CN106265792B - 一种抗皮肤光老化的药物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药领域，具体涉及一种抗皮肤光老化的药物及其制备方法与质量检测方法。该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份。该药物制备成片剂、丸剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液。本发明药物可明显增强光老化皮肤组织SOD活性，降低MDA含量，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量，使自由基对成纤维细胞损害减轻，发挥延缓皮肤光老化的作用。

Description

一种抗皮肤光老化的药物及其检测方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种桤木皮与山青皮的活性药物及其制备方法。

背景技术

皮肤光老化是指皮肤长期反复暴露于紫外线下而引起的皮肤结构和功能的特征性改变。表现为皮肤表而粗糙、松弛、下垂，出现粗深皱纹和局部色斑，甚至发生良性或恶性肿瘤等。皮肤光老化的主要组织学特征是胶原纤维减少和弹性纤维变性。目前认为紫外线照射皮肤后可以产生高度反应的自由基，这些自由基通过氧化或交联作用，破坏皮肤的抗氧化系统，导致皮肤内各种细胞的损伤、突变和死亡。紫外线辐射可诱导皮肤成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（ Matrix metalloproteinases， MMPs）高表达，这些MMPs通过长期反复损伤和降解胶原从而导致真皮胶原缺乏。目前对皮肤光老化的研究是多方面的，近年来国内外应用多种不同中药或其提取物对皮肤光老化的防治作用进行了颇有成效的研究。

1、人参

程基焱等研究人参的主要成分人参皂苷Rb_l与芳维甲酸乙醋对光老化成纤维细胞胞质内基质金属蛋白酶表达的影响，通过体外对真皮成纤维细胞进行细胞培养，用人参皂苷Rbl与芳维甲酸乙酯对其进行干扰，紫外线照射48h后用免疫组织化学测定其基质金属蛋白酶的表达，结果发现人参皂苷Rbl与芳维甲酸乙酯对培养成纤维细胞胞质基质金属蛋白酶的表达均有显著抑制作用（P<0.05），而人参皂苷Rbl和芳维甲酸乙酯对其表达的抑制作用相互之间差异无显著性（P>0.05）。研究表明人参皂苷Rbl对光老化成纤维细胞具有与芳维甲酸乙酯相似的防治作用，其机理与芳维甲酸乙酯的作用机理可能相同或者相似，即通过调节MMPs活性防治皮肤光老化。

2、黄芪

王诗晗通过研究黄芪提取液对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化模型皮肤组织中一些氧化代谢产物，包括羟脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量，以及无毛小鼠真皮结构变化，结果发现模型组无毛小鼠皮肤组织SOD活性明显降低，HYP含量显著减少，MDA含量明显增加（P<0.05）；模型+黄茂高剂量组的皮肤中HYP及MDA含量与正常组差异无显著性，但其对SOD活性有提高作用（P<0.05） ；模型+黄芪中剂量、模型+黄茂高剂量组HYP含量提高（P<0.05） ， MDA含量降低（P<0.01），并呈剂量依赖。皮肤组织形态学检查结果显示：模型组可见弹性纤维发生变性、破坏乃至消失，呈嗜碱性变、无定形、颗粒状，出现断裂、破碎，变粗、卷曲扭结、聚集成团，甚至消失，呈现光老化状态；模型+黄芪中、低剂量组小鼠真皮层可见波浪状弹性纤维，纤维少见断裂、破碎，卷曲扭结、聚集成团，与模型组比较有所改善，中、低剂量组之间无显著差别；模型+黄芪高剂量组的弹性纤维受损程度较各自的中、低剂量组轻。研究表明黄芪提取液对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化具有保护作用，其机理可能是一方而黄茂木身具有清除自由基的作用，另一方而黄芪可以通过提高SOD活力来达到防光目的。

3、黄芩

阂玮等研究黄芩对紫外线（UVA、UVB）损伤皮肤细胞（角质形成细胞和成纤维细胞）的保护作用，分别采用30、60、90mj/cm²的UVB和4，8，12）j/cm²的UVA照射培养的健康青少年男子环切术切除的包皮的原代角质形成细胞和成纤维细胞，加入黄芩进行干预处理后，以MTT法检测细胞活性。结果发现UVA、UVB照射可引起皮肤角质形成细胞和成纤维细胞损伤，而经黄芩预处理后其细胞活性可恢复18%～38%，紫外线照射前黄芩预处理的细胞活性均高于无黄芩处理的细胞（P<0.05）。实验表明黄芩具有光保护性能，可减轻UVA、UVB对皮肤细胞的损伤作用。

4、黄精

杨智荣等采用人工光源（高压汞灯）长期照射小鼠皮肤，通过局部外用黄精，测定照射部位皮肤羟脯氨酸含量，结果发现光老化实验中药物组、基质组、对照组皮肤中的羟脯氨酸含量依次递减。试验表明黄精外用有促进胶原纤维合成，防治光老化的作用。

5、绿茶

茶色素是绿茶的主要活性成分，国内外多篇研究表明左旋表没食子儿茶素没食子酸酯是绿茶中最有效的化学光防护剂。

张素慧等研究茶色素对紫外线照射致小鼠皮肤光老化的防护作用，在光镜下观察茶色素对真皮弹性纤维的影响，然后通过NestedPCR检测皮肤组织线粒体DNA（mtDNA）的缺失突变，结果发现茶色素（灌胃或外涂）能有效改善光老化模型小鼠真皮弹性纤维的病变，两者均可不同程度地缓解小鼠皮肤组织mtDNA的缺失突变，从而延缓皮肤光老化。

Chiu等应用绿茶提取物对光老化病人进行随机双盲临床试验研究，绿茶口服组、绿茶霜外用组、对照组之间的临床分级结果没有显著差异，不过通过皮肤活检发现经绿茶处理后的皮肤弹性组织有显著改善（P<0.05），表明绿茶可以预防光老化从而保护人皮肤。

