CN106267202A - 具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体及其制备 - Google Patents

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Abstract

具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体及其制备。所述金纳米棒复合载体以金纳米棒为核，二氧化硅为壳层，在壳层外表面修饰光动力治疗的近红外荧光染料。制备：将氯金酸溶液与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，加入硼氢化钠冰水混合溶液得纳米金种子溶液A；在二元表面活性剂溶液中加入硝酸银溶液和氯金酸溶液，反应后加入盐酸得溶液B，再加入抗坏血酸和溶液A，反应后得金纳米棒；将正硅酸乙酯甲醇溶液和氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液加入金纳米棒溶液中得复合纳米粒子；向近红外荧光染料中加入1‑（3‑二甲基氨基丙基）‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，再加入N‑羟基琥珀酰亚胺得溶液C；将复合纳米粒子溶液与溶液C混合即得产物。

Description

具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体及其制备
技术领域
本发明涉及纳米复合载体，尤其是涉及一种具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)是严重威胁人类健康的第二大疾病，其治愈率低、死亡率高。我国癌症发生率目前正处于快速上升期，据世界卫生组织全球癌症报告显示：2015年我国有280多万人死于癌症。目前临床上多采用常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗等，但这些方法均存在很大的局限性，如耐药性、晚期转移率高、愈后多不佳等(Omoti,A.E.&Omoti,C.E.Ocular toxicity of systemic anticancer chemotherapy.Pharm Pract(Granada)4,55-59(2006))。因此，新型的肿瘤治疗方法如光热疗发、光动力疗法、基因疗法成为研究的热点。但是单一的治疗方式也很难达到良好的临床治疗效果。因此，发展两种或多种肿瘤治疗手段联合起来共同抗击肿瘤，成为肿瘤医学发展的重点研究内容之一。
光热疗法是利用高温来治疗肿瘤的一种方法,是局部治疗肿瘤的新手段。通过热疗试剂能够有效地将光能转换为热能，高温杀伤恶性肿瘤细胞，并且对人体无毒副作用，因而被国际医学界称之为“绿色疗法”(Choi,W.I.,Sahu,A.,Kim,Y.H.&Tae,G.Photothermalcancer therapy and imaging based on gold nanorods.Ann Biomed Eng 40,534-546(2012))。近年来有大量研究显示：金纳米棒(Gold nanorods，AuNR)具有良好的光学特性，在很窄的光谱带宽下具有更高的等离子体共振强度，同时金纳米棒的紫外吸收光谱其长径比有关，其可调范围可以到达近红外区域。与其他金属材料相比，金纳米棒在肿瘤光热治疗方面有着更强的光热转化优势，因此，常被用作为肿瘤光热治疗的首选材料。
光动力疗法是治疗人体局部病变特别是恶性肿瘤的一种激光医学技术，以光、光敏剂和氧的相互作用为基础。当光敏剂受到特定波长的光照射时，它能够吸收光子而被激发,又通过系间跨越转变为三重态而将吸收的光能迅速传递给周围的氧分子，氧分子发生一系列光化学反应形成单线态氧，从而杀伤肿瘤或其他病理组织，达到治疗的目的(Agostinis,P.et al.Photodynamic therapy of cancer:an update.CA Cancer J Clin61,250-281(2011).)。近红外荧光染料在长波长段(700～900nm)有强吸收峰，对应于生物体自身吸收较弱的“治疗窗口”，可实现较好深层组织的光动力治疗。但荧光染料在水中容易发生团聚而产生荧光淬灭现象，且量子产率较低，这些问题影响了近红外荧光染料在光动力治疗方面的应用。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体。
本发明的另一个目的在于提供一种具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法。
所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，以金纳米棒(AuNR)为核，二氧化硅(SiO2)为壳层，并在二氧化硅壳层外表面修饰光动力治疗的近红外荧光染料。
所述金纳米棒的长径比可为2～7，金纳米棒的表面等离子共振吸收区域可介于600-1200nm波长范围之内。所述壳层的厚度可为2～30nm。
所述近红外荧光染料可采用罗丹明染料、异硫氰酸荧光素荧光染料、酞菁类荧光染料、吲哚菁绿荧光染料、花青素类荧光染料、花菁类荧光染料等中的一种。
所述金纳米棒的局部等离子共振吸收峰与近红外荧光染料的吸收峰重叠。
所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法，包括以下步骤：
1)将氯金酸溶液与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，再加入硼氢化钠冰水混合溶液，得到纳米金种子溶液A；
