CN106282178B - 重组嗜酸乳杆菌s层蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其应用 - Google Patents

重组嗜酸乳杆菌s层蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种引物对。本发明公开一种嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因。本发明还公开一种重组菌株。本发明还公开一种重组蛋白。本发明还公开重组质粒pGEXS的构建方法。本发明还公开上述重组蛋白的提取纯化方法。本发明还公开重组质粒pGEXS、重组菌株，重组蛋白在拮抗H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞中的应用。本发明还公开一种试剂盒。本发明构建的表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的载体pGEXS中含有GST标签，从大肠杆菌中提取的S层蛋白与GST标签相连，可通过GST的柱子得到高度纯化的S层蛋白；与嗜酸乳杆菌ATCC 4356相比，重组大肠杆菌的S层蛋白表达产量更高，纯度达到95%。

Description

重组嗜酸乳杆菌S层蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其应用
技术领域
本发明涉及表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的大肠杆菌，属于生物技术基因工程领域；具体包括：表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白质粒pGEXS的构建，表达的嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白的提取纯化，以及该重组表达的S层蛋白能够拮抗H9N2禽流感病毒侵袭鸡和小鼠树突状细胞。
背景技术
1、禽流感病毒利用树突状细胞发生免疫逃避的机制
禽流感(Aivan influenza，AI)是由禽流感病毒引起的禽类传染病，严重危害我国养禽业的健康发展和人类安全。疫苗预防和在黏膜部分阻断病毒入侵是防治禽流感病毒的主要方式，但目前我国禽流感疫苗接种后产生免疫应答的保护力难以防控禽流感的发生，疫苗接种后禽流感在部分区域仍然呈流行态势，这与禽流感病毒容易突变造成疫苗的失效密切相关。因此，高效阻断禽流感病毒对呼吸道黏膜的侵袭是防治禽流感的重要措施。
小鼠和鸡是研究禽流感病毒的模式动物，位于黏膜固有层中的树突状细胞作为机体功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，可摄取、加工处理和递呈抗原，起着“哨兵”的作用。虽然禽流感病毒通过黏膜上皮细胞唾液酸α-2,3Gal受体介导侵袭，但树突状细胞对禽流感病毒的摄取和递呈是启动免疫应答的先决条件。DC-SIGN是位于树突状细胞表面的C型凝集素受体，研究发现DC-SIGN可通过自身的凝集素糖识别域(carbohydrate recognition domain，CRD)识别病毒表面的甘露糖和岩藻糖等糖类基团。人类免疫缺陷病毒(HIV-1)和SARS冠状病毒(SARS)均可通过与DC-SIGN受体结合，介导病毒利用树突状细胞参与免疫逃避。研究证实禽流感病毒同样可以通过与DC-SIGN结合，抑制树突状细胞的活化和对病原微生物的递呈，促进病毒在人源树突状细胞内的复制，并通过DC-SIGN直接将病毒颗粒传递给淋巴组织中其他易感细胞，从而发生病毒逃逸，给禽流感的防控增加了难度。
2、乳酸杆菌S层蛋白的研究进展
S层蛋白是古细菌和某些细菌(大约600余种细菌)表面的一层蛋白成分，分子量为40-200kD，能在菌体表面自装配为规则晶格的单分子层，以非共价键方式结合在细胞外膜上。研究已证实嗜酸乳杆菌ATCC 4356含有S层蛋白。乳酸杆菌S层蛋白的结构和生化特性与一般细菌S层蛋白有所不同，如等电点较高、分子量较小等。乳酸杆菌S层蛋白分子量在25-71kD之间，是目前已知S层蛋白中最小的一类，通常S层蛋白均为弱酸性蛋白，但乳酸杆菌S层蛋白呈强碱性，其等电点(pI)在9.35～10.4之间。虽然一些革兰氏阳性菌的S层蛋白大都为糖蛋白，但大部分乳酸杆菌S层蛋白则不具备糖基化的结构，为非糖蛋白。到目前为止，仅发现布氏乳酸杆菌(L.buchneri)的S层蛋白存在糖基化结构。
近年来有研究报道发现乳酸杆菌的S层蛋白具有拮抗病原菌侵袭机体的现象，但具体机制尚不清楚。研究发现，从卷曲乳酸杆菌分离的S层蛋白可以抑制产肠毒素大肠杆菌对层粘连蛋白和基质胶的粘附；与此同时卷曲乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌也具有拮抗作用。但乳酸杆菌的S层蛋白能否拮抗病毒的侵袭的研究尚不完备。
3、S层蛋白可以特异性结合树突状细胞的机制
