CN1355690A - 一种延长可溶性病毒特异性配体在粘膜上半寿期的方法 - Google Patents

一种延长可溶性病毒特异性配体在粘膜上半寿期的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种延长可溶性病毒特异性配体在粘膜上半寿期的方法,该方法是通过改变病毒特异性配体,使之与粘膜上寄居的细菌结合。本发明还提供了一种嵌合分子,它包含病毒特异性配体和细菌特异性配体。

Description

一种延长可溶性病毒特异性配体在粘膜上半寿期的方法
                          相关申请
本申请要求1999年4月16日递交的美国临时申请60/129,722的优先权，后者在此作为本申请的参考。
                 有关政府资助研发项目权属的声明
无。
                            发明背景
用可溶性病毒受体预防病毒感染是目前一个活跃的研究领域。在众多努力中，目前正在考察经鼻给予可溶性ICAM-1预防鼻病毒感染(感冒)的效果(Boehringer Ingelheim and Bayer)。设计的可溶性病毒受体的起效机制为：占据病毒所有的宿主结合位点，从而使病毒没有可附着于其靶细胞的位点。然而，一个病毒颗粒在其表面具有许多的宿主细胞结合位点，例如，鼻病毒有60个。可溶性病毒受体必须同时覆盖病毒上所有的结合位点才能消除其感染性。这要求病毒受体与病毒颗粒之比极高(以鼻病毒为例，需＞60∶1)。而且，由于结合是一种可逆过程，不可能同时覆盖一个病毒上的所有结合位点。理论上，只要病毒上还有一个自由的结合位点，它就能够感染宿主。
用可溶性病毒受体预防病毒感染的临床试验成功率不高。可溶性ICAM-1受体被发现预防流感的效果很低，而且只有当遭遇鼻病毒之前它们已经存在于鼻粘膜上时才有效。由于被感染的宿主在感染后2至3天才会觉察到某些症状，确保可溶性病毒受体在感染时已经存在于鼻粘膜上的唯一途径是在一段推定危险期内定期给予这些受体。
尤其是，存在着一个可溶性病毒受体在粘膜表面半寿期短的问题。由于可溶性病毒受体可以自由移动，它们很容易被正常的粘膜纤毛清除机制所清除。因此就需要频繁地重复给药，ICAM研究的对象不得不每日给予可溶性病毒受体6次。这很可能导致成本高、顺应性差，阻碍可溶性ICAM-1受体疗法成为一种预防流感的可行方法。
本发明的目的是延长可溶性病毒特异性配体在粘膜表面的半寿期，从而降低用可溶性病毒特异性配体预防病毒感染的成本和用药频率。
                             附图简述
图1显示的是：一个嵌合分子将一个病毒结合于细菌细胞表面，该细菌细胞则生长在粘膜上。该图显示用对粘膜寄居细菌具有特异性的细菌结合结构域改造的可溶性病毒特异性配体(1)使病毒颗粒(4)与动物粘膜(2)上的细菌(3)结合。(1)也可以是包含病毒特异性配体和细菌特异性配体的嵌合分子。
图2是以气雾剂形式将所述嵌合分子递送入鼻通道所适用的容器的正视图。
                           发明概述
本发明提供了一种延长病毒特异性配体在寄居有细菌的动物粘膜上半寿期的方法，所述方法包括将经改造后可结合粘膜上细菌表面的病毒特异性配体与粘膜接触。许多不同的细菌可作为结合目标。例如，可将病毒特异性配体改造成可结合链球菌，乳杆菌，链球菌，葡萄球菌，乳球菌，拟杆菌，芽孢杆菌和奈瑟菌。可用细菌特异性配体来改造所述病毒特异性配体，所述细菌特异性配体是对细菌某胞外组分具有特异性的抗体、多肽、蛋白质、肽、脂类或糖，或以上所述的组合物。也可以用抗体片段、单链抗体、F(ab)s，F(ab)2s或细菌特异性非抗体结合元件。所述细菌特异性配体还可以选自：LytA的C末端胆碱结合区，PspA的C末端结合区，溶葡萄球菌素(SPACWT)的C末端，InIB的C末端，抗S层蛋白抗体和抗肽聚糖抗体。
病毒特异性配体与细菌特异性配体可以多种方式连接，包括与此两者连接的双官能接头，均聚双官能接头或肽接头等。
本发明提供病毒特异性配体，其中的病毒特异性配体部分可以是肽、多肽、蛋白质、糖或它们的组合物。本发明病毒特异性配体还可以是抗体或选自单链抗体、F(ab)和F(ab)2的抗体片段。本发明病毒特异性配体可通过与细菌特异性配体共价结合而加以改造。
本发明病毒特异性配体可包含CD4，DC-SIGN，ICAM-1，HveC，脊髓灰质炎病毒受体，玻连蛋白受体，CD21和HveA受体序列。所述病毒特异性配体还可以是唾液酸或硫酸肝素之类糖。
本发明还提供了一种嵌合分子，即包含病毒特异性配体和细菌特异性配体的双官能分子。所述细菌特异性配体与自然寄居于粘膜上的细菌结合。
除以上所述的方法之外，本发明还包括所述嵌合分子本身。所述嵌合分子如上所述并可以制备成例如冻干制剂的干燥产物或以无菌水溶液配制的生理相容性溶液。
本发明还提供一种制造上述嵌合分子的方法，该方法包括将病毒特异性配体与细菌特异性配体连接，所述细菌特异性配体中的结合结构域可结合寄居于粘膜上的细菌，所述病毒特异性配体则结合感染性病毒颗粒。所述制造方法还包括将所述嵌合分子在无菌、药学认可溶液中溶解成单位剂型。
本发明还提供了一种将病毒颗粒与寄居于动物粘膜上的细菌结合的方法，其步骤包括让细菌与经改造可溶性病毒特异性配体接触，所述改造后配体具有对寄居于粘膜上的细菌具有特异性的细菌特异性配体，从而使得病毒颗粒可被固定于细菌上的可溶性病毒特异性配体特异性地识别。
本发明还提供了一种向鼻粘膜递送含单位剂量所述嵌合分子的生理相容性溶液的系统，该系统包括：(i)含于无菌、药学认可溶液中的嵌合分子，所述嵌合分子包含一个病毒特异性配体和一个细菌特异性配体，后者可结合自然寄居于健康粘膜上的细菌；和(ii)一个具有第一和第二末端的容器，第一末端是一个底座，用于包含溶液，第二末端是一个开口的锥形尖嘴，用于将物质和喷雾剂送入鼻腔。较好的是，所述系统中的容器其第一末端是柔性的，可将外部压力从容器传递给溶液，从而迫使液体从第二末端呈气雾状喷出。
本发明还提供一种药物组合物，包括治疗有效量的嵌合分子或通过结合细菌特异性配体加以改造的病毒特异性配体。所述药物组合物可配制成溶液、粉末、霜剂、凝胶、药膏、灌注液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、鼻喷雾剂、滴鼻液、栓剂和气雾剂。所述药物组合物也可以配制成栓剂、药垫、凝胶、糊剂、泡沫剂和喷雾剂。
                           实施方式描述A.引言
粘膜上寄居着大量共栖的细菌。如果将病毒特异性配体固定于这些粘膜寄居细菌的表面，就能显著提高这些配体的半寿期。首先，固定于粘膜寄居细菌上的可溶性病毒特异性配体被粘膜纤毛清除机制清除的可能性大大降低。这可以将例如可溶性ICAM(例如用于灭活鼻病毒)的用量从每日6次减为每日2次，大大改善了患者的顺应性，并降低了成本。而且，当病毒颗粒与固定在粘膜寄居细菌上的可溶性病毒特异性配体结合时，它们也将被固定在该细菌上(见图1)。
所述病毒特异性配体可通过细菌特异性配体固定在细菌上。所述细菌特异性配体可用于改造所述病毒特异性配体或与之缔合成为嵌合分子。所述病毒特异性配体与病毒颗粒结合，细菌特异性配体则将该病毒颗粒/病毒特异性配体复合物固定于细菌表面。
因为细菌一般大于病毒颗粒，这就可以阻止病毒进而感染宿主细胞。以此方式，仅一个与病毒特异性配体相互作用就可以消除病毒颗粒的感染性，而不需要象病毒特异性配体和病毒可自由移动时那样，病毒颗粒上有多少结合位点(例如，鼻病毒上有60个)就要有多少可溶性病毒特异性配体。
另一种潜在的中和机制是病毒干扰。与固定于硬细菌细胞壁上的病毒特异性配体结合会因造成病毒颗粒的空间变形而对某些病毒颗粒造成破坏。最后，可溶性病毒特异性配体固定于粘膜寄居细菌可减少药物的每日使用次数和每次用量，从而显著降低成本。B.定义