2)在二元表面活性剂溶液中加入硝酸银溶液和氯金酸溶液，反应后加入盐酸，继续反应，得到反应溶液B；
3)向反应溶液B中加入抗坏血酸和纳米金种子溶液A，反应，静置，离心，清洗后，得金纳米棒；
4)将正硅酸乙酯甲醇溶液和氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液加入到金纳米棒溶液中，搅拌，离心，清洗后，得到以金纳米棒(AuNR)为核，以二氧化硅(SiO2)为壳的AuNR@SiO2复合纳米粒子；
5)向近红外荧光染料中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应后再加入N-羟基琥珀酰亚胺，继续反应，得到反应溶液C。
6)将AuNR@SiO2复合纳米粒子溶液与反应溶液C混合，避光搅拌后，离心，洗涤，即得具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体。
在步骤1)中，所述氯金酸溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液、硼氢化钠冰水混合溶液的体积比可为(4～8)︰(5～10)︰(0.5～2)，所述氯金酸溶液的摩尔浓度可为0.1～1mM，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的摩尔浓度可为0.05～0.2M，硼氢化钠冰水混合溶液的摩尔浓度可为5～20mM。
在步骤2)中，所述二元表面活性剂可选自十六烷基三甲基溴化铵/水杨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵/甲基水杨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵/油酸钠、甲基水杨酸钠/油酸钠、水杨酸钠/油酸钠等中的至少一种；所述二元表面活性剂溶液、硝酸银溶液、氯金酸溶液、盐酸的体积比可为(50～100)︰(3～6)︰(40～80)︰(0.1～1)，所述硝酸银溶液的摩尔浓度可为1～5mM，所述氯金酸溶液的摩尔浓度可为0.1～1mM；所述反应的时间可为1～3h，继续反应的时间可为10～30min。
在步骤3)中，所述抗坏血酸和纳米金种子溶液A的体积比可为(0.1～0.5)︰(0.1～0.5)；所述抗坏血酸的摩尔浓度可为0.05～0.1M；所述反应的时间可为10～60s；静置的时间可为10～24h。
在步骤4)中，所述正硅酸乙酯甲醇溶液、氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液、金纳米棒溶液的体积比可为(5～20)μL︰(5～20)μL︰(5～20)mL，所述正硅酸乙酯甲醇溶液的质量百分浓度可为5％～20％，所述氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液的质量百分浓度可为1％～10％；所述搅拌的时间可为12～24h。
在步骤5)中，所述近红外染料与步骤4)得到的AuNR@SiO2复合纳米粒子的摩尔比可为(200～500)︰1；所述反应的时间可为30～40min，所述继续反应的时间可为30～40min。
在步骤6)中，所述避光搅拌的时间可为4～6h。
为了克服近红外荧光染料的局限性，实现光热和光动力治疗的联合应用，本发明将近红外荧光染料连接在金纳米棒表面，通过调节金纳米棒的等离子共振吸收峰和中间壳层的厚度，实现荧光增强，从而提高近红外荧光染料的光动力治疗效果。在激光辐射后，实现了金纳米棒光热治疗和近红外荧光染料光动力治疗的协同作用，显著增强了肿瘤治疗效果，因此所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体可在制备治疗肿瘤药物中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所述金纳米棒复合载体为核壳结构，充分利用金纳米棒表面等离子共振产生的强烈局部电磁场，通过调节中间壳层二氧化硅的厚度，实现了金纳米棒对近红外荧光染料显著的荧光和光动力增强效果。
2、本发明所述金纳米棒复合载体在同一波长激光照射下，使得光热和光动力治疗效果协同增强，从而获得更显著的肿瘤治疗效果。
附图说明
图1是不同长径比AuNR的透射电子显微镜对比图。在图1中，A为长：50.6±3.0nm、宽：16.3±0.9nm、AR：3.1；B为长：61.8±6.3nm、宽：14.1±0.9nm、AR；4.4；C为长：62.3±4.7nm、宽：9.9±0.7nm、AR；6.3。
图2是AuNR及AuNR@SiO2复合纳米粒子的透射电子显微镜对比图。在图2中，A为长：56.9±4.3nm、宽：17.1±0.9nm、AR；3.3；B为SiO2壳层厚度：12.2±0.5nm。
图3是AuNR及AuNR@SiO2复合纳米粒子的紫外吸收图谱。
图4是AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体的红外图谱。
图5是AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体的荧光光图谱。
图6是AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体的光动力效应。
图7是AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体的光热效应。
图8是AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体在HepG2细胞中细胞杀伤率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
