CN102617738B - 重组融合蛋白cld的多肽、编码序列及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组融合蛋白CD4-LINKER-DC-SIGN(CLD)的多肽、编码序列及制备方法和应用。重组融合蛋白CLD，其序列为SEQ ID NO.1-16中奇数序列所示核苷酸序列和SEQ ID NO.1-16偶数序列所示氨基酸序列，其步骤：第一以克隆于质粒的人CD4和DC-SIGN全长cDNA为模板，通过PCR扩增，得到目的片段；第二酶切PCR产物和原核载体，构建重组表达载体；第三将获得的表达载体转化大肠杆菌，得到表达重组蛋白CLD的工程菌；第四通过诱导培养至一定浓度的工程菌后获得培养产物；第五稀释法复性蛋白；第六Ni2+亲和层析法分离、纯化经过复性的蛋白。蛋白纯化综合采用稀释复性与Ni2+亲和层析，能使蛋白纯度达到90%以上。本发明所涉及蛋白具有抗HIV-1吸附和感染的双重活性，在开发治疗/预防HIV-1的药物方面具有很大价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体涉及重组融合蛋白CLD (CD4-LINKER-DC-SIGN)的多肽、编码序列，还涉及重组融合蛋白CLD的多肽、编码序列的制备方法，同时还涉及重组融合蛋白CLD的多肽、编码序列的用途。
技术背景
艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染引起的传染性疾病。HIV-1主要有三种传播途径：血液传播、性传播及母婴垂直传播。全球范围内性传播又是最主要的传播方式，尤其是异性间性传播已成为艾滋病传播的主要途径。我国大约有43.6%的感染者是通过性活动感染上病毒的。
HIV通过性途径的初始感染发生在生殖道以及直肠等黏膜组织处。树突状细胞（dentritic cell，DC）大量分布在阴道、子宫、直肠等黏膜层，在初始感染中扮演了一个关键角色。DC虽然不是HIV感染的主要靶细胞，但HIV-1通过DC的迁移而将感染和吸附的病毒传递给淋巴结的靶细胞，引起HIV-1的大量繁殖，因此，DC被认为有可能是HIV-1性传播途径中最先感染和/或吸附的细胞。HIV-1能低效率地感染非成熟态DC或不感染成熟态DC，但无论是非成熟态还是成熟态DC，都可以通过其表面的DC-SIGN等吸附HIV-1病毒颗粒，而DC-SIGN是子宫、直肠等黏膜树突状细胞上的HIV-1的主要吸附受体。
HIV-1侵入细胞的过程是病毒包膜蛋白识别、结合CD4和辅助受体的过程。HIV-1包膜蛋白亚基gp120与宿主细胞的CD4分子结合，引起gp120的构象发生变化，使其能进一步与辅助受体（通常是趋化因子受体CCR5或CXCR4）结合；gp120与辅助受体作用后，使HIV-1包膜蛋白的另一亚基gp41暴露出来，gp41 N端插入细胞的磷脂双分子层，最终导致病毒包膜与宿主细胞膜发生融合，致使病毒进入细胞。HIV-1包膜蛋白与CD4及辅助受体的结合足以使病毒感染细胞。根据HIV-1在感染细胞过程中使用的是CCR5还是CXCR4辅助受体可将HIV-1分为R5和X4病毒，有些亚型艾滋病毒还存在使用CCR5和CXCR4的中间类型R5X4病毒。但无论是R5，X4还是R5X4病毒都要利用CD4才能完成感染过程。因此，以CD4为靶位点的拮抗物可以有效地阻断HIV-1侵入细胞，如可溶性CD4等。
CD4的D1D2区是HIV-1 gp120的结合位，可溶性D1D2-CD4被证明可以作为一种有效的抗HIV-1分子药物及开发成潜在的杀微生物剂。DC-SIGN通过其凝集素来吸附HIV-1gp120。申请人胡勤学等曾将DC-SIGN凝集素片断在大肠杆菌中进行了表达，表达的可溶性DC-SIGN能很好地抑制HIV-1通过DC-SIGN吸附和传播。DC-SIGN与HIV-1 gp120的结合能力高于CD4与HIV-1gp120的结合，而且两种蛋白作用于HIV-1gp120结合的位点也不相同，因此不会产生竞争，CD4和DC-SIGN之间也不会直接结合。将CD4的D1D2区与DC-SIGN融合表达，可溶性CD4-DC-SIGN融合蛋白可以同时结合并封闭HIV-1 gp120上的CD4位点和DC-SIGN位点，使HIV-1无法通过CD4侵入，也无法通过DC-SIGN进行传播，在20μg/ml的可溶性CD4-DC-SIGN融合蛋白存在的情况下，在黏膜组织模型上可以显著的抑制HIV-1病毒传播感染。这是首次将蛋白融合表达来达到同时抑制 HIV-1 传播和感染的目的。具备独立或者通过组合成为新型抗HIV-1 杀微生物剂的潜力，同时，由于相对于CD4具备更强与gp120的结合能力，可以在一定条件下替代CD4作为实验/检测试剂使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种重组融合蛋白CLD的氨基酸、DNA序列，该序列同时编码与CD4 D1D2结构与DC-SIGN碳水化合物识别区域。编码产物能够同时与病毒包膜蛋白gp120上受体CD4以及吸附受体DC-SIGN的结合位点结合。
本发明的另一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白CLD的制备方法，方法易行，操作简便，采用稀释复性与Ni2+亲和层析，可以使蛋白纯度达到90%以上。
本发明的再一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白CLD在制备治疗或预防抗HIV-1病毒的药物中的应用。
本发明通过基因重组技术，克隆了人CD4 与DC-SIGN胞外部分，通过PCR引物引入GGGGS linker，并经原核表达和纯化获得融合蛋白。纯化后融合蛋白在细胞和人黏膜组织模型上体现了对病毒感染与传播的良好抑制能力，部分融合蛋白与单体蛋白相比在抑制HIV感染靶细胞，传播方面有了显著的提高，具备作为新一代杀微生物剂的潜力，同时，由于系列融合蛋白相对CD4单体蛋白而言，与病毒包膜蛋白具有更强的结合能力，可以在一定条件下替代可溶性CD4在实验/检测中的使用。
重组融合蛋白CLD的DNA编码序列、氨基酸序列的制备方法，其步骤是：
构建重组融合蛋白载体：
CD4 （HU，QX. JOURNAL OF VIROLOGY， Dec. 2000， p. 11858–11872）胞外部分DNA片段以及DC-SIGN（马新锋， 胡勤学， 中华微生物学和免疫学杂志， 2004， 24 (1)， 67-71）胞外部分DNA片段来源于克隆于pcDNA3.1（市售，Invitrogen公司）的全长基因cDNA。在扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamH Ⅰ和 HindⅢ两个酶切位点；通过调整CD4 3’和 DC-SIGN 5’的引物序列还改变引物融合蛋白的linker长度。PCR扩增各个DNA片段，琼脂糖电泳后胶回收PCR产物，分别对CD4进行NdeⅠ/BamH Ⅰ双酶切；对DC-SIGN 进行BamH Ⅰ/HindⅢ双酶切；对pET28a（市售，Invitrogen公司）进行NdeⅠ/ HindⅢ双酶切，然后胶回收酶切DNA片段。分别将切好后的CD4、DC-SIGN和pET28a DNA片段混合后做连接反应，连接产物转化E. coli DH5α菌株（市售，TAKARA公司），转化产物涂布于含有卡那霉素的LB培养基上筛选。平板上筛选出的单菌落接种扩大培养后一部分提取质粒进行双酶切验证，一部分送至上海桑尼生物科技有限公司测序。经上述验证结果正确的质粒保存备用。本发明中构建的表达载体命名如下：
(1)
pET28a-C15D 编码C15D，包含 CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN CRD部分和15个氨基酸的linker。
(2) pET28a-C20D 编码C20D，包含 CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN CRD部分和20个氨基酸的linker。
(3) pET28a-C25D 编码C25D，包含 CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN CRD部分和25个氨基酸的linker。
(4) pET28a-C35D 编码C35D，包含 CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
(5) pET28a-mC35D 编码mC35D，包含 CD4 D1D2 N端106 氨基酸部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
(6) pET28a-sC35D 编码sC35D，包含 CD4 D1D2 N端87 氨基酸部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
(7) pET28a-C25ND 编码C25ND，包含 CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN NECK以及CRD部分和25个氨基酸的linker。
(8) pET28a-C35ND 编码包含 C35ND，CD4 D1D2 N端部分、DC-SIGN NECK以及CRD部分和35个氨基酸的linker。
重组融合蛋白的表达与纯化：
表达载体转化菌株E.coli Rosetta 菌株（市售，Novagen公司），挑取单菌落至试管培养过夜，按照1：100比例扩大培养至OD值为0.6-1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导4-5小时后离心收集菌体，冰浴条件下超声破碎，离心收集包含体。包含体用含1M盐酸胍的溶液洗涤两次，然后用含有5mM DTT的盐酸胍溶液溶解，室温（20-25℃，以下相同）100 rpm 震荡4小时，4℃，12000rpm离心30分钟，上清过0.45μm 滤膜过滤。上清稀释在含10%（体积，以下相同）甘油，20mM Tris，500mM NaCl复性缓冲液中，1mM还原型谷胱甘肽/0.2 mM氧化型谷胱甘肽作为氧化还原对，4℃条件下，复性24小时。
复性蛋白经镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化后，用透析液（5%体积甘油，20mM Tris， 0.2M NaCl）透析除去咪唑，平衡后，产物用超滤管浓缩。将各个复性融合蛋白浓缩至一定浓度，纯度检测采用SDS-PAGE，表明获得的蛋白纯度可以达到90%以上。
重组融合蛋白抑制
HIV
传播与感染：
重组融合蛋白CLD的多肽、DNA编码序列以及其在制备治疗或预防HIV-1病毒的药物中的应用，其步骤是：
本发明所得的系列重组融合蛋白对HIV-1具有良好的抑制作用。系列重组融合蛋白通过重组融合蛋白中的CD4与HIV-1病毒的包膜蛋白结合后产生蛋白变构，使其丧失与宿主细胞CD4受体结合的能力，从而保护宿主细胞不被病毒感染。表达DC-SIGN分子的DC细胞能够在体内迁移到淋巴结，与HIV-1病毒的主要靶细胞CD4阳性细胞作用而能够起到病毒传播作用。重组融合蛋白中的DC-SIGN CRD部分通过竞争性的结合到病毒包膜蛋白上的结合位点后，抑制了表达有DC-SIGN分子细胞与病毒的相互作用。重组病毒通过以上的作用方式达到抑制病毒感染的目的。
