CN106324119A - 同时测定独一味药材中8种成分的uplc方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法，所述8种成分为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8‑O‑乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷。本发明方法可以将上述8种成分有效检测并分离，准确可靠、简便快速地测定其含量，为全面监控独一味药材质量提供了有效的保障。

Description

同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法
技术领域
本发明涉及药物质量控制方法技术领域，具体涉及同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法。
背景技术
独一味(Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo)系藏族习用药材，为唇形科植物，主要分布于我国西藏、云南、四川、青海、甘肃等地。药用部位为独一味的干燥地上部分，生长于海拔2700-4500米的高原或高山上强度风化的碎石滩中或石质高山草甸、河滩地(四川植物志、云南植物志)，主要成分有黄酮类、环烯醚萜类和苯乙醇苷类。
目前，测定独一味药材中各种成分方法通常都是HPLC法。然而，HPLC法检测的时间较长，效率不高。同时，从数量上看，其最多同时检测独一味药材中的7种成分，而考虑到中药材的活性成分繁多，要更加可靠、更加全面地监控独一味药材的质量，也有必要对检测成分的种类进行扩展。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法，其特征在于：所述8种成分为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷，包括以下步骤：
(1)8种成分标准曲线的建立：
a、对照品溶液的制备：
取胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；
b、对照品溶液的测定：
配制系列浓度的混合对照品溶液，分别注入UPLC色谱仪，梯度洗脱，测定各色谱峰峰面积，得到胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷的标准曲线；
色谱条件如下：
检测波长：238nm、320nm和350nm；
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以水或0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
梯度洗脱：0～10min，6％～14.5％B；10～18.5min，14.5％～17％B；18.5～23min，17％～18％B；
(2)待测样品中8种成分的含量测定：
c、供试品溶液的制备：
取待测独一味药材粉末，加甲醇提取，过滤得供试品溶液；
d、供试品溶液的测定：
取供试品溶液，注入UPLC色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷的含量。
进一步地，步骤c中，所述独一味药材粉末的粒径为过4号筛。
进一步地，步骤c中，所述甲醇为70％甲醇。
进一步地，所述甲醇与独一味药材的体积质量比为60mL：1g。
进一步地，步骤c中，所述提取为回流提取。
进一步地，回流提取的温度为80℃。
进一步地，所述回流提取的时间为60min。
进一步地，所述过滤为0.22μm微孔滤膜过滤。
进一步地，所述色谱柱为Kinetex 2.6μm XB-C18色谱柱。
进一步地，所述色谱条件的柱温为30℃。
进一步地，所述色谱条件的流速为1.0mL/min。
本发明成功建立了同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法，该方法准确可靠、简便快速。本发明的方法，为全面监控独一味药材质量提供了有效的保障。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1和图2分别为对照品(A)及独一味地上部分(B)色谱图；各色谱峰的归属如下1.胡麻属苷；2.山栀苷甲酯；3.绿原酸；4.咖啡酸；5.8-O-乙酰山栀苷甲酯；6.连翘酯苷B；7.木犀草苷；8.麦角甾苷。
图3为提取方法筛选的结果。
图4为提取时间筛选的结果。
图5为提取溶剂筛选的结果。
图6为回流温度筛选的结果。
图7为料液比筛选的结果。
图8为对比梯度洗脱程序一的色谱图。
图9为对比梯度洗脱程序二的色谱图。
图10为对比梯度洗脱程序三的色谱图。
具体实施方式
实施例1本发明的方法及方法学考察
1材料
Prominence UFLC XR超快速液相色谱仪(日本岛津)、BSA124S电子天平(德国赛多利斯)、UPH-I-10T型超纯水器。胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品均来自成都普思生物科技股份有限公司，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。独一味32批样品采自不同产地，如表1所示，经成都医学院钟世红副教授鉴定为独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo干燥地上部分。
表1独一味药材样品的来源
2方法与结果
2.1色谱条件