5mL 0.5mM氯金酸与5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，搅拌均匀，加入新鲜配制的0.6mL 0.01M NaBH4，快速搅拌2min，溶液颜色有黄色变为棕黄色，金种溶液室温继续生长30min。
称取1.4g十六烷基三甲基溴化铵和0.2468g油酸钠，加50ml水加热搅拌溶解，冷却至室温，加入4.8ml 4nM硝酸银和50ml 0.5mM氯金酸，静置15min后，继续搅拌1.5h，平行三份，分别加入浓盐酸0.26、0.35和0.55ml，搅拌15min，再加入0.25ml 64mM抗坏血酸，快速搅拌30s，最后加入0.16ml上述所制金种溶液，搅拌30s，30℃静置12h，离心洗涤后分散在水中，即得不同长径比(aspect ratio,AR)的AuNR溶液。AuNR纳米粒子的TEM图如图1所示，图1中的A、B和C三种AuNR纳米粒子的长径比分别为3.1、4.5和6.2，大小均匀，分散性较好。
实施例2
按照实施例1的步骤，通过调节盐酸的投料量至0.27mL，制得如图2A所示长径比为3.3的AuNR纳米粒子。此AuNR纳米粒子的紫外吸收图谱如图3所示；AuNR纳米粒子在783nm处有较强的等离子共振吸收。取10ml制备好的AuNR溶液，加入100l 0.1M氢氧化钠，搅拌15min，加入12μL10％正硅酸乙酯(TEOS)的甲醇溶液和12μL 1％氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的甲醇溶液，共三次，每次间隔30min，30℃水域搅拌24h，离心、洗涤后分散在水中，即得AuNR@SiO2溶液。AuNR@SiO2复合纳米粒子的TEM图片如图2B所示，从透射电镜图中可以看到明显的二氧化硅层，其厚度约为12.2nm。AuNR@SiO2纳米粒子的紫外吸收图谱如图3所示，其等离子共振吸收红移至796nm，说明实验中包覆二氧化硅成功；且AuNR@SiO2的等离子共振吸收峰与IR795的紫外吸收峰几乎完全重叠，这为后续的荧光增强奠定了基础。
实施例3
取2.5ml 4μg/ml的花菁染料(IR795)溶液，加入15μL 1mM 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌反应30min，再加入15μL 1mM N-羟基琥珀酰亚胺反应30min。将10nM AuNR@SiO2复合纳米粒子加上述溶液，继续室温避光震荡5h，反应结束后，将悬浮液离心清洗2次，将收集到的沉淀重新分散于等体积的去离子水中，即可得到AuNR@SiO2-IR795核壳纳米粒子。连接IR795后，紫外吸收图谱及透射电镜图与AuNR@SiO2的无明显变化。AuNR@SiO2-IR795复合纳米载体的红外图谱如图4所示，修饰IR795后，1657cm-1处峰增强，为酰胺键的特征峰，说明IR795已成功连接在二氧化硅层的表面。
实施例4
取0.2mL 1nM AuNR@SiO2-IR795复合纳米载体用超纯水稀释至2mL后，对其荧光强度进行测定，同时测定等量的IR795在水中和甲醇中的荧光强度。荧光图谱如图5所示，当IR795连接在AuNR@SiO2表面后，其荧光强度是水中的51.7倍，与在甲醇中相比也有2.5倍地增强。
取2mL 0.1nM AuNR@SiO2-IR795溶液及等量的IR795溶液，分别加入10μL 0.01μg/mL 9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)溶液作为1O2检测剂，震荡孵育2min。1O2的检测需在暗室中进行，用808nm激光器(1W/cm2)照射混合溶液，每光照5min检测一次荧光光谱变化，总照射时间为30min。从图6的ABDA荧光强度减弱结果可知：随着激光照射时间的延长，IR795组ABDA的荧光强度减弱量无明显变化，而AuNR@SiO2-IR795组ABDA的荧光强度减弱量逐渐增加，说明单独IR795无明显的光动力作用，而AuNR@SiO2-IR795在荧光增强的同时也增强了IR795的光动力作用。与单独的IR795相比，AuNR@SiO2-IR795的光动力效果增强了6.3倍。
实施例5
取2mL 0.1nM AuNR@SiO2-IR795溶液及等量量的AuNR@SiO2和IR795溶液放入样品池，用808nm激光器(1W/cm2)照射，激光光源与样品池之间的距离为5cm，并进行固定，在样品池内放入热敏电耦温度计并开始进行读数并计时，平均5s进行读数并记录。以水作为空白对照，IR795有微弱的光热作用，而AuNR@SiO2和AuNR@SiO2-IR795的光热作用明显增强。从温度变化曲线图7可以看到，激光照射10min后，AuNR@SiO2-IR795纳米粒子的温度上升至56℃，表明AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体具有良好的光热效果。
实施例6
将IR795、AuNR@SiO2、AuNR@SiO2-IR795用Minimum Essential Media(MEM)培养液分别配成浓度为0.4μM、1nM、1nM的样品，加入到事先铺好HepG2细胞的96孔板中，每空细胞数1×104个，共孵育12h后，弃去培养液，磷酸缓冲盐溶液润洗一次，加入新的培养液，用808nm激光器(1W/cm2)照射5min，激光光源与细胞培养板之间的距离为5cm。激光照射后继续培养12h，未加激光照射的直接孵育24h后，分别加20μL 5mg/mL噻唑蓝(MTT)溶液，孵育4h，弃去上清液，每空加入200μL DMSO溶液，避光孵育10min，在490nm处测定光密度(OD)值。实验结果如图8所示，当激光照射后，AuNR@SiO2-IR795组细胞存活率明显降低至28％，说明激光照射后触发了AuNR@SiO2-IR795金纳米棒复合载体的光热和光动力效应，对肝癌细胞有较强的杀伤效果。