重组融合蛋白相对于CD4具备更强的与gp120的结合能力，可以在一定条件下替代CD4作为实验/检测试剂使用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：方法易行，操作简便，采用稀释复性与Ni2+亲和层析，可以一步将蛋白纯化到90%以上纯度。重组融合蛋白通过与病毒包膜蛋白gp120的结合，可以同时竞争性地抑制病毒与宿主细胞上的CD4受体与DC-SIGN等吸附受体的结合，因此，仅用一种蛋白就能够抑制HIV-1感染靶细胞，同时防止HIV-1通过DC细胞扩散到富含CD4+靶细胞的淋巴结等处造成病毒的快速扩增。部分融合蛋白与出发单体蛋白CD4相比，与gp120蛋白的结合活性有了不同程度的提高。融合蛋白能够同时抑制 HIV-1 的传播与感染，这是目前需要其他两种药物 / 蛋白 / 化学试剂联合使用才能达到的效果。
附图说明
图1 为重组融合蛋白的载体构建流程示意图。
具体实施方式
实施例1：重组融合蛋白 CLD 的氨基酸、编码序列的制备方法，其步骤是：
表达载体构建
CD4 胞外部分DNA片段以及DC-SIGN胞外部分DNA片段来源于克隆于pcDNA3.1的人全长基因cDNA。采用引物对分别进行CD4以及DC-SIGN部分DNA片段的扩增，构建融合蛋白表达载体：
(1)
pET28a-C15D 编码包含 CD4 D1D2 N端178aa部分、DC-SIGN CRD部分和15个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC和引物C2：GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCCGAACCGCCACCGCCAGCTAGCACCACGATGTCTAT扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点；采用引物D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和引物D2：GGTGGATCCCACCCCTGTCCCTGG扩增DC-SIGN CRD片段；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamH Ⅰ和 HindⅢ两个酶切位点，获得CD4 D1D2 N端178 aa部分和DC-SIGN CRD部分基因片段后，对片段进行相应的双酶切；对质粒pET28a进行HindⅢ和NdeⅠ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插入后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C15D；编码蛋白质C15D的核苷酸序列见 SEQ ID NO.1，对应蛋白序列为，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
(2) pET28a-C20D 编码包含 CD4 D1D2 N端 178aa部分、DC-SIGN CRD部分和20个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC和引物C3：
GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCAGCTAGCACCACGATGTCTAT扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点；采用引物D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和引物D3： GGTGGATCCG
GCGGTGGCGGATCGGGCGGTGGCGGATCGCACCCCTGTCCCTGG扩增DC-SIGN CRD片段；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamHⅠ和 HindⅢ两个酶切位点。获得CD4 D1D2 N端 178aa部分和DC-SIGN CRD部分基因片段后，对片段进行相应的双酶切；对质粒pET28a进行HindⅢ和NdeⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒， 用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插入后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C20D；编码蛋白质C20D的核苷酸序列见SEQ ID NO.3，对应蛋白序列，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
(3) pET28a-C25D 编码包含 CD4 D1D2 N端 178aa部分、DC-SIGN CRD部分和25个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC；C2：GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCCGAACCGCCACCGCCAGCTAGCACCACGATGTCTAT扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamHⅠ两个酶切位点；采用引物D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG； D3： GGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGGCGGTGGCGGATCGCACCCCTGTCCCTGG扩增DC-SIGN CRD片段；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamHⅠ和 HindⅢ两个酶切位点，获得CD4 D1D2 N端 178aa部分和DC-SIGN CRD部分基因片段后，对片段进行相应的双酶切；对质粒pET28a进行HindⅢ和NdeⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C25D；编码蛋白质C25D的核苷酸序列见SEQ ID NO.5, 对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
(4) pET28a-C35D 编码包含 CD4 D1D2 N端 178氨基酸部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC和引物C2：GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCCGAACCGCCACCGCCAGCTAGCACCACGATGTCTAT扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamHⅠ两个酶切位点；以引物D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和D4：
GGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCGGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCGGTGGCGGATCGCACCCCTGTCCCTGG扩增DC-SIGN CRD片段为模板，利用D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和D6：GGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCGGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCGGTGG引物对进行二次扩增；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段通过引物分别在序列的5’和3’引入BamHⅠ和 HindⅢ两个酶切位点，获得CD4 D1D2 N端 178aa部分和DC-SIGN CRD部分基因片段后，对片段进行相应双酶切；对质粒pET28a进行HindⅢ和NdeⅠ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插入后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C35D；编码蛋白质C35D的核苷酸序列见SEQ ID NO.7，对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
(5) pET28a-mC35D 编码包含 CD4 D1D2 N端106 氨基酸部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC和C4：
GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCCGAACCGCCACCGCCG GTGTCAGAGTTGGCAGTCAA扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点；对构建好的质粒pET28a-C35D进行NdeⅠ和BamH Ⅰ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-mC35D；编码蛋白质mC35D的核苷酸序列见SEQ ID NO.9，对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
(6) pET28a-sC35D 编码包含 CD4 D1D2 N端87 氨基酸部分、DC-SIGN CRD部分和35个氨基酸的linker。
采用引物C1：TATACCATGGGCAAAGAAAGTGGTGCTGGGC和C5：GCCGGATCCACCTCCACCAGAGCCACCTCCGCCCGAACCGCCACCGCCCTCCACTTCACAGATGTAAGT扩增CD4 D1D2片段；扩增CD4 胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入NdeⅠ和BamHⅠ两个酶切位点；对构建好的质粒pET28a-C35D进行NdeⅠ和BamHⅠ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-sC35D；编码蛋白质sC35D的核苷酸序列见SEQ ID NO.11，对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
(7) pET28a-C25ND 编码包含 CD4 D1D2 N端 178aa部分、DC-SIGN NECK以及CRD部分和25个氨基酸的linker。
