CN106319001A

CN106319001A - 一种重组干扰素γ的产业化制备方法与应用

Info

Publication number: CN106319001A
Application number: CN201611063211.5A
Authority: CN
Inventors: 马永; 赵百学; 王安良
Original assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: Jiangsu Jingsen Biomedical New Materials Technology Co., Ltd.
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2036-11-28
Also published as: CN106319001B

Abstract

本发明提供了一种重组干扰素γ(rpIFNγ)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的产业化生产方法。具体涉及到：1、rpIFNγ大肠杆菌表达菌株的构建；2、rpIFNγ高密度发酵工艺开发；3、rpIFNγ包涵体变性和复性工艺开发；4、复性后rpIFNγ样品的纯化制备。通过以上4个层面的技术攻关，本发明方法生产的rpIFNγ具有较高的生物活性(比活达到5‑7×10⁷U/mg)，且该方法产量高(达到1.5g/L以上)、成本低廉、易于放大。

Description

一种重组干扰素γ的产业化制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组猪干扰素γ(rpIFNγ)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的产业化生产方法。

背景技术

干扰素(Interferon,IFN)是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN抗原性不同，可分为IFNγ、IFNβ、IFNγ三种。其中II型IFN目前只发现一种，即IFN-γ，主要由活化的T细胞、NK细胞等产生，其生物活性是参与免疫调节。IFNγ是免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白，它具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抑制造血细胞增殖和免疫调节等功能，适用于病毒感染性疾病(如肝炎)、骨髓增生性疾病、淋巴细胞系肿瘤及其它肿瘤等疾病的治疗。

我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物用干扰素的生产方法成为近年来的研究热点。猪干扰素γ作为一种非特异性广谱抗病毒生物制剂在兽药领域具有广阔的药用前景，可有效增强猪仔的免疫功能，提高机体对病毒的防御作用。但是天然的猪干扰素γ在猪体内含量甚微，因此无法通过直接提取进行临床应用，而对猪干扰素γ进行重组表达则可能是解决该问题的有效手段。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统，具有成本低、产量高、易放大等特点。为了获得更高的蛋白产量研究人员开发了高密度发酵方法，但在高密度发酵过程中由于菌体密度较高往往会导致发酵复合培养基成本高、DO控制困难等问题。针对这些问题，菌株构建、发酵过程的控制、发酵培养基的筛选就显得尤为重要。

此外，使用大肠杆菌作为真核生物来源蛋白的表达宿主时，由于大肠杆菌的高效表达、匮乏的蛋白翻译和修饰等多种因素导致真核蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式进行表达。包涵体是一种无活性的蛋白聚集体，需要进行人工复性才能获得相应的生理活性。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。

发明内容

本专利要解决的四个技术层面的问题是：1、构建符合药用蛋白要求的rpIFNγ大肠杆菌表达菌株，实现蛋白的高效表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rpIFNγ大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发rpIFNγ包涵体的变性和复性工艺；4、确立易于放大、成本低廉、工艺简单纯化方法，制备高纯度、高生物活性的rpIFNγ样品。

本发明目的之一在于提供一种表达rpIFNγ大肠杆菌的高密度发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵。所述的高密度发酵包括如下步骤：

将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；

设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；

发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料培养；

待菌体生长至OD₆₀₀≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM的IPTG进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。

所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L，七水合硫酸镁1.5-3g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

所述补料培养基的流加速度维持在25-30g/h之间

所述微量元素母液成分包括：FeSO₄.7H₂O 10g/L、ZnSO₄.7H₂O 2.25g/L、CuSO₄.5H₂O15g/L、MnSO₄.5H₂O 5g/L、CaCl₂.7H₂O 1g/L、CoCl.6H₂O 1g/L、Na₂MoO₄.2H₂O 1.125g/L、H₃BO₃0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin 0.5g/L。