乳酸杆菌S层蛋白作为已知最小的S层蛋白，可作为S层蛋白结构和功能的研究模型，其显著的结晶特性、基因的可修饰性以及S层晶格空间结构特性，在生物技术、纳米科技和生物医药等方面有着巨大的应用前景。目前研究证实乳酸杆菌的S层蛋白可以结合DC-SIGN受体诱导树突状细胞的活化，而禽流感病毒同样可以通过与DC-SIGN结合利用树突状细胞发生免疫逃逸，乳酸杆菌的S层蛋白是否能够通过竞争性结合树突状细胞的DC-SIGN受体来拮抗禽流感病毒对树突状细胞的侵袭？这对于在呼吸道黏膜部位直接切断H9N2禽流感病毒的侵袭途径和抑制病毒的免疫逃避，以及防治和净化禽流感疫病，具有重要的研究和生产实践意义。
按照常规方法从乳酸杆菌中提取S层蛋白的过程中涉及到各种变性剂，例如盐酸胍、氯化锂、尿素等，这些试剂的残留可能带来蛋白结构的破坏以及一些毒性作用的产生，并且提取的S层蛋白中含有其它杂质。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种引物对。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种能够高效表达嗜酸乳杆菌ATCC4356(L.acidophilus ATCC 4356)S层蛋白的重组质粒pGEXS。本发明中构建的表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的载体pGEXS中含有GST标签，从大肠杆菌中提取的S层蛋白与GST标签相连，可以通过GST的柱子得到高度纯化的S层蛋白；嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白样品通经SDS-PAGE电泳，灰度扫描后得到S层蛋白的纯度为50％(图5泳道3)，通过BCA蛋白检测试剂盒(购买于Pierce公司)发现每1011CFU的乳酸杆菌S层蛋白产量为6.0mg；重组大肠杆菌中S层蛋白表达产量更高，通过BCA蛋白检测试剂盒(购买于Pierce公司)发现每1011CFU的重组大肠杆菌S层蛋白产量为11.9mg，蛋白样品通过GST柱子纯化，经SDS-PAGE电泳，灰度扫描后得到S层蛋白的纯度为95％(图6泳道6)。因此，重组大肠杆菌中S层蛋白产量提高98.33％((11.9-6.0)/6.0＝98.33％)；且纯度从50提高到95％。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种重组菌株。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供了一种重组蛋白。
本发明所要解决的第六个技术问题是提供了重组质粒pGEXS的构建方法。
本发明所要解决的第七个技术问题是提供了上述重组蛋白的提取纯化方法。
本发明所要解决的第八个技术问题是提供了上述的重组质粒pGEXS、重组菌株，重组蛋白在拮抗H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞中的应用。
本发明所要解决的第九个技术问题是提供了一种试剂盒。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
本发明内容还包括一种嗜酸乳杆菌ATCC 4356(L.acidophilus ATCC 4356)S层蛋白基因，所述S层蛋白基因通过所述的引物对扩增得到。所述的一种嗜酸乳杆菌ATCC 4356S层蛋白基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明内容还包括一种重组质粒pGEXS，所述重组质粒pGEXS含有所述的嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因。
其中，上述重组质粒pGEXS含有GST标签。
本发明内容还包括一种重组菌株，所述重组菌株含有所述的重组质粒pGEXS。
本发明内容还包括一种重组蛋白，所述重组蛋白是通过所述的重组菌株表达得到。
其中，上述的重组质粒pGEXS的构建方法，包括以下步骤：
1)嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因的克隆：以嗜酸乳杆菌ATCC 4356提取的基因组DNA为模板，用所述的引物对PCR扩增得到表达S层蛋白的目的基因序列；
2)重组质粒pGEXS的构建：用限制性内切酶XhoI和BamHI将pGEX-4t-2质粒线性化，将线性化的pGEX-4t-2质粒与步骤1)PCR扩增得到的基因序列进行连接，得到pGEXS质粒。
上述重组质粒pGEXS的构建方法，具体包括以下步骤：
1)嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因的克隆
参照已发表的基因序列序列(GenBank登陆号:CP000033.3)，设计一对扩增嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白目的基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入经BamHI和XhoI内切酶线性化的pGEX-4t-2载体的同源臂(下划线为同源臂)，引物序列如下：