采用引物D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和D5：GGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGGCGGTGGCGGATCGGTGGGTGAGCTCTCAGAG扩增DC-SIGN NECK和CRD片段；在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamHⅠ和 HindⅢ两个酶切位点，获得基因片段后，对片段进行相应双酶切；对构建好的质粒pET28a-C35D进行NdeⅠ和BamHⅠ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段是否正确插后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C25ND；编码蛋白质C25ND的核苷酸序列见SEQ ID NO.13，对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。
(8) pET28a-C35ND 编码包含 CD4 D1D2 N端 氨基酸部分、DC-SIGN NECK以及CRD部分和35个氨基酸的linker。
采用D1：ACGGAGCTCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG和D6：GGTGG
ATCCGGCGGCGGCGGCTCGGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCGGTGG扩增DC-SIGN 胞外片段，以pET28a-C25ND为模板，在扩增DC-SIGN胞外部分DNA片段时，通过引物分别在序列的5’和3’引入BamH Ⅰ和 HindⅢ两个酶切位点，获得基因片段后，对片段进行相应的双酶切；对构建好的质粒pET28a-C35D进行NdeⅠ和BamH Ⅰ双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳后采用Fermentas胶回收试剂盒回收DNA片段。在无菌Eppendorf管中加入130ng内切酶酶切处理的基因片段，100ng质粒pET28a的酶切产物，1μl T4连接酶，2μl T4连接酶缓冲液，加水至20μl，混匀，16℃连接12h；将2μl连接产物加入到200μl感受态大肠杆菌DH5α，混匀，42℃热激转化，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃培养过夜，从转化的平板上挑取6个菌落接种至5 ml 含卡那霉素的LB，37℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用HindⅢ和NdeⅠ双酶切质粒，验证基因片段正确插后，将经验证插入正确的质粒进行DNA序列测定，该质粒命名为pET28a-C35ND；编码蛋白质C35ND的核苷酸序列见SEQ ID NO.15，对应蛋白序列见，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
系列重组融合蛋白的诱导表达
(1)
阳性克隆转化表达用大肠杆菌Rosetta（市售，Novagen公司）。
(2) 将上述含有目的质粒的菌种接种至含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养过夜。取1ml过夜培养物接入300ml含卡那霉素的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养5h。
重组融合蛋白的纯化
(1)
4℃，8000rpm/min离心10min收集表达菌体，用预冷的PBS洗涤菌体一次；
(2)
4℃，8000rpm/min离心10min，用蛋白重悬缓冲液重悬菌体；
(3)
菌体重悬后，用超声波裂解菌体；
(4)
4℃，12000rpm/min离心20min弃上清，保留沉淀；
(5)
包含体用含1M盐酸胍的溶液洗涤两次，然后用含有5mM DTT的6M盐酸胍-PBS溶液溶解，室温下摇床100 rpm 震荡4小时；
(6)
4℃,12000rpm离心30分钟，上清用0.45μm滤膜过滤后稀释在含10%体积的甘油，20mM Tris，500mM NaCl复性缓冲液中，1mM还原型谷胱甘肽/0.2 mM氧化型谷胱甘肽为氧化还原对，4℃条件下，复性24小时；
(7)
用镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化：
A) 75%体积比的乙醇预洗层析柱；
B) 悬浮Ni SepharoseTM 6 Fast Flow，吸取5ml装填层析柱；
C) 层析柱补Ni2+后加入10%体积的甘油，20mM Tris，500mM NaCl平衡；
D) 加入含目的蛋白的溶液，将流速控制在2-10倍柱体积/h；
E) 加入30ml 10%体积的甘油，20mM Tris，500mM NaCl，50mM咪唑洗涤柱材料吸附的杂蛋白，将流速控制于10~20柱体积/h；
F) 加入洗脱液(10%体积的甘油，20mM Tris，500mM NaCl，300mM 咪唑)洗脱目的蛋白，将流速控制在2~10倍柱体积/h，分管收集洗脱液并测定每管OD280值；
G) 将收集的目的蛋白，4℃于透析缓冲液（20mM Tris，200mM NaCl，5%甘油）中透析24h；
H) SDS-PAGE 电泳检测重组融合蛋白纯度，表明获得了纯度为90%以上的单一蛋白。WESTERN-BLOT确证融合蛋白获得了正确表达。
I) Bradford蛋白浓度测定试剂盒。检测方法详见说明书。结果表明，各纯化的融合蛋白的浓度在300-700μg/ml。
实施例
2
：融合蛋白生物活性的检测：
重组融合蛋白C15D、C20D、C25D、C35D、mC35D、sC35D、C25ND、C35ND在制备治疗或预防抗HIV-1病毒的药物中的应用，其步骤是：
(1)
HIV-1 BaL 假病毒的制备：
包膜蛋白质粒采用含pcDNA3.1 BaL env基因（Centralized Facility for
AIDS Reagents），框架质粒采用缺失env基因的pNL4-3- luc-env-/（Centralized Facility for
AIDS Reagents）。两种质粒通过脂质体转染（Lipofectamine™ 2000，Invitrogen Corporation）方法共转染293T细胞。转染48h后，含病毒的培养基上清用0.45μm 滤膜过滤后加入10%体积的胎牛血清，-80℃保存备用；采用luciferase检测试剂盒（市售，promega公司）测定病毒滴度。
(2) HIV-1 病毒的制备：
转染质粒分别采用pNL4-3 （Centralized Facility for
AIDS Reagents）和 pNL4-3 BaL（Centralized Facility for
AIDS Reagents）。这两种质粒经转染后制备的病毒辅助受体嗜性分别为CXCR4和CCR5。用脂质体（Lipofectamine™ 2000，Invitrogen Corporation）转染293T细胞。转染48h后，含病毒的培养基上清用0.45μm滤膜过滤后加入10%体积的胎牛血清，-80℃保存备用。常规p24 ELISA试剂盒（市售，Beckman Coulter）测定病毒滴度。
(3) 重组融合蛋白在细胞水平上对病毒的中和：
将各重组融合蛋白稀释至1μM后，按1：3比例进行系列稀释，添加500 TCID50的HIV-1 BaL 假病毒孵育1h，孵育后加入24h前铺好的U87-CD4-CCR5细胞的细胞培养板中共培养48h， 然后裂解细胞，采用Promega Luciferase Assay System 检测细胞的自发萤光。结果表明系列重组融合蛋白对HIV-1 BaL具有良好的中和效果，相对起始单体蛋白CD4， C35D、C25ND、C35ND抑制效率能够提高 2-5 倍。同时，部分融合蛋白相对于起始蛋白，具有更好的广谱中和能力。在100nM蛋白浓度的情况下，融合蛋白与不同来源的HIV-1病毒毒株孵育1小时后与U87-CD4-CCR5细胞的细胞培养板中共培养48h，裂解后采用前述方法检测蛋白对病毒的抑制效果，结果见表一，阳性对照为培养基与病毒混合物，所测萤光值定义为100%，结果表明，融合蛋白 C25ND 、 C35ND 与起始蛋白相比，针对不同来源病毒的中和能力得到了显著的提高。
表一
融合蛋白中和不同来源
HIV-1
病毒毒株
| 毒株 | CD4 | DC-SGIN | C25ND | C35ND |
| BaL | 99.8 | 0 | 99.9 | 99.9 |
| 811 | 93.9 | 0 | 99.8 | 99.9 |
| MSW2 | 56.7 | 0 | 89.1 | 92.5 |
(4)
重组融合蛋白在细胞水平上对病毒的吸附抑制：
C15D、C35D、C25ND、C35ND系列重组融合蛋白稀释到1μm之后，与HIV-1 BaL孵育1h之后与RajiB DC-SIGN+细胞共孵育3小时，洗涤4-5次去除游离病毒后加入细胞裂解液裂解。10000rpm 10min之后取上清，用p24 ELISA试剂盒检测细胞吸附病毒量，结果表明系列融合蛋白能够明显抑制病毒对RajiB DC-SIGN+细胞的吸附，减少通过吸附产生的对细胞的感染，抑制效率均能达到80%以上。
(5) 重组融合蛋白在黏膜组织中抑制HIV吸附/感染。
A) 重组融合蛋白在黏膜组织中抑制HIV-1 BaL感染：
人宫颈组织被切成3×3mm的小块后置于200μl RPMI培养基中培养。病毒与20μg/ml的重组融合蛋白C15D 孵育1h后，与准备好的黏膜组织共培养2小时，彻底清洗组织块中非特异性吸附的游离病毒后，置于新鲜培养基中培养14d。
B) 重组融合蛋白在黏膜组织中抑制HIV-1 BaL吸附：
对黏膜组织如前处理后，在24–48 h培养期间培养基中加入100 ng/ml 的重 组人 MIP-3 ( R&D Systems； chemotactic for DCs)， 收集迁移出的细胞，洗涤后并与PM1细胞共培养。以上处理的组织块及细胞经培养，裂解，离心后收集上清用ELISA试剂盒测p24滴度。结果显示在黏膜组织水平上，重组融合蛋白C15D对病毒吸附、感染靶细胞具有良好的抑制作用，均可达到90%以上。其他几种融合蛋白具有类似的抑制效果。
SEQUENCE
LISTING
<110>
中国科学院武汉病毒研究所
<120>
重组融合蛋白
CLD
的多肽、编码序列及制备方法和应用
<130>
重组融合蛋白
CLD
的多肽、编码序列及制备方法和应用
<160>
16
<170>
PatentIn version 3.1
<210>
1
<211>
1098
<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
1
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60
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cagaagaaga