Kinetex 2.6μm XB-C18色谱柱，流动相乙腈(B)-0.1％磷酸水溶液(A)，梯度洗脱(0～10min，6％～14.5％B；10～18.5min，14.5％～17％B；18.5～23min，17％～18％B)；流速1.0mL·1.0mL·min-1；柱温30℃；进样量2μL。胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238nm，绿原酸、咖啡酸连翘酯苷B、麦角甾苷检测波长为320nm，木犀草苷检测波长为350nm。上述色谱条件下，样品各色谱峰保留时间适中，样品中各组分的色谱峰分离度良好，对照品及样品图见图1和图2。
2.2对照品溶液制备
精密称定胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷各对照品适量，加入甲醇配成含量为0.275、0.278、0.494、0.036、0.328、0.448、0.422、0.334mg·mL的混合对照品A溶液。精密吸取混合对照品A1.0mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为混合对照品B溶液。
2.3供试品溶液制备
取独一味药材粉末(中粉)约0.5g，精密称定，加入70％甲醇30mL，称定质量，回流提取60min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。
2.4线性关系考察
分别吸取2.3项下混合对照品B溶液1μL、2μL、4μL，混合对照品A溶液4μL、8μL进样2μL。结果表明上述8个成分分别在一定质量浓度与峰面积呈良好线性关系。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到各对照品的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。
表2 8种成分的标准曲线
成分 回归方程 R2 线性范围/μg
胡麻属苷 y＝713115.6111x-8510.5 0.9998 0.0275～2.200
山栀苷甲酯 y＝900098.7648x-3933.7 0.9998 0.0278～2.224
绿原酸 y＝2000000x+15174 0.9999 0.0494～3.952
咖啡酸 y＝4000000x+9295.4 0.9998 0.0036～0.288
8-O-乙酰山栀苷甲酯 y＝712731.5947x+1020.7 0.9999 0.0328～2.624
连翘酯苷B y＝735449.0223－320.55 0.9999 0.0448～3.584
木犀草苷 y＝1000000x+13773 0.9999 0.0422～3.376
麦角甾苷 y＝871201.9679－2990.1 0.9999 0.0334～2.672
2.5精密度试验
取同一供试品(S2)2μL，重复进样5次，计算得胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.28％，0.50％，1.21％，0.50％，0.53％，0.21％，1.42％，0.16％。表明仪器精密度良好。
2.6重复性试验
取同一份样品(S2)粉末6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定。结果胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.49％，0.33％，1.59％，0.73％，0.64％，0.58％，0.98％，0.75％。表明方法的重复性良好。
2.7稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(S2)，分别于0，1，2，4，6，12，24h时进样测定，记录峰面积。结果胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷峰面积RSD分别是0.69％，0.66％，1.41％，1.16％，0.81％，0.55％，1.05％，0.46％。表明独一味药材供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.8加样回收率试验
取同一供试品6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入70％甲醇溶液配制的各对照品溶液适量，按2.3项下方法制备供试溶液并依法测定，计算加样回收率，结果见表3。
表3独一味药材中8种成分加样回收率实验结果
2.9样品的测定
取独一味药材样品，按2.3项下方法分别制备供试品溶液，平行两份，吸取供试品溶液2μL，按2.1项下色谱条件测定。计算样品含量，结果见表4。
表4独一味药材中8种成分的含量(n＝2)(mg·g-1)
实施例2本发明方法的工艺筛选
(1)检测波长筛选
对S2提取物进行全波长扫描，结果显示胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯在238nm处有最大吸收，咖啡酸323nm有最大吸收，绿原酸326nm有最大吸收，木犀草苷345nm有最大吸收，连翘酯苷B、麦角甾苷在330nm处有最大吸收，综合8种成分的吸收光谱，最终确定胡麻属苷、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯选用238nm为检测波长，咖啡酸、绿原酸、连翘酯苷B、麦角甾苷选用320nm作为检测波长，木犀草苷选用350nm为检测波长。
(2)提取方法筛选
1.提取方法考察
取独一味药材粉末两份(中粉)约0.5g，精密称定，加入70％甲醇30mL，称定质量，70℃，分别进行回流和超声提取60min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，按实施例1中2.1项下色谱条件测定，比较8个成分的平均峰面积，结果如图3所示。
结果显示，回流提取效果较佳。
2.提取溶剂浓度考察