Claims (10)

1.具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，其特征在于以金纳米棒为核，二氧化硅为壳层，并在二氧化硅壳层外表面修饰光动力治疗的近红外荧光染料。
2.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，其特征在于所述金纳米棒的长径比为2～7，金纳米棒的表面等离子共振吸收区域介于600～1200nm波长范围之内。
3.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，其特征在于所述壳层的厚度为2～30nm。
4.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，其特征在于所述近红外荧光染料采用罗丹明染料、异硫氰酸荧光素荧光染料、酞菁类荧光染料、吲哚菁绿荧光染料、花青素类荧光染料、花菁类荧光染料中的一种。
5.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体，其特征在于所述金纳米棒的局部等离子共振吸收峰与近红外荧光染料的吸收峰重叠。
6.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将氯金酸溶液与十六烷基三甲基溴化铵溶液混合，再加入硼氢化钠冰水混合溶液，得到纳米金种子溶液A；
2)在二元表面活性剂溶液中加入硝酸银溶液和氯金酸溶液，反应后加入盐酸，继续反应，得到反应溶液B；
3)向反应溶液B中加入抗坏血酸和纳米金种子溶液A，反应，静置，离心，清洗后，得金纳米棒；
4)将正硅酸乙酯甲醇溶液和氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液加入到金纳米棒溶液中，搅拌，离心，清洗后，得到以金纳米棒为核，以二氧化硅为壳的AuNR@SiO2复合纳米粒子；
5)向近红外荧光染料中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应后再加入N-羟基琥珀酰亚胺，继续反应，得到反应溶液C；
6)将AuNR@SiO2复合纳米粒子溶液与反应溶液C混合，避光搅拌后，离心，洗涤，即得具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体。
7.如权利要求6所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述氯金酸溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液、硼氢化钠冰水混合溶液的体积比为(4～8)︰(5～10)︰(0.5～2)，所述氯金酸溶液的摩尔浓度可为0.1～1mM，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的摩尔浓度可为0.05～0.2M，硼氢化钠冰水混合溶液的摩尔浓度可为5～20mM。
8.如权利要求6所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述二元表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵/水杨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵/甲基水杨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵/油酸钠、甲基水杨酸钠/油酸钠、水杨酸钠/油酸钠中的至少一种；所述二元表面活性剂溶液、硝酸银溶液、氯金酸溶液、盐酸的体积比可为(50～100)︰(3～6)︰(40～80)︰(0.1～1)，所述硝酸银溶液的摩尔浓度可为1～5mM，所述氯金酸溶液的摩尔浓度可为0.1～1mM；所述反应的时间可为1～3h，继续反应的时间可为10～30min。
9.如权利要求6所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述抗坏血酸和纳米金种子溶液A的体积比为(0.1～0.5)︰(0.1～0.5)；所述抗坏血酸的摩尔浓度可为0.05～0.1M；所述反应的时间可为10～60s；静置的时间可为10～24h；
在步骤4)中，所述正硅酸乙酯甲醇溶液、氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液、金纳米棒溶液的体积比可为(5～20)μL︰(5～20)μL︰(5～20)mL，所述正硅酸乙酯甲醇溶液的质量百分浓度可为5％～20％，所述氨丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液的质量百分浓度可为1％～10％；所述搅拌的时间可为12～24h；
在步骤5)中，所述近红外染料与步骤4)得到的AuNR@SiO2复合纳米粒子的摩尔比可为(200～500)︰1；所述反应的时间可为30～40min，所述继续反应的时间可为30～40min；
在步骤6)中，所述避光搅拌的时间可为4～6h。
10.如权利要求1所述具有光热/光动力治疗性能的金纳米棒复合载体在制备治疗肿瘤药物中应用。
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