CN106265342A - 一种红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，将红景天的根茎进行干燥并粉碎，加入酒精进行超声提取、过滤；将滤液减压浓缩，加入石油醚和乙酸乙酯进行萃取除杂，再往浓缩后的下层水相中加入正丁醇萃取红景天苷成分；将正丁醇部位减压浓缩得到的红景天粗提取液，进行D101大孔树脂吸附分离，取30％乙醇部位洗脱，浓缩；冷冻干燥后加入戊二醇和去离子水进行溶解，除菌，即得红景天抗氧化抗皱提取液。本发明采用从红景天中提取的红景天提取液可显著提高T‑SOD酶活力单位，经过人体安全性测试，具有抗氧化抗皱功效，可为化妆品等行业提供优质原料，具有较好的市场前景。

Description

一种红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法及其应用，具体涉及红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法及其在化妆品中的应用。

背景技术

红景天(Rhodiolarosea L.)为景天科(Crassulaceae)，红景天属多年生草本或亚灌木植物，是珍贵的药用植物，是重要的中草药材，也是藏医常用药材，素有“神草”之称。由于其生长环境恶劣，如缺氧、低温干燥、狂风、受紫外线照射、昼夜温差大，因而具有很强的生命力和特殊的适应性，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。

红景天的化学成分主要有黄酮类、酪醇、红景天苷(Salidroside)、谷甾醇、有机酸、挥发油、多糖、脂肪、蛋白质等。其中，红景天苷及其苷元酪醇是红景天主要有效成份，也是评价红景天及其提取物的最重要指标。根据目前公认的Harman衰老理论，随着年龄增长引起的退行性变是由自由基引起的。红景天作为一种传统药物，其药理作用与红景天的抗自由基作用密切相关。有学者发现，红景天浸液能提高机体免疫力和肌肉运动能力，增加体内SOD活性，降低甘油三酯含量，并能调整体内cAMP和cGMP的比值，具有延缓衰老的作用。

目前为止，有关红景天提取物的应用研究，多用于保健品、医药方面；有关红景天提取物用在化妆品原料开发方面的研究很少。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种应用于化妆品的红景天抗氧化抗皱提取液制备方法，实现了有效的对皮肤抗氧化抗皱的效果。

本发明的技术方案如下：所提供的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1]以红景天为原料，将红景天的根茎进行干燥并粉碎成20-30目的粉末；然后加入酒精进行超声提取、过滤；

2]将步骤1所得的滤液在48-55℃减压浓缩，得粗提取浸膏；再加水成悬浮液，加入2-4倍体积的石油醚去除红景天油脂类成分；

3]将步骤2所得的下层水相，减压浓缩去除残留的石油醚，再加入2-4倍体积的乙酸乙酯萃取，去除杂质；

4]将步骤3所得的下层水相，减压浓缩去除残留的乙酸乙酯，再加入2-4倍体积的正丁醇萃取红景天苷成分，将正丁醇层减压浓缩得红景天粗提取液，冷冻、干燥，即得红景天提取物；

5]将步骤4所得的红景天提取物加水溶解，采用D101大孔吸附树脂静态吸附分离，然后加入去离子水洗脱去除大极性水溶性成分，再用乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩得红景天抗氧化抗皱提取物；

6]将步骤5所得的红景天抗氧化抗皱提取物经冷冻干燥后，加入戊二醇和去离子水进行溶解，除菌，即得红景天抗氧化抗皱提取液。

上述步骤1中的超声提取、过滤具体是：在常温条件下，用质量浓度为90％-95％的工业酒精提取2-3次，每次2-5h，过滤；再用质量浓度为48％-52％的工业酒精提取2-3次，每次2-5h，再过滤；所述步骤1中红景天与每次酒精的质量/体积比为1:7-12。