紫外线辐射人类皮肤能增加过氧化氢酶（CAT）活性，减少谷胱甘肽氧化物酶（GSH-Px）活性和总谷胱甘肽水平，Kaityar等研究发现经EGCG预处理后能恢复紫外线诱导的谷胱甘肽水平，并对谷胱甘肽过氧化物酶提供保护作用。试验研究表明EGCG可以通过抗氧化来防治皮肤光老化。

6、芍药

Lee等研究了芍药苷对紫外线诱导引起的人类和无毛小鼠皮肤角质形成细胞的DNA损伤的影响，并研究了含有芍药苷的化妆品制剂对人体皮肤的防皱效果。通过Comet法测定培养的人和无毛小鼠皮肤的角质形成细胞活性，结果发现芍药苷可以保护UVB照射引起的角质形成细胞的DNA损伤，其中正常人类角质形成细胞DNA损伤从19.4%卜降为0.001 %，无毛小鼠皮肤角质形成细胞的DNA损伤从41%下降为0.01 %；用含有0.5%芍药苷的化妆品制剂20名志愿人员进行为8周的临床试验，统计发现芍药苷可以显著减少而部皱纹（P<0.05）。试验表明芍药贰可以保护皮肤成纤维细胞，并显著减少而部皱纹，有良好的防光和抗皱作用。

7、地榆

Tsukahara等每大在相同时间应用UVB照射大鼠后立即在单侧后肢外涂地榆提取物，6周后用Bissett计分和图像分析大鼠后肢皮肤皱纹，用扫描电镜（SElVn观察皮肤弹性，用影像分析系统定量弹性纤维的线性，结果发现地榆提取物对大鼠后腿皮肤皱纹的形成有明显抑制作用，对UVB引起皮肤弹性降低有明显抑制作用并呈剂量依赖性，同时还能抑制弹性纤维卷曲。试验表明地榆提取物可预防UVB照射引起的慢性光老化。

8、莪术

王志成等研究了莪术油UVB所致豚鼠皮肤损伤的治疗作用及其机制。实验豚鼠随机分组后，把每一只豚鼠右侧背部暴露皮肤（5 cm ×5 cm）置于UVB光源卜，其中莪术油组每大照射后用莪术油涂抹皮肤暴露处，连续照射30d后，取各组豚鼠背部双侧皮肤，进行形态学观察及抗氧化指标CAT、SOD、GSH-Px、总抗氧化能力（T- AOC）和MDA检测。结果发现莪术油治疗组照射侧和所有未照射侧未见表皮增厚而UVB照射组照射侧表皮可见增厚；与UVB照射组比较，莪术油治疗组成纤维细胞显著增加（P<0.01），同组两侧比较UVB照射组照射侧成纤维细胞数显著减少（P<0.05），而莪术油治疗组未见明显改变；与UVB照射组比较，莪术油治疗组CAT、 SOD和GSH-Px显著升高（P<0.05， P<0.01） ，MDA含量显著降低（P<0.01）。试验表明莪术油对于紫外线辐射损伤后的皮肤具有一定的治疗作用，其作用机制可能与提高抗氧化酶含量及清除体内自由基有关。

9、雷公藤

程基焱等应用健康新生儿包皮建立体外培养真皮成纤维细胞光老化模型，分组后应用中药雷公藤的有效成分雷公藤甲素与芳维甲酸乙酯进行干扰，然后用免疫组织化学技术观察衰老皮肤真皮成纤维细胞的基质金属蛋白酶表达的变化，用光学显微镜观察成纤维细胞形态变化。结果发现雷公藤甲素的3种浓度对体外培养的真皮成纤维细胞胞质内MMP-1、MMP-3的表达的抑制作用均与芳维甲酸乙酯的相似，提示3种浓度雷公藤甲素对皮肤光老化均具有与维甲酸相似的预防和治疗作用，即通过调节基质金属蛋白酶的活性而防治皮肤的光老化。

10、巴豆

朱彦君等通过应用巴豆油外涂对经过UVA、UVB照射20周后的无毛小鼠光老化皮肤进行治疗，研究发现经治疗后60d皮肤纹理变得细腻，皮沟、皮脊分布均匀，皮肤纹理在皮肤平均粗糙度、算术平均粗糙度和皮肤平滑深度三方而均有明显差异，治疗组表皮、真皮结构随着时间的延长逐渐恢复，治疗30d时基本恢复正常。表明应用巴豆油化学脱皮剂，对光老化的无毛小鼠进行治疗，通过皮肤纹理、皮肤的病理组织学检测证明，巴豆油能逆转光老化引起的无毛小鼠表皮、真皮组织改变，这为临床应用巴豆油治疗皮肤光老化疾病提供了实验基础。

11、绞股蓝

王丽红等研究内服绞股蓝对紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化模型的影响，把无毛小鼠随机分组，模拟紫外线长期照射16周，造成皮肤光老化模型，给药组照射同时灌胃绞股蓝提取液，采用病理组织切片制片技术，HE染色以40倍光镜观察真皮结构改变，并以生化分析方法测定SOD活性，HYP及MDA含量。结果发现绞股蓝低、中、高剂量组对SOD活性均有提高作用（P<0.05），中、高剂量组可提高HYP含量，降低MDA含量。实验表明绞股蓝提取液具有拮抗紫外线照射引起的无毛小鼠皮肤光老化的作用。

12、杜仲

Ho等研究发现从杜仲中分离的桃叶珊瑚苷，能够很显著地减少紫外线引起的人成纤维细胞中MMP-1的生成，与对照组相比，能够抑制MMP- 1的产生近57%，并抑制MMP- 1mRNA的表达。这些结果表明桃叶珊瑚苷是一种可以用来防治紫外线的潜在物质。