P1:GGTTCCGCGTGGATCCGCTGTATCTACTGTTAGCGCTGCTACT(SEQ ID NO:2)
P2:GATGCGGCCGCTCGAGTTATCTAAAGTTTGCAACCTTA(SEQ ID NO:3)
以嗜酸乳杆菌ATCC 4356提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增能够表达S层蛋白的目的基因序列。PCR反应体系为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环，72℃1min 10s，4℃10min。回收扩增产物。
2)重组质粒pGEXS的构建
用限制性内切酶XhoI和BamHI将pGEX-4t-2质粒线性化。反应条件为XhoI和BamHI各2μL，10×buffer 5μL，pGEX-4t-2质粒1μg(5μL)，超纯水36ul，37℃作用2h。将酶切产物回收得到线性化的pGEX-4t-2质粒。将线性化的pGEX-4t-2质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pGEXS质粒，酶切鉴定并测序。
上述的重组蛋白的提取纯化方法，包括以下步骤：将所述的重组质粒pGEXS导入大肠杆菌Rosetta-gami2中，然后诱导表达得到菌体，将菌体加入PBS重悬离心，重悬液进行超声破碎，破碎后的得到的菌液离心，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE验证，将收集的上清过GST柱子，纯化提取得到S层蛋白。
本发明构建的重组质粒pGEXS化学转化获得的能够表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)及其表达的S层蛋白提取纯化方法，具体步骤如下：
1)取1μL(200ng/μL)重组质粒pGEXS加入到50μL大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)化学转化感受态细胞中，轻弹几下，不可吸吹，于冰上放置30min。水浴锅中42℃热激90s，在冰上孵育5min后加入900μL SOC培养基，轻轻颠倒混匀，放入37℃恒温培养箱中复苏10min，将复苏的菌液放置于37℃摇床中，150rpm，培养40min，取出菌液，5000rpm，离心5min，弃去上清，取100μL菌液涂布于氨苄霉素抗性固体基础培养基LB平板，12-16h可见阳性菌落。
2)挑取重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)的阳性菌落，在含有氨苄青霉素(50μgmL)的基础培养基LB培养基中过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例接种于新的基础培养基LB培养基中进行培养，当菌液OD值达到0.5时，加入IPTG诱导重组大肠杆菌中S层蛋白的表达，于18℃条件下，诱导培养20h。8000rpm，10min，离心收集菌体。加入PBS重悬离心收集到的菌体，重悬液进行超声破碎。破碎后的得到的菌液，14000rpm，离心30min。收集上清和沉淀进行SDS-PAGE验证，结果表明上清中有S层蛋白的表达。将收集的上清过GST柱子，纯化提取的S蛋白，使用SDS-PAGE检验得到的蛋白。
上述的重组质粒pGEXS、重组菌株，重组蛋白在拮抗H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞中的应用。
本发明还包括表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中提取的S层蛋白在拮抗H9N2禽流感病毒侵袭小鼠和鸡树突状细胞中的应用。
以下为重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中提取的S层蛋白拮抗H9N2禽流感病毒侵袭小鼠和鸡树突状细胞相关指标的检测：
将培养好的小鼠或鸡树突状细胞铺到12孔板中，1×106/孔。S层蛋白处理组：每孔加入200μL(400μg/mL)S层蛋白；空白对照组：每孔加入200μL RPMI-1640培养基，于37℃作用1h，弃去S层蛋白，两组同时加入200μL(106EID50)H9N2禽流感病毒后，病毒于4℃吸附1h，弃去上清，加入新的维持培养基，病毒入侵1h后，收集以上2种处理作用的树突状细胞，通过流式和实时荧光定量PCR的方法检测侵入细胞中H9N2禽流感病毒的数量。结果表明重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中提取的S层蛋白处理树突状细胞后，能够有效地拮抗H9N2禽流感病毒对小鼠或鸡树突状细胞的侵袭。
本发明内容还包括一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的重组质粒pGEXS、重组菌株，重组蛋白。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色和优点：