上述步骤2和步骤3重复进行2-3次。

上述步骤4中的冷冻温度为-80℃。

上述步骤5中乙醇的体积分数为30％。

上述步骤5中的D101大孔吸附树脂的吸附分离是采用质量浓度为90％-95％乙醇浸泡至少24小时，用乙醇湿法装柱，继续用乙醇洗脱至洗脱液与水混合为澄清为止，再用质量浓度为4％-5％的稀盐酸洗脱柱子至7-8个柱体积，再用水洗脱至洗脱液的PH值为中性，并将液面放至与树脂齐平，以便上样；

上述步骤5中红景天提取液上样量与D101大孔吸附树脂的质量比为1:10-15。

上述步骤6中戊二醇的质量浓度为48％-52％。

上述步骤6中除菌具体是经0.22μm滤膜的万级操作台除菌。

上述方法制备的红景天抗氧化抗皱提取液应用于制备化妆水、乳液、精华和眼霜的添加剂。其中，红景天苷采用高效液相色谱法检测，以红景天苷为标准品，确定红景天苷的含量以及HPLC检测法分析其主要成分保留时间，所得红景天苷提取物加入50％的戊二醇水进行溶解，可应用于化妆水、乳液、精华、眼霜等的添加剂。

本发明的优点：

1、本发明采用从红景天中提取的红景天提取液可显著提高T-SOD酶活力单位，经过人体安全性测试，具有抗氧化抗皱功效，可为化妆品等行业提供优质原料，具有较好的市场前景。

2、本发明采用溶剂提取、萃取以及大孔吸附树脂分离法，快速分离得到高效抗皱功效红景天提取液。

3、本发明提取的红景天抗氧化抗皱提取液中红景天苷含量达14％。

附图说明

图1是本发明红景天提取液制备工艺流程图；

图2是本发明红景天提取物的HPLC谱图；

图3是本发明红景天苷标准曲线图；

图4是本发明红景天提取物对SOD酶活性的影响示意图；

图5是本发明红景天提取液急性毒性实验结果示意图。

具体实施方式

实施例1：

(1)取红景天原料1kg，干燥后进行粉碎，过20-30目筛；

(2)加入95％的酒精10L超声提取2次，每次2-5h，过滤；用50％的工业酒精10L超声提取2次，每次2-5h，过滤，合并滤液，滤液于48℃减压浓缩得粗提取浸膏备用；

(3)粗提取浸膏加入适量水形成混悬液后加入1L石油醚连续萃取三次，去除脂溶性成分；下层水相加入1L乙酸乙酯连续萃取三次,除杂质；

(4)乙酸乙酯萃取后的下层水相加入1.5L正丁醇萃取，重复三次，合并萃取液，于-0.09MPa、60℃下减压浓缩回收溶剂，得到红景天粗提取浸膏，浸膏-80℃冷冻干燥得红景天粗提物，共76g。

(5)称取40g粗提物，进行D101大孔吸附树脂分离，静态吸附4h，依次用去离子水、30％的乙醇、50％的乙醇、100％的乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，洗脱体积3L，流速为20ml/min，减压浓缩，冷冻干燥，得红景天抗氧化抗皱提取物，经用HPLC法测定红景天苷含量约为14％，HPLC检测谱图见图2。

HPLC谱图条件：流动相：A相甲醇，D相水；0.01-30min，A＝15％；C-18，250mm*4.6mm，5μm；流速1ml/min；柱温箱：30℃；进样量：10μl；样品浓度5mg/ml。

实施例2：

(1)取红景天原料2kg，干燥后进行粉碎，过20-30目筛；

(2)加入95％的酒精20L超声提取2次，每次2-5h，过滤；用50％的工业酒精20L超声提取2次，每次2-5h，过滤，合并滤液，滤液于48℃减压浓缩得粗提取浸膏备用；

(3)粗提取浸膏加入适量水形成混悬液后加入3L石油醚连续萃取三次，去除脂溶性成分；下层水相加入3L乙酸乙酯连续萃取三次，除杂质；

(4)乙酸乙酯萃取后的下层水相加入3L正丁醇萃取，重复三次，合并萃取液，于-0.09MPa、60℃下减压浓缩回收溶剂，得到红景天粗提取浸膏，浸膏-80℃冷冻干燥得红景天粗提物，共155g。

