司，型号：NRD-200
干燥器
样品来源：
质量分数0.1％、0.2％、0.5％FTY720滴眼液
主要试剂：
乙腈(Burdick&Jack，色谱纯)
三氟乙酸(Darmstadt，Germany，色谱纯)
甲醇(Honeywell，色谱纯)
超纯水(Milli-Q Academic A10)
硝酸钾饱和溶液(自配)
实施例1：FTY720滴眼液眼前段刺激性实验(Draize实验)
在整个Draize实验过程中，未出现任何实验动物体重减轻、死亡、躁狂、其他精神和行为异常。根据Draize实验眼刺激性评分，各组FTY720滴眼液对眼部结膜、角膜和虹膜等眼前段结构均无刺激性，属于无刺激性级别的物质。如图1所示，可见各FTY720滴眼液组结膜无充血、无分泌物；角膜透明、荧光色染色阳性提示角膜上皮机械性损伤完整性好，角膜基质层无水肿、无瘢痕、云翳等异常；前房清、未见渗出、Tyndall现象；虹膜纹理清晰，颜色正常，表面未见渗出；晶状体透明。各项眼前段指标同生理盐水组相同。
实施例2：FTY720滴眼液HPLC检测方法学的建立
2.1标准曲线的建立
精密吸取质量分数0.5％FTY720滴眼液一定量，流动相稀释，配制成浓度为5、10、20、50、80μg/mL FTY720对照品溶液。分别吸取20uL注入液相色谱仪。以峰面积A对浓度C线性回归，求得标准曲线，即A(y)＝3.8129C(x)+4.2128，R2＝0.9994。图2结果表明FTY720滴眼液在5-80μg/mL范围内线性良好。质量分数0.1％、0.2％FTY720滴眼液也均能按照相同的原则建立HPLC检测方法学(包括标准曲线的建立、精密度试验、回收率试验和专属性试验)。
2.2精密度试验
分别制备低、中、高浓度FTY720对照品溶液(分别为5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL)，日内进针次数5次，日间进针次数3次，测定3d，分别计算日内和日间精密度。结果见表4。三种不同浓度的FTY720对照品溶液日内精密度、日间精密度RSD均小于1.0％，符合2010版中国药典相关规定，表明HPLC的检测方法精密度良好。
表4日内和日间精密度
2.3回收率试验
分别制备质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720对照品滴眼液，各制备三份，将测得的峰面积代入标曲算得实际浓度，实际浓度与理论浓度的比值即为回收率。结果见表5。低、中、高浓度FTY720对照品滴眼液的回收率分别在100％至104.2％之间，符合FTY720滴眼液的测定要求。
表5回收率实验结果
2.4专属性试验
分别取FTY720溶剂(阴性对照)、质量分数0.1％、0.2％、0.5％FTY720滴眼液0.1mL，分别用流动相稀释至10mL，得到稀释后的空白滴眼液及10ug/mL、20μg/mL、50μg/mL的FTY720滴眼液。分别取上述溶液各20uL注入液相色谱仪，记录色谱图。图3的结果表明空白滴眼液在此色谱条件下无色谱峰出现，说明空白基质及其他辅料不会干扰FTY720的测定无干扰，该HPLC的检测方法的专属性良好。
实施例3:FTY720滴眼液稳定性加速实验
3.1质量分数0.1％FTY720滴眼液稳定性加速实验
质量分数0.1％FTY720滴眼液稳定性加速实验浓度变化曲线见图4，对应的数据结果如表6所示。
表6质量分数0.1％FTY720滴眼液在不同储存条件和时间点的浓度变化
3.2质量分数0.2％FTY720滴眼液稳定性加速实验
质量分数0.2％FTY720滴眼液稳定性加速实验浓度变化曲线见图5，对应的数据结果如表7所示。
表7质量分数0.2％FTY720滴眼液在不同储存条件和时间点的溶质浓度
3.3质量分数0.5％FTY720滴眼液稳定性加速实验
质量分数0.5％FTY720滴眼液稳定性加速实验浓度变化曲线见图6，对应的数据结果如表8所示。
表8质量分数0.5％FTY720滴眼液在不同储存条件和时间点的溶质浓度
实施例4：FTY720滴眼液在同种异体大鼠角膜移植模型中抗排斥效果
建立48只大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，将其随机平均分为6组，分别为FTY720溶剂组(阴性对照组)、质量分数0.1％FTY720滴眼液组、质量分数0.2％FTY720滴眼液组、质量分数0.5％FTY720滴眼液组、口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)以及质量分数0.05％FK506混悬液组(阳性对照组)。除口服用药组外，其他组均使用各自滴眼液滴眼，给药频率为4次/日，给药时间为30日。每日观察FTY720滴眼液的抗排斥效果，根据Holland’s角膜排斥评分标准进行评分。用药结束后对各组实验动物进行生存分析和生存曲线对比。另建立18只大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，按照上述方法随机平均分组，每组3只模型，用药同上。在实验第14日，处死动物后，取眼球制备角膜植片石蜡切片，HE染色进行病理学检查，并使用免疫组织化学法，检测各组植片中IL-2、IL-10、IFN-γ、TGF-β等免疫排斥反应相关因子的表达情况，进而评估FTY720滴眼液抗排斥反应的效果。