DO属于发酵过程中重要监控参数之一，对于有氧培养而言大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，同时发酵液中的氧浓度变化也是发酵过程监测和菌体生长情况的重要反馈信号之一。例如，在分批培养结束时要进行补料培养，而补料开始的信号则是DO的突然上升。一般而言，发酵液DO过低会造成菌体的生长缓慢、质粒丢失、蛋白产量低的问题；发酵液中DO过高则会导致菌体生长过快、代谢负荷过重、质粒丢失、蛋白产量低、能耗增大等问题。因此，控制发酵过程中的DO在合理区间是保证发酵结果的必要手段。一般情况下，对于高密度发酵而言，发酵的前期菌体代谢较慢可以通过提高转速和空气通气量来保证DO的稳定。随着菌体生长代谢趋于旺盛耗氧量随之提高，此时通过提高转速(转速过高会导致剪切力过大、菌体死亡及质粒丢失)和空气通气量无法满足对氧气的需求，因此需要通入纯氧以起到维持DO的作用。对于高密度发酵后期，随着生物量的增大，发酵液趋于粘稠，氧气传质下降，DO的控制会更加困难，此时氧气对于DO维持就更为重要。本发明通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-40％之间，具体来说就是，设定DO为30-40％，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.2-1vvm，然后通过逐渐提高转速(不超过900转)以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在30-40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。

所述发酵种子活化方法具体为：将构建好的rpIFNγ大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。

所述发酵一级种子液制备方法为：从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8-10h，此为一级种子液。

所述发酵二级种子液制备方法为：将一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液。

上述任何用于菌体培养的器皿和培养基在使用前均应进行过滤或者湿热灭菌，任何培养基在灭菌结束冷却后使用前均应加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素以保证纯种培养。

本发明目的之二在于提供一种rpIFNγ包涵体变性前预纯化的处理方法，通过该方法可以去除rpIFNγ包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，降低下游纯化成本，提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。包括：

1、菌体破碎收集后的rpIFNγ包涵体固体颗粒使用bufferB(20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，100-300mM NaCl，1mM PMSF,0.5-2％TritonX-100，pH＝8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；

2、将上步收集的rpIFNγ包涵体使用bufferC(20-100mM Tris-HCl，0.5-5mMEDTA，0.1-0.3M NaCl，1mM PMSF，0.5-2％TritonX-100，2-4M脲，pH＝8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；

3、将上步收集的包涵体使用bufferD(20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，1-1.5mM NaCl，1mM PMSF，pH＝8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；

4、将上步收集的包涵体使用缓冲液E(20-100mM Tris-HCl，0.2-0.5M蔗糖，1mMPMSF，pH＝8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液；

5、将上步收集的包涵体使用去离子水重悬至10-25g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rpIFNγ包涵体。

本发明还提供了一种用于易于操作的的rpIFNγ包涵体变性和复性的方法，该方法具有操作简单、复性蛋白活性高的特点。该方法包括：首先取预纯化后的包涵体使用含有5-7M盐酸胍或者8-10M脲的bufferF(20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，1mM PMSF，pH＝8.0)充分重悬至50-100g/L，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物，然后将上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤即得rpIFNγ包涵体变性液。将rpIFNγ包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到复性缓冲液bufferG中，变性液流加的速度控制在1-2mL/min(对于5L复性缓冲液而言，其他复性体积的话进行相应的同比例缩小或者放大)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.05-0.2mg/mL之间，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于10-20℃条件下静置24-48h，复性结束。所述复性缓冲液bufferG为复性成败的关键，其主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，5-20％甘油，0.2-1.0M盐酸胍，0.5-5mM EDTA，1mM PMSF，pH＝8.0-9.0。

本发明还提供了一种rpIFNγ包涵体复性后样品的纯化方法，该方法具有操作简单和易于放大的特点。所述纯化方法是使用阳离子交换层析对rpIFNγ包涵体复性后样品纯化，纯化后的rpIFNγSDS-PAGE电泳检测纯度达到90％以上。所述方法包括：将复性结束后的rpIFNγ包涵体复性液使用超滤法进行2倍以上浓缩→使用去离子水或者20mM Tris-HCl，pH＝9.0缓冲液进行2倍及以上稀释，稀释后检测溶液电导率不高于30mS/m→将稀释后的复性液继续浓缩至原复性体积的1/2或以下→使用0.45μm膜过滤处理后上强阳离子交换柱Sepharose Fast Flow进行纯化→电泳检测纯化后纯度。所述纯化方法中的超滤浓缩步骤旨在降低纯化前样品体积和进行换液降低溶液中的电导率，如果不考虑上样前的样品体积的话可以直接对复性液进行稀释然后过0.45μm除去杂质后直接进行上样纯化。本发明提供的方法只需要对rpIFNγ复性液进行一步纯化即可达到较高的标准，目的产物纯度可达到90％以上，这是常规纯化方法难以实现的。