13、何首乌

Hwang等研究何首乌提取物对紫外线照射引起无毛小鼠皮肤损伤的影响，照射后局部应用何首乌提取物14d后，用免疫组化法对皮肤可溶性超氧化物歧化酶（SOD）的活性进行了测定，结果发现与蒸馏水对照组相比，何首乌治疗组的SOD1表达的蛋白质及活性升高，并呈剂量依赖性。试验表明何首乌提取物可以抑制紫外线对SOD的破坏，说明何首乌可能内含抗皮肤光老化的物质。

14、其他天然植物

Alcaraz等研究局部应用一种蕨类植物（Poly-podium leucotomos， PL）的提取物对紫外线照射后无毛小鼠表皮变化的影响，结果发现与PL未处理的对照组小鼠相比，局部应用PL的治疗组小鼠皮褶厚度显著降低，另外与阳性对照组小鼠相比，治疗组小鼠光损害的组织学参数显著降低，其中包括真皮弹力纤维变性，而且有趣的是8周后停止紫外线照射后，治疗组患皮肤癌的小鼠数量也同样减少。实验初步表明这种蕨类植物有助于改善和局部抑制皮肤光老化小鼠的组织学损害，并且可能有助于降低紫外线诱发的小鼠患皮肤肿瘤的数量Moon等研究表明，蒜头素提取物和堇菜属提取物可以显著减少紫外线诱导的人成纤维细胞中MMP- 1的表达并具有剂量依赖性。

随着对皮肤光老化发生机制研究的深入，中药对其防治作用的研究也取得了相应进展。众多对大然植物防光研究的结果表明，中药及其提取物在改善皮肤组织结构、提高抗氧化酶活性、抑制基质金属蛋白酶高表达、增强皮肤免疫防御功能等多方而对皮肤光老化起着防治作用。中药是拮抗皮肤光老化的一种有效手段，在改善和防治皮肤光老化方而具有巨大的潜力。

本发明药物是经发明人多年来精心研制，主要用于抗皮肤光老化。经研究表明，本发明药物对皮肤光老化具有较好的治疗效果。

在本发明药物中原料药的基源如下：

山青皮为海桐花科海桐属植物大叶海桐Pittosporum daphniphylloides Hu et Wang[P. Daphniphylloides sensu Rehd. et Wils.]的树皮和果实。

桤木皮为桦木科桤木属桤木Alnus cremastogyne Burk.的树皮。

上述药材均购于哈药集团人民同泰药店。

发明内容

本发明的目的是提供一种山青皮与桤木皮的药物。

本发明的另一目的是提供该药物的制备方法。

本发明还提供了该药物的质量检测方法。

本发明还提供了该药物的制药用途。

本发明的目的是由以下方式实现的：

一种抗皮肤光老化的药物，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份。

该药物是优选由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，桤木皮2重量份。

该药物是优选还可以由以下重量份的原料制成的：山青皮2重量份，桤木皮1重量份。

该药物是优选还可以由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，桤木皮1重量份。

所述的药物可以制备成片剂、丸剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、口服液。

所述的药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得。

所述抗皮肤光老化的药物的质量检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份；该药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得；

其质量检测方法为：采用高效液相色谱法进行左旋表儿茶素的含量测定：

（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；检测波长：268nm；柱温：35℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL；

（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的左旋表儿茶素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

所述抗皮肤光老化的药物的质量检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份；该药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得。

其检测方法为：采用气相色谱法对百里香酚、牻牛儿醛进行含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：DB-1701型毛细管柱；检测器：氢火焰离子化检测器；载气：N₂，流量：25mL·mL^-1；氢气流量：45mL·mL^-1；空气流量：450mL·min^-1；分流比：7：2；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至130℃，每分钟10℃升至200℃，保持3.5min；内标法；

（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

（4）对照品溶液的制备：精密称取百里香酚对照品、牻牛儿醛对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含百里香酚0.301mg·mL^-1及牻牛儿醛0.901mg·mL^-1的对照品储备溶液，备用；

（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。

一种由山青皮、桤木皮制成的药物在制备治疗痤疮药物中的应用，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份。

一种由山青皮、桤木皮制成的药物在制备治疗黄褐斑药物中的应用，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，桤木皮1～2重量份。

实验一：本发明药物延缓皮肤光老化的药效学实验研究

本研究采用紫外线模拟日光照射诱发小鼠皮肤光老化模型，观察本发明药物对其皮肤衰老有关指标的影响，为本发明药物在延缓皮肤光老化方而的应用进一步提供实验依据。

1 材料

1.1动物

昆明种小鼠50只，体重20士2g，雌雄各半，黑龙江中医药大学佳木斯学院实验物中心提供。

1.2药品和试剂

本发明药物：处方：山青皮50g，桤木皮50g；

制备方法：（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。

对比药物A：处方：山青皮100g；制备方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物A。

对比药物B：处方：桤木皮100g；制备方法：取干燥的桤木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物B。

对比药物C：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物C。

对比药物D：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液，干燥，得对比药物D。

SOD测定试剂盒、MDA测定试剂盒、羟脯氨酸测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3主要仪器

紫外灯管（南京华强电子有限司，80W UVA灯和160W UVB灯）；紫外线强度测定仪（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，型号：ZQJ一254型）；紫外可见光分光光度计（苏州江东精密仪器有限公司，型号：752N）；组织匀浆机（上海越磁电子科技有限公司，型号：T10型）。

