CN107106553A - 用于干眼的动物模型和此类动物的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于产生用于研究干眼的动物模型的方法以及使用此类动物模型测试用于眼部病状的候选治疗剂和确定此类治疗剂的功效的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月2日提交的美国临时申请No.62/086,263的优先权权益，其全部内容以引用方式并入本文。
发明背景
在干眼研究会(DEWS)2007年的报告中将干眼病(DED)或干燥性角膜结膜炎(KCS)描述为“泪液和眼部表面的多因子疾病，其引起以下症状：不适、视力障碍和潜在损害眼部表面的泪膜不稳定，伴有泪膜渗透压的增加和眼部表面炎症。”(Ocular Surf 5(2):75-92,2007)。据估计，总计491万的50岁及以上的美国人(约323万女性和168万男性)患有干眼。更有数千万人具有不太严重的症状且可能为更具发作性的疾病表现(出处同前)。
存在两个公认的干眼亚组，即与水样液缺乏/泪液产生减少相关联的干眼，以及与泪膜蒸发相关联的干眼(“蒸发过强型干眼”)。
在水样液缺乏组中，存在两个主要子类：舍格伦综合征(syndrome)(SS)干眼和非SS干眼。在舍格伦综合征中，通过全身性自身免疫过程靶向泪腺。泪腺被活化的T细胞浸润，这导致腺泡和导管细胞死亡以及泪液分泌不足。若干种自身免疫疾病与SS干眼综合征相关联，诸如类风湿性关节炎、硬皮症、多肌炎、淋巴瘤、淀粉样变性、血色素沉着症、结节病和系统性红斑狼疮(Djalilian AR等人Dry eye.在Krachmer JH,Mannis MJ,Holland EJ,编者Cornea.第2版Philadelphia.Elsevier Mosby；2005中)。非舍格伦综合征干眼呈由泪腺功能障碍引起的水样液缺乏的形式，其中已排除SS干眼的全身性自身免疫特征。非SS干眼的最常见形式为年龄相关性干眼(Ocular Surf 5(2):75-92,2007)。
蒸发过强型干眼由来自眼部表面的水分损失增加引起，尽管泪腺分泌功能正常。其导因已被分类为内因性的，诸如由影响眼睑结构或动力学的疾病引起；或外因性的，其中眼部表面疾病的发生归因于一些外因性暴露，诸如苛刻的环境条件。
激素状态改变(例如，绝经之后)可导致干眼的发展或加剧。还已知若干其它外部因素引起或促成干眼，诸如接触镜片佩戴、屈光性激光手术、吸烟，以及持续的视力工作诸如电脑使用、看电视和长时间的阅读。干眼的恶化还与存在于办公室环境、装有空气调节设备的汽车中的低湿度条件以及极热或极冷天气相关联。干眼还可由减少泪液产生的药物诸如抗组胺药、抗抑郁药、安定药和利尿剂引起(Ocular Surf 5(2):75-92,2007)。
患有干眼的患者表现出通过T细胞浸润以及CD3、CD4和CD8及淋巴细胞活化标志物CD11a和HLA-DR的上调所体现的结膜炎(Stern ME等人Invest Ophthalmol Vis Sci.43:2609–2614(2002))。因此，干眼发病可取决于T细胞活化和自身免疫炎症。促炎性细胞因子(诸如白介素(IL)-1)和基质金属蛋白酶(MMP)也涉及干眼的发病。在干眼患者的泪膜中已发现IL-1的促炎性形式(IL-1α和成熟IL-1β)的增加和无生物活性的前体IL-1β的减少(Solomon A等人Invest Ophthalmol Vis Sci.42:2283–2292(2001))。
发明内容
本公开涉及一种干眼病的动物模型。本文公开了在反映出人干眼病(DED)的病理生理的啮齿动物中诱导干眼病的方法。啮齿动物可以是小鼠或大鼠。还公开了患有诱导性干眼病的啮齿动物在例如测试用于治疗DED的候选药剂中的使用方法。
本文公开的方法通过向啮齿动物施用东莨菪碱和苯扎氯铵(BAC)来诱导DED。
可通过各种手段施用东莨菪碱，包括全身施用诸如注射、透皮贴剂以及向啮齿动物中植入泵。例如，可通过泵的植入以每天0.4-4.0mg/20g体重的浓度提供输注来施用东莨菪碱。可向啮齿动物的眼部表面局部施用苯扎氯铵。例如，可以0.05-0.4％的浓度施用BAC，每天一至四次。