本发明的主要优点在于：

提供的rpIFNγ使用的大肠杆菌表达菌株和表达载体符合相关制药领域的要求，并且具有较高的目的蛋白表达量和方便下游处理的特点。

提供的rpIFNγ大肠杆菌高密度发酵方法具有培养基成分明确、成本低廉、易于放大和重复的特点，并且提供的高密度发酵工艺具有蛋白产出高的特点(达到1.5g/L以上)。

提供的包涵体预纯化方法可以明显的降低包涵体内杂蛋白的含量，从而降低杂质对于变复性操作的干扰，具有操作简单、效果良好的特点。

提供的包涵体复性方法具有易于放大、操作简单、复性蛋白生物活性高(比活达到5-7×10⁷U/mg)的特点。

提供的包涵体复性液纯化方法具有步骤简单(一步阳离子交换层析纯化)、易于放大、操作简单的特点，经过一步纯化，样品电泳纯可以达到90％以上。

附图说明

图1为rpIFNγ基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道M为200bp DNA Ladder；泳道1为两端含有XhoI和XbaI酶切位点的rpIFNγ基因PCR产物。

图2为rpIFNγ表达质粒构建过程图。

图3为rpIFNγPCR产物和pET28a质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测鉴定图。

其中，泳道M为200bp DNA Ladder；泳道1为pET28a质粒酶切产物；泳道为2：rpIFNγ PCR产物的酶切产物；

图4为rpIFNγ重组转化子的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测鉴定图

其中，泳道M为200bp DNA Ladder；泳道1-8为不同单菌落菌液对应的PCR产物；

图5为rpIFNγ小量诱导表达SDS-PAGE电泳鉴定图

其中，泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为rpIFNγ诱导表达后菌体超声裂解上清；泳道2为rpIFNγ诱导表达诱导表达后菌体超声裂解沉淀。

图6为rpIFNγ大肠杆菌工程菌株在NBS-BioFlo/CelliGen 115发酵罐3L表达鉴定

其中，泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1为发酵产生rpIFNγ包涵体变性液。

图7为rpIFNγ包涵体经过预纯化后后变性液SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图

其中，泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为rpIFNγ发酵产生包涵体变性液(未经预纯化)；泳道2为rpIFNγ经预纯化后包涵体变性液rpIFNγ。

图8为rpIFNγ包涵体复性液使用阳离子交换层析纯化色谱图

图9为rpIFNγ复性液纯化后样品非还原SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图

其中，泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1为纯化后的rpIFNγ浓缩样品。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行进一步的阐述，需理解，这些实施例仅用于对本发明加以说明而不用于限制本发明。

实施例1 rpIFNγ大肠杆菌菌株的构建和表达鉴定

发明人先前已经完成了rpIFNγ基因的针对大肠杆菌密码子优化、mRNA自由能优化，并将优化后的rpIFNγ基因插入到了pET21b载体构建成重组表达质粒，记为pET21b-rpIFNγ；该表达质粒pET21b-rpIFNγ使用分子克隆的手段被导入到大肠杆菌BL21(DE3)(记为BL21(DE3)-pET21b-rpIFNγ)表达宿主中并实现蛋白高效表达，具体可见专利(申请号：201210593705.X)所述。为了将rpIFNγ基因从pET21b载体克隆至pET28a中，参见如下步骤：

1、取冻存于-80℃冰箱的BL21(DE3)-pET21b-rpIFNγ和DH5α-pET28a菌株甘油管，融化后接种于LB液体培养基中，37℃220rpm摇床过夜培养后使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提(购自于天根生化科技有限公司)。