2 方法

2.1动物分组与给药

随机分为7组：

空白对照组（即正常组）：不进行紫外照射且不给药；

蒸馏水ig组（模型组）：紫外照射并ig等量蒸馏水；

本发明药物组（50mg/kg）：紫外照射并ig本发明药物水溶液；

对比药物A组（50 mg/kg）：紫外照射并ig对比药物A水溶液；

对比药物B组（50 mg/kg）：紫外照射并ig对比药物B水溶液；

对比药物C组（50 mg/kg）：紫外照射并ig对比药物C水溶液；

对比药物D组（50 mg/kg）：紫外照射并ig对比药物D水溶液；

ig组小鼠在进行紫外线照射前30min给药。

2.2造模

除正常对照组外，其余各组小鼠以10% 溶液取背部正中皮肤脱毛，暴露2cm ×2cm大小皮肤。模拟UV照射。照射光源：UVA灯80W，UVB灯160 W。光源在距离小鼠约40cm处进行照射。第1周每天照射1次，每次1h，第2周起每天照射2次，每次40min，持续照射至累计照射剂量达到UVA 304. SJ/，UVB 6.3J/。

2.3取材

第60天末次照射2h后，脱须椎处死小鼠，取脱毛部位皮肤约1，拟作羟脯氨酸含量检测；另取脱毛部位皮肤1，以20%福尔马林溶液固定，拟作成纤维细胞计数；取余脱毛背部皮肤0. 1 g左右，拟作MDA和SOD检测。

2.4成纤维细胞计数

取福尔马林溶液固定的皮肤组织切片，HE染色，显微镜下计成纤维细胞数（以每片计算1000个细胞，确定其中成纤维细胞日）。

2.5羟脯氨酸含量检测

精确称取0. 050g皮肤组织，加入90～100℃水解液中水解40min，离心l0min，取上清液。严格按羟脯氨酸测定试剂盒操作说明检测。

2.6MDA、 SOD含量检测

以预冷生理盐水漂洗所取0. 1g左右的皮肤组织，除去结缔组织和皮下脂肪，滤纸拭干，称重，将组织剪碎后倒入内切式匀浆管中，量取9倍该皮肤组织重量的预冷生理盐水，先取少量倒入装有组织块匀浆器中，冰水中匀浆15 min，然后倒入剩余生理盐水，制成10%组织匀浆。将10%组织匀浆以3000r/min离心l0min取上清液备用。严格按MDA、SOD试剂盒操作说明检测。

2.7统计学方法

结果以均数±标准差（ ±s）表示，用SPSS11.0软件进行方差分析及组间检验。

3 结果

3.1小鼠皮肤一般状态

正常组小鼠皮肤表而光滑有弹性，纹理清楚，无皱纹；

模型组小鼠皮肤表而有明显红斑，失去弹性和光泽，表皮角化、粗糙伴脱屑，有深的褶皱；

本发明药物量组小鼠皮肤皱纹已不明显，无明显红斑，纹理清楚，无皱纹，无脱屑，已接近正常组小鼠皮肤；

对比药物A组小鼠皮肤上述表现较模型组有良性逆转，红斑减少，局部皮肤凹凸不平，有脱屑，有皱纹；

对比药物B组小鼠皮肤上述表现较模型组有良性逆转，红斑减少，局部皮肤凹凸不平，有脱屑，有皱纹。

对比药物C组小鼠皮肤上述表现较模型组有良性逆转，红斑减少，局部皮肤凹凸不平，有脱屑，有皱纹；

对比药物D组小鼠皮肤上述表现较模型组有良性逆转，红斑减少，局部皮肤凹凸不平，有脱屑，有皱纹。

3.2本发明药物对小鼠皮肤成纤维细胞数目的影响

实验结果见表1-1。与正常组比较，模型组皮肤成纤维细胞数目显著降低（P<0.01）。本发明药物组与模型组相比，皮肤成纤维细胞数明显升高，有显著性差异（P < 0.05）；对比药物A组和对比药物B组，与模型组相比，皮肤成纤维细胞数没有升高；对比药物C组和对比药物D组，与模型组相比，皮肤成纤维细胞数略有升高，但无显著性差异。

3.3本发明药物对小鼠皮肤SOD、MDA的影响

实验结果见表1-1。与正常组比较，模型组皮肤SOD活性显著降低（P <0.01），MDA水平显著升高（P<0.01）。本发明药物组与模型组相比，皮肤SOD活性均明显升高（分别P <0.01）、MDA含量显著降低（P <0.01）；对比药物A组和对比药物B组，与模型组相比，皮肤SOD活性略几乎没有升高，MDA含量几乎没有降低；对比药物C组和对比药物D组，与模型组相比，皮肤SOD活性略有升高，但不明显，MDA含量略有降低，但无显著性差异。

3.4本发明药物对小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响

实验结果见表1-1。与正常组比较，模型组皮肤羟脯氨酸含量显著下降（P<0. 01）。本发明药物组与模型组相比，皮肤羟脯氨酸含量明显升高（P <0.05）；对比药物A组和对比药物B组，与模型组相比，皮肤羟脯氨酸含量几乎没有升高；对比药物C组和对比药物D组，与模型组相比，皮肤羟脯氨酸含量略有升高，但无显著性差异。

表1-1 对小鼠皮肤成纤维细胞数目、SOD、MDA、羟脯氨酸含量影响（±s，n=10）

注:与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

4讨论与结论

在现代医学众多衰老学说中，衰老的自由基学说已受到现代医学界普遍认同。皮肤老化是机体衰老的一部分，大量的研究证明自由基的积累损伤是皮肤组织老化的重要原因。本实验结果中，本发明药物可明显增强光老化小鼠皮肤组织SOD活性，降低MDA含量，表明本发明药物可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量，使自由基对成纤维细胞损害减轻，发挥延缓皮肤光老化的作用。

特别是，本发明药物的作用效果明显优于对比药物A、对比药物B、对比药物C、对比药物D，说明本发明药物中两种药味之间的配伍精良，缺一不可，并且在特定的制备方法下，两种药味之间的组合产生了明显的协同增效作用，产生了一加一大于二的技术效果。