质量分数0.5％FTY720滴眼液组角膜植片平均生存期为25.0±3.0天，与阴性对照组(11.0±1.6天)和质量分数0.1％FTY720滴眼液组(12.9±2.1天)有明显的统计学差异(p值均<0.05)。质量分数0.2％FTY720滴眼液角膜植片平均生存期为17.4±1.8天，优于阴性对照组(p<0.05)，但明显少于质量分数0.5％FTY720滴眼液组(p<0.05)。质量分数0.1％FTY720滴眼液组角膜植片平均生存期同阴性对照组无明显统计学差异(p＝0.078)。口服FTY720治疗组和质量分数0.05％FK506混悬液组角膜植片平均生存期分别为28.6±1.8天和29.1±1.5天，两组均与阴性对照组有统计学差异(p<0.05)。口服FTY720治疗组和质量分数0.05％FK506混悬液组之间无明显统计学差异(p＝0.585)，且两组均优于质量分数0.5％FTY720滴眼液组(p值均<0.05)。角膜植片石蜡切片和HE染色的病理学检查结果均支持上述结果，质量分数0.05％FK506混悬液组、口服FTY720治疗组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组的炎细胞浸润程度、角膜厚度、角膜基质层纤维小板肿胀崩解程度均轻于阴性对照组。同时，质量分数0.1％、0.2％FTY720滴眼液也均显示出了一定的抗排斥效果，但效果比0.5％FTY720滴眼液弱。因此，质量分数在0.1％～0.5％可以作为FTY720滴眼液抗排斥反应的有效用药浓度范围。以上实验结果均与眼前段检查的临床表现相符。
4.1各组角膜植片生存期数据统计分析
表9各组角膜植片平均生存期
如表9所示，实验结束后，未出现任何大鼠死亡、白内障、眼内炎、前房鸡血等并发症。实验动物未出现体重减轻、脱毛、颜色改变、行为异常等情况。根据Holland’s角膜排斥评分标准，A：FTY720溶剂组(阴性对照组)角膜植片平均生存期为11.0±1.6日；B：口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)角膜植片平均生存期为28.6±1.8日；C：质量分数0.05％FK506混悬液组(阳性对照组)角膜植片平均生存期为29.1±1.5日；D-F：依次分别为质量分数0.1％、0.2％和0.5％FTY720滴眼液组，各自角膜植片平均生存期为12.9±2.1日、17.4±1.8日和25.0±3.0日。
FTY720溶剂组、质量分数0.1％和0.2％FTY720滴眼液组内，所有实验大鼠均在30日内达到排斥反应评分标准，时间集中在术后2周左右。而口服FTY720治疗组、质量分数0.05％FK506混悬液组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组的角膜生存时间明显延长，并且各自有4、5和1只大鼠在观察结束后仍未达到角膜植片排斥的标准。各组中位数同平均角膜植片生存期大致相符，其中FTY720溶剂组(阴性对照组)最低，为10.5日，而质量分数0.5％FTY720滴眼液组明显高于此阴性对照组为25日。
4.2术后第14日各组典型眼前段照相
术后第14日各组缝线均无松脱，前房形成良好，无白内障、眼内炎和前房出血等并发症。由图7可见FTY720溶剂组(阴性对照组)和质量分数0.1％FTY720滴眼液组角膜植片明显水肿、混浊，眼内结构窥不清，角膜上皮水肿、粗糙，角膜反光点边界不清、形状不规则。植片边缘可见少量角膜新生血管生长。在质量分数0.2％FTY720滴眼液组，可见角膜轻度水肿，植片轻度混浊，虹膜纹理不清，但仍能看清瞳孔轮廓，角膜缘周边可见少量新生血管形成，尚未长入角膜植片。在口服FTY720治疗组、质量分数0.05％FK506混悬液组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组，可见角膜植片无水肿、植片透明，虹膜纹理清晰可见，瞳孔正位，无反应性渗出，晶状体透明，植片及植床均未见新生血管形成。
4.3各组角膜植片生存曲线图