2、将pET21b-rpIFNγ重组质粒使用引物进行PCR扩增，PCR反应结束后使用琼脂糖电泳凝胶进行电泳检测并切胶回收PCR产物，电泳结果如图1所示。PCR所用引物为T7启动子通用引物。

3、将pET28a质粒和rpIFNγ PCR扩增产物同时使用XbaI和XhoI限制性内切酶(购自于NEB)进行双酶切，酶切结束后对酶切产物进行琼脂糖电泳凝胶分析(分析结果如图3所示)，使用DNA纯化回收试剂盒(购自于天根生化科技有限公司)回收酶切产物片段，回收操作按照试剂盒说明书进行。

4、将回收的rpIFNγ和pET28a酶切产物使用T4DNA连接酶(购自于NEB)进行酶连，酶连方案使用连接酶说明书推荐方案进行，酶连结束后将酶连产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自于天根生化科技有限公司)。转化完毕后，将感受态细胞涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜培养。

5、从转化平板上挑取单克隆接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃，220rpm培养8h。培养完毕后取出部分菌液，作为PCR扩增模板对单菌落进行PCR鉴定，PCR引物为T7启动子通用引物。PCR扩增体系为50μl，所使用DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶(购自于天根生化科技有限公司)，所使用扩增条件按照说明书推荐方案进行。PCR结束后，使用1％琼脂糖电泳凝胶进行分析，分析结果如图4所示。

6、使用质粒小提试剂盒进行质粒抽提，将所抽提质粒进行DNA测序。比对分析测序结果，测序结果正确的质粒对应菌株即为阳性的目标菌株，记为BL21(DE3)-pET28a-rpIFNγ。

7、取BL21(DE3)-pET28a-rpIFNγ甘油管按照1％接种量接种于含有50μg/mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0时加入终浓度为1mM IPTG进行诱导表达，诱导表达4h后离心收集菌体。

8、将步骤7中诱导表达后菌体使用PBS重悬至0.05g/mL，使用探针式超声波细胞破碎仪进行超声破碎，破碎条件为：200W工作3s间隔4s，共计超声破碎28min。将超声破碎后产物10000g/20min离心收集，分别收集上清和沉淀。取沉淀使用含有8M脲的bufferF(50mMTris-HCl，0.5mM EDTA，1mM PMSF，pH＝8.0)变性溶解，然后将制备的超声裂解物上清和变性液进行SDS-PAGE电泳分析，分析结果如图5所示。通过图5可以看出rpIFNγ以包涵体形式进行表达。

实施例2 rpIFNγ高密度发酵

本实施例主要阐述了BL21(DE3)-pET28a-rpIFNγ菌株的高密度发酵工艺，发酵工艺中使用成分明确的葡萄糖和甘油作为菌体代谢的碳源，使用氨水(发酵过程中既用于pH调节也用做氮源用于菌体代谢)和磷酸氢二铵作为菌体代谢的氮源；由于未使用类似于酵母粉、蛋白胨之类的复合培养基，避免了复合氮源/碳源带来的批次之间不稳定性，因此不同发酵批次的培养基成分可以很容易实现控制，并且由于葡萄糖和甘油成本较低，因此发酵工艺总体成本得到良好的控制。发酵结束后发酵菌体OD₆₀₀可达90-100之间，目的蛋白表达量达到1.5g/L以上。

制备例1具体步骤如下：

1、发酵种子液的制备：将实施例1中构建好的rpIFNγ大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化；

2、从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8h，此为一级种子液。

3、将步骤2中的一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液制备。

4、分批发酵培养基的成分：一水合柠檬酸1.5g/L，磷酸二氢钾13g/L，磷酸氢二铵4g/L，葡萄糖15g/L，七水合硫酸镁1.5g/L；按照分批发酵培养基的成分称取3L量的试剂，使用2L单蒸水溶解后，调节pH至6.5，定容至3L。将配好的分批发酵培养基倒入发酵罐(NBS-3L)进行灭菌，冷却后，通过注射器向发酵罐中打入3mL上文中提到的微量元素母液(过滤除菌)和终浓度为50μg/mL的卡那霉素(过滤除菌)抗生素。按照补料培养基的成分称取500mL量的相关试剂(甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L)补料培养基，定容至500mL后121℃，20min灭菌处理，使用前还要向补料培养基中加入1/1000(V/V)的前述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。