实验二：高效液相色谱法测定本发明药物中左旋表儿茶素的含量

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（Agilent110高效液相色谱仪及工作站，G1311Aquat泵，G1314紫外检测器）。

1.2试药

左旋表儿茶素对照品（中国药品生物制品检定研究院）；本发明中药组合物；中药材（哈药集团人民同泰药店提供）；甲醇（色谱醇，上海生化工助剂厂）；其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1处方

山青皮500g，桤木皮500g。

2.2 制备方法：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。

2.3 左旋表儿茶素的含量测定

2.3.1 HPLC色谱条件

采用HypersilDs（4.0mm×125mm，5μm）色谱柱；流动相：比例为80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；检测波长：268nm；柱温：35℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL；在该色谱条件下，对照品及样品色谱峰良好，无山青皮阴性对照对测定无干扰。

2.3.2对照品溶液的制备

精密称取80℃干燥至恒重的左旋表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液。

2.3.3供试品溶液与阴性对照液的制备

精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；另按处方比例制备不含桤木皮的阴性对照品，同法制成阴性对照液。

2.3.4标准曲线的绘制

精密称取80℃干燥至恒重的左旋表儿茶素对照品适量，用甲醇制成10.4，20.8，41.6，83.2，166.4μgmL^-1系列浓度的溶液，分别精密量取上述5种浓度溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

以峰面积比值与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21.2763C-0.1391，r=0.9999。表明左旋表儿茶素在10.4～166.4μgmL^-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3.5稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μL，分别于0、1、2、4、8h进样，并计算左旋表儿茶素含量。结果8h内RSD为0.45%（n=5）。表明样品溶液在8h内稳定。

2.3.6重复性试验

按供试品溶液制备方法平行处理样品5份，依法测定左旋表儿茶素含量并计算。结果测得左旋表儿茶素平均含量为0.12mg·g^-1，RSD为1.3%。

2.3.7精密度实验

精密吸取左旋表儿茶素对照品溶液，重复进样5次，依法测定峰面积。结果RSD为0.23%（n=5）。表明精密度较好。

2.3.8回收率实验

精密称取已知左旋表儿茶素含量的同一批号的样品6份，按高、中、低浓度分别精密加入适量的左旋表儿茶素对照品溶液，按样品测定项下操作，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为100.3%，RSD为0.45%（n=5）。

2.3.9样品含量测定

分别量取对照品溶液和供试品溶液适量，用微孔滤膜滤过，各进样10μL，按上述色谱条件测定3批样品，平行测定5次。按外标法以峰面积计算供试品溶液左旋表儿茶素的含量。本品含左旋表儿茶素应为标示含量的95%～105%，以每1g样品含左旋表儿茶素计，不得少于0.12mg。3批样品含量分别为100.8%（RSD=1.2%），101.7%（RSD=1.3%），99.2%（RSD=1.1%）。

实验三：不同药物中左旋表儿茶素的含量测定

1 待测样品

1.1 本发明药物：处方：山青皮50g，桤木皮50g；

制备方法：（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。

1.2 对比药物A：处方：山青皮100g；制备方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物A。

1.3 对比药物B：处方：桤木皮100g；制备方法：取干燥的桤木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物B。

1.4 对比药物C：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物C。

1.5 对比药物D：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液，干燥，得对比药物D。

2 测定方法

采用本发明实验二提供的高效液相色谱法测定各个药物中的左旋表儿茶素的含量。

3 测定结果

测定结果见表3-1

3-1 样品含量测定结果

4 讨论与结论

从表3-1中可以看出，本发明药物中的左旋表儿茶素的含量明显高于其他药物，这可能也是本发明药物在治疗皮肤光老化方面的效果优于其他药物的原因。

实验四：气相色谱法同步测定本发明药物中百里香酚、牻牛儿醛的含量

1仪器与试药

Agilent7890N气相色谱仪：FID检测器，A.01.12.1色谱工作站；SGH－300高纯氢气发生器（北京东方精华科技苑科技有限公司）；色谱柱弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；梅特勒－托利多十万分之一电子分析天平；百里香酚对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；牻牛儿醛对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；本发明药物（参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备），试剂：环己酮，无水乙醇均为色谱纯。

2色谱条件

色谱柱：DB-1701型毛细管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；检测器：氢火焰离子化检测器（FID），载气：N₂，流量：25mL·mL^-1；氢气流量：45mL·mL^-1；空气流量：450mL·min^-1；分流比：7：2；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至130℃，每分钟10℃升至200℃，保持3.5min；内标法。

3试验方法与结果

3.1内标溶液的制备

取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1g含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。

3.2供试品溶液的制备

精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。

3.3对照品储备溶液的制备

精密称取百里香酚对照品、牻牛儿醛对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含百里香酚0.301mg·mL^-1及牻牛儿醛0.901mg·mL^-1的对照品储备溶液，备用；

3.4阴性对照溶液的制备

取按处方中未加百里香酚与牻牛儿醛的空白溶液，按“3.2”项下制备方法，制成阴性对照溶液。

3.5线性关系的考察

分别精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL对照品储备液于10mL容量瓶中，加内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别取1μL进样，记录色谱图，以百里香酚、牻牛儿醛与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），浓度（C）为横坐标（X），分别绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y（百里香酚）=1.1148X－0.0016，R²=0.9999，百里香酚浓度在0.144～2.552mg·mL^-1范围内，线性关系良好；Y（牻牛儿醛）=1.1347X+0.0035，R²=0.9999，牻牛儿醛浓度在0.195～3.466mg·mL^-1范围内，线性关系良好。

3.6精密度试验

取百里香酚浓度为0.230mg·mL^-1和牻牛儿醛浓度为0.290mg·mL^-1的对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，分别计算2种成分与内标的峰面积比值（A/A内标），百里香酚、牻牛儿醛的RSD分别为0.22%和1.3%（n=6）。