如图8所示，FTY720溶剂组(MST＝11.0±1.6日)、质量分数0.1％FTY720滴眼液组(MST＝12.9±2.1日)的大鼠都在术后一周开始陆续达到角膜排斥反应的标准，两者生存曲线之间无明显的统计学差异，p＝0.078。质量分数0.2％FTY720滴眼液组(MST＝17.4±1.8日)生存曲线同FTY720溶剂组和质量分数0.1％FTY720滴眼液组之间具有明显的统计学差异，均p<0.05。质量分数0.5％FTY720滴眼液组(MST＝25±3.0日)在延长角膜植片生存期的效果明显优于前面三组，均p<0.05；但抗排斥效果较口服FTY720治疗组(MST＝28.6±1.8日)、质量分数0.05％FK506混悬液组(MST＝29.1±1.5日)差，p值分别为0.025和0.009，均低于设定值(P＝0.05)。而口服FTY720治疗组、质量分数0.05％FK506混悬液组在实验期内的角膜植片生存率并无明显统计学差异，p＝0.585。
4.4各组角膜植片炎症因子指数图
4.4.1各组总炎症指数评分随时间变化曲线
如图9所示，在30日实验观察期结束时，各组均出现不同程度的角膜植片新生血管。与FTY720溶剂组(阴性对照组)、质量分数0.1％FTY720滴眼液组和质量分数0.2％FTY720滴眼液组相比，质量分数0.5％FTY720滴眼液组新生血管评分低，具有统计学差异(p值均<0.05)。而质量分数0.05％FK506混悬液组新生血管评分最低，优于口服FTY720治疗组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组(p值均<0.05)。
4.5角膜植片石蜡切片及HE染色
由图10可见，在术后第14日，阴性对照组、质量分数0.1％FTY720滴眼液组和质量分数0.2％FTY720滴眼液组的病理切片及HE染色均表现为，角膜上皮层出现肿胀，个别有大疱改变，角膜基质层明显增厚，纤维小板肿胀、部分崩解，结构不规则，大量炎症细胞浸润、增殖，并可以在植床与植片交界区出现血管管腔和红细胞，这提示新生血管的形成。此外，内皮细胞层也明显增厚，水肿。以上病理表现与图7中的术后14日眼前段照片中的临床表现相符，提示强烈的免疫炎症反应的发生。
相反，在口服FTY720治疗组(1.2mg/kg/日)、质量分数0.05％FK506混悬液组和质量分数0.5％FTY720滴眼液组中，角膜厚度、纤维组织的排列、炎细胞浸润程度、新生血管数量等，均明显低于阴性对照组。以上表现与前面生存分析和炎症指数的结果相吻合。

Claims (10)

1.一种FTY720滴眼液，其特征在于，含FTY720作为活性成分，还含pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂和注射用水。
2.根据权利要求1所述的FTY720滴眼液，其特征在于，每升含1-5g FTY720作为活性成分，还含pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂和注射用水；所述的FTY720滴眼液pH值为6.0-7.5，渗透压为280-320mOsmol/kg。
3.根据权利要求1或2所述的FTY720滴眼液，其特征在于，所述的pH调节剂为磷酸盐缓冲液，所述的渗透压调节剂为氯化钠，所述的抑菌剂为苯扎氯铵。
4.根据权利要求3所述的FTY720滴眼液，其特征在于，所述的FTY720滴眼液每升含FTY7201-5g、磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g、苯扎氯铵0.1g和余量的注射用水。
5.根据权利要求4所述的FTY720滴眼液，其特征在于，所述的FTY720滴眼液每升含FTY7202-5g、磷酸氢二钠15.35g、磷酸二氢钠4.14g、氯化钠0.5g、苯扎氯铵0.1g和余量的注射用水。
6.一种权利要求4所述的FTY720滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取适量注射用水，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和苯扎氯铵，使全溶；然后加入FTY720溶解，再加注射用水补足体积；过滤除菌后得到FTY720滴眼液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的过滤除菌是用0.2μm过滤网过滤除菌。
8.FTY720在制备眼部外用制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，FTY720滴眼液在制备眼部外用免疫抑制剂中的应用。
10.FTY720滴眼液在角膜移植中用于延长角膜植片生存期、抑制免疫反应的药物中的应用。
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