5、将制备好的二级种子液按照10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基的发酵罐中开始补料-分批高密度发酵培养，设定发酵温度为37℃、pH为6.8、DO 40％，pH使用氨水和磷酸(20％)进行关联调节，DO通过关联转速、通气量和高纯氧进行控制。发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料培养(补料培养基的流加速度维持在25-30g/h范围)。待菌体生长至0D₆₀₀≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为1.0mM的IPTG 37℃进行诱导表达，诱导表达6h结束培养。取部分发酵菌体进行SDS-PAGE表达分析，分析结果如图6所示。使用离心法收集发酵液中的菌体，所收集得到菌体可以进行进一步破碎处理也可冻存于-40℃冰箱中备用。

制备例1中的步骤1-3为本领域觉的常规方法，制备例中列出的具体条件仅用作说明而非限制本发明。

制备例1中的分批发酵培养基是高密度发酵的关键，组分明确、成本低廉，在制备例1的基础上对培养基组分含量进行微调(见表1)，同时步骤5的高密度发酵参数在前期研究的基础上也进行微调(见表2，表中未列参数与制备例1相同)，取制备例2、3的发酵菌体进行SDS-PAGE表达分析，结果和制备例1基本一致。

表1

表2

参数	制备例1	制备例2	制备例3
				接种量	10％	5％	15％
pH	6.8	7.0	7.2
				DO	40％	30％	35％
IPTG	1.0mM	0.5mM	0.75mM
				诱导表达时间	6h	4h	5h

实施例3 rpIFNγ包涵体的获得和预纯化处理

对于大肠杆菌胞内表达的包涵体而言，包涵体的获得需要对菌体进行裂解。菌体的裂解包括：物理法、化学法、酶法等；三种方法可以单独使用也可以联用以达到更好的菌体裂解效果，其中在工业中大肠杆菌破碎应用比较广泛的方法是高压均质机破碎处理，该方法在操作过程中可以很好地控制操作温度从而最大限度的降低蛋白的热失活。菌体裂解后可以通过简单地离心即可收集得到包涵体沉淀。一般而言，包涵体颗粒中主要含有目的蛋白，同时还含有脂类、杂蛋白、核酸等杂质，这些杂质会对下游的变复性和纯化效果形成干扰。因此，包涵体在进一步的变复性处理之前一般需要预纯化去除目的蛋白质外的杂质，从而降低下游的纯化成本和提高复性效果。

本实施例具体阐明了裂解大肠杆菌发酵菌体制备包涵体和包涵体的预纯化处理，具体如下：

1、实施例2制备例1得到的发酵菌体使用缓冲液A(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM氯化钠，1mM PMSF，0.5mg/mL溶菌酶，pH＝8.0)充分重悬至菌体浓度为100g/L，室温搅拌1.5h。

2、使用ATS-AH1500高压均质机对发酵菌体进行物理破碎，调节压力900bar，进行均质破碎2次，6500g/20min离心收集rpIFNγ包涵体，离心后所得上清丢弃，沉淀即为包涵体。

3、使用缓冲液B(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mMNaCl，1mM PMSF，1％TritonX-100，pH＝8.0)重悬至10g/L(包涵体质量按湿重计算)，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次

4、将步骤3收集的猪干扰素γ包涵体使用缓冲液C(50mM Tris，1mM EDTA，100mMNaCl，1mM PMSF，1％TritonX-100，4M脲，盐酸调节pH＝8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。

5、将步骤4收集的包涵体使用缓冲液D(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，1mMPMSF，pH＝8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次。

6、将步骤5收集的包涵体使用缓冲液E(50mM Tris-HCl，0.4M蔗糖，1mM PMSF，pH＝8.0)重悬至10g/L，室温搅拌处理5h，4000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液。