3.7重复性试验

取同一批样品，按样品测定项下的方法重复测定6次，结果百里香酚、牻牛儿醛的RSD分别为0.33%、1.6%（n=6）。

3.8稳定性试验

取同一批样品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、12h后测定，结果按百里香酚、牻牛儿醛的RSD分别为0.38%、0.35%，说明样品溶液在12h内测定，结果稳定。

3.9加样回收率试验

取已知含量的样品溶液9份，并加入适当的低、中、高对照品溶液，按样品测定法测定百里香酚、牻牛儿醛含量，分别计算回收率，结果见表4-1。

表4-1 回收率测定结果（n=9，%）

结果表明，本方法的回收率较好，百里香酚的回收率分别在99.4%～100.2%，牻牛儿醛的回收率在98.1%～100.7%之间，相对标准偏差分别为0.28%与0.86%，本测定方法能满足本发明药物中百里香酚与牻牛儿醛的含量测定。

3.10定量限与检测限

采用“信噪比法”来确定本研究的定量限和检测限，取线性标准溶液适量，采用加无水乙醇逐步稀释法进行稀释，当进样浓度为6.27、9.90μg·mL^-1时，取1μL进样，连续进样3次，得到百里香酚、内标、牻牛儿醛信噪比平均值分别接近10.0，可以以此浓度为定量限；继续稀释进样，当进样浓度为1.044、1.65μg·mL^-1，连续进样3次，得到百里香酚、内标、牻牛儿醛信噪比平均值接近3.0，可以以此浓度为检测限。

3.11耐用性试验

经不同色谱柱考察和溶液稳定性考察，以及柱温，进样口温度和检测器温度考察，表明本方法耐用性良好，适用于本发明药物中两组分的含量测定。

3.11.1色谱柱的影响

选用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品的含量，计算含量值的RSD%分别为1.3、1.7、1.6。结果表明，样品用不同的PEG色谱柱测定含量，百里香酚、牻牛儿醛与内标均可有效分离，说明方法耐用性良好。

3.11.2柱温的影响

柱温对分离的影响主要为影响主峰的出峰时间，温度越高，主峰出峰时间越短，在第一阶段为80℃时，百里香酚主峰百里香酚与杂质峰能保证基线分离，第二阶段130℃时牻牛儿醛主峰与杂质峰能保证基线分离，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

3.11.3进样口温度的影响

进样口温度高于柱温时，百里香酚与杂质峰能够保证基线分离，牻牛儿醛与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

3.11.4检测器温度的影响

检测器温度高于进样口温度时，百里香酚与杂质峰能够保证基线分离，牻牛儿醛与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。

3.12样品含量测定结果

经过方法学验证，本含量测定方法操作简便、准确度高、重现性好，能更有效地控制产品质量。因此应用该方法对10批样品，按照前述方法采用内标法进行含量测定，结果见表4-2。

表4-2 样品含量测定结果

4讨论

4.1系统适应性试验

在本试验气相色谱系统下，分别吸取样品测定用混合对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各1μL，记录色谱图。2种组分与内标物均能够较好地分离，阴性无干扰。该系统适应性结果见表4-3。

表4-3系统适应性试验

4.2内标物的选择

曾试用过环己酮、萘、联苯、水杨酸甲酯等，因样品挥发性成分多，结果以环己酮的保留时间及分离效果最合适。

4.3柱温的选择

百里香酚、环己酮和牻牛儿醛的沸点相差比较大，柱温低时，牻牛儿醛的保留时间过长，柱温高时，百里香酚与杂质不能有效分离，经采用两段程序升温方式能满足两种成分的同时分析。

4.4本品的含量限度

由10批次产品测定结果，暂定本品的含量限度为：本品每1g含百里香酚不得少于0.200mg，含牻牛儿醛不得少于0.200mg。

本方法对2种成分同时进行分离与检测，方法快速、灵敏，分离度好、专属性好，能有效地控制药品质量。

实验五：不同药物中百里香酚、牻牛儿醛的含量测定

1 待测样品

1.1 本发明药物：处方：山青皮50g，桤木皮50g；

制备方法：（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。

1.2 对比药物A：处方：山青皮100g；制备方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物A。

1.3 对比药物B：处方：桤木皮100g；制备方法：取干燥的桤木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物B。

1.4 对比药物C：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液，干燥，得对比药物C。

1.5 对比药物D：处方：山青皮50g，桤木皮50g；制备方法：取干燥的山青皮50g，桤木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液，干燥，得对比药物D。

2 测定方法

采用本发明实验四提供的气相色谱法同步测定百里香酚、牻牛儿醛的含量的方法，进行测定。

3 测定结果

测定结果见表5-1

5-1 样品含量测定结果

4 讨论与结论

从表5-1中可以看出，本发明药物中的百里香酚、牻牛儿醛的含量明显高于其他药物，这可能也是本发明药物在治疗皮肤光老化方面的效果优于其他药物的原因。

实验六：本发明药物治疗皮肤光老化疗效观察

目前激光和强脉光治疗新进展、疗效方面的文献较多，而疗效维持的时效、延缓反弹方面的报道却较很少。通过临床观察，发明人发现对于皮肤光老化经过激光和强脉光治疗治疗后，面临反弹的问题，主要表现为色素沉着。2014年6月～2014年12月，发明人采用口服本发明药物治疗光老化患者，取得了较好效果。

1 资料和方法

1.1 临床资料

共16例光老化患者，其中女15例，男1例，年龄35～45岁。临床表现有面部皮肤粗糙、弹性差、色素沉着、黄褐斑、老年斑等。

入选患者均符合以下条件：①无光敏性皮炎病史；②近1个月未服用光敏性药物；③治疗前无阳光暴晒史；④近1个月未使用祛斑产品；⑤无免疫缺陷及凝血障碍方面的疾病；⑥均同意治疗期、观察期注意防晒；⑦签署知情同意书。