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tcttaactaa aggtccatcc aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga 240
agcctttggg
accaaggaaa cttccccctg atcatcaaga atcttaagat agaagactca 300
gatacttaca
tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga 360
ttgactgcca
actctgacac ccacctgctt caggggcaga gcctgaccct gaccttggag 420
agcccccctg
gtagtagccc ctcagtgcaa tgtaggagtc caaggggtaa aaacatacag 4
ggggagaaga
ccctctccgt gtctcagctg gagctccagg atagtggcac ctggacatgc 540
actgtcttgc
agaaccagaa gaaggtggag ttcaaaatag acatcgtggt gctagcgggc 600
ggaggtggct
ctggtggagg tggatccggc ggcggtggat cgcacccctg tccctgggaa 660
tggacattct
tccaaggaaa ctgttacttc atgtctaact cccagcggaa ctggcacgac 720
tccatcaccg
cctgcaaaga agtgggggcc cagctcgtcg taatcaaaag tgctgaggag 780
cagaacttcc
tacagctgca gtcttccaga agtaaccgct tcacctggat gggactttca 840
gatctaaatc
aggaaggcac gtggcaatgg gtggacggct cgcctctgtt gcccagcttc 900
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ggaacagagg agagcccaac aacgttgggg aggaagactg cgcggaattt 960
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gctggaacga cgacaaatgt aatcttgcca aattctggat ctgcaaaaag 100
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<210>
2
<211>
365
<212>
PRT
<213>
人工合成
<400>
2
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Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1
5
10
15
Arg Gly
Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
20
25 30
Val Glu
Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His
35
40
45
Trp Lys
Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
50
55
60
Leu Thr
Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
65
70
75
80
Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
85
90 95
Ile Glu
Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu
100
105
110
Glu Val
Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His
115
120 125
Leu Leu
Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly
130
135
140
Ser Ser
Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln
145
150 155
160
Gly Glu
Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly
165
170
175
Thr Trp
Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys
180 185
190
Ile Asp
Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
195
200
205
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser His Pro Cys Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe
210
215
220
Gln Gly
Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn Ser Gln Arg Asn Trp His Asp
225
230
235
240
Ser Ile
Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly Ala Gln Leu Val Val Ile Lys
245
250
255
Ser Ala
Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn
260
265
270
Arg Phe
Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp
275 280
285
Gln Trp
Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp
290
295
300
Asn Arg
Gly Glu Pro Asn Asn Val Gly Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe
305
310
315
320
Ser Gly
Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp
325
330
335
Ile Cys
Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe
340
345
350
Leu Ser
Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn Pro Pro Pro Ala
355
360
365
<210>
3
<211>
1113
<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
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tggtgctggg caaaaaaggg gatacagtgg aactgacctg tacagcttcc 120
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agcctttggg
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gatacttaca
tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga 360
ttgactgcca
actctgacac ccacctgctt caggggcaga gcctgaccct gaccttggag 420
agcccccctg
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ggggggaaga
ccctctccgt gtctcagctg gagctccagg atagtggcac ctggacatgc 540
actgtcttgc
agaaccagaa gaaggtggag ttcaaaatag acatcgtggt gctagcaggt 600
ggaggcggtt
caggcggagg tggctctggt ggaggtggat ccggcggtgg cggatcgcac 660
ccctgtccct
gggaatggac attcttccaa ggaaactgtt acttcatgtc taactcccag 720
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acgactccat caccgcctgc aaagaagtgg gggcccagct cgtcgtaatc 780
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aggagcagaa cttcctacag ctgcagtctt ccagaagtaa ccgcttcacc 840
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tag
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4
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人工合成
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4
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1
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Arg Gly
Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
20
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Val Glu
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35
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Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
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55