1、本试验构建的质粒pGEXS是目前国内外第一个以pGEX-4t-2为载体的能够高效表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的质粒。
2、本发明成功构建了表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的质粒pGEXS，并转化入大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)。经过SDS-PAGE验证嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)内可以被成功表达，并且通过GST标签可以获取高度纯化的S层蛋白。
3、本发明高效表达得到的重组大肠杆菌表达的S层蛋白能够拮抗H9N2禽流感病毒侵袭小鼠和鸡树突状细胞，这种表达的S层蛋白为在黏膜处阻断禽流感病毒入侵细胞，保护机体免受伤害提供了一种新的途径。因此本申请有望为拮抗禽流感病毒侵袭细胞提供新的方法和思路。
附图说明
图1：嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白目的基因的PCR扩增结果凝胶电泳图；泳道1：M表示5000bp的DNA Marker；泳道2：1代表PCR成功克隆1263bp的嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的基因；
图2：表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白的质粒pGEXS酶切验证电泳图；泳道1：M表示5000bp的DNA Marker；泳道2：1代表质粒pGEXS酶切后的产物(用限制性内切酶XhoI和BamHI消化，目的条带从上到下分别为：载体骨架4951bp和目的蛋白基因序列1263bp)；
图3：构建的载体质粒pGEXS示意图；
图4：转入载体质粒pGEXS的重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)菌落PCR验证电泳图；泳道1：M表示5000bp的DNA Marker，泳道2～13：1～12代表菌落PCR后的产物(目的条带大小927bp)；泳道14：阴性对照；
图5：嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白SDS-PAGE电泳图；泳道1：蛋白Marker；泳道2：嗜酸乳杆菌ATCC 4356菌体；泳道3：嗜酸乳杆菌ATCC 4356菌体用盐酸胍变性后离心取上清透析得到的样品；
图6：转入载体质粒pGEXS的重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)表达的S层蛋白以及其提纯产物验证的SDS-PAGE电泳图；泳道1：蛋白Marker；泳道2：R为空白大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)菌体；泳道3：GST为转化了pGEX-4t-2质粒的大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)；泳道4：S为转化了pGEXS质粒的大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)菌体；泳道5：上清为菌体超声后得到的上清；泳道6：纯化为经过GST柱子纯化最终得到的S层蛋白；
图7：流式检测表达的S层蛋白对H9N2禽流感病毒侵袭小鼠树突状细胞的拮抗结果图；H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白提前处理组；
图8：流式检测表达的S层蛋白对H9N2禽流感病毒侵袭鸡树突状细胞的拮抗结果图；H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白提前处理组；
图9：实时荧光定量PCR检测表达的S层蛋白对H9N2禽流感病毒侵袭小鼠树突状细胞的拮抗结果图；H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白提前处理组；
图10：实时荧光定量PCR检测表达的S层蛋白对H9N2禽流感病毒侵袭鸡树突状细胞的拮抗结果图；H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白提前处理组。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：
嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；E.coli JM109感受态细胞、大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞购自诺唯赞生物科技有限公司；pGEX-4t-2质粒购自Life Technologies；