在用东莨菪碱和BAC治疗的啮齿动物中，干眼病状的特征在于相对于对照水平(例如，未治疗的啮齿动物的眼)泪液产生的减少和眼部刺激的增加。在一个实例中，泪液产生的减少通过检测相对于对照水平的泪液产生减少来测量。在另一个实例中，眼部刺激的增加通过检测眼内的以下项中的一个或多个来测量：相对于对照水平，眼中炎性细胞的增加、炎性细胞因子的增加、或荧光素染色的增加。所谓“减少”和“增加”意指相对于对照水平的至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多的差异。
在向啮齿动物施用东莨菪碱和BAC时，干眼病状在施用数天内，例如在施用5、7、10、14、21或28天内是明显的。根据本文公开的方法，东莨菪碱和BAC的施用可持续一周或多周，诸如两周、三周或四周，以及最多两个月或更长时间(如果需要)。
本文还公开了测试候选药剂用于治疗干眼的功效的方法。所述方法包括提供啮齿动物、向啮齿动物施用东莨菪碱和苯扎氯铵以诱导啮齿动物的干眼、向患有干眼的啮齿动物施用候选药剂，以及确定候选药剂是否有效地治疗啮齿动物的干眼。
在一些实施方案中，在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用后的一个时间点施用候选药剂，由此使得可评估候选药剂改善DED的症状或病状的功效。例如，可在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用后3、4、5、6、7、14或28天施用候选药剂。候选药剂的功效可通过测量相对于对照水平(例如，接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受候选药剂的动物的眼)泪液产生的增加和/或眼部刺激的减少来测定。
在一些实施方案中，在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用的同时施用候选药剂。在这些实施方案中，可评估候选药剂预防DED，例如预防或延迟干眼的发作或限制其发展的能力。候选药剂的功效可通过测量相对于对照水平(例如，接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受候选药剂的动物的眼)，候选药剂限制或消除泪液产生减少和/或限制或消除眼部刺激增加的能力来测定。
候选药剂可局部或全身施用，这可取决于候选药剂的性质。局部施用的实例包括以滴剂、喷雾或凝胶形式向啮齿动物的眼或鼻施用候选药剂。全身施用的实例包括口服、注射或输注。
附图说明
图1A-1B：(A)表示在治疗起始之前(第-3天，基线)或治疗起始之后第7、14、21和28天的泪液产生的测量；在每一天，五个条形从左至右表示针对以下项的测量：初始假手术(sham)、BAC、Scop.以及BAC+Scop.治疗。相对于对照或单独BAC治疗，经施用东莨菪碱(Scop)和施用苯扎氯胺加东莨菪碱(BAC+Scop)四周，泪液产生显著减少。***＝p<0.001。(B)表示在治疗起始之前(第-3天，基线)或治疗起始之后第7、14、21和28天的角膜荧光素染色评分的测量；在每一天，五个条形从左至右表示针对以下项的测量：初始、假手术、BAC、Scop.以及BAC+Scop.治疗。相对于对照且相对于仅使用BAC或Scop的治疗，经施用BAC+Scop四周，角膜荧光素染色显著增加。****＝p<0.0001。
图2A-2D：(A)相对于对照且相对于仅使用BAC或Scop的治疗，在BAC+Scop治疗的眼中角膜血管新生增加，如通过增加的CD31+细胞染色所测量的。(B)相对于对照且相对于仅使用BAC或Scop的治疗，在BAC+Scop治疗的眼中，通过四周的治疗，角膜血管骨架化(新的血管)长度明显增加。(C)相对于对照且相对于仅使用BAC或Scop的治疗，在BAC+Scop治疗的眼中淋巴管生成增加，如通过增加的LYVE1细胞染色所测量的。(D)相对于对照且相对于仅使用BAC或Scop的治疗，在BAC+Scop治疗的眼中，通过四周的治疗，角膜淋巴管骨架化长度明显增加。