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Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
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Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
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90 95
Ile Glu
Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu
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110
Glu Val
Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His
115
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Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly
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Ser Ser
Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln
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150 155
160
Gly Gly
Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly
165
170
175
Thr Trp
Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys
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190
Ile Asp
Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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200
205
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Cys Pro Trp
210
215
220
Glu Trp
Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn Ser Gln
225
230
235
240
Arg Asn
Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly Ala Gln
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250
255
Leu Val
Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln Leu Gln
260
265
270
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Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Leu Asn
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285
Gln Glu
Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu Pro Ser
290
295
300
Phe Lys
Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro Asn Asn Val Gly Glu Glu
305
310
315
320
Asp Cys
Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys Cys Asn
325
330
335
Leu Ala
Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys Ser Arg
340
345
350
Asp Glu
Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn Pro Pro
355
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365
Pro Ala
370
<210>
5
<211>
1128
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DNA
<213>
人工合成
<400>
5
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His Pro
Cys Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe
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265
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290
295
300
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人工合成
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7
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actgtcttgc
agaaccagaa gaaggtggag ttcaaaatag acatcgtggt gctagcgggc 600
ggtggcggtt
cgggcggagg tggctctggt ggaggtggat ccggcggcgg cggctcgggt 660
ggtggtggtt
ctggcggtgg cggatcgggc ggtggcggat cgcacccctg tccctgggaa 720
tggacattct
tccaaggaaa ctgttacttc atgtctaact cccagcggaa ctggcacgac 780
tccatcaccg
cctgcaaaga agtgggggcc cagctcgtcg taatcaaaag tgctgaggag 840
cagaacttcc
tacagctgca gtcttccaga agtaaccgct tcacctggat gggactttca 900
gatctaaatc
aggaaggcac gtggcaatgg gtggacggct cgcctctgtt gcccagcttc 960
aagcagtatt
ggaacagagg agagcccaac aacgttgggg aggaagactg cgcggaattt 1020
agtggcaatg
gctggaacga cgacaaatgt aatcttgcca aattctggat ctgcaaaaag 1080
tccgcagcct
cctgctccag ggatgaagaa cagtttcttt ctccagcccc tgccacccca 1140
aacccccctc
ctgcgtag
1158
<210>
8
<211>
385
<212>
PRT
<213>
人工合成
<400>
8
Met Gly
Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1
5
10
15
Arg Gly
Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
20
25
30
Val Glu
Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His
35
40
45
Trp Lys
Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
50
55
60
Leu Thr
Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
65
70
75
80
Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
85
90
95
Ile Glu
Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu
100
105
110
Glu Val
Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His
115
120
125
Leu Leu
Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly
130
135
140
Ser Ser
Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln
145
150
155 160
Gly Glu
Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly
165
170
175
Thr Trp
Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys
180
185
190
Ile Asp
Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
195
200
205
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210
215
220
Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Cys Pro Trp Glu
225
230
235
240
Trp Thr
Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn Ser Gln Arg
245
250 255
Asn Trp
His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly Ala Gln Leu
260
265
270
Val Val
Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln Leu Gln Ser
275
280 285
Ser Arg
Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Leu Asn Gln