“抗体”是这样的蛋白质，功能上是一种结合蛋白，结构上含有一段氨基酸序列，该序列来自产生该抗体的动物的免疫球蛋白编码基因的框架区。抗体可由一条或多条多肽构成，所述多肽由免疫球蛋白基因或其片段编码。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及多变的免疫球蛋白可变区基因。轻链分κ或λ型。重链分γ、μ、α或ε型，据此将免疫球蛋白分为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
已知，典型的免疫球蛋白(抗体)结构是一个四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对各有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N端是一个约100-110左右氨基酸的可可变区，主要负责识别抗原。可变轻链(VL)和可变重链(VH)即分别指这些轻链和重链。
抗体的存在形式可以是完整的免疫球蛋白，也可以是各种肽酶消化产生的许多特征性片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区内二硫键下消化抗体，生成F(ab)′2，即Fab的二聚体，Fab本身是一条与VH-CH1通过二硫键连接的轻链。在温和条件下还原F(ab)′2，断裂铰链区内的二硫键，从而将F(ab)′2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体实际上是带有部分铰链区的Fab(见，基础免疫学，W.E.Paul编辑，Raven Press，N.Y.(1993))。虽然不同的抗体片段根据对完整抗体的消化来定义，本领域技术人员可以看出，此类Fab′片段也可以通过化学合成或重组DNA技术全合成。因此，所谓抗体在此既包括由完整抗体改造而得的抗体片段，也包括用重组DNA方法全合成的抗体片段。优选抗体包括单链抗体(以单多肽链形式存在的抗体)，尤其是单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中，可变重链与可变轻链连接成一条连续的多肽。单链Fv抗体是一种共价连接的VH-VL异二聚体，它可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达得到，所述的两段序列或者直接连接，或者通过一段肽编码接头相连。Huston等(1988)，美国科学院院报85：5879-5883。当VH与VL连接成一条单肽链时，VH与VL结构域非共价缔合。在丝状噬菌体表面表达的第一个功能性抗体分子是单链Fv′s(scFV)，然而，其他表达策略也已获得成功。例如，如果将轻链、重链之一与g3病毒衣壳蛋白融合，其互补链则输出至周质中成为可溶性分子，就能在噬菌体上展示Fab分子。两链可以由同一复制子或不同复制子编码；重要的是，每个Fab分子内的两条抗体链可在翻译后拼装，且该二聚体通过其中一链连接g3p而被包含在噬菌体颗粒内(见，美国专利5733743)。scFv抗体和许多其他结构将天然聚集但化学可分的轻链和重链多肽由V区转变成了类似于已知抗原结合位点结构的三维结构(见，美国专利5,091,513，5,132,405和4,956,778)。特别优选的抗体包括那些已在噬菌体上展示的抗体(例如scFv，Fv，Fab和二硫键连接的Fv(Reiter等(1995)蛋白质工程8：1323-1331))。抗体还包括二抗体和小抗体。
“双官能连接剂”或“双官能接头”指其一个官能团与第一分子上一个化学部分反应，另一个官能团与第二分子上一个化学部分反应的分子。双官能连接剂可用于将两个不同的分子通过所述官能团相连。
“嵌合”指两个不同来源分子的组合。“嵌合分子”是一种双官能分子，例如经改造而具有非天然结构域即细菌特异性配体的病毒特异性配体。此类分子可以通过离子健、共价键或氢键等多种机制物理缔合。
“结构域”即分子中具有特定功能特性的区域。结构域可以是蛋白质、糖类或脂类。可用多种方法来制造结构域。而且，结构域还可以来自于天然存在的分子或是其类似物。或者，结构域也可以从非天然序列聚合物分子文库中分离得到。“结构域”的例子包括“病毒特异性配体”和“细菌特异性配体”。
“配体”即能够与其他分子结合的分子。配体可以是各种具有结合特性的离子或分子，包括但不限于离子、有机分子、无机分子、肽、蛋白质、多肽、糖类、脂类和聚合物。
“病毒特异性配体”指能够结合病毒颗粒、蛋白质、糖类、脂类或非病毒感染宿主细胞所产生的表面分子的分子。当结构域结合病毒颗粒多过接合粘膜背景时，认为所述结合是特异性的。所述病毒特异性配体可包含结合病毒上分子的受体区。所述病毒特异性配体可包含表达于细胞表面的分子胞外区，这些区域负责着分子结合病毒颗粒的能力。例如，病毒特异性配体可能存在于CD4之类分子中，CD4对于HIV与细胞的结合至关重要。病毒特异性配体也可以从肽组合文库或某病毒血清阳性患者的编码序列文库中筛选得到。病毒特异性配体可以是抗体(例如单链抗体、抗体、Fab及其他抗体片段)，肽和有机小分子。实际上，可从任何来源鉴定或分离得到病毒特异性配体，只要所述配体具有结合病毒分子或病毒颗粒的能力。病毒特异性配体可以是有机分子和无机分子。此类分子可以通过筛选文库获得。
“细菌特异性配体”指可与细菌表面(包括细胞膜和细胞壁)上的蛋白质、糖或脂类相互作用或结合的分子。当配体结合靶细胞多过结合粘膜背景时，认为所述结合是特异性的。细菌特异性配体也可以从肽组合文库或细菌、哺乳动物、病毒或植物的核酸序列文库中筛选得到。细菌特异性配体可以是抗体(例如单链抗体、抗体、Fab及其他抗体片段)，肽和有机小分子。实际上，可从任何来源鉴定或分离得到细菌特异性配体，只要所述配体能够结合细菌分子或细菌。细菌特异性配体可以是有机分子和无机分子。此类分子可以通过筛选文库获得。
“半寿期”指动物或动物组织从自体中清除50％某特定物质所需的时间。
“经改造而结合”在描述病毒特异性配体时表示病毒特异性配体以一种特殊方式结合或附着于细菌上，从而使得改造后的病毒特异性配体的结合量比受控实验条件下的非改造病毒特异性配体高至少2倍。
“健康粘膜上的天然寄居者”指动物粘膜上常见的微生物，例如细菌，但它们对其宿主没有致病性。
“粘膜”指机体内各种管型腔(例如肠道、子宫、气管等)内的内衬组织层。它包括一层含各种单细胞粘膜腺的上皮细胞和其下的一层细隙和淋巴组织，中间由基底膜隔开。即使在宿主健康时，粘膜上也通常聚居着多种细菌。
“肽接头”或“肽连接”指两分子间通过一个氨基酸的氨基(NH3 +)与另一氨基酸的羧基(COO-)共价结合而形成的连接。这样的连接不一定发生在多肽骨架上，它们也可以由各种氨基酸的官能团形成，例如天冬氨酸和谷氨酸等的COO-官能团和赖氨酸或精氨酸等的NH3 +官能团。本领域技术人员还可以看出，肽接头并不限于肽键本身，而是可以包含连接两分子的其他氨基酸或其后化学成分。
“生理相容性溶液”指接触患者时对其无害的溶液。
“可溶性病毒特异性配体”指可在溶液中游离存在，且不与天然细胞或其来源体结合的病毒特异性配体。当它们存在于水性溶液中时，可以呈悬浮、部分溶解或完全溶解状态。
分子的“可溶性”是指它能够以游离形式存在于溶液中。
“无菌”指溶液中病毒、活的细菌和真菌含量极低，符合FDA有关可接触人体组织的无菌溶液要求的溶液。
细菌“表面”指其胞外基质，细胞壁和细胞膜。
“单位剂量”或“单位剂型”指药物制剂中活性成分含量已定。
“病毒特异性配体”指与病毒相互作用的例如多肽或糖等分子。有些病毒特异性配体由细胞表达并结合病毒颗粒，从而使病毒进入该细胞。“病毒特异性配体”可从肽文库或化合物文库中筛选得到。而且，“病毒特异性配体”并不一定与宿主细胞的序列同源。当所述病毒特异性配体成为本发明嵌合分子的一部分时，它将结合并保留病毒颗粒，从而阻止它们继续结合其靶宿主细胞开始其感染过程。C.本发明的病毒特异性配体
