CN104771385A - Fty720在制备治疗干眼症药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属药物应用领域，涉及FTY720在制药中的新用途，具体涉及FTY720在制备治疗干眼症药物中的用途，尤其是在制备治疗眼表疾病综合征药物中的新用途，所述的FTY720对以综合征为代表的眼表自身免疫性炎症具有免疫调控和抑制作用。本发明经动物实验证实，稀释后的FTY720以眼用滴剂的方式小鼠眼部给药，治疗后的NOD小鼠综合征的炎症表现明显缓解，泪液质与量明显改善，泪膜破裂时间明显延长，泪液和眼表组织中的致炎因子及MMP水平显著降低。进一步的，所述的FTY720可制成治疗

Description

FTY720在制备治疗干眼症药物中的用途

技术领域

本发明属于药物应用领域，涉及FTY720在制药中的新用途，具体涉及FTY720在制备治疗干眼症药物中的用途，尤其是在制备治疗眼表疾病综合征药物中的新用途，所述的FTY720对以综合征为代表的眼表自身免疫性炎症具有免疫调控和抑制作用。

背景技术

研究报道，干眼症是主要的眼表疾病之一，该眼表疾病指多因素导致的泪液异常和眼表炎症，其主要症状表现为眼表不适、视力影响、泪膜不稳定并眼表组织的损害。其发病过程中同时合并泪膜渗透压升高和眼表炎症（Lemp,M.A.2007.The definition and classification of dry eye disease:report of theDefinition and Classification Subcommittee of the International Dry EyeWorkShop(2007).The Ocular Surface,5(2),75-92.）。最近越来越多的研究表明，干眼症的发病机制非简单的泪膜质与量的异常以及眼表组织和外分泌腺受损，而是T细胞介导的眼表组织和腺体自身免疫性炎症（Schaumburg,C.S.,Siemasko,K.F.,De Paiva,C.S.,Wheeler,L.A.,Niederkorn,J.Y.,Pflugfelder,S.C.,&Stern,M.E.2011.Ocular surface APCs are necessaryfor autoreactive T cell-mediated experimental autoimmune lacrimalkeratoconjunctivitis.The Journal of Immunology,187(7),3653-3662.）。综合征是一种典型的干眼症，病理上主要表现为泪腺和唾液腺等外分泌腺的自身免疫性炎症（Lemp,M.A.1995.Report of the National EyeInstitute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes.CLAO J21:221-232.）。

由于干眼症的发生发展影响因素多，涉及面广，已经成为临床上常见的眼表疾病。研究显示，诱发干眼症的因素包括眼表炎症，药物滥用，长期佩戴角膜接触镜、更年期、长期使用电脑以及其他免疫因素等。目前，干眼症的主要治疗方法包括人工泪液，皮质类固醇激素以及环保霉素A（Cyclosporine A，CsA）等免疫抑制剂。但是，人工泪液仅是一种泪液替代品，其本身无治疗作用；皮质类固醇激素及CsA等药物长期使用对眼表均有一定的毒副作用，迄今为止，临床实践中尚无治疗干眼症的特效药物。因此，研发疗效好且长期使用无明显局部及全身毒副作用的药物成为当下干眼症治疗中亟待解决的棘手问题。

FTY720是日本学者从冬虫夏草子囊菌培养液中提取出抗生素成分ISP-1，经化学修饰后合成的一种新型的具有免疫调控作用的制剂，其分子量小于500道尔顿（Fujita,T.,K.Inoue,S.Yamamoto,T.Ikumoto,S.Sasaki,R.Toyama,K.Chiba,Y.Hoshino,andT.Okumoto.1994.Fungal metabolites.Part11.A potent immunosuppressive activity found in Isaria sinclairii metabolite.J Antibiot(Tokyo)47:208-215.）。该制剂在结构上不同于现有技术的免疫抑制剂如CsA、他克莫司以及雷帕霉素等真菌多肽。国内外研究结果显示，该制剂在治疗多发性硬化，抗器官移植排斥，减轻缺血再灌注损伤以及诱导肿瘤细胞凋亡和防止转移等方面都显示出其具有独特的治疗效果。研究还显示该制剂作为免疫调控剂具有如下优势：只将淋巴细胞滞留于周围淋巴器官，而对淋巴细胞正常的增殖、迁徙和分化功能无影响，在缓解局部炎症的同时，不造成肌体全面的免疫抑制效应。

目前为止，国内外尚未见FTY720用于干眼症治疗的研究报道。本申请的发明人拟提供FTY720在制备治疗干眼症药物中的新用途。

发明内容

本发明的目的是提供FTY720在制药中的新用途，具体涉及FTY720在制备治疗干眼症药物中的用途，尤其是在制备治疗眼表疾病综合征药物中的新用途，所述的FTY720对以综合征为代表的眼表自身免疫性炎症具有免疫调控和抑制作用。