图3眶外泪腺的流式细胞术。相对于对照，在用Scop、BAC和Scop+BAC治疗的细胞中，CD45+细胞的百分比增加。
具体实施方式
本文公开了在反映出人干眼病(DED)的病理生理的动物中诱导干眼病的方法。还公开了患有诱导性干眼病的啮齿动物在测试用于治疗DED的候选药剂中的使用方法。
干眼病(DED)，也称为干眼综合征(DES)或干燥性角膜结膜炎(KCS)，是一种生理学特征为以下项中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、或所有的病状：泪液产生减少、泪膜蒸发增加、眼部炎症、泪液渗透压(盐含量)增加以及对眼部表面的损伤。DED的症状包括眼部不适、视力障碍和泪膜不稳定性。
本文公开了在啮齿动物中诱导干眼病的方法。所述方法包括以一定的量向啮齿动物施用抗胆碱能剂东莨菪碱和眼部刺激物苯扎氯铵(BAC)，并且持续足以在动物中诱导干眼病的时间。所得的眼部病症表现出人DED的多种特征。
在研发本文所公开方法的过程中，发明人能够在啮齿动物中诱导高度类似于临床人疾病的干眼病。例如，用所公开的方法诱导干眼病状易于进行并且可持续数周。此外，通过所公开的方法产生的动物模型表现出人干眼病中常见的眼部炎症和泪液缺乏。因此，这种模型能够实现干眼中的病理生理变化的研究和用于治疗DED的治疗性药物候选物的测试。
在动物中产生干眼病
在所述方法的第一步骤中，向啮齿动物诸如小鼠或大鼠施用作为抗胆碱能剂的东莨菪碱并施用作为眼部刺激物的苯扎氯胺(BAC)。
抗胆碱能剂是一种阻断中枢和/或外周神经系统中的神经递质乙酰胆碱的物质。抗胆碱能剂的实例包括例如东莨菪碱、盐酸东莨菪碱、甲溴东莨菪碱、阿托品、甲硝阿托品以及硫酸阿托品。在本文公开的方法中，抗胆碱能剂为东莨菪碱或盐酸东莨菪碱。
在所公开的方法中，东莨菪碱全身性地施用。用于全身施用的方法包括注射、透皮贴剂和泵的植入，诸如允许实验室动物的连续给药的渗透泵。用于动物模型的全身施用的此类方法在本领域中是已知的。在具体实施方案中，东莨菪碱通过渗透微型泵施用。合适的渗透微型泵包括例如ALZET渗透泵(Durect Corporation,Cupertino,California)。
为了植入泵，将啮齿动物麻醉并且在皮下装配泵。泵提供受控量的东莨菪碱。东莨菪碱的示例性浓度包括0.1-4.0mg/20g体重/天、0.5-3.5mg/20g体重/天、1.0-3.0mg/20g体重/天、或约2.0mg/20g体重/天。东莨菪碱施用数天或数周，例如1、2、3、4周或更多周。
眼部刺激物为一种在眼中产生刺激的物质。眼部刺激物的示例包括表面活性剂、防腐剂、过敏原、细小颗粒、以及干燥剂或环境条件。在本文公开的方法中，眼部刺激物为苯扎氯铵(BAC)。
在所公开的方法中，BAC局部施用至眼部表面。BAC可以0.5-2.0μl/剂，例如1μl/剂的剂量，以0.05-1.0％且在具体实施方案中以0.1-0.2％的浓度施用。施用可以为一至四次/天，例如，每天两次，每周施用一至三天。在一些实施方案中，施用每天进行两次，每周施用两天。BAC的施用可以进行一周或多周，例如1、2、3、4周或更多周。
评价模型动物的干眼病状
在模型动物中，通过检测相对于对照水平泪液产生的减少和眼部刺激的增加来确认干眼病。干眼还可通过检测相对于对照水平血管新生和/或淋巴管生成的增加来确认。
在本公开通篇中，对照水平表示未治疗的啮齿动物眼中的水平。在评估是针对被全身施加的药剂的功效的情况中，未治疗的眼为未治疗的啮齿动物的眼。未治疗的动物可以为初始(基本上没接受治疗)动物或假手术的动物(接受不向动物递送药剂，或向动物递送安慰剂诸如盐水的植入泵，或接受未实际植入泵的手术)。在药剂被局部施加至眼而非全身施加的情况中，对照还可以是一只眼接受治疗的动物的未治疗的眼。在评价通过施用东莨菪碱和BAC对干眼病状的诱导的语境中，对照水平为未治疗动物的眼中的水平。