1.2 方法

将患者随机分为2组：

Ⅰ组（口服本发明药物）：8例，本发明药物，参照说明书实施例2制备，2片/次，2次/天，30天为一个疗程，连续4个疗程；

Ⅱ组（强脉冲光系统或调Q、像素激光）：8例，根据个体面部皮肤光老化的情况选择强脉冲光590nm或者1064nm、532nm调Q双波长激光、2940nm像素激光并选择相应的能量进行治疗，2次治疗间隔22～25天，5次为一个疗程。

1.3疗效评价及标准

描述性评分方法参考Glogau（Glogau RG. Physiologic and structuralchanges associated with aging shin [J].DermatolClin,1997,15：555-559.），图像分析法是在Chung（Chung JH,Lee SH,Youn CS,et al.Cutaneous photodamage in Koreans：influence of sex,sun-exposure,smoking and skin color[J].Arch Dermatol,2001,137：1043-1051）、Larnier（Larnier C, Ortonne JP,Venot A, etal. Evaluation ofcutaneous photodamage using a photographic scale[J].Br J Dermatol,1994,130：167-173.）、Lever（Lever L, Kumar P, Marks R.Topical retinoic acid fortreatmentof solar damage[J].Br J Dermatol,1990,122：91-98）、Watson（Watson RE,GriffithsCE.Pathogenic aspects of cutaneous photoaging

[J].J Cosmet Dermatol,2005,4：230-236.）等的评价方法基础上略加改进。

1.3.1 疗效标准

显效：治疗前后面部皮肤光老化评分减轻2个等级或者减轻跨2个分值（如从5分→3分或以下）；

有效：治疗前后面部皮肤光老化评分减轻1个等级或者减轻跨1个分值（如从3分→2分）；

无效：治疗前后面部皮肤光老化评价减轻低于1个等级或者几乎没变化。

1.3.2 每位观察者治疗前拍面部正位、侧位片，用描述性评价法结合评价图像分析评分法进行面部皮肤光老化评价；Ⅰ组每月评价一次，Ⅱ组每次激光治疗前评价一次；治疗结束后，均在第6、12、18个月随访一次，拍照并进行评价。

2 结果

共有16例患者，治疗4个月后疗效统计见表6-1，各组反弹情况见表6-2。

表6-1 治疗4个月后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组疗效统计（例，%）

经统计学处理显示，Ⅰ组疗效优于Ⅱ组，P＜0.005；

表6-2 各组6、12、18个月反弹情况（例）

统计学处理显示，第6个月的反弹例数，2组之间无差异，P＞0.05；在第12个月、第18个月时，Ⅰ组与Ⅱ组（P＜0.05），反弹例数有差异，Ⅰ组反弹例数低于Ⅱ组（P＜0.05）。

3结论

口服本发明药物治疗皮肤光老化，效果好、安全可靠。效果优于激光、强脉冲光治疗，特别是在降低反弹率和推迟反弹时间上有明显优势。

实验七：本发明药物治疗痤疮的实验研究

本发明药物对皮肤光老化有非常好的治疗效果，研究人员预测，本发明药物对痤疮也应该具有一定的治疗效果，于是便开展了尝试性实验研究，观察本发明药物对痤疮的治疗效果。

1实验材料

1.1动物

雄性金黄地鼠，重（100±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，微生物控制为清洁级。

1.2药物

本发明药物：本发明药物：处方：山青皮50g，桤木皮50g；

制备方法：（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。制成0.200g/mL浓度的本发明药物溶液备用。

对照组：清热暗疮片（广州王老吉药业股份有限公司，国药准字Z44020578），主要成分：穿心莲浸膏、人工牛黄、金银花、蒲公英浸膏、大黄浸膏、山兰根浸膏、桅子浸膏、珍珠层粉、甘草。制成0.200g/mL浓度的清热暗疮片溶液备用。

模型组：生理盐水。

1.3主要仪器及试剂

LD4-2型高速离心机（北京医用离心机厂）、GC-1200C放射免疫计数器（中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司）、脱水机、生物组织自动包埋机、摊片机、切片机。睾酮（T）、雌二醇（E₂）试剂盒均由中美合资天津九鼎医学生物工程有限公司提供。

2实验方法

2.1动物分组

雄性金黄地鼠饲养3天，无不良反应，饮食、饮水、活动正常者纳入实验。随机分成3组：模型组、清热暗疮片组、本发明药物组，每组各10只。

2.2动物给药

饲养3天后开始灌胃给药，连续灌胃30天，各组金黄地鼠分别按以下方案给药：模型组：以生理盐水灌胃，2mL/天；清热暗疮片组：以0.200g/mL浓度的清热暗疮片溶液灌胃，2mL/天；本发明药物组以0.800g/mL浓度的本发明药物溶液灌胃，2mL/天。

2.3模型

以金黄地鼠侧腹部皮脂腺斑作为实验模型。

2.4标本采集

于实验第34天取材，取材前禁食，自由饮水，24h后，用摘除眼球法采血3~5mL滴入试管，分离血清送检。采血后脱颈椎处死动物，在强光照射下，用游标卡尺测量右侧斑块的最大横径和最大纵径。立即取下金黄地鼠侧腹部皮脂腺斑组织，切取约1cm×1cm组织块以10%甲醛固定液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，于光镜下观察皮脂腺斑的组织学改变。