本发明的病毒特异性配体包括能够结合病毒，从而将病毒导向感染部位的胞外蛋白质或其部分，以及各种胞外基质组分或其部分。所述病毒特异性配体可以是且不限于多肽、糖多肽、糖、蛋白质、肽、脂类、有机分子、无机分子或它们的组合物。表I例举了含病毒特异性配体的分子。本领域技术人员可以看出，表I并非穷举，因此，本发明并不限于表I所列。DC-SIGN分子是一种树状细胞(DC)特异性分子，最近被发现是HIV的又一受体(Geijtenbeek等，细胞100：587-597(2000))。此外，例如结合埃博病毒(EBV)的CD21受体和IgA受体等也含有病毒特异性配体。
本发明适用病毒特异性配体的鉴定需要分离特定的病毒，并鉴定哪些宿主组分与病毒相互作用从而使病毒可结合并停留于这些细胞上。本领域技术人员可以看出，本发明方法不仅包括已发现的病毒特异性配体，而且还包括将会找到的病毒特异性配体。
                        表I
 病毒 病毒特异性配体
 人鼻病毒(HRV)，主族 ICAM-1
 流感病毒A 唾液酸
 腺病毒 玻连蛋白
 埃博病毒(EBV) CR2(C3受体)
 I型单纯性疱疹病毒(HSV I) 硫酸肝素/HveA/HveC
 II型单纯性疱疹病毒(HSV II) 硫酸肝素/HveA/HveC
 脊髓灰质炎病毒 脊髓灰质炎病毒受体(PVR)
乙型肝炎 唾液酸糖蛋白
人免疫缺陷病毒(HIV) CD4，CXCR4，CCR5，DC-SIGN
也可以通过筛选肽或小分子文库来鉴定病毒特异性配体(有关与各种靶相互作用的小分子的分离可参见例如Howwell D.等，免疫药物学33(1-3)：68-72(1996)；Dower W.，现代化学与生物学2(3)：328-34(1998))。通常，此类化合物文库为有机小分子，无机小分子和肽。实际上，任何化合物都可能用作本发明的病毒特异性配体。常用的是可溶于水溶液或有机溶液(尤其是DMSO型溶液)的化合物。可将病毒特异性配体筛选试验设计成：自动地按步骤筛选大型化合物文库，并且多试验平行进行(例如，以机器人试验方式在微滴板上进行微滴定模式的试验)。可以看出，化合物可来自许多生产商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，Fluka Chemika-Biochemica Analytika(BuchsSwitzerland)等。
病毒特异性配体的大处理量筛选法包括提供一个包括大量潜在病毒特异性配体化合物的组合化合物或肽文库。所谓组合性化合物文库是指将化学合成或生物合成的化合物，通过化合物“基元”组合而成的集合。例如，一个线性化合物(例如多肽)文库由一组化合物基元(氨基酸)在给定化合物长度范围(即多肽化合物内的氨基酸数)内的所有排列组合构成。通过这种化合物基元的组合性混合可合成无数化合物。
制备和筛选组合性化合物文库是本领域的已知技术。这样的化合物文库包括但不限于肽文库(参见美国专利5,010,175，Furka，国际肽及蛋白质研究杂志37：487-493(1991)和Houghton等，自然354：84-88(1991))。也可以采用建立化合物多样性文库的其他化学方法。此类化学方法包括但不限于：拟肽(例如PCT公开号WO91/19735)，编码肽(例如PCT公开号WO93/20242)，随机生物寡聚物(例如PCT公开号WO92/00091)，苯并二氮杂草(例如美国专利5,288,514)，例如乙内酰脲、苯并二氮杂草和二肽等多样体(diversomers)(Hobbs等，美国科学院院报90：6909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等，美国化学协会杂志114：6568(1992))，以葡萄糖为骨架的非肽类肽类似物(Hirschmann等，美国化学协会杂志114：9217-9218(1992))，小化合物文库的有机类似物合成法(Chen等，美国化学协会杂志116：2661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(Cho等，科学261：1303(1993))，和/或磷酸肽酯(Campbell等，有机化学杂志59：658(1994))，核酸文库(Ausubel等，同上，Berger和Sambrook，同上)，肽核酸文库(美国专利5,539,083)，抗体文库(Vaughne等，自然与生物技术14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖类文库(Liang等，科学274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，有机小分子文库(例如苯并二氮杂草，Baum C & EN，1月18，p.33(1993))；类异戊二烯(美国专利5,569,588)；噻唑烷酮(thiazolidinone)和间噻唑酮(metathiazanone)(美国专利5,549,974)；吡咯烷(美国专利5,525,735和5,519,134)；吗啉基化合物(美国专利5,506,337)；苯并二氮杂草(美国专利5,288,514)等。
制备组合文库的设备可以购买得到(例如，357MPS，390MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A应用生物系统，FosterCity，CA，9050Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，许多组合文库本身可以购买得到(例如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，MartekBiosciences，Columbia，MD.等)。
然后，可在一个或多个试验中对这些“组合性化合物文库”或“配体文库”进行筛选，鉴定出具有所需病毒特异性配体活性的文库成员(即化合物种类或亚类)。鉴定病毒特异性配体的试验包括免疫学方法(例如ELISA)，放射学方法，荧光法，比色法等。这些方法都是本领域熟知的。可将由此鉴定出的化合物作为常规“前导配体(lead ligands)”或以其本身作为病毒特异性配体。
鉴定到结合病毒颗粒或病毒分子的病毒特异性配体后，即可将它们与细菌特异性配体连接(见后文)形成针对粘膜寄居细菌的嵌合分子。也可以从噬菌体展示文库中筛选病毒特异性配体。D.细菌特异性配体
本发明的细菌特异性配体包括能够特异性结合粘膜上菌群的分子组分或其组成部分。表II例举了聚居于正常健康粘膜上的代表性菌种。所列的菌属或菌种可以选来用作细菌特异性配体的结合靶群。所列并非穷举，因而不是本发明的范围限定。
               表II  人常粘膜天然寄居细菌
    鼻/咽     阴道     结肠/直肠
链球菌属 乳杆菌属 拟杆菌属
轻型链球菌 L.jensensii 芽孢杆菌属
卵圆链球菌 L.crispatus
唾液链球菌 酶乳乳杆菌
肺炎链球菌 干酪乳杆菌
葡萄球菌属 棒状杆菌属
表皮葡萄球菌 葡萄球菌属
金黄色葡萄球菌 链球菌属
奈瑟菌属
乳球菌属
显然，细菌特异性配体在与病毒特异性配体融合后应保留其结合性。以下是4类主要的细菌特异性配体及其实例。这些细菌特异性配体可以是任何类型的分子，包括肽、糖肽、糖、脂类。
i.细菌细胞壁靶向序列
许多细菌分泌蛋白质会结合于自身细胞的表面(例如，自溶素，参见Garcia，J.L.等，1994，细菌学杂志，176，4066-4072(1994)；Wren，B.W.，1991，分子微生物学，5，797-803；Braun等，1997，分子微生物学，25，285-294)或特定的靶细胞(例如溶葡萄球菌素，参见Baba，T.& Schneewind，O.，1996，欧洲生物学杂志，15，4789-4779和Baba，T.& Schneewind，O.，1998，欧洲生物学杂志，17，4639-4646。