(5)称取40g粗提物，进行D101大孔吸附树脂分离，静态吸附4h，依次用去离子水、30％的乙醇、50％的乙醇、100％的乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，洗脱体积3L，流速为20ml/min，减压浓缩，冷冻干燥，得红景天抗氧化抗皱提取物，经用HPLC法测定红景天苷含量约为14.5％。

实施例3：

(1)取红景天原料5kg，干燥后进行粉碎，过20-30目筛；

(2)加入95％的酒精35L超声提取2次，每次2-5h，过滤；用50％的工业酒精35L超声提取2次，每次2-5h，过滤，合并滤液，滤液于48℃减压浓缩得粗提取浸膏备用；

(3)粗提取浸膏加入适量水形成混悬液后加入5L石油醚连续萃取三次，去除脂溶性成分；下层水相加入5L乙酸乙酯连续萃取三次，除杂质；

(4)乙酸乙酯萃取后的下层水相加入5L正丁醇萃取，重复三次，合并萃取液，于-0.09MPa、60℃下减压浓缩回收溶剂，得到红景天粗提取浸膏，浸膏-80℃冷冻干燥得红景天粗提物，共390g。

(5)称取40g粗提物，进行D101大孔吸附树脂分离，静态吸附4h，依次用去离子水、30％的乙醇、50％的乙醇、100％的乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，洗脱体积3L，流速为20ml/min，减压浓缩，冷冻干燥，得红景天抗氧化抗皱提取物，经用HPLC法测定红景天苷含量约为14％。

将本发明所得的红景天抗氧化抗皱提取液进行抗氧化活性评价、急性口毒性实验、多次皮肤刺激实验、急性眼部刺激实验、人体斑贴实验验证，具体如下：

一、抗氧化活性评价

将成纤维细胞接种于平皿中，待铺板率达到60％时，即可进行给药试验；实验组采用既定的药物浓度刺激，对照组(阴性组)采用空白培养液进行孵育，阳性组采用VC对照。孵育后24h胰酶消化细胞，收集细胞，800rpm，5min离心，PBS清洗3次，后加入一定量的PBS，吹打混匀，置入-80℃冰箱，反复冻融一定次数，离心后，取上清液，置于4℃冰箱。参照BCA蛋白定量说明书，进行蛋白浓度测定，计算测定SOD所需蛋白量；参照SOD活性测定说明书，进行活性测定，计算SOD活力单位；结果显示与VC对照，红景天提取物可显著提高T-SOD酶活力单位，如图4所示。

二、急性毒性实验

根据2007版《化妆品卫生规范》，筛选10只健康小鼠，雌雄各半，急性毒性试验中一次限量法的操作方法，以20ml/kg的剂量将待检品以灌胃的方式作用于相对应的动物。灌胃结束后禁食3～4h。随后观察和记录动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。如图5所示，结果显示，红景天提取物安全无毒。

三、多次皮肤刺激实验

挑选白色，皮肤光滑无伤口兔子，性别不限，雌性必须为未孕和未曾产仔兔子，试验前彻底除去兔子背部脊柱两侧被毛，以备涂抹试验样品，做四组平行；在每只兔背部涂抹植物抗敏舒缓剂，设置空白对照，溶剂对照为50％1,3-丁二醇去离子水的混合物，阳性对照20％SDS溶液，连续涂抹14d，从第二天开始每次涂抹前剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物，计分并记录试验结果，见表1。

表1红景天提取液多次皮肤刺激实验结果

由表1的实验结果可以看出，根据2007版《化妆品卫生规范》判定红景天提取物无皮肤刺激性。

四、急性眼部刺激实验

试验前检查兔子双眼，挑选双眼无刺激现象、无角膜和结膜缺损的兔子在试验兔右眼结膜内滴入0.1ml受试液，左眼不做任何处理作为对照，于试验后1h、24h、48h、72h观察并记录双眼有无异常情况，按照《化妆品卫生规范》(2007版)中急性眼刺激实验如表2的计分原则计分。