试剂：Q5高保真酶购自NEB公司；RNAios Plus，Agarose Gel DNA PurificationKit，限制性内切酶，反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄青霉素购自广州飞扬生物工程有限公司(Omega Bio-Tek代理)；II One Step Cloning Kit定点克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
实施例1 重组质粒pGEXS的构建
1、酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因的克隆
参照已发表的基因序列(GenBank登陆号:CP000033.3)，设计一对扩增嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白目的基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入经BamHI和XhoI内切酶线性化的pGEX-4t-2载体的同源臂(下划线为同源臂)，引物序列如下：
P1:GGTTCCGCGTGGATCCGCTGTATCTACTGTTAGCGCTGCTACT(SEQ ID NO:2)
P2:GATGCGGCCGCTCGAGTTATCTAAAGTTTGCAACCTTA(SEQ ID NO:3)
以嗜酸乳杆菌ATCC 4356提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增能够表达S层蛋白的目的基因序列。PCR反应体系为50μL，反应体系如下：GXL酶扩增Buffer 10μl，dNTP 5μl，P1 2.5μl，P2 2.5μl，模板1μl，GXL酶1μl，水28μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环，72℃1min 10s，4℃10min。回收扩增产物。如图1可知：1为PCR成功克隆1300bp的嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的基因。切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收扩增产物。以上引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。2、重组质粒pGEXS的构建
用限制性内切酶XhoI和BamHI将pGEX-4t-2质粒线性化。反应条件为XhoI和BamHI各2μL，10×buffer 5μL，pGEX-4t-2质粒1μg(5μL)，超纯水36μL，37℃酶切2h，将酶切产物回收得到线性化的pGEX-4t-2质粒。将线性化的pGEX-4t-2质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(II One Step Cloning Kit购买于南京诺唯赞生物科技有限公司)说明书进行连接，得到pGEXS质粒，限制性内切酶XhoI和BamHI酶切验证正确，如图2所示。所获得的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对，结果表明所克隆的嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100％。得到的重组质粒pGEXS，其结构示意图如图3所示。
实施例2 表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)的验证
取1μL(200ng/μL)重组质粒pGEXS加入到50μL大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)化学转化感受态细胞中，轻弹几下，不可吸吹，于冰上放置30min。水浴锅中42℃热激90s，在冰上孵育5min后加入900μL SOC培养基，轻轻颠倒混匀，放入37℃恒温培养箱中复苏10min，将复苏的菌液放置于37℃摇床中，150rpm，培养40min，取出菌液，5000rpm，离心5min，弃去上清，取100μL菌液涂布于氨苄霉素抗性固体基础培养基LB平板，12-16h可见阳性菌落。挑取菌落进行验证，如图4，1-12为进行PCR验证的菌落，结果显示均为阳性，13为阴性对照，PCR验证的引物如下：
P3：TGCTGCTTTACTTGCTGTTG(SEQ ID NO:4)
P4：CTCTTGCTTACGCTGGCTAC(SEQ ID NO:5)
以上引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例3 重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)表达的S层蛋白的提取和纯化