7、将步骤6收集的包涵体使用去离子水重悬至10g/L，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的rpIFNγ包涵体。将预纯化后的包涵体用SDS-PAGE检测包涵体纯度，分析结果如图7所示，通过电泳检测分析可以看出通过预纯化后包涵体中杂蛋白得到了部分的去除，起到了纯化的作用。对预纯化后的包涵体性液使用Quantity One软件进行灰度分析，纯度约为80％。

8、将步骤7最终收集得到的包涵体蛋白使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，干燥至恒重后称量干燥后样品的质量。换算后可得1L发酵液最终可以获得2g预纯化后包涵体冻干粉，折算纯度后可得每升发酵液可以获得1.6g目的蛋白。

实施例2制备例2、3得到的发酵菌体按照实施例3收集得到rpIFNγ固体颗粒，预纯化步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表3，表中未列参数与制备例1相同。

表3

用制备例1相同的方法进行纯度和含量的计算，制备例2、3纯度约为75％、82％；折算纯度后可得每升发酵液可以获得1.7g左右目的蛋白。

实施例4 rpIFNγ包涵体变性液制备和复性

本实施例阐述了rpIFNγ包涵体变性液制备和体外稀释复性方法，该方法的原理是首先将预纯化后的包涵体固体颗粒使用变性剂变性获得可溶性变性液，然后通过人工配制的复性缓冲液从而提供一种蛋白折叠环境，将变性后蛋白溶液缓慢的加入到复性缓冲液中从而实现变性剂浓度的降低诱发蛋白折叠形成正确的高级结构，最终形成有活性的rpIFNγ。该方法在操作中只需要进行一步稀释，操作简单，因此在工业上很容易实现放大，所复性蛋白经过细胞活性测定表明活性可以达到1×10⁷U/mg以上，在目前报道中属于较高水平。制备例1的复性具体步骤如下：

1、预纯化后的包涵体使用含有6M盐酸胍缓冲液F(50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，1mM PMSF，pH＝8.0)充分重悬至50g/L(按湿重计)，室温搅拌处理10-15h，10000g/30min离心收集上清液丢弃不溶物。

2、将上步离心收集的上清液使用0.22μm的滤膜进行过滤进一步除去不溶物即得猪干扰素γ包涵体变性液。

3、配制5L包涵体复性缓冲液G(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，1mM PMSF，5％甘油，0.5M盐酸胍，pH＝8.5)。

4、取步骤2制备的rpIFNγ包涵体变性液使用蠕动泵缓慢加入到步骤3制备的复性缓冲液中，变性液添加的过程中保持复性液被快速搅拌以便变性液可以快速的混匀。变性液流加的速度控制在1-2mL/min(对于5L复性缓冲液而言)，变性液添加完毕后复性体系中蛋白浓度维持在0.1mg/mL左右，变性液添加完毕后将复性缓冲液置于10-20℃条件下静置36h，复性结束。

实施例4制备例2、3得到的变性液复性步骤参照上述制备例1的方法，改变部分参数见表4，表中未列参数与制备例1相同。

表4

实施例5 rpIFNγ包涵体复性样品的纯化制备

该实施例阐述了rpIFNγ包涵体复性后样品的纯化方法。使用DNAMAN预测rpIFNγ的等电点为10.58，因此在小于该等电点pH条件下可以使用阳离子交换色谱进行rpIFNγ的纯化制备。发明人使用Sepharose Fast Flow填料对rpIFNγ复性样品进行纯化，纯化结束后非还原电泳检测纯度可达到90％以上，因此该方法具有操作简单和易于放大的特点。实施例4制备例2的纯化具体步骤如下：

1、5L rpIFNγ包涵体复性液使用PALL台式超滤系统(选用3KDa膜包)进行超滤浓缩，浓缩至体积为2.5L，加入水或者20mM TrisHCl(pH9.0)稀释至样品电导率不高于30mS/m。将稀释后的复性液继续浓缩至原复性体积的1/2或以下。