泪液产生的减少被鉴定为相对于对照水平至少10％、20％、30％、40％或50％的泪液产生减少。用于测量泪液产生的方法包括酚红棉线(PRT)测试和席尔梅尔氏(Schirmer’s)测试。在PRT测试中，在不麻醉的情况下对动物加以约束，并且将加载酚紅的棉线(诸如ZONE-QUICK,FCI Ophthalmics,Pembroke,MA)放置在内眦或外眦(眼睛的内角或外角)，或使所述棉线接触结膜囊或泪囊，持续20秒以测量泪液产生。测量变红(由因碱性泪液的润湿造成的pH变化引起)的棉线的量(毫米)。然后，可在另一只眼上重复所述程序以针对每只小鼠获得2个测量值。席尔梅尔氏测试使用纸条测量泪液产生。所述测试包括将小滤纸条放置在下眼睑的内部(结膜囊)。将该条在适当位置维持数分钟。然后将纸移除并且测量水分的量(mm)。
眼部刺激的增加通过检测眼内的以下项中的一个或多个来鉴定：相对于对照水平，眼中炎性细胞的增加、炎性细胞因子的增加、或荧光素染色的增加。
炎性细胞的增加为相对于对照水平一种或多种类型的炎性/免疫细胞的至少10％、20％、30％、40％或50％的增加。炎性/免疫细胞类型包括骨髓细胞(包括嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和淋巴细胞(包括T细胞和B细胞)。炎性细胞可通过本领域中已知的各种方法检测和测量。最通常地，通过鉴定细胞表面标记物确定细胞的存在/丰度来测量炎性细胞。例如，骨髓细胞和淋巴细胞为CD45+，因此，这种标记物可用于鉴定炎性细胞相对于非炎性细胞的存在。淋巴细胞特异性标记物包括CD3(鉴定T细胞)、CD4(鉴定辅助T细胞)、CD8(鉴定细胞毒性T细胞)以及B220或CD19(鉴定B细胞)。另外的细胞表面标记物是本领域中已知的，检测这些标记物的抗体和其它药剂也是本领域中已知的。检测这些标记物的抗体可例如通过角膜组织的组织学检查和组织切片的抗体染色用于鉴定炎性细胞。检测这些标记物的抗体还可通过以下方式使用：将抗体施加至细胞群体以针对特异性标记物的表达进行染色并且通过流式细胞术治疗细胞以定量表达标记物的细胞。
炎性细胞因子的增加为相对于对照水平一种或多种类型的炎性细胞因子的至少10％、20％、30％、40％或50％的增加。炎性细胞因子包括：白介素(IL)，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13；肿瘤坏死因子(TNF)，诸如TNF-α、TNF-β、TGF-β(转化生长因子-β)；CXCL9以及干扰素(IFN)，诸如IFN-γ。用于测量炎性细胞因子的方法包括使用检测细胞因子的抗体或其它药剂以鉴定或定量样品中的细胞因子的免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)。
荧光素染色的增加为使用国家眼科研究所(NEI)评分的大于5、8、10或12的评分。对于荧光素染色，将荧光素钠施加至动物的眼部表面，通常没有镇静作用。在施加数分钟后，使用蓝光在显微镜下对角膜荧光素染色进行评分。相对于健康的角膜组织，眼的不规则部分诸如磨蚀和炎症发出更大强度的荧光。使用国家眼科研究所(NEI)评分标准对荧光进行评分。在NEI评分中，在0-3的等级上单独地对角膜的五个部分(中央、上方、下方、鼻侧及颞侧)的荧光进行评分，其中0指示没有染色并且3指示广泛染色，其中每只眼最大评分为15。如果使用不同的评分标准或荧光技术，那么荧光素染色的增加将鉴定为相对于对照水平荧光的至少10％、20％、30％、40％或50％的增加。
角膜血管新生和/或淋巴管生成的测量可进一步确认干眼。为了研究血管新生和淋巴管生成，将动物麻醉并且切开角膜并与鉴定新淋巴管形成的药剂(诸如针对淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE1)的抗体)或鉴定新血管形成的药剂(诸如针对内皮前体细胞标记物CD31的抗体)一起孵育。新血管或淋巴管生长的区域的鉴定可用作眼部病状恶化和干眼发展的另外指标。
测试用于干眼病的候选药剂
所公开的啮齿动物(大鼠和小鼠)可用于研究DED和测试用于治疗干眼的候选药剂。
因此，本文公开了测试候选药剂用于治疗干眼的功效的方法，所述方法包括向患有通过所公开的方法诱导的DED的动物施用候选药剂，以及测试候选物治疗DED的能力。