通常，靶特异性由这些分子的C末端决定(Garcia，J.L.等，1994(同上)和Wren，1991(同上)中又称细胞壁靶向序列)。了解最多的是特异性结合胆碱的分子，胆碱是肺炎链球菌和其他一些细菌(卵圆链球菌)细胞壁的组成之一。这些分子包括LytA和LytB。其他细菌结合性分子包括靶向于单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogene)和芽孢杆菌的InIB(Braun等(同上))和靶向于金黄色葡萄球菌的溶葡萄球菌素(Baba，1996，(同上)和Baba，1998，(同上))。也可用这些分子的C末端(靶向)结构域来制造结合上述特定细菌的嵌合分子。
例如，可将ICAM-1(人鼻病毒受体，主族)的一个结构域通过基因工程方法与溶葡萄球菌素的靶向结构域融合。于是可产生特异性结合鼻粘膜上葡萄球菌的嵌合分子。这可以显著延长此类嵌合分子在鼻粘膜上的半寿期。
也可用LytA或PspA的靶向序列将嵌合分子ICAM-1导向链球菌和葡萄球菌。
显然，自然界还存在着许多此类细胞壁靶向序列。随着越来越多的特异性结合细菌表面的蛋白质被发现，通过对这些分子的剪截可以测定它们的细胞壁靶向序列以及基本保留细胞壁靶向性的最小结构域。可按照本发明对这些序列加以利用，尤其是针对所研究粘膜上大量存在的细菌的那些序列。
ii.细菌细胞壁片段的特异性抗体片段
可对抗体，尤其是单链抗体片段(scFv)进行靶特异性筛选，然后用多种表达系统(包括细菌，例如烟草等植物)大量产生。用这些系统来筛选对共同的细菌细胞壁结构具有特异性的scFv片段。一旦鉴定到这些抗体，就可将它们与后文所述的病毒特异性配体结合。虽然优选scFv，但诸如Fab或Fab′等其他抗体片段也可用于细菌靶向。也可用完整抗体。
许多细菌细胞壁组分是已知的，并适合作为嵌合分子的靶。例如，肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞壁都有的组分之一(Baron，S.，医学微生物学，第三版，1991，p.48)，适合作为本发明scFv分子的靶。包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的许多细菌都分泌S层蛋白质，它们会自动聚集成围绕细菌的S层(Singleton，P.和Sainsbury，D.，微生物学和分子生物学辞典，第2版，1994，p.783；微生物学粘度回顾，37：311-339(1983))。因此，S层蛋白质适合作为本发明scFv分子的靶。
iii.细菌特异性筛选所得的肽或小分子
也可在肽或小分子文库中筛选对前述靶细菌的特异性(有关与各种靶作用的小分子的分离可参见Horwell D等，免疫药物学33(1-3)：68-72(1996)；Dower W.，当代化学与生物学观点2(3)：328-34(1998))。与前述方法类似，可以通过筛选组合性小分子文库和肽文库来鉴定细菌特异性配体。一旦鉴定到结合细菌的小分子，就可将它们与本发明的病毒特异性配体结合，生成针对粘膜寄居细菌的嵌合分子。与细菌细胞壁靶向序列和scFv相比，这些小分子的优点在于更小，因而可减少发生不需要的宿主免疫应答的机会。
iv.糖类细菌特异性配体
可用糖类作为细菌特异性配体。例如，已知细胞上的糖成分可结合称为粘附素的一类细菌蛋白(有关粘附素，可参见Soto等，细菌学杂志(1999)181：1059-1071；St.Geme，儿科进展(1997)44：43-72；Ljungh等，FEMS免疫学和医学微生物学(1996)，16：117-126；Ljungh和Wadstreom，实验医学和生物学进展(1996)408：129-140)。细菌粘附素的靶一般是糖蛋白和糖脂上的糖成分。例如，大多数大肠杆菌表达甘露糖特异性粘附素，但有些还表达半乳糖特异性粘附素(Wold等，感染与免疫(1988)56：2531-2537)。因此，可将甘露糖和半乳糖作为某些大肠杆菌的糖类配体。而且，有些乳杆菌也表达甘露糖特异性粘附素(Adlerberth等，应用环境微生物学(1996)62：2244-2257)。
表III例举了适合本发明的细菌特异性配体。本领域技术人员可以看出，表III并非穷举，并不是本发明范围的限定。
                       表III
配体 靶
LytA/PspA(C末端) 肺炎链球菌(胆碱)
卵圆链球菌
InIB(C末端) 单核细胞增多性李斯特菌
芽孢杆菌
溶葡萄球菌素(SPACWT) 金黄色葡萄球菌
抗肽聚糖抗体片段 所有革兰氏阳性菌
S层蛋白质特异性抗体片段 某些乳杆菌和其他革兰氏阳性菌
E.本发明嵌合分子
本发明嵌合分子至少包括两部分：结合病毒颗粒的病毒特异性配体和将病毒特异性配体导向粘膜寄居细菌的细菌特异性配体。本发明可用抗体作为病毒特异性配体。可对抗体，尤其是单链抗体片段(scFv)进行靶特异性筛选，然后用多种表达系统(包括细菌和例如烟草等植物)大量产生。用这些系统来筛选病毒抗原，蛋白质，脂质和糖特异性的scFv片段。一旦鉴定到这些抗体，就可将它们与后文所述的病毒特异性配体结合。虽然优选scFv，但诸如Fab或Fab′等其他抗体片段也可用来连接病毒特异性配体。也可用完整抗体。许多病毒分子是已知的，并适合用作病毒特异性配体的靶。克隆识别病毒抗原(例如麻疹病毒抗原)的IgG序列的方法是已知的(Burgoon等，免疫学杂志163：3496-3502(1999)。以下详细描述在噬菌体展示文库中鉴定抗体的方法。
i.生产嵌合分子的基因工程方法
制备本发明的嵌合分子可通过：分离相应嵌合成员(病毒特异性配体和细菌特异性配体)的编码核酸，然后将它们连接并表达融合分子。也可以通过化学(共价)连接或非共价连接将成员分子结合在一起。
a.重组DNA的分离和操作
分离和操作重组DNA是常规方法。讲述本发明所用一般方法的基本教科书包括Sambrook等的分子克隆实验室手册(第2版，1989)；Kriegler，基因转移与表达实验室手册(1990)；和现代分子生物学方法(Ausubel等，1994)。
通常，从cDNA和基因组DNA文库获得编码各嵌合成员或结构域的核酸序列，或用寡核苷酸引物扩增技术分离得到。为了建立cDNA文库，应选择富含靶mRNA的原料。然后，用逆转录酶将mRNA转录成cDNA，将其连接到重组载体中，转染到重组宿主内进行扩增、筛选和克隆。建立和筛选cDNA文库的方法是熟知的(例如可见Gubler & Hoffman，基因25：263-269(1983)；Sambrook等(同上)；Ausubel等(同上))。
为了建立基因组文库，从组织中提取DNA，用机械剪切或酶消化产生约12-20kb的片段。然后通过梯度离心分离去除大小不合适的片段，然后构建在λ噬菌体载体中。这些载体和噬菌体体外包装。用Benton & Davis，科学196：180-182(1977)所述的噬菌斑杂交法分析重组噬菌体。
分离病毒特异性配体/细菌特异性配体嵌合分子任一部分编码核酸的另一种方法是将合成寡核苷酸引物与RNA或DNA模板扩增联用(美国专利4,683,195和4,683,202；PCR方法与应用指南(Innis等，1990))。可用诸如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)等方法直接由mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增编码融合成员的核酸序列。可设计寡核苷酸引物来扩增编码已知序列的核酸。
也可以用噬菌体展示技术鉴定肽型病毒特异性配体或细菌特异性配体(Smith，G.P.，科学，228：1315-1317(1985))。简而言之，可将组合性肽序列克隆到噬菌体载体中，生成与噬菌体衣壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体表面(有关噬菌体展示方法可参见Kay等，肽和蛋白质的噬菌体展示(1996))。与衣壳蛋白融合的外源蛋白可用于与底物结合，因此可对噬菌体文库进行筛选，研究所述外源蛋白与所研究配体的结合能力。本发明中，噬菌体文库可编码抗体片段(例如Fab)，单链抗体，组合肽，天然序列，或它们的组合物。