挑取重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)的阳性菌落，在含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB培养基中过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例接种于新的LB培养基中进行培养，当菌液OD值达到0.5时，加入IPTG诱导重组大肠杆菌中S层蛋白的表达，于18℃，诱导培养20h。8000rpm，10min，离心收集菌体。加入PBS重悬离心收集到的菌体，重悬液进行超声破碎。破碎后，14000rpm，30min，离心。收集上清和沉淀进行SDS-PAGE验证，结果表明上清中有S层蛋白的表达。将收集的上清过GST柱子，纯化提取的S蛋白，经SDS-PAGE验证得到了S层蛋白，如图6所示，R为空白大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)菌体，GST为转化了pGEX-4t-2质粒的大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)，S为转化了pGEXS质粒的大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)菌体，上清为菌体超声后得到的上清，纯化为经过GST柱子纯化最终得到的S层蛋白。S层蛋白分子量为43kd，结合的GST蛋白的分子量为26kd，因此，纯化后带有GST标签的S层蛋白分子量为69kd，与SDS-PAGE结果一致。通过灰度分析，纯化后的S层蛋白纯度为95％。相对于嗜酸乳杆菌ATCC 4356(每1011CFU的乳酸杆菌S层蛋白产量为6.0mg)，重组大肠杆菌中S层蛋白表达产量更高(每1011CFU的重组大肠杆菌S层蛋白产量为11.9mg)，产量提高98.33％。
实施例4 小鼠和鸡骨髓源树突状细胞的分离培养
1、小鼠骨髓源树突状细胞的分离培养
(1)颈椎脱臼处死4-6周龄的C57BL/6小鼠，处死后立即浸入75％的酒精中浸泡5min，再转入含有2％双抗的PBS浸泡5min，无菌条件下取出小鼠的股骨和胫骨，用剪刀和镊子将骨头外面的肉剥干净。
(2)用1mL注射器吸取含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基(4℃预冷，无血清)，将骨髓冲洗至10mL无菌离心管中，收集离心管中的骨髓细胞悬液，1200rpm，5min。
(3)弃去上清，加入预热的红细胞裂解液(南京鼎思生物技术有限公司)(800μL/只)，轻轻混匀，室温静置作用1min后，立即加入含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基终止裂解反应，1200rpm，离心5min，收集经红细胞裂解液作用后的细胞。
(4)弃去上清，用5mL含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基重悬细胞，1200rpm，离心5min，收集细胞。
(5)弃去上清，用RPMI-1640完全培养基(含有10％灭活胎牛血清，1％青链霉素，10ng/mL rmGM-CSF和10ng/mL rmIL-4)重悬细胞，细胞以1×106个/mL密度接种于Costar 6孔细胞培养板中。小鼠的rmGM-CSF和rmIL-4购买于Peprotech公司。
(6)37℃，5％CO2培养箱中培养60h后，全量换液，再加入新鲜的RPMI-1640完全培养基继续培养至第6天。
(7)收集悬浮以及半贴壁的细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞。
2、鸡骨髓源树突状细胞的分离培养
(1)15日龄左右的SPF小鸡经处死后立即浸入75％的酒精中浸泡5min，再转入含有2％双抗的PBS浸泡5min，无菌条件下取出鸡的股骨和胫骨，用剪刀和镊子将骨头外面的肉剥干净。
(2)5mL注射器吸取含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基，冲洗股骨和胫骨的骨髓至髓腔变白，收集得到的冲洗液，1000rpm，离心8min，收集沉淀细胞。
(3)弃上清，收集并用含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基对沉淀细胞进行重悬得到细胞悬液，然后按照等体积的比例将细胞悬液慢慢加入已备好的Histopaque-1119玻璃离心管中，2500rpm，离心30min，收集细胞。
(4)步骤3)离心后出现3层，小心收集中间白色雾状层细胞，加入含有2％青链霉素的RPMI-1640培养基进行重悬，1000rpm，离心8min，收集鸡骨髓细胞。
(5)弃上清，使用RPMI-1640完全培养基(含有10％灭活胎牛血清，1％青链霉素，50ng/mL鸡重组GM-CSF和50ng/mL鸡重组IL-4)重悬步骤4)得到的鸡骨髓细胞。鸡rmGM-CSF购买于Abcam公司，鸡rmIL-4购买于Kingfisher公司。
(6)将步骤5)分离到的鸡骨髓细胞接种于Costar 6孔细胞培养板中，每孔再加入2mL RPMI-1640完全培养基，细胞终浓度为1×106个/mL。
(7)将步骤6)得到的细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，培养至第2天和第4天，各半量换液1次。