所谓“治疗”意指改善DED的症状或病状，或预防DED(例如预防或延迟DED的发作，或限制DED的发展)。
术语“测试药剂”和“候选药剂”在本文中可互换地用于指预期用于治疗干眼的任何药剂。药剂可以是重组、修饰或天然的核酸分子；合成、修饰或天然的肽；合成、修饰或天然的多肽，包括抗体；或有机或无机化合物，包括小分子。术语“小分子”是指具有小于3000道尔顿，优选小于2000或1500，更优选小于1000或800道尔顿的分子质量的化合物。
待评估的测试药剂可局部或全身性地施用至动物。例如，药剂可以滴眼剂或鼻内喷雾的形式施用。另选地，药剂可口服或肠胃外施用，并且如果肠胃外施用，可以呈溶液、混悬液、膏剂、注射剂、栓剂等的形式。候选药剂的合适剂量可基于动物体重和施用途径决定。施用条件诸如其时间安排及次数也根据待使用的药剂决定。
在DED诱导开始时施用候选药剂
在一个实施方案中，DED诱导开始的同时施用候选药剂。在一些实施方案中，将待测试的啮齿动物组随机分成以下组：初始(未治疗的)、假手术(全身施用盐水、植入泵但未东莨菪碱治疗，或类似于泵植入的手术但实际没有植入泵)、苯扎氯胺加东莨菪碱(BAC加Scop)、仅测试药剂、或测试药剂加BAC加Scop.。干眼诱导开始的同时向测试药剂组中的动物施用候选药剂，即所述候选药剂的施用与开始DED诱导同一天开始或在同一周内开始。所有治疗进行至少一周、两周、三周或四周。在第7、14、21和28天测量泪液产生和角膜荧光素染色。在第28天，将动物麻醉并且收获眶外泪腺和角膜用于进一步研究。
通过检测候选药剂在与对照水平类似的水平下维持泪液产生和/或预防或限制眼部刺激的能力来确定候选药剂预防、延迟DED的发作或限制DED的发展的能力。在此语境中，对照水平为未治疗的眼(即，没用候选药剂治疗的眼)的水平，所述未治疗的眼可包括接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受候选药剂的动物的眼，或接受东莨菪碱和苯扎氯铵以及候选药剂的动物的眼中的一只，其中候选药剂局部施加至同一动物的另一只眼。
在一个实施方案中，接受测试药剂加BAC加Scop的动物未发展DED，即，在整个研究中泪液产生维持在对照水平的5％、10％或15％或以内，并且/或者在整个研究中眼部炎症的水平维持在对照水平的5％、10％或15％或以内，所述眼部炎症的水平如通过眼中炎性细胞的水平、炎性细胞因子的水平和/或荧光素染色评分所测量的。
在另一个实施方案中，相对于接受BAC加Scop但未接受候选药剂的动物，接受测试药剂加BAC加Scop的动物显示出DED症状发作的延迟，即，使泪液产生减少和/或眼部刺激的发展延迟一周、两周或三周。
在另一个实施方案中，接受测试药剂加BAC加Scop的动物发展较温和的DED症状，即在这些动物中出现泪液产生减少和/或眼部刺激，但是泪液产生减少和/或眼部刺激出现的水平介于未接受DED诱导治疗的动物(例如初始动物)中的水平与在接受BAC加Scop但未接受候选药剂的动物中观察到的水平之间。
在DED诱导开始之后施用候选药剂
在另一个实施方案中，在DED诱导开始后施用候选药剂。在一些实施方案中，在干眼诱导开始后一至两周，即在干眼诱导开始后7-14天之间开始向测试药剂组中的动物施用候选药剂。将测试药剂施用一至三周。在从干眼诱导开始的第7、14、21和28天测量泪液产生和角膜荧光素染色。在第28天，将动物麻醉并且收获眶外泪腺和角膜用于进一步研究。
通过检测相对于对照水平接受候选药剂和BAC加Scop的动物的泪液产生增加和/或眼部刺激减少来确定候选药剂治疗DED的能力，所述对照水平在此语境中可以是接受BAC加Scop但未接受候选药剂的动物的眼中的水平。
实施例
实施例1在动物中产生干眼病状。
动物：所有与动物相关的程序都由Regeneron IACUC审查和批准，并且按照动物在眼科和视觉研究中的使用(the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)的ARVO声明进行。成年C57BL/6小鼠(8-10周龄)购自Taconic Biosciences(Germantown,NY)。