本发明进行了动物实验，分别进行活体观察和组织检测，结果证实，所述的FTY720对以综合征为代表的眼表自身免疫性炎症具有免疫调控和抑制作用。进一步的，所述的FTY720可制成治疗综合征为代表的眼表疾病的药物，尤其是制成特定使用浓度范围的眼部滴剂。

本发明将FTY720稀释后以眼用滴剂的方式小鼠眼部给药，治疗后的NOD小鼠综合征的炎症表现明显缓解，泪液质与量明显改善，泪膜破裂时间明显延长，泪液和眼表组织中的致炎因子及MMP水平显著降低。本发明中，确定FTY720滴剂在小鼠眼表组织的最佳使用浓度在0.005%-0.05%之间，与传统免疫抑制剂相比，达到同等甚至更优疗效，FTY720治疗浓度明显降低，该浓度FTY720给药2月后未见小鼠眼部明显毒副作用。

本发明以业内公认的具有典型综合征特点的非肥胖糖尿病小鼠（non-obese diabetes Mice，NOD mice）为模型。选取10周龄雄性NOD小鼠168只，随机分为7组，每组24只，分别为0.5％FTY720组、0.05％FTY720组、0.005%FTY720组、0.001%FTY720组、0.05%CsA组、生理盐水组和阳性对照组。使用生理盐水将FTY720分别稀释成0.5%、0.05％、0.005％、0.001%的FTY720水溶液，CsA使用生理盐水稀释成0.05%的水溶液，以上药物给药方法均为小鼠双眼点滴，设置生理盐水组和阳性对照组24只。FTY720各组、0.05%CsA组以及生理盐水组均为每天3次给药，给药时间分别为上午8点±1小时，中午12点±1小时和下午5点±1小时，空白组不作任何干预。观察时间窗分别为药物干预后2周，1个月和2个月。活体观察指标包括泪膜破裂时间（break-up test,BUT），酚红绵线试验（phenol red cotton thread test，PRCTT）检查，同时收集小鼠泪液标本，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测白介素1β（interleukin-1beta，IL-1β）水平。小鼠处死后，收集结膜和泪腺组织标本，免疫组织化学检测细胞间粘附分子1（intercellularadhesion molecule-1，ICAM-1）和白细胞共同抗原（leucocyte common antigen，LCA）在各组的表达水平，明胶酶谱法检测各组角膜组织基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）水平。实验结果显示：FTY720各组与0.05%CsA组的BUT和酚红棉线湿润长度在2周、1个月和2个月的观察窗逐渐提高，其中2周观察窗上升最明显，生理盐水组和阳性对照组的BUT和酚红棉线湿润长度随着时间延长逐渐下降。印迹细胞学检查示药物干预各组的上皮细胞和杯状细胞的数目均较治疗前有明显提高，核浆比例改善，细胞核深染，生理盐水组和阳性对照组未见改善。ELISA检测显示，各干预组中除了0.5%FTY720组IL-1β水平明显上调之外，其余各组皆显著下降，生理盐水组和阳性对照组IL-1β水平随时间延长逐渐升高。免疫组织化学检查可见生理盐水组和阳性对照组的眼表组织中炎症细胞浸润明显，ICAM-1表达持续升高，经药物干预后，炎症细胞显著减少，ICAM-1表达下调。明胶酶谱法结果显示，MMP-2和MMP-9在阳性对照组、生理盐水组和0.5％FTY720表达水平明显上调，与之相比，FTY720其余低浓度治疗组和CsA组的MMP-2和MMP-9表达水平显著降低。以上各干预组中，0.005%FTY720组的总体疗效好于其他FTY720组以及0.05%CSA组(p<0.05)。

本发明实验结果还显示，0.5%FTY720组治疗1周后可见小鼠眼表组织充血水肿，0.001%FTY720疗效相对较弱，FTY720的治疗浓度在0.005%-0.05%之间的疗效最佳。结果明确界定了FTY720在NOD小鼠综合征上的最佳浓度范围，为该药的进一步临床研究打下了坚实基础。

本发明提供了FTY720治疗以综合征为代表的干眼症的新用途，为FTY720治疗以综合征为代表的干眼症治疗提供了有价值的药物选择，进一步为眼表免疫性炎症治疗提供了新的治疗策略和治疗思路。