2、将上述超滤浓缩后的复性液，使用0.45μm膜过滤处理。

3、使用AKTA Purifier纯化系统，阳离子交换柱Sepharose Fast Flow(xk26柱材，柱床体积为30ml)对步骤2中样品进行纯化。平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH＝9.0)，洗脱用缓冲液(20mM Tris-HCl，1MNaCl，pH＝9.0)。首先使用平衡缓冲液对柱床进行平衡，平衡至pH、电导率、UV280稳定，然后10ml/min上样，上样结束后再次使用平衡缓冲液平衡至pH、电导率、UV₂₈₀稳定。洗脱：1、一步提高洗脱缓冲液浓度至30％，至UV稳定；然后逐渐提高洗脱液经过柱床的浓度，在10个柱体积，经过柱床的洗脱缓冲液浓度达到60％，当UV₂₈₀>15mAu时开始收集样品，纯化色谱图如图8所示；将纯化收集的样品使用截留分子量为3KDa的超滤浓缩管进行超滤浓缩，取浓缩后的样品使用非还原电泳进行纯度检测，分析结果如图9所示，使用Quantity One软件对电泳结果进行灰度分析，分析纯度为93％。实施例4制备例2、3的纯度也在95％左右。

实施例6 rpIFNγ包涵体复性样品的抗病毒活性测定

1、预先培养好的IBRS-2单层细胞，用0.05％Trypsin消化后用10％FBS MEM稀释至合适的细胞密度(约2.5×10⁵个/ml)的细胞悬液，铺96孔细胞板100μl/孔，37℃5％CO₂培养4h左右，待其贴壁。

2、等细胞贴壁后，将重组猪干扰素γ样品进行4倍梯度稀释，做12个梯度，每个梯度重复3个孔，稀释用7％FBS MEM培养基。将稀释后的猪干扰素样品一次加入贴壁的96孔细胞板进行换液，100μL/孔，细胞对照和病毒对照孔各加入100μl稀释液，37℃5％CO₂过夜培养18-24h，长至均匀单层细胞。

3、用BCA法检测重组猪干扰素γ复性后纯化样品的蛋白浓度，用于比活的计算。

4、弃上清，向每孔中加入100μL VSV病毒液(约1-2×10²TCID₅₀/孔)，细胞对照孔加100μL维持液(3％FBS MEM培养基)，VSV稀释用3％FBS MEM培养基。加完后置37℃5％CO₂培养约24h。

5、攻毒后约24h，在倒置显微镜下观察细胞病变，统计各稀释度CPE孔和无CPE孔数。病毒对照孔75％以上细胞出现病变(“++++”)时，判定结果。病变程度“++”及以上判为CPE孔，否则判为无CPE孔。病变程度用以下符号表示：“-”表示细胞无病变；“+”表示25％以下的细胞有病变；“++”表示25％-50％的细胞有病变；“+++”表示50％-75％的细胞有病变；“++++”表示75％-100％的细胞有病变；

6、按Reed-Muench两氏法计算猪干扰素效价，猪干扰素活性单位以U表示。能保护半数细胞免受攻击病毒破坏的猪干扰素最高稀释度的倒数，即为猪干扰素效价。再根据蛋白浓度计算比活。

举例：Reed-Muench两氏法计算待测样品猪干扰素效价，如表5所示。(下表所列无CPE孔数、出现CPE孔数的数值仅为本例说明的随机取值，并非实验具体数值)

表5

病毒液特定稀释度时的CPE孔数：从最低稀释度出现的CPE孔数逐个累加至该特定稀释度时的CPE孔数，如稀释度为10^-1的CPE孔数为稀释度为10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1时的CPE孔数的逐个累加，即0+1+3+7+8+8＝27；稀释度为10^-2的CPE孔数为稀释度为10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2时的CPE孔数的逐个累加，0+1+3+7+8＝19。

病毒液特定稀释度时的无CPE孔数：从最高稀释度无CPE孔数逐个累加至该特定稀释度时的无CPE孔数，如稀释度为10^-2的无CPE孔数为稀释度为10^-1、10^-2时的无CPE孔数的累加，即0+0＝0；如稀释度为10^-3的无CPE孔数为稀释度为10^-1、10^-2、10^-3时的无CPE孔数的累加，即0+0+1＝1。