干眼模型诱导：将27只成年雄性C57BL/6小鼠随机分成初始(未治疗的)、假手术(接受与植入泵的手术等同的手术，但实际没有植入泵且未进行东莨菪碱或BAC治疗)、苯扎氯胺(BAC)、东莨菪碱(Scop)、或BAC加Scop组。
东莨菪碱泵的植入：对于Scop组，对小鼠皮下植入填充有Scop的渗透泵(2mg/20g体重/天)，持续4周。用开他敏(120mg/kg，IP)和安耐宁(5mg/kg，IP)麻醉小鼠。使用无菌显微外科技术和手术显微镜，将微型渗透泵放置在背部皮肤下，然后将皮肤缝合，并且将红霉素眼膏施加至伤口以防止感染。
苯扎氯铵治疗：对于BAC治疗，将1μl的0.1-0.2％BAC局部施用在右眼眼部表面上，每天两次，每周2天，持续四周。
泪液产生测量和角膜荧光素染色评分：在第7、14、21和28天每周一次进行泪液产生和角膜荧光素染色。对于泪液产生测量，在对动物加以约束的情况下，将酚紅棉线放在眼颞侧囊(未接触角膜)上，并且在适当位置保持1分钟。将棉线的润湿部分按mm标定为泪液产生。对于荧光素染色，将0.5μl的2％荧光素钠放在眼部表面上。施加五分钟后，使用国家眼科研究所(NEI)评分标准在显微镜下对角膜荧光素染色进行评分。对于评分，将角膜分为五个部分(中央、上方、下方、鼻侧及颞侧)，在0-3的等级上对其中每个部分的荧光进行评分，其中0指示没有染色并且3指示广泛染色，其中每只眼最大评分为15。
角膜血管新生、淋巴管生成和泪腺浸润的定量：在干眼诱导后第28天，在深度开他敏(120mg/kg，IP)和安耐宁(5mg/kg，IP)麻醉下，将眼球收集在4％多聚甲醛(PFA)中以用于角膜血管新生和淋巴管生成研究。收获眶外泪腺用于流式细胞术以检查免疫细胞浸润。
组织学分析：将角膜从眼球中切出来，在PBS中洗涤，在室温下使用10％正常驴血清和1％Triton X-100的PBS溶液封闭1小时以封闭抗体非特异性位点。然后，将样品在PBS中洗涤，与针对淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE1)的抗体(1:1000)(RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)和针对CD31的抗体(1:100)(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)的混合物在4℃下孵育过夜。然后将样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤并且与二抗缀合的染料AlexaFluor 488驴抗大鼠IgG(H+L)1:100(LifeTechnologies,A21208,Graceland,NY)和AlexaFluor 594驴抗大鼠IgG(H+L)1:400(LifeTechnologies,A21207)在室温下一起孵育2小时。在孵育后，将样品在PBS中洗涤并且平坦地固定在载玻片上。使用附接至荧光显微镜(Nikon Eclipse80i)的数字RT SE Spot相机捕捉染色的血管和淋巴管的图像。使用图像软件进行图像分析。
流式细胞术：在切开后，将眶外泪腺放置在具有3％胎牛血清溶液(FBS)(LifeTechnologies)的PBS(Life Technologies)中。用MACS温和解离器(Miltenyi Biotech,SanDiego,CA)程序脾-04解离腺体。将细胞悬浮液过滤通过70um网式过滤器(MiltenyiBiotech,San Diego,CA)以除去组织碎片。用FACS缓冲液(具有3％FBS和2mM EDTA的PBS)(Life Technologies)洗涤细胞一次。将洗涤的细胞重悬于具有FcR封闭Ab(1:50稀释度)(Biolegend,San Diego,CA)的FACS缓冲液中，并且在4℃下孵育15分钟。将细胞离心沉淀以除去FcR封闭Ab并且用LIVE/DEAD可固定的蓝色死细胞染色试剂盒(1:500稀释度)(LifeTechnologies)以及CD45PerCP-Cy5.5、克隆30-F11、大鼠IgG2b(1:100稀释度)(BDBioscience)进一步染色。将细胞在4℃下染色25min，之后用FACS缓冲液洗涤两次。然后将细胞重悬于稳定固定剂(BD)中并且在LSR II(BD Bioscience)上遵循由公司提供的标准方案进行采集。通过FlowJo(Tree Star,Ashland,OR)分析数据。