噬菌体展示技术已被用于鉴定病毒特异性配体。例如，已用噬菌体展示技术鉴定了HIV-1，RSV(呼吸性合胞病毒)和I、II型单纯性疱疹病毒的高亲和力抗病毒人抗体(Barbas和Burton，生物技术趋势，14：230-234(1996))。构成噬菌体展示文库的序列可以来自所研究病毒血清阳性的个体(Bjorling等，基因与病毒学杂志80：1987-1993(1999))。例如，可从一长期无症状HIV阳性患者的IgG1κ序列噬菌体展示文库中鉴定到与HIV-1表面糖蛋白gp120反应的人Fab片段(Barbas等，分子生物学杂志230：812-823(1993))。也可以用噬菌体展示技术筛选随机化和部分随机化的肽文库来鉴定结合HIV-1衣壳糖蛋白gp120的Fab肽(Ferrer和Harrison，病毒学杂志73：5795-5802(1999))。可将鉴定所得噬菌体的核酸序列克隆，并用作病毒特异性配体。
一旦分离得到编码嵌合分子两组分的核酸序列，就可以将它们融合成编码嵌合分子的连贯序列。通常，用包含了限制酶位点的扩增引物扩增两组分，使它们能够按所需方向剪接(Ausubel等，现代分子生物学方法，第1-3卷，John Wiley &Sons，Inc.(1994-1998))。
在优选实施方式中，本发明的病毒特异性配体/细菌特异性配体嵌合体用重组核酸技术合成。在形成了编码病毒特异性配体/细菌特异性配体的基因后，将其连接到受合适启动子控制的表达盒中，在宿主中表达该蛋白质，分离出所表达的蛋白质，视需要将其复性。实施以上过程的全部技术可参见Sambrook等的分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，(1989)或Ausubel等。
最后，可用合成寡核苷酸来构建表达本发明嵌合蛋白质的重组基因。可用自动化合成仪(Van Devanter等，核酸研究12：6159-6168(1984))，按照固相亚磷酰胺三酯法(Beaucage & Caruthers，Tetrahedron letts.22：1859-62(1981))化学合成寡核苷酸。用非变性丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC(Pearson & Reanier，层析杂志255：137-149(1983))纯化寡核苷酸。
具体地说，该方法用一系列代表基因有义链和反义链的40至120bp重叠寡核苷酸进行。然后，将这些DNA片段退火，连接，克隆。也可以用精准引物通过扩增方法扩增所研究基因的一段特定序列。然后将该特定序列连接到表达载体内。
克隆后，可用例如双链模板测序的链终止法(Wallace等，基因16：21-26(1981))验证所克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
b.重组核酸表达的方法
将所需基因克隆后就可以表达获得嵌合分子或其组分。为了实现克隆基因的高水平表达，通常将所需基因(例如嵌合体成员)亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子，转录/翻译终止子，如果是编码蛋白质的核酸则还有启动翻译的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的，可参见Sambrook等和Ausubel等。表达蛋白质的细菌表达系统可以获得，例如大肠杆菌，杆菌属和沙门氏菌(Palva等，基因22：229-235(1983)；Mosbach等，自然302：543-545(1983))。有市售的这些表达系统的试剂盒。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞类真核表达系统是本领域熟知的，而且有市售的。
选择启动子指导异源核酸的表达需根据具体用途。启动子到异源转录起始位点的距离最好与它在原环境中到转录起始位点的距离相同。然而，诚如所知，该距离可以有一定的改变，这不会降低启动子的功能。
除启动子外，表达载体通常还含有一个转录单元或表达盒，其中包含了在宿主细胞中表达嵌合成员编码核酸所需的所有其他元件。因此，一个典型的表达盒包含与编码嵌合成员或嵌合分子的核酸序列操作性连接的启动子，转录产物有效聚腺苷酸化所需的信号，核糖体结合位点和翻译终止子。在构建物中还可以包含一段可切除的信号肽序列，用于促进转化细胞分泌编码蛋白。表达盒的其他元件包括增强子，如果用基因组DNA作为结构基因，则还含有带功能性剪接供体和受体位点的内含子。
表达载体内的元件一般还包括在大肠杆菌内有效的复制子，编码抗生素抗性以便挑选出含重组质粒的细菌的基因，和位于质粒非必需区内用来插入真核序列的独特限制位点。具体抗生素抗性的选择并不重要，任何已知抗性基因都可以。如果必要，最好选择原核序列以防干扰真核细胞内DNA的复制。
将外源核苷酸序列引入宿主细胞的各种已知方法都可用。这包括磷酸钙转染，Polybrene，原生质体融合，电穿孔，脂质体，显微注射，血浆载体，病毒载体，以及其他各种将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传物质引入宿主细胞的方法(例如Sambrook等，同上)。
c.纯化本发明多肽的方法
可用标准技术将所述嵌合成员或嵌合分子纯化到基本纯，所述技术包括用硫酸铵等进行的选择性沉淀；柱层析，免疫纯化等(见，Scopes，蛋白质纯化原理与实践(1982)；美国专利4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。
可用许多方法来纯化重组融合蛋白或融合成员。例如，可将已知具有分子粘附性的蛋白质与嵌合成员或嵌合分子可逆融合。由于该合适的配体，嵌合成员或嵌合分子可选择性地吸附到纯化柱上，然后以较纯的形式洗出。然后酶促去除该配体。最后，可用免疫亲和柱纯化嵌合成员或嵌合分子。
ii.生成嵌合分子的非基因工程方法
本发明的嵌合分子可用多种方法制备。这些嵌合分子主要由病毒特异性配体与细菌特异性配体组成。可溶性病毒特异性配体与细菌特异性配体可通过共价键或离子相互作用和氢键相连。此外，本领域技术人员不难看出，所述病毒特异性配体和细菌特异性配体还包含例如抗体等其他分子，或包含在例如脂质体的其他分子中，协助将病毒特异性配体或嵌合成员导向要研究的靶位点。
a.病毒特异性配体与细菌结合蛋白的化学偶联
本发明实施方式之一中，可溶性病毒特异性配体通过共价键与细菌特异性配体化学偶联。分子化学偶联的方法是本领域熟知的。例如可见美国专利5,856,125关于分子偶联方法的论述。将病毒特异性配体与细菌特异性配体结合的方法根据细菌配体的化学结构而不同。多肽通常含各种官能团，例如羧酸(-COOH)或游离胺(-NH2)基团，它们可以与病毒特异性配体或细菌靶向蛋白上的相应官能团反应。也可以对多肽进行衍生从而结合上其他反应性官能团。
“接头”在此指用来将可溶性病毒特异性配体与细菌粘膜表面蛋白相连的分子。所述接头能够与病毒特异性配体和细菌特异性配体形成共价键。合适的接头是本领域熟知的，包括但不限于直链或支链碳接头，杂环接头或肽接头。当病毒特异性配体与细菌特异性配体都为多肽时，接头可与组分氨基酸通过它们的侧基(例如与半胱氨酸的二硫键)相连，或可与末端氨基酸α-碳氨基和羧基相连。
此外，还可用双官能接头形成所需偶联体，此类接头的一个官能团与特定配体上的基团反应，另一个官能团与核酸结合分子反应。也可以通过对细菌靶向蛋白或病毒特异性配体进行化学处理来进行衍生。例如，对糖蛋白的化学处理包括用高碘酸盐对糖部分进行二醇剪切，产生游离醛基。糖蛋白上的该游离醛基可与其他反应物上的游离氨基或肼基反应从而与之结合(见美国专利4,671,958)。另一个例子中，可以在多肽上形成游离巯基(见美国专利4,659,839)。