取独一味药材粉末(中粉)约0.5g，精密称定，各50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇30mL，称定质量，70℃，回流提取60min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，按实施例1中2.1项下色谱条件测定。比较8和成分的平均峰面积，结果如图4所示。
结果显示，70％甲醇提取效果较佳。
3.提取时间考察
取独一味药材粉末(中粉)约0.5g，精密称定，加入70％甲醇30mL，称定质量，70℃，分别回流提取30min、60min、90min、120min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，按实施例1中2.1项下色谱条件测定。比较8个成分的平均峰面积，结果如图5所示。
结果显示，回流提取60min效果较佳。
4.提取温度考察
取独一味药材粉末(中粉)约0.5g，精密称定，加入70％甲醇30mL，称定质量，分别在70℃、75℃、80℃、85℃，回流提取60min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，按实施例1中2.1项下色谱条件测定。比较8个成分的平均峰面积，结果如图6所示。
结果显示，提取温度为80℃时效果较佳。
5.料液比考察
取独一味药材粉末(中粉)约0.5g，精密称定，分别加入70％甲醇30mL、40mL、50mL，称定质量，80℃回流提取60min，冷却后用溶剂补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液，按实施例1中2.1项下色谱条件测定。比较8个成分的平均峰面积，结果如图7所示。
结果显示，料液比为1g：60mL时效果较佳。
根据以上考察结果，最终确定以70％甲醇30mL为溶剂，提取温度80℃，回流提取60min此方法作为供试品制备的方法。
(3)梯度洗脱程序筛选
发明人对多个梯度程序进行了筛选，实验结果证明，只有在本发明洗脱工艺下才能有效分离检测出本发明要分离检测的8个成分，而采用其他的梯度洗脱工艺，比如下面的三种梯度洗脱工艺则无法有效检测：
对比梯度洗脱程序一：0～8min，7％～12％B；8～19.5min，12％～17％B；19.5～23min，17％～18％B；结果如图8所示。
对比梯度洗脱程序二：0～10min，6％～15％B；10～18.5min，15％～17％B；18.5～23min，17％～18％B；结果如图9所示。
对比梯度洗脱程序三：0～6min，6％～8％B；6～18min，8％～18％B；18～23min，18％～18％B；结果如图10所示。
综上所述，本发明的方法，通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法，该方法准确可靠、简便快速。本发明的检测方法，为全面监控独一味药材质量提供了有效的保障。

Claims (10)

1.同时测定独一味药材中8种成分的UPLC方法，其特征在于：所述8种成分为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷，包括以下步骤：
(1)8种成分标准曲线的建立：
a、对照品溶液的制备：
取胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；
b、对照品溶液的测定：
配制系列浓度的混合对照品溶液，分别注入UPLC色谱仪，梯度洗脱，测定各色谱峰峰面积，得到胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷的标准曲线；
色谱条件如下：
检测波长：238nm、320nm和350nm；
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：以水或0.1％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
梯度洗脱：0～10min，6％～14.5％B；10～18.5min，14.5％～17％B；18.5～23min，17％～18％B；
(2)待测样品中8种成分的含量测定：
c、供试品溶液的制备：
取待测独一味药材粉末，加甲醇提取，过滤得供试品溶液；
d、供试品溶液的测定：
取供试品溶液，注入UPLC色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、咖啡酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷和麦角甾苷的含量。
2.根据权利要求1所述的UPLC方法，其特征在于：步骤c中，所述独一味药材粉末的粒径为过4号筛。
3.根据权利要求1所述的UPLC方法，其特征在于：步骤c中，所述甲醇为70％甲醇。
4.根据权利要求1或3所述的UPLC方法，其特征在于：所述甲醇与独一味药材的体积质量比为60mL：1g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的UPLC方法，其特征在于：步骤c中，所述提取为回流提取；优选的，回流提取的温度为80℃。
6.根据权利要求5所述的UPLC方法，其特征在于：所述回流提取的时间为60min。
7.根据权利要求5所述的UPLC方法，其特征在于：所述过滤为0.22μm微孔滤膜过滤。
8.根据权利要求1-7任一项所述的UPLC方法，其特征在于：所述色谱柱为Kinetex2.6μmXB-C18色谱柱。
9.根据权利要求1-5任一项所述的UPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为30℃。
10.根据权利要求1-5任一项所述的UPLC方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为1.0mL/min。
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