(8)步骤7)的鸡骨髓树突状细胞诱导培养至第6天时，收集细胞，加相应的处理，进行后续试验。
实施例5 流式检测提取S层蛋白拮抗H9N2禽流感病毒侵袭小鼠和鸡树突状细胞
将实施例4培养好的小鼠骨髓来源的树突状细胞和鸡骨髓树突状细胞分别铺到12孔细胞培养板中，1×106/孔。H9N2禽流感病毒由江苏省农业科学院兽医所提供，取H9N2禽流感病毒与Dylight 488标记分子孵育，润洗后获得Dylight 488-H9N2禽流感病毒。S层蛋白处理组：每孔加入200μL(400μg/mL)S层蛋白；空白对照组：每孔加入200μL RPMI-1640培养基，于37℃作用1h，弃去S层蛋白，两组同时加入200μL(106EID50)Dylight 488-H9N2禽流感病毒后，病毒于4℃吸附1h，弃去上清，加入新的维持培养基(含有2％灭活胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司)、1％青链霉素(南京鼎思生物技术有限公司)和2ng/mL小鼠rmGM-CSF(Peprotech公司)或者2ng/mL rmGM-CSF(Kingfisher公司))，病毒入侵1h后，分别收集各处理组的树突状细胞，2000rpm，10min，离心后弃上清，PBS清洗两次后，重悬细胞，通过流式的方法检测侵入细胞中Dylight 488-H9N2禽流感病毒的数量。如图7、8所示，H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白提前处理组，结果表明重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中提取的S层蛋白提前作用于小鼠和鸡树突状细胞能够有效地拮抗H9N2禽流感病毒对小鼠和鸡树突状细胞的侵袭；与单独病毒组(H9N2)相比，S层蛋白处理组树突状细胞内的H9N2禽流感病毒数量显著减少。(**P<0.01)。
实施例6实时荧光定量PCR检测提取S层蛋白拮抗H9N2禽流感病毒侵袭小鼠和鸡树突状细胞
将实施例4培养好的小鼠骨髓来源的树突状细胞和鸡骨髓树突状细胞分别铺到12孔板中，1×106/孔。S层蛋白处理组：每孔加入200μL(400μg/mL)S层蛋白；空白对照组：每孔加入200μL RPMI-1640培养基，于37℃作用1h，弃去S层蛋白，两组同时加入200μL(106EID50)H9N2禽流感病毒后，于4℃吸附1h，弃去上清，加入新的维持培养基(含有2％灭活胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司)、1％青链霉素(南京鼎思生物技术有限公司)和2ng/mL小鼠rmGM-CSF(Peprotech公司)或者2ng/mL rmGM-CSF(Kingfisher公司))，病毒入侵1h后，分别收集各处理组的树突状细胞，2 000rpm，10min，离心后弃上清，PBS清洗两次后，加入RNAios Plus(宝生物工程(大连)有限公司)。提取不同处理组树突状细胞的RNA，反转录后通过实时荧光定量PCR检测各处理组树突状细胞中的H9N2禽流感病毒HA基因片段的相对含量。如图9、10所示，H9N2为空白对照组，S+H9N2为S层蛋白处理组，实时荧光定量PCR的结果表明重组大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中提取的S层蛋白提前作用于小鼠和鸡树突状细胞能够有效地拮抗H9N2禽流感病毒对小鼠和鸡树突状细胞的侵袭。与单独病毒组(H9N2)相比，S层蛋白处理组树突状细胞内的H9N2禽流感病毒数量显著减少(**P<0.01)。
上述仅为本发明优选的实施例，这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出其它不同形式的变化或变动，这些也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.重组质粒pGEXS、重组菌株、重组蛋白在制备拮抗H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞药物中的应用，其特征在于，所述重组质粒pGEXS是用限制性内切酶XhoI和BamHI将pGEX-4t-2质粒线性化，将线性化的pGEX-4t-2质粒与表达 嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S 层蛋白的目的基因序列进行连接获得，所述重组菌株是重组质粒pGEXS导入大肠杆菌Rosetta-gami2中即得，所述重组蛋白是将重组菌诱导表达得到菌体，将菌体加入PBS重悬离心，重悬液进行超声破碎，破碎后的得到的菌液离心，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE验证，将收集的上清过GST柱子，纯化提取得到S层蛋白即得。
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