也可以用例如马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯等异双官能接头作为选择性连接(见美国专利5,851,527)。马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯与病毒特异性配体蛋白质的反应会将蛋白质上的氨基衍生化，然后，该衍生化的氨基可与例如含游离巯基的细菌配体蛋白反应。还已知许多其他将各种化合物与蛋白质结合的方法和接头分子。例如可参见欧洲专利申请188,256；美国专利4,671,958；4,659,839；4,414,148；4,699,784；4,680,338；4,569,789；5,856,571；5,824,805；5,470,997；7,470,843；5,470,932；5,843,937和4,589,071；以及Borlinghaus等，癌症研究47：4071-4075(1987)。
b.融合蛋白的制备
当病毒特异性配体和细菌特异性配体都是较短的蛋白质时，可用标准肽合成技术合成单链连贯多肽形式的嵌合分子。也可以分别合成病毒特异性配体和细菌特异性配体，然后通过一分子的氨基末端与另一分子的羧基末端缩合形成肽键而融合。也可以将病毒特异性配体和细菌特异性配体各自与间隔肽分子的末端之一缩合，从而形成一条连贯的融合蛋白。
也可以用固相合成法生成融合蛋白，其中，将序列的C末端氨基酸固定于不溶性的支持相上，然后依次加上序列中的其他氨基酸。固相合成技术可参见Barany和Merrifield，的“固相肽合成”；肽的分析、合成与生物学，第二卷，pp.3-284：肽合成的特殊方法，A部；Merrifield等，美国化学协会杂志85：2149-2156(1963)，和Stewart等，固相肽合成，第2版，Pierce Chem.Co.，Rockford，III(1984)。
虽然病毒特异性配体与细菌特异性配体经常直接相连，本领域技术人员可以看出，两分子可以用含一个或多个氨基酸的肽间隔基隔开。通常，间隔基除了连接蛋白质以保留彼此间基本距离或其他空间关系之外没有特定生物活性。然而，间隔基中氨基酸的选择也会影响分子的某些特性，例如折叠，净电荷，或疏水性等。
表达后，重组嵌合融合蛋白可用标准方法纯化，例如硫酸铵沉淀，亲合柱，柱层析，凝胶电泳等(R.Scopes，蛋白质纯化，Springer-Verlag，NY(1982)，Deutscher，酶学方法，第182卷：蛋白质纯化指南，Academic Press，Inc.，NY(1990))。用于本发明方法，优选的是约50-95％均匀性的基本纯组合物，80-95％或以上均匀性最好。
本领域技术人员可以看出，化学合成、生物表达和/或纯化后，本发明的融合分子的构象会完全不同于其成员多肽原来构象。此时，一般需要将多肽变性还原，然后重新折叠成优选构象。还原和变性蛋白质并诱导重新折叠的方法是本领域熟知的(例如，Debinski等，生物化学杂志，268：14065-14070(1993))；Kreitman和Pastan，生物偶联化学，4：581-585(1993)；和Buchner等，生物化学年报，205：263-270(1992))。最后，可通过标准层析技术从功能性嵌合分子中分离去除非功能性嵌合分子，这些技术可逆并选择性地结合功能性嵌合分子，而让非功能性嵌合分子通过。
c.病毒特异性配体对细菌结合蛋白的免疫导向
也可通过免疫靶向将病毒特异性配体导向细菌粘膜表面。众所周知，抗体或抗体片段可与多种分子偶联(例如，与多肽、放射性同位素、药物、毒素等)，从而将这些分子引向特定部位(例如，美国专利4,046,722；4,699,784；4,332,647；4,348,376；4,361,544；4,468,457；4,444,744；4,460,459；4,624,846；5,698,178；5,057,313和4,460,561)。可用此类抗体将病毒特异性配体直接导向靶细菌，或作为接头将其与细菌特异性配体相连，然后将病毒特异性配体导向粘膜上的细菌。
较好的是将病毒特异性配体与抗体共价结合(美国专利5,851,527)。所述结合可以是直接结合，或通过一段短或长接头结合，并通过抗体和/或酶上的一个或多个官能团(例如胺、羧基、苯基、巯基或羟基)发生。各种常用接头都可使用，例如二硫氰酸酯，二异硫氰酸酯，二(羟基琥珀酰亚胺)酯，碳二亚胺，马来酰亚胺-琥珀酰亚胺酯，戊二醛等，以及前文所述其他接头。
如果病毒特异性配体是蛋白质，将抗体与之结合的一个简便方法是在戊二醛存在下将抗体与之混合，形成抗体-蛋白质偶联体。最初的Schiff碱连接可通过例如用硼氢化物还原成仲胺来稳定化。也可用二异硫氰酸酯或碳二亚胺替代戊二醛。
用例如马来酰亚胺-琥珀酰亚胺酯之类异双官能接头实现选择性更高的连接。所述酯与酶的反应会将病毒特异性配体上的氨基衍生化，然后，该衍生物可与含游离巯基的抗体Fab片段(或连有巯基的更大片段或完整免疫球蛋白，利用Traut′s试剂)反应。
宜将病毒特异性配体连接于抗体上距离抗原结合位点较远的位点。这可以如前所述通过与剪切所得的链间巯基连接来实现。其他方法包括将羧基部分已氧化的抗体与含有至少一个游离氨基的病毒特异性配体反应，于是生成一个初期Schiff碱(亚胺)连接，最好通过硼氢化还原反应将其还原成仲胺，从而形成最后的偶联物。
考虑到大小，偶联物宜包含一个抗体与一个病毒特异性配体分子相连。然而，为了提高与靶抗原结合的亲和力和效率，也可能优选将多个抗体片段例如Fab或F(ab)′2片段与一个病毒特异性配体相连。如果病毒特异性配体不是太大，也可以将多个病毒特异性配体与一个抗体或抗体片段相连。也可以采用一个以上病毒特异性配体和抗体的偶联物，条件是它们能够到达靶位点，而且从粘膜上清除不是太快。也可使用不同大小偶联物的混合物，或含有聚集体的偶联物，需注意的条件是相同的。F.嵌合分子与粘膜寄居细菌结合以及病毒固定化的检测
制得嵌合分子后必需检测其与粘膜寄居细菌结合的效率。以下描述了几种检测嵌合分子结合性的方法。
将嵌合分子与靶细菌混合，使之与细菌表面结合。经洗涤后，至少可用两种常用方法检测结合于细菌表面的嵌合分子。可加入对病毒特异性配体具有特异性的抗体，使之与嵌合分子结合。可用荧光标记(例如FITC或PE)的第二抗体通过FACS分析或荧光显微镜观察与细菌结合的抗体。例如，将CD4(HIV受体)导向乳杆菌的嵌合分子与相应的细菌混合。洗涤细菌，与FITC-标记的抗CD4抗体一起孵育，再次洗涤，然后用流式细胞计数仪分析。FITC通道内的荧光标记细菌(FL1)反映每个细菌结合的FITC-偶联抗体的相对量，该值与结合嵌合分子数成正比。也可在UV光下用显微镜观察细菌。每个细菌周围的荧光反映嵌合分子结合于细菌表面。
为了检测细菌嵌合蛋白复合体结合或固定病毒的能力，可用完整病毒或病毒特异性配体本身来测定受体结合作用。例如，在以上CD4例子中，用合适的染料标记CD4的配体gp120，然后检测gp120与带嵌合分子或不带嵌合分子的细菌的相对结合性。也可以将染料与抗gp120抗体相连，用于检测相对结合性。
合适的结合是指：细菌与嵌合分子的结合具有充分的选择性，使得所述结合比非改性病毒特异性配体与细菌表面的结合高至少2倍。以非改性细菌为对照，如果病毒结合是背景水平的2倍，则为合适的病毒结合。两种检测都称采用了具有充分科学性的方法和原理来控制随机误差。G.本发明的药物制剂
本发明的嵌合分子适合配制成药物制剂的形式。可将嵌合分子与与肽相容的药学认可赋形剂混合。合适的赋形剂包括水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，以及它们的混合物。所述嵌合分子还可以与诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂等辅剂混合以增强嵌合分子的吸收。
更具体地说，本发明嵌合分子可与各种本领域已知的溶液和其他化合物混合。例如，其给药形式可以是包含在水、盐水或缓冲液中的单位剂型。