290
295
300
Glu Gly
Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu Pro Ser Phe
305
310 315
320
Lys Gln
Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro Asn Asn Val Gly Glu Glu Asp
325
330
335
Cys Ala
Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys Cys Asn Leu
340
345
350
Ala Lys
Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys Ser Arg Asp
355
360
365
Glu Glu
Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn Pro Pro Pro
370
375
380
Ala
385
<210>
9
<211>
942
<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
9
atgggcagca
gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat
60
atgaagaaag
tggtgctggg caaaaaaggg gatacagtgg aactgacctg tacagcttcc 120
cagaagaaga
gcatacaatt ccactggaaa aactccaacc agataaagat tctgggaaat 180
cagggctcct
tcttaactaa aggtccatcc aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga 240
agcctttggg
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gatacttaca
tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga 360
ttgactgcca
actctgacac cggcggtggc ggttcgggcg gaggtggctc tggtggaggt 420
ggatccggcg
gcggcggctc gggtggtggt ggttctggcg gtggcggatc gggcggtggc 480
ggatcgcacc
cctgtccctg ggaatggaca ttcttccaag gaaactgtta cttcatgtct 540
aactcccagc
ggaactggca cgactccatc accgcctgca aagaagtggg ggcccagctc 600
gtcgtaatca
aaagtgctga ggagcagaac ttcctacagc tgcagtcttc cagaagtaac 660
cgcttcacct
ggatgggact ttcagatcta aatcaggaag gcacgtggca atgggtggac 720
ggctcgcctc
tgttgcccag cttcaagcag tattggaaca gaggagagcc caacaacgtt 780
ggggaggaag
actgcgcgga atttagtggc aatggctgga acgacgacaa atgtaatctt 840
gccaaattct
ggatctgcaa aaagtccgca gcctcctgct ccagggatga agaacagttt 900
ctttctccag
cccctgccac cccaaacccc cctcctgcgt
ag
942
<210>
10
<211>
313
<212>
PRT
<213>
人工合成
<400>
10
Met Gly
Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1
5
10
15
Arg Gly
Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
20
25
30
Val Glu
Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His
35
40
45
Trp Lys
Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
50
55
60
Leu Thr
Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
65
70
75
80
Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
85
90
95
Ile Glu
Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu
100
105
110
Glu Val
Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr Gly
115
120
125
Gly Gly
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130
135
140
Gly Gly
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145
150
155
160
Gly Ser
His Pro Cys Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys
165
170
175
Tyr Phe
Met Ser Asn Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala
180
185
190
Cys Lys
Glu Val Gly Ala Gln Leu Val Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu
195
200
205
Gln Asn
Phe Leu Gln Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp
210
215
220
Met Gly
Leu Ser Asp Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp
225
230
235
240
Gly Ser
Pro Leu Leu Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu
245
250
255
Pro Asn
Asn Val Gly Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly
260
265
270
Trp Asn
Asp Asp Lys Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys
275
280
285
Ser Ala
Ala Ser Cys Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala
290
295
300
Pro Ala
Thr Pro Asn Pro Pro Pro Ala
305
310
<210>
11
<211>
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<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
11
atgggcagca
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60
atgaagaaag
tggtgctggg caaaaaaggg gatacagtgg aactgacctg tacagcttcc 120
cagaagaaga
gcatacaatt ccactggaaa aactccaacc agataaagat tctgggaaat 180
cagggctcct
tcttaactaa aggtccatcc aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga 240
agcctttggg
accaaggaaa ctttcccctg atcatcaaga atcttaagat agaagactca 300
gatacttaca
tctgtgaagt ggagggcggt ggcggttcgg gcggaggtgg ctctggtgga 360
ggtggatccg
gcggcggcgg ctcgggtggt ggtggttctg gcggtggcgg atcgggcggt 420
ggcggatcgc
acccctgtcc ctgggaatgg acattcttcc aaggaaactg ttacttcatg 480
tctaactccc
agcggaactg gcacgactcc atcaccgcct gcaaagaagt gggggcccag 540
ctcgtcgtaa
tcaaaagtgc tgaggagcag aacttcctac agctgcagtc ttccagaagt 600
aaccgcttca
cctggatggg actttcagat ctaaatcagg aaggcacgtg gcaatgggtg 660
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ctctgttgcc cagcttcaag cagtattgga acagaggaga gcccaacaac 720
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aagactgcgc ggaatttagt ggcaatggct ggaacgacga caaatgtaat 780
cttgccaaat
tctggatctg caaaaagtcc gcagcctcct gctccaggga tgaagaacag 840
tttctttctc
cagcccctgc caccccaaac ccccctcctg
cgtag
885
<210>
12
<211>
294
<212>
PRT
<213>
人工合成
<400>
12
Met Gly
Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1
5
10
15
Arg Gly
Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
20
25 30
Val Glu
Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His
35