统计分析：使用双因素方差分析和杜凯氏多重比较检验(仅针对角膜血管长度、淋巴管长度研究进行)，利用GraphPad Prism(6.0a版，GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)进行参数数据的统计分析。数据显示为平均值±平均值标准误差(SEM)。小于0.05的p值被视为统计学显著性。*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001；****＝p<0.0001。
结果：如图1A所示，全身递送Scop.加上局部施用BAC后，泪液产生显著减少。此外，角膜染色评分显著增加(图1B)。在Scop+Bac施用一周后，变化是明显的。
此外，如图2A和2B中所描绘，用BAC+Scop治疗4周后，角膜血管骨架化长度显著增加。类似地，如图2C和2D中所展示，BAC+Scop治疗4周后角膜淋巴管骨架化长度增加。
此外，治疗4周后眶外泪腺含有免疫细胞浸润，如图3中所指示的。
实施例2.测试候选药剂预防或抑制干眼发作的能力
对于对候选药剂预防或抑制干眼发展的功效的研究，将小鼠组随机分成以下组：初始(未治疗的)、假手术(接受与泵的植入等同的手术，但实际没有植入泵且未进行东莨菪碱或BAC治疗)、苯扎氯胺加东莨菪碱(BAC加Scop)、仅测试药剂、或测试药剂加BAC加Scop。
如上所述诱导干眼。对于BAC加Scop治疗，将小鼠皮下植入递送东莨菪碱(2mg/20g体重/天)的渗透泵，并且将1μl的0.1-0.2％BAC局部施用在右眼眼部表面上，一天两次，每周2天。
在干眼诱导开始的同一天开始向测试药剂组中的动物施用候选药剂。将候选药剂以滴眼剂、鼻内喷雾的形式施用至动物，或以注射液的形式肠胃外施用至动物。候选药剂的合适剂量和施用频率基于动物体重和施用途径决定。施用的时间安排和频率取决于待使用的药剂。所有治疗进行至少一周、两周、三周或四周。在第7、14、21和28天测量泪液产生和角膜荧光素染色。在第28天，将动物麻醉并且收获眶外泪腺和角膜用于流式细胞术和组织学。还定量了角膜血管新生和淋巴管生成。
候选药剂的功效通过检测相对于对照水平(例如，接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受候选药剂的动物的眼中的水平)，候选药剂维持泪液产生和/或预防或限制眼部刺激的能力来确定。
实施例3.测试候选药剂治疗干眼病状的能力
对于对候选药剂治疗干眼的功效的研究，将小鼠组随机分成以下组：初始(未治疗的)、假手术(接受与泵的植入等同的手术，但实际没有植入泵且未进行东莨菪碱或BAC治疗)、苯扎氯胺加东莨菪碱(BAC加Scop)、仅测试药剂、或测试药剂加BAC加Scop。
如上所述诱导干眼。对于BAC加Scop治疗，将小鼠皮下植入递送东莨菪碱(2mg/20g体重/天)的渗透泵，并且将1μl的0.1-0.2％BAC局部施用在右眼眼部表面上，一天两次，每周2天。干眼诱导方法持续至少一周、两周、三周或四周。
在干眼诱导开始后一至两周，例如在干眼诱导开始后7-14天之间开始向测试药剂组中的动物施用候选药剂。将候选药剂以滴眼剂、鼻内喷雾的形式施用至动物，或以注射液的形式肠胃外施用至动物。候选药剂的合适剂量和施用频率基于动物体重和施用途径决定。施用的时间安排和频率取决于待使用的药剂。将测试药剂施用一至三周。在从干眼诱导开始的第7、14、21和28天测量泪液产生和角膜荧光素染色。在第28天，将动物麻醉并且收获眶外泪腺和角膜用于流式细胞术和组织学。还定量了角膜血管新生和淋巴管生成。