本发明制剂中嵌合分子的最终浓度宜在0.2-200μg/ml之间，以5-50μg/ml为佳，10-30μg/ml更好。配制后，可将嵌合分子装入无菌容器，然后密封保存于低温，例如4℃，也可将其冷冻干燥，直至临用前才重悬于合适的缓冲液中。冷冻干燥可以实现嵌合分子以稳定形式长期保存。
适合阴道给药的制剂包括例如霜剂、凝胶、栓剂或药塞。例如，美国专利5,840,685讲述了一种阴道内给药的药物组合物，其中包含一种吸收促进剂，例如阴离子型或阳离子型表面活性剂，和一种脂肪族羧酸。可以在所述组合物中加入动物蛋白(如牛血清白蛋白)或植物蛋白以增强活性成分的稳定性。配制阴道制剂的其他方法可参见美国专利4,659,969，4,670,419，4,609,640和3,917,825。
栓剂、粘合剂和载体可以包含例如聚烷二醇或甘油三酯。口服制剂可包含例如药用糖精、纤维素和碳酸镁等常用赋形剂。这些组合物的形式可以是溶液、悬浮液、片剂、丸药、胶囊、缓释剂或粉剂，其中含10-95％嵌合分子。
可将本发明嵌合分子配制成通过鼻腔给药的制剂。采用固体载体的鼻给药制剂包括粒径约10-500μm之间的粗粉。也可采用载体为液体的合适制剂。H.剂型
本领域技术人员可以看出，将本发明制剂施加到粘膜上可通过多种方式进行。然而，较好的是，本发明药物制剂施加于粘膜上后，本发明的病毒特异性配体可与机体不同粘膜上各自的靶相互作用。例如，可经鼻、口服、用栓剂或阴道灌洗给予所述制剂。
除其他多种方法外，本发明嵌合分子的药用可通过鼻给药进行。各种鼻给药方法是本领域熟知的。可将鼻用药物制剂配制成盐溶液，并采用苄基醇或其他合适的防腐剂，促进生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物，和/或其他本领域已知的增溶剂或分散剂。合适的液体制剂可以鼻喷雾剂、滴鼻液，或用喷雾器以气雾剂的形式给予，这包括所述活性成分的水溶液或油溶液。
递送鼻喷雾剂的装置是已知的。典型的是可容纳液体的手持容器(5)(图2)。优选容器有两端，其中一端为柔性底(6)，另一端为尖嘴(7)，尖嘴(7)为钝锥形，末端开口，与底部流体相通(图2)。该钝锥使得尖嘴和开口可部分进入鼻孔。当挤压柔性底时，一定量的气雾流就从尖嘴口(8)喷入鼻腔，于是被吸入并递送到鼻粘膜(图2)。
鼻用粉剂以吸气的方式给予，即将装有粉剂的容器靠近鼻子，然后迅速将其中的粉剂吸入鼻腔。有关多肽的鼻给药，还可参见以下专利：美国专利5,877,163，5,846,978，5,747,445，5,663,169，5,578,597，5,502,060，5,476,874，5,413,999，5,308,854，5,192,668和5,187,074。
阴道给药的制剂可以是阴道栓剂、药塞、霜剂、凝胶、糊剂、膏药、泡沫剂或喷雾剂形式，其中除活性成分外还含有本领域已知的合适的赋形剂。
直肠给药一般采用栓剂。此类栓剂所用的各种组合物可参见例如美国专利5,859,048和5,759,566。
口服给药可采用漱口液的形式。
给药效率取决于许多因素，其中包括活性成分与粘膜的接触世间。
以下实施例是描述而非限定。本领域技术人员不难看出，许多非关键参数是可变的，并可获得近似的效果。实施例实施例1：ICAM-SPACWT(基因融合)
表达含ICAM-1的1区和2区(人鼻病毒HRV主族的基本受体(见例如Casasnovas，J.M.和Springer，T.A.，病毒学杂志68：5882-5889(1994)；CasasmovasJ.M.等人，病毒学杂志72：6244-6246，1998)的多肽，形成与溶葡萄球菌素C末端结构域SPACWT(见例如Baba，T.和Schneewind，O.，欧洲生物学杂志15：4789-4797(1996)和17；4639-4649(1998))的融合蛋白，从而将该嵌合分子导向金黄色葡萄球菌表面。用聚合酶链反应(PCR)扩增编码ICAM-11区和2区以及SPACWT的DNA片段，所用的引物在ICAM-1的1-168残基两侧和溶葡萄球菌素(SPACWT)的389-480残基两侧框内引入大肠杆菌限制位点。将这些片段连接在一起，放入用于哺乳动物细胞内表达并含有可选标记疱疹胸腺嘧啶激酶(TK)的哺乳动物表达盒中。
嵌合分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。在标准条件下，将含有编码ICAM-1的1区和2区以及SPACWT的DNA片段的表达载体转染到CHO细胞中。在标准培养基(Dulbecco′s改进型必需培养基，其中含10％胎牛血清)中大量培养这些细胞；在培养基中加入HAT(次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶)，维持对疱疹TK标记的选择压，挑选出转染子。培养48-96小时后，裂解细胞释放出含有嵌合分子的胞质组分。4℃，将细胞溶解在含有非离子性除垢剂Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物(10μg/ml抑蛋白酶肽和亮抑蛋白酶肽，EDTA 1mM)的生理缓冲液(磷酸盐缓冲液)中1小时，防止嵌合分子被蛋白酶降解。
用单克隆抗体亲合性层析纯化嵌合分子。将与ICAM-1反应的单克隆抗体RR1/1与惰性柱基质偶联。让含有嵌合分子的CHO细胞裂解液通过前置柱去除与柱基材非特异性结合的物质，然后通过固定有RR1/1的柱。嵌合分子的ICAM-1部分将与抗体结合从而固定到柱上。然后用pH逐渐升高直至pH11.0的一系列除垢剂洗涤缓冲液洗柱。在洗柱过程中，嵌合分子仍结合在柱上，非结合或弱结合性杂质则被洗去。然后用pH12.5的除垢剂缓冲液特异性地从柱上洗脱结合的嵌合分子。实施例2：肽聚糖特异性的唾液酸-scFv(化学连接)
将唾液酸(Fluka Chemicals LTD，Switzerland)与肽聚糖(所有革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分之一)特异性的单链可可变区抗体片段(scFv)化学连接。用异双官能交联剂(例如ABH或MPBH(Pierce Inc.USA))进行所述偶联。
ABH含有一个与唾液酸顺二醇部分反应的肼基和一个在UV裂解后与scFv非特异性反应的光叠氮基。MBPH和ABH一样含有一个与唾液酸顺二醇部分反应的肼基。然而，MBPH没有非特异性的光叠氮基，而有一个与scFv内-SH基团特异性反应形成硫醚键的马来酰亚胺基团。
偶联后，用亲合性层析充分纯化出唾液酸连scFv产物而去除非偶联物质。首先以基于分子大小的FPLC用S-200柱分离反应混合物。然后用阴离子交换(MonoQ)层析进一步纯化相应大小的洗出峰物质。
本领域技术人员可用多种方法确定是否获得了功能性偶联物，即，是否通过肽聚糖结合细菌表面并通过唾液酸结合流感病毒A。例如，可将偶联物与革兰氏阳性菌和荧光标记的流感A病毒颗粒混合。如果存在功能性偶联物，它们会一端结合革兰氏阳性菌，而另一端结合病毒颗粒，形成一个桥。与细菌表面缔合的病毒颗粒可通过荧光显微镜检来检测。实施例3：S-蛋白特异性的CD4-scFv(生物素-亲和素连接)
许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均能合成S层蛋白质，这些蛋白质包围细菌表面形成一个S层。阴道菌群内的许多乳杆菌可产生S层蛋白质。利用生物素-亲和素交联将S层蛋白特异性scFv与HIV受体CD4连接。用Altman等所述的方法(科学274，94-96(1996))在基因水平将一段15氨基酸的肽(BSP，生物素第五肽)(BirA酶底物)与scFv的COOH-端和CD4的1区和2区融合。简而言之，将编码GlySer接头和BSP的DNA与编码scFv和CD4的1区和2区的DNA片段3′端融合。如实施例1所述，在CHO细胞中表达含BSP的蛋白质，然后用酶BirA特异性地在BSP的赖氨酸残基上生物素化。也可以如实施例1所述在CHO中表达非改性CD4(1区和2区)和scFv，并纯化。然后用生物素的NHS-酯(Pierce Inc.，USA)在氨基上生物素化。