附图说明：

图1是ELISA法比较各组泪液中IL-1β的水平，

其中，*:FTY720低剂量治疗组(0.05%,0.005%and0.001%)以及0.05%CsA与阳性对照和生理盐水组比较:P<0.01;

#:阳性对照组和生理盐水组与0.5%FTY720组比较:P<0.01；F：FTY720。

图2是结膜组织免疫组化各组ICAM-1的表达水平比较，

其中显示：与阳性对照组和生理盐水组比较，ICAM-1的表达水平在FTY720各组及0.05%CsA均明显下降。

图3是结膜组织免疫组化各组LCA表达水平比较。

其中显示：在阳性对照组及生理盐水组，结膜下可见大量白细胞浸润，与之相比，FTY720及CsA治疗后，LCA阳性的白细胞数量明显减少。

图4是明胶酶谱法检测各组角膜MMP的水平变化，

其中显示：与阳性对照组合生理盐水组比较，除0.5%FTY720组外，MMP-2和MMP-9的表达水平在其他FTY720治疗组均呈现明显下降。

具体实施方式：

实施例1

1.实验动物：10周龄雄性NOD小鼠168只，购自中科院上海分院九亭实验动物中心，中科院上海生命科学院健康科学研究中心动物房统一清洁饲养，有关该小鼠的Sjogren综合症模型国外已有相关研究证实。

2：药品来源：FTY720为白色结晶纯，由浙江杭州同明科技有限公司马启明先生惠赠，生理盐水溶解成水溶液（本申请所用FTY720经生理盐水稀释后所用浓度的PH值在7.28～7.52之间，下同），CsA眼药水购自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，生理盐水进一步稀释成水溶液。

实验试剂：酚红棉线购自Zone-quick公司，小鼠ELISA试剂盒购自Quantikine M Murine;R&DSystems,Minneapolis,MN，抗小鼠单克隆抗体ICAM-1购自Biolegend公司，抗小鼠单克隆抗体LCA购自eBioscience公司，Ripa蛋白裂解液购自申能博彩生物科技有限公司。

3：干预方法：使用生理盐水将FTY720分别稀释成0.5%、0.05％、0.005％FTY720、0.001%FTY720水溶液，CsA稀释成0.05%CsA水溶液，小鼠眼部点滴，同时设置生理盐水组和阳性对照组各30只。FTY720各组、CsA组以及生理盐水组每天3次给药，时间分别为上午8点±1小时，中午12点±1小时和下午5点±1小时，空白组不作任何干预。观察时间窗为药物干预后2周，1个月和2个月。

4：观察指标：

1：活体观察指标

1）：BUT

麻醉后检查各组小鼠的泪膜破裂时间，以观察眼表杯状细胞及眼睑相关腺体的合成和分泌功能；

1％戊巴比妥钠小鼠腹腔注射麻醉（10μl/g，下同），于25倍解剖显微镜下，显微镊拉开小鼠的眼睑，连续观察泪膜变化，以角膜上第1个干燥点出现为准，观察BUT，重复三遍，取平均值（下同）。

2）：PRCTT：

麻醉后测试各组小鼠的酚红棉线湿润长度，以观察各组泪液的泪液分泌量，评估泪腺的功能；

小鼠麻醉方法同上，25倍解剖显微镜下，显微镊拉开下眼睑，将酚红棉线置于小鼠的下睑穹隆结膜（注意尽量不要刺激角膜和结膜），1分钟后测量酚红棉线变红长度，重复三遍，取平均值（下同）。

3）：ELISA

小鼠常规腹腔麻醉后，收集各组小鼠泪液，测试泪液中白介素-1β的水平，藉以评估泪液中的致炎因子水平：

小鼠常规腹腔麻醉后，毛细管吸取1μl0.1％牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA）滴于小鼠眼表，开合小鼠眼睑使液体和泪液充分混合后，于下穹窿部吸取1μlBSA和泪液混合液，置于200μlEP管中，双眼各取1μl，－80℃冰箱冻存待用。检测时将同组5个小鼠的样本混合，稀释6倍，检测各组IL-1β水平，重复三遍，取均值（下同）。ELISA操作步骤如下（双抗体夹心法）：