40
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Trp Lys
Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
50
55
60
Leu Thr
Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
65
70
75
80
Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
85
90
95
Ile Glu
Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Gly Gly Gly Gly
100
105
110
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115
120 125
Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His
130
135
140
Pro Cys
Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met
145
150 155
160
Ser Asn
Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu
165
170
175
Val Gly
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180 185
190
Leu Gln
Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu
195
200
205
Ser Asp
Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro
210
215
220
Leu Leu
Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro Asn Asn
225
230
235
240
Val Gly
Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp
245
250
255
Asp Lys
Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala
260
265
270
Ser Cys
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285
Pro Asn
Pro Pro Pro Ala
290
<210>
13
<211>
1626
<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
13
atgggcagca
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60
atgaagaaag
tggtgctggg caaaaaaggg gatacagtgg aactgacctg tacagcttcc 120
cagaagaaga
gcatacaatt ccactggaaa aactccaacc agataaagat tctgggaaat 180
cagggctcct
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agcctttggg
accaaggaaa cttccccctg atcatcaaga atcttaagat agaagactca 300
gatacttaca
tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga 360
ttgactgcca
actctgacac ccacctgctt caggggcaga gcctgaccct gaccttggag 420
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cggtgggtga gctctcagag aaatccaagc tgcaggagat ctaccaggag 720
ctgacccagc
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caaggaaact
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14
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PRT
<213>
人工合成
<400>
14
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5
10
15
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Ser His Met Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr
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25
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Val Glu
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40
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Trp Lys
Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe
50
55
60
Leu Thr
Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg
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70
75
80
Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
85
90
95
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Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu
100
105
110
Glu Val
Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His
115
120
125
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130
135
140
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Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln
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150
155
160
Gly Glu
Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly
165
170
175
Thr Trp
Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys
180
185
190
Ile Asp
Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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200
205
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210
215
220
Val Gly
Glu Leu Ser Glu Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu
225
230
235
240
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Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys
245
250
255
Leu Gln
Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly
260
265
270
Glu Leu
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275
280
285
Trp Leu
Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Met Gln
290
295
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Glu Ile
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310
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Pro Glu
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Tyr Gln
Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu
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360
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Lys Ser
Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala
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375
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Ala Val
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390
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400
Gln Gly
Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn Ser Gln Arg Asn Trp His Asp
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410
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Ser Ile