2.5指标观测及方法

2.5.1一般情况

每日观察记录金黄地鼠的饮食、饮水、大小便、精神状况及活动度。

2.5.2测量皮脂腺斑的大小

实验开始时先用电动剃须刀剃尽金黄地鼠背部毛，将地鼠用乙醚麻醉后，在强光照射下，用游标卡尺测量右侧斑块的最大横径和最大纵径。实验结束时再次将鼠毛剃尽，用同样的方法、在同样的部位测量右侧斑块的最大横径和最大纵径。

2.5.3血清睾酮（T）的测定

将所取鼠血4℃、3000r/min离心10min，分离血清送检，采用双抗体放射免疫法进行检测，具体操作按试剂盒说明书进行。由黑龙江中医药大学附属医院同位素室协助完成。

2.5.4血清雌二醇（E₂）的测定

将所取鼠血4℃、3000r/min离心10min，分离血清送检，采用液相平衡竞争放射免疫分析法进行检测，具体操作按试剂盒说明书进行。由黑龙江中医药大学附属医院同位素室协助完成。

2.5.5观察皮脂腺斑显微结构的变化

将10%甲醛固定液中的皮脂腺斑组织固定脱水后，常规石蜡包埋，切片，HE染色后，光镜下观察皮脂腺班的显微结构。由黑龙江中医药大学附属医院病理科协助完成。

3实验结果

3.1对金黄地鼠皮脂腺斑大小的影响

实验结果显示用药前，各组动物皮脂腺斑大小经统计处理，差别无统计学意义（P>0.05），各组之间具有可比性；用药后，本发明药物组与模型组之间没有显著性差异（P>0.05）。见表7-1。

表7-1 对金黄地鼠皮脂腺斑大小的影响（mm²，±s）

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.2对金黄地鼠血清睾酮水平的影响

实验结果显示：用药后睾酮水平比较，本发明药物组与对照组之间没有显著性差异（P>0.05）。见表7-2。

表7-2治疗后各组金黄地鼠血清睾酮（T）水平的比较（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.3本发明药物对金黄地鼠血清雌二醇水平的影响

用药后，雌二醇水平比较，本发明药物组与模型组之间没有显著性差异（P>0.05）。见表7-3。

表7-3治疗后各组金黄地鼠血清雌二醇（E₂）水平的比较（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05。

4 结论

以金黄地鼠侧腹部皮脂腺斑作为实验模型，观察本发明药物对皮脂腺斑、血清激素的影响，结果表明，本发明药物不能缩小皮脂腺斑、不能使皮脂腺变薄，不能降低血清睾酮、也不能提高血清雌二醇水平。通过本实验初步了解本发明药物不能治疗痤疮，对治疗痤疮无效。

具体实施方式：

实施例1：本发明药物

处方：山青皮50g，桤木皮50g

制备方法：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，即得。

实施例2：本发明药物硬胶囊剂

药物处方：山青皮500g，桤木皮500g

制备方法：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入硬胶囊，制成1000粒。

采用高效液相色谱法对左旋表儿茶素进行含量测定：

（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；检测波长：268nm；柱温：35℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL；

（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的左旋表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测，检测结果为左旋表儿茶素的含量为0.1823mg/g。

采用气相色谱法对百里香酚、牻牛儿醛进行含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：DB-1701型毛细管柱；检测器：氢火焰离子化检测器；载气：N₂，流量，1.0mL·mL^-1；氢气流量：45mL·mL^-1；空气流量：450mL·min^-1；分流比：7：2；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至130℃，每分钟10℃升至200℃，保持3.5min；内标法；

（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

（4）对照品溶液的制备：精密称取百里香酚对照品、牻牛儿醛对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含百里香酚0.301mg·mL^-1及牻牛儿醛0.901mg·mL^-1的对照品储备溶液，备用；

（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。

（6）测定结果：本品每1g含百里香酚为0.225mg，含牻牛儿醛为0.231mg。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种抗皮肤光老化的药物，其特征在于，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，桤木皮1重量份；该药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得。

2.一种抗皮肤光老化的药物的检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，桤木皮1重量份；该药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得；

其特征在于，采用高效液相色谱法进行左旋表儿茶素的含量测定：

（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；检测波长：268nm；柱温：35℃；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL；

（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的左旋表儿茶素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密称取该药物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

3.一种抗皮肤光老化的药物的检测方法，该药物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，桤木皮1重量份；该药物采用如下方法制备：

（1）取山青皮、桤木皮，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取挥发油，得挥发油提取物Ⅰ，备用；

（2）将山青皮、桤木皮水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤，得蒸馏后的水溶液，加热浓缩，得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ，备用；保留水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，备用；

（3）取步骤（2）所得水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小时，合并乙醇提取液，滤过，得乙醇提取液，回收乙醇并浓缩，得乙醇提取浓缩液Ⅳ，备用；保留乙醇提取后的药渣Ⅴ，备用；

（4）将步骤（3）所得乙醇提取后的药渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小时，合并水提取液，滤过，得水提取液，加热浓缩，得水提取浓缩液Ⅵ；

（5）将步骤（3）所得混合乙醇提取浓缩液Ⅳ、步骤（4）所得水提取浓缩液Ⅵ、步骤（2）所得蒸馏后的水浓缩液Ⅱ合并，混匀，干燥，粉碎，再加入步骤（1）所得挥发油提取物Ⅰ，混匀，装入胶囊即得；

其特征在于，采用气相色谱法对百里香酚、牻牛儿醛进行含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：DB-1701型毛细管柱；检测器：氢火焰离子化检测器；载气：N₂，流量：25mL·mL^-1；氢气流量：45mL·mL^-1；空气流量：450mL·min^-1；分流比：7：2；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至130℃，每分钟10℃升至200℃，保持3.5min；内标法；

（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；

（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；

（4）对照品溶液的制备：精密称取百里香酚对照品、牻牛儿醛对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含百里香酚0.301mg·mL^-1及牻牛儿醛0.901mg·mL^-1的对照品储备溶液，备用；

（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。