将等摩尔的生物素化CD4与scFv混合。然后加入摩尔比1/4的亲和素(每个亲和素有4个生物素结合位点)，使得生物素化的CD4与scFv结合成多聚复合物。此时，复合物包含0∶4，1∶3，2∶2，3∶1和4∶0的CD4∶scFv。用亲和层析分离这些不同的复合物。在FPLC中，各复合物从S-200柱上洗入不同的流份。收集CD4∶scFv为1∶3，2∶2和3∶1的复合物流份。然后，这些流份进一步用阴离子交换(MonoQ)层析纯化。实施例4：用ICAM-1/SPACWT作为鼻喷雾剂防止鼻病毒感染
在CHO细胞内表达ICAM-1/SPACWT嵌合分子，用亲和层析纯化，并以30μg/ml的浓度保存于无菌盐水中。可以给可能接触人鼻病毒的人(例如医护人员和空勤人员)使用含此溶液的鼻喷雾剂。在接触最多的时期，例如冬季，这些人每日每鼻孔喷一次。可使用该产品的其他场合还包括在与感染者接触前，或在出席不能因病缺席的重要会议或事件前1周。

Claims (41)

1.一种延长病毒特异性配体在动物粘膜上半寿期的方法，所述粘膜上寄居着细菌，所述方法包括：使粘膜与病毒特异性配体接触，所述病毒特异性配体经改造而可结合粘膜寄居细菌的表面。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的病毒特异性配体经改造可结合以下粘膜寄居细菌，它们选自乳杆菌，链球菌，葡萄球菌，乳球菌，拟杆菌，杆菌和奈瑟菌。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的病毒特异性配体通过与细菌特异性配体结合而被改造。
4.根据权利要求3所述的方法，所述的细菌特异性配体是抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，所述的抗体选自单链抗体，F(ab)和F(ab)2。
6.根据权利要求3所述的方法，所述的细菌特异性配体包括肽、多肽、蛋白质、糖，或它们的组合物。
7.根据权利要求3所述的方法，所述细菌特异性配体选自：LytA的C末端胆碱结合区，PspA的C末端胆碱结合区，溶葡萄球菌素(SPACWT)的C末端，InIB的C末端，抗S层蛋白抗体和抗肽聚糖抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，所述的病毒特异性配体与细菌特异性配体通过双官能交联剂结合而被改造。
9.根据权利要求1所述的方法，所述的病毒特异性配体通过与细菌特异性配体共价结合而被改造。
10.根据权利要求1所述的方法，所述的病毒特异性配体与细菌特异性配体通过肽接头相连。
11.根据权利要求3所述的方法，所述的病毒特异性配体是抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，所述的抗体选自单链抗体，F(ab)和F(ab)2。
13.根据权利要求1所述的方法，所述的细菌特异性配体包括肽、多肽、蛋白质、糖，或它们的组合物。
14.根据权利要求3所述的方法，所述的病毒特异性配体包括CD4，DC-SIGN，ICAM-1，HveA，HveC，脊髓灰质炎病毒受体，玻连蛋白受体，CD21或IgA受体序列。
15.根据权利要求3所述的方法，所述的病毒特异性配体是糖类。
16.根据权利要求15所述的方法，所述的糖选自唾液酸和硫酸肝素。
17.一种嵌合分子，包含病毒特异性配体和细菌特异性配体，所述细菌特异性配体结合粘膜上寄居的细菌。
18.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述细菌特异性配体是抗体。
19.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述抗体选自单链抗体，F(ab)和F(ab)2。
20.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述细菌特异性配体包括肽、多肽、蛋白质、糖，或它们的组合物。
21.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述细菌特异性配体选自：LytA的C末端胆碱结合区，PspA的C末端胆碱结合区，溶葡萄球菌素(SPACWT)的C末端，InIB的C末端，抗S层蛋白抗体和抗肽聚糖抗体。
22.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述细菌特异性配体结合以下细菌，它们选自乳杆菌，链球菌，葡萄球菌，乳球菌，拟杆菌，杆菌和奈瑟菌。
23.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述的病毒特异性配体是抗体。
24.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述的病毒特异性配体选自以下抗体：单链抗体，F(ab)和F(ab)2。
25.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述的病毒特异性配体包括肽、多肽、蛋白质、糖，或它们的组合物。
26.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述的病毒特异性配体包括CD4，DC-SIGN，ICAM-1，HveA，HveC，脊髓灰质炎病毒受体，玻连蛋白受体，CD21或IgA受体序列。
27.根据权利要求17所述的嵌合分子，所述嵌合分子包含在无菌水溶液中。
28.根据权利要求27所述的嵌合分子，所述溶液是生理相容性溶液。
29.一种制造嵌合分子的方法，其步骤包括：将病毒特异性配体与细菌特异性配体连接，所述细菌特异性配体结合粘膜寄居细菌，所述病毒特异性配体结合感染性病毒颗粒。
30.根据权利要求29所述的方法，所述的病毒特异性配体包括CD4，DC-SIGN，ICAM-1，HveA，HveC，脊髓灰质炎病毒受体，玻连蛋白受体，CD21或IgA受体序列。
31.根据权利要求29所述的方法，所述嵌合分子以无菌的药学认可溶液溶解成单位剂型。
32.根据权利要求29所述的方法，所述病毒特异性配体与细菌特异性配体通过肽接头相连。
33.根据权利要求29所述的方法，所述病毒特异性配体与细菌特异性配体通过双官能交联剂相连。
34.根据权利要求29所述的方法，所述细菌特异性配体是抗体。
35.根据权利要求29所述的方法，所述细菌特异性配体是糖类。
36.一种将病毒颗粒与动物粘膜寄居细菌相连的方法，其步骤包括：(i)使细菌与连有细菌特异性配体的病毒特异性配体接触；(ii)让病毒颗粒被病毒特异性配体特异性识别，从而与所述细菌相连。
37.一种向鼻粘膜递送包含在生理相容性溶液中的单位剂量嵌合分子的系统，它包括：(i)以无菌、药学认可溶液配制的嵌合分子，所述嵌合分子具有能结合病毒颗粒的病毒特异性配体和能结合健康粘膜上天然寄居细菌的细菌特异性配体；(ii)具有第一和第二末端的容器，第一末端是包含溶液的柔性底部，第二末端是开口的锥形尖嘴，用于将定量的气雾喷剂送入鼻孔。
38.根据权利要求37所述的系统，所述第一末端为柔性，可将压力由容器传递给溶液，使得溶液从所述容器第二末端喷出。
39.一种药物组合物，包含治疗有效量的嵌合分子或通过结合细菌特异性配体而改造的病毒特异性配体。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，所述组合物被配制成溶液、粉剂、霜剂、凝胶、药膏、灌洗液、悬浮液、片剂、丸药、胶囊、栓剂和气雾剂。
41.根据权利要求39所述的药物组合物，所述组合物被配制成阴道栓剂、药塞、凝胶、糊剂、泡沫剂和喷雾剂。
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