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425
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Ser Ala
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440
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Arg Phe
Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp
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455
460
Gln Trp
Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp
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470
475
480
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490
495
Ser Gly
Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp
500
505
510
Ile Cys
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520
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Leu Ser
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535
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<210>
15
<211>
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<212>
DNA
<213>
人工合成
<400>
15
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cagaagaaga
gcatacaatt ccactggaaa aactccaacc agataaagat tctgggaaat 180
cagggctcct
tcttaactaa aggtccatcc aagctgaatg atcgcgctga ctcaagaaga 240
agcctttggg
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gatacttaca
tctgtgaagt ggaggaccag aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga 360
ttgactgcca
actctgacac ccacctgctt caggggcaga gcctgaccct gaccttggag 420
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agaaccagaa gaaggtggag ttcaaaatag acatcgtggt gctagcgggc 600
ggtggcggtt
cgggcggagg tggctctggt ggaggtggat ccggcggcgg cggctcgggt 660
ggtggtggtt
ctggcggtgg cggatcgggc ggtggcggat cgcagggtga gctctcagag 720
aaatccaagc
tgcaggagat ctaccaggag ctgacccagc tgaaggctgc agtgggtgag 780
cttccagaga
aatctaagct gcaggagatc taccaggagc tgacccggct gaaggctgca 840
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actcggctga
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<213>
人工合成
<400>
16
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1
5
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Leu Thr
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Ser Leu
Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys
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Glu Val
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Leu Leu
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135
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Ser Ser
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150 155
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Gly Glu
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165
170
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Thr Trp
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180 185
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Ile Asp
Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
195
200
205
Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210
215
220
Gly Gly
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Glu Leu Ser Glu
225
230
235
240
Lys Ser
Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala
245
250
255
Ala Val
Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln
260
265
270
Glu Leu
Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser
275 280
285
Lys Leu
Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Trp Leu Lys Ala Ala Val
290
295
300
Gly Glu
Leu Pro Glu Lys Ser Lys Met Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu
305
310
315
320
Thr Arg
Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln
325
330
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Gln Glu
Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu
340
345
350
Leu Pro
Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg
355
360
365
Leu Lys
Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu
370
375
380
Ile Tyr
Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Glu Arg Leu Cys
385
390
395
400
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Cys Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe
405
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Met Ser
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420
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Glu Val
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Ala Ser
Cys Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala
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Thr Pro
Asn Pro Pro Pro Ala
545
550
Claims (5)
1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
3.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。
4.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中的任意一项所述的分离的蛋白质在制备治疗或预防抗HIV-1病毒的药物中的应用。
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| Teunis B.H. et al.Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3 and HIV-1.《The Journal of Biological》.2002,第277卷(第13期),11314-11320. |
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