表2红景天提取液急性毒性实验结果

从表2可以看出，急性眼部刺激实验结果显示红景天提取物无眼部刺激性。

五、人体斑贴实验

筛选年龄25-50岁志愿者，将红景天苷提取物分别滴加于斑试器小孔中，用量约20-25μl，贴于志愿者手臂内侧，阴性对照为溶剂组，空白对照为未做任何处理。将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂区侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，贴服48h。去除受试物斑贴器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应，如果为阴性，于斑贴实验后24h，48h分别再观察一次。按化妆品规范要求记录反应结果，见表3。

表3红景天提取液人体斑贴实验结果

从表3可以看出，人体斑贴实验结果显示红景天提取物无皮肤刺激性。

经过实施例及实验验证，本发明所得的红景天抗氧化抗皱提取液满足人体安全性测试，具体很好的抗氧化抗皱功效，可为化妆品等行业提供优质原料，同时本发明提取的红景天抗氧化抗皱提取液分离纯化方法简单、操作方便、适用于工业生产。

Claims (10)

1.一种红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1]以红景天为原料，将红景天的根茎进行干燥并粉碎成20-30目的粉末；然后加入酒精进行超声提取、过滤；

2]将步骤1所得的滤液在48-55℃减压浓缩，得粗提取浸膏；再加水成悬浮液，加入2-4倍体积的石油醚去除红景天油脂类成分；

3]将步骤2所得的下层水相，减压浓缩去除残留的石油醚，再加入2-4倍体积的乙酸乙酯萃取，去除杂质；

4]将步骤3所得的下层水相，减压浓缩去除残留的乙酸乙酯，再加入2-4倍体积的正丁醇萃取红景天苷成分，将正丁醇层减压浓缩得红景天粗提取液，冷冻、干燥，即得红景天提取物；

5]将步骤4所得的红景天提取物加水溶解，采用D101大孔吸附树脂静态吸附分离，然后加入去离子水洗脱去除大极性水溶性成分，再用乙醇洗脱，将洗脱液减压浓缩得红景天抗氧化抗皱提取物；

6]将步骤5所得的红景天抗氧化抗皱提取物经冷冻干燥后，加入戊二醇和去离子水进行溶解，除菌，即得红景天抗氧化抗皱提取液。

2.根据权利要求1所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的超声提取、过滤具体是：在常温条件下，用质量浓度为90％-95％的工业酒精提取2-3次，每次2-5h，过滤；再用质量浓度为48％-52％的工业酒精提取2-3次，每次2-5h，再过滤；所述步骤1中红景天与每次酒精的质量/体积比为1:7-12。

3.根据权利要求1所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤2和步骤3重复进行2-3次。

4.根据权利要求1所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的冷冻温度为-80℃。

5.根据权利要求1所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤5中乙醇的体积浓度为30％。

6.根据权利要求1或5所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤5中的D101大孔吸附树脂的吸附分离是采用质量浓度为90％-95％乙醇浸泡至少24小时，用乙醇湿法装柱，继续用乙醇洗脱至洗脱液与水混合为澄清为止，再用质量浓度为4％-5％的稀盐酸洗脱柱子至7-8个柱体积，再用水洗脱至洗脱液的PH值为中性，并将液面放至与树脂齐平。

7.根据权利要求6所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤5中红景天提取液与D101大孔吸附树脂的质量比为1:10-15。

8.根据权利1所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤6中戊二醇的质量浓度为48％-52％。

9.根据权利要求1或8所述的红景天抗氧化抗皱提取液的制备方法，其特征在于：所述步骤6中除菌具体是经0.22μm滤膜的万级操作台除菌。

10.按权利要求1所述方法制备的红景天抗氧化抗皱提取液应用于制备化妆水、乳液、精华和眼霜的添加剂。