通过检测相对于对照水平(例如，接受BAC加Scop但未接受候选药剂的动物眼中的水平)，接受候选药剂和BAC加Scop的动物的泪液产生增加和/或眼部刺激减少来确定功效。
Claims (21)
1.一种在啮齿动物中诱导干眼病的方法，所述方法包括向所述啮齿动物施用东莨菪碱和苯扎氯铵。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其中东莨菪碱通过输注泵的植入来施用。
4.如权利要求3所述的方法，其中东莨菪碱以0.4-4.0mg/20g体重/天的浓度施用。
5.如权利要求1所述的方法，其中苯扎氯铵局部施用至所述啮齿动物的眼部表面。
6.如权利要求5所述的方法，其中苯扎氯铵以0.05-0.4％的浓度、每天一至四次地施用。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将东莨菪碱和苯扎氯铵向所述啮齿动物施用最多两个月的时间段。
8.如权利要求6所述的方法，其中将东莨菪碱和苯扎氯铵向所述啮齿动物施用两至四周。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述干眼病状的特征在于相对于对照水平经过治疗的眼中泪液产生减少且眼部刺激增加。
10.如权利要求9所述的方法，其中泪液产生减少通过检测相对于对照水平至少10％的泪液产生减少来检测。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述眼部刺激增加通过检测所述眼内的以下项中的一个或多个来测量：相对于对照水平，所述眼中炎性细胞的增加、炎性细胞因子的增加、或荧光素染色的增加。
12.一种测试候选药剂用于治疗干眼的功效的方法，所述方法包括提供啮齿动物、向所述啮齿动物施用东莨菪碱和苯扎氯铵以在所述啮齿动物中诱导干眼、向所述啮齿动物施用所述候选药剂，以及确定所述候选药剂是否有效地治疗所述啮齿动物的干眼。
13.如权利要求13所述的方法，其中所述候选药剂在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用后至少7天施用。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述候选药剂在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用后至少14天施用。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述候选药剂在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用后至少28天施用。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述候选药剂局部或全身施用。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述局部施用为以滴剂、喷雾或凝胶的形式向所述啮齿动物的眼或鼻施用所述候选药剂。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述全身施用选自口服、注射或输注。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述候选药剂的功效通过检测相对于接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受所述候选药剂的动物泪液产生的增加和/或眼部刺激的减少来确定。
20.如权利要求12所述的方法，其中在东莨菪碱和苯扎氯铵开始施用的同时施用所述候选药剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述候选药剂的功效基于相对于接受东莨菪碱和苯扎氯铵但未接受所述候选药剂的动物所述候选药剂限制或消除泪液产生减少和/或限制或消除眼部刺激增加的能力来确定。
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