①取出包被有IL-1β抗体的检测酶标条，各管先加入50μl稀释液，随后依次加入标准曲线测试样品、标准品和检测样品各50μl，混匀1分钟，贴封条，室温孵育2小时；

②倾去各管液体，冲洗5次，最后一次冲洗后，敲击酶标条，充分干燥；

③于各反应孔中，加入100μl新鲜稀释的酶标抗体，贴封条，室温孵育2小时；

④倾去各管液体，冲洗5次，最后一次冲洗后，充分干燥；

⑤于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，室温30分钟，蔽光；

⑥勿倾去各管液体，于各反应孔中加入2M硫酸100μl，中止反应；

⑦于TECAN酶标仪参考波长470nm读取各孔样品吸光值，根据标准曲线值计算样品浓度。

2：处死后指标

各组分别于给药后2周±1天、1个月±1天和2个月±1天处死10只，行以下检测：

1）：免疫组织化学

（1）免疫组织化学

各组小鼠腹腔过量麻醉处死，25倍解剖显微镜下取结膜组织，免疫组化检测各组ICAM-1和LCA的表达水平；

实验步骤：

各组小鼠腹腔过量麻醉处死，25倍解剖显微镜下取结膜组织，4％多聚甲醛溶液固定24小时，10％，20％和30％蔗糖梯度脱水，OCT冰冻包埋，冰冻切片机切成厚约5μm组织片，干燥2小时以上，免疫组化检测各组ICAM-1和LCA的表达水平，步骤如下：

⑴冰冻切片放置于湿盒中，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）平衡10分钟；

⑵0.1%Trixon-x-100破膜2分钟；

⑶倾去Trixon-x-100，PBS冲洗3次，每次5分钟；

⑷3％过氧化氢阻断5分钟，灭活内源性过氧化物酶；

⑸倾去过氧化氢，PBS冲洗3次，每次5分钟；

⑹1％山羊血清封闭10分钟，倾去勿洗；

⑺滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，（抗体稀释比例：ICAM-11:100；LCA1:150），设置动物正常血清作阴性对照；

⑻倾去一抗，PBS冲洗3次，每次5分钟；

⑼滴加二抗（稀释比例：1:500）,室温孵育1小时；

⑽倾去二抗，PBS冲洗3次，每次5分钟；

⑾滴加DAB显色液，显微镜下控制染色深浅；

⑿自来水冲洗10分钟中止反应；

⒀苏木素复染1分钟，自来水冲洗30分钟返蓝；

⒁玻片干燥，中性树胶封片，显微镜下观察。

2）明胶酶谱法：

取各组小鼠角膜，提取角膜蛋白，明胶酶谱法检测各组角膜组织中基质金属蛋白酶表达水平；

实验步骤：

①角膜蛋白提取：－80℃冰箱取出第一部分8周NOD小鼠角膜，加入1ml1×显影缓冲液，电动匀浆器裂解组织，冰上放置30分钟，放入4℃离心机12000转离心30分钟，取上清，移至另一无菌Eppendorf管，BCA测蛋白浓度，Ripa液平衡后，加入2×Loading buffer,置于－80℃冰箱。使用时冰上溶解蛋白，勿煮，待用。

②配置含0.1％明胶和0.1％SDS的10％聚丙烯酰胺凝胶，室温待凝；

③配置浓缩胶，上端插入10孔梳，室温待凝；

④浓缩胶凝固后，将凝胶置入电泳槽，加入1x电泳缓冲液，上样，接入电流，浓缩胶电压为80V跑过浓缩胶后，调电压为120V，直至溴酚蓝跑至凝胶底部；

⑤置于复性缓冲液中轻摇，室温孵育30分钟；

⑥置于显影缓冲液中，摇床缓慢摇动，室温孵育30分钟；

⑦重置于新的显影缓冲液中，摇床缓慢摇动，37℃孵育18小时；

⑧0.5％的考马斯亮蓝R250染色60分钟；

⑨加入脱色液适当脱色，至深蓝色背景上显出无色清晰酶谱条带停止。然后以双蒸水漂洗残留染料；

⑩扫描分析将胶以Image Scanner(Amersham)扫描成像，Quantity one软件分析各酶谱条带灰度值，比较各组MMP-2和MMP-9的活性水平。

表1是各组BUT比较，其中，*:FTY720和0.05%环孢霉素A（Cyclosporine A，CsA）与阳性对照组和生理盐水组比较，P<0.01；*#：0.005%FTY720与其他FTY720组及0.05%CsA组比较，P<0.01.

表1各组之间泪膜破裂时间比较（单位：秒）

表2是各组PERTT比较，其中*:FTY720和0.05%CsA与阳性对照组和生理盐水组比较。P<0.01；*#：0.005%FTY720与其他FTY720组及0.05%CsA组比较，P<0.01.

表2各组之间酚红棉线湿润长度比较（单位:毫米）

Claims (5)

1.FTY720在制备治疗干眼症药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的干眼症是以综合征为代表的干眼症。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的FTY720对以综合征为代表的干眼症具有免疫调控和抑制作用。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物是特定使用浓度范围的眼部滴剂。

5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物浓度范围为0.005%-0.05%的FTY720。