CPE：Cytopathic effect细胞病变

距离比＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)＝(75-50)/(75-25)＝0.5

Log₄(X)＝距离比×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.5×(-1)+(-6)＝-6.5

含义：猪干扰素稀释度到4^-6.5时，能保护半数细胞免受攻击病毒破坏。该稀释度的倒数1/X，即为0.1ml待测样品含有的猪干扰素活性单位(U)，本例中待测样品的效价为4^6.5×10＝8.19×10⁴U/ml。

7、根据步骤6中rpIFNγ活性测定的结果换算比活，结果如表6所示。

表6重组猪干扰素γ抗病毒活性测定结果

样品编号	蛋白浓度(mg/mL)	-log₄(X)	效价(U/mL)	比活(U/mg)
					重组猪干扰素γ	9.960	13.50	1.34E+09	1.35E+08

Claims

1.重组猪干扰素γ的制备方法，为重组猪干扰素γ大肠杆菌的高密度发酵表达，该方法包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵；所述的高密度发酵包括如下步骤：

设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；

2.根据权利要求1所述的重组猪干扰素γ的制备方法，其特征在于所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L，七水合硫酸镁1.5-3g/L。

3.根据权利要求1所述的重组猪干扰素γ的制备方法，其特征在于在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液，所述微量元素母液成分包括：FeSO₄.7H₂O 10g/L、ZnSO₄.7H₂O 2.25g/L、CuSO₄.5H₂O 15g/L、MnSO₄.5H₂O 5g/L、CaCl₂.7H₂O1g/L、CoCl.6H₂O 1g/L、Na₂MoO₄.2H₂O 1.125g/L、H₃BO₃ 0.0625g/L、HCl 41.75ml、Biotin0.5g/L。

4.根据权利要求1所述的重组猪干扰素γ的制备方法，其特征在于所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(V/V)的如权利要求3所述的微量元素母液。

5.根据权利要求1所述的重组猪干扰素γ的制备方法，其特征在于DO通过下述方法稳定在30-40％：发酵初期设定空气通气量为0.2-1vvm，然后通过逐渐提高转速以维持DO稳定，当调节转速和空气量不足以维持DO在30-40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。

6.根据权利要求1所述的重组猪干扰素γ的制备方法，还包括rpIFNγ包涵体变性前预纯化的处理方法，包括：

(1)权利要求1中诱导表达结束后的菌体离心破碎；(2)菌体破碎收集后的rpIFNγ包涵体固体颗粒分别使用bufferB、bufferC、bufferD、bufferE、去离子水重悬，离心收集包涵体沉淀，即得到预纯化后的rpIFNγ包涵体；

所述bufferB主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，100-300mM NaCl，1mMPMSF,0.5-2％TritonX-100，pH＝8.0；

所述bufferC主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，0.1-0.3M NaCl，1mMPMSF，0.5-2％TritonX-100，2-4M脲，pH＝8.0；

所述bufferD主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，0.5-5mM EDTA，1-1.5mM NaCl，1mMPMSF，pH＝8.0；

所述bufferE主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，0.2-0.5M蔗糖，1mM PMSF，pH＝8.0。

7.根据权利要求6所述的重组猪干扰素γ的制备方法，还包括rpIFNγ包涵体变性，变性液为含5-7M盐酸胍或者8-10M脲的bufferF，所述bufferF主要组分包括：20-100mMTris-HCl，0.5-5mM EDTA，1mM PMSF，pH＝8.0。

8.根据权利要求7所述的重组猪干扰素γ的制备方法，还包括将包涵体复性，复性缓冲液bufferG的主要组分包括：20-100mM Tris-HCl，5-20％甘油，0.2-1.0M盐酸胍，0.5-5mMEDTA，1mM PMSF，pH＝8.0-9.0。

9.根据权利要求7所述的重组猪干扰素γ的制备方法，还包括复性后样品的纯化，所述纯化方法是使用阳离子交换层析对rpIFNγ包涵体复性后样品进行一步纯化。