CN106248833A - 牛乳寡糖测定方法 - Google Patents

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    • G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray

Abstract

本发明公开了一种牛乳寡糖测定方法，包括如下步骤：步骤一、提取牛乳寡糖粗品；步骤二、首先利用Sep‑Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化，得到纯化的牛乳寡糖液体，后利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖体进行富集，得到富集的牛乳寡糖液体，最后将富集的牛乳寡糖液体干燥，得到牛乳寡糖；步骤三、采用2‑氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理；以及步骤四、采用高效液相串联离子阱飞行时间质谱对衍生化的牛乳寡糖进行测定。本发明试验方法简单可行、结果稳定、可用于牛乳寡糖的分离和测定。

Description

牛乳寡糖测定方法
技术领域
本发明涉及一种牛乳寡糖测定方法。
背景技术
寡糖(低聚糖)是少数单糖(2-10个)缩合的聚合物，可通过多糖水解得到，是牛奶中最丰富的固体组成之一。研究表明，牛乳寡糖可以作为益生元刺激新生儿肠道有益微生物的生长。然而，由于牛乳中寡糖种类和结构的多样性，及其极微量的含量，使得牛乳中寡糖含量的测定和结构的测定存在很大挑战，目前国内并没有一个牛乳寡糖的检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种牛乳寡糖测定方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种牛乳寡糖测定方法，包括如下步骤：
步骤一、提取牛乳寡糖粗品；
步骤二、首先利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化，得到纯化的牛乳寡糖液体，之后利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖体进行富集，得到富集的牛乳寡糖液体，最后将富集的牛乳寡糖液体干燥，得到牛乳寡糖；
步骤三、采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理；以及
步骤四、采用高效液相串联离子阱飞行时间质谱对衍生化的牛乳寡糖进行测定。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，以体积份数计，所述步骤一中，提取牛乳寡糖粗品的具体方法包括：
1.1)取100份牛乳，于10℃、10×104g条件下超高速离心90min，除去底部的酪蛋白和上层的脂肪；以及
1.2)取50份中间水层加入100份的无水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min条件下离心30min，重复离心两次后，取上清液，然后用浓缩仪浓缩干燥，得到所述牛乳寡糖粗品。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，以体积份数计，所述步骤二中，利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化的具体方法包括：
2.1)首先用50份甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用100份0.1％(v/v)TFA润洗Sep-Pak C18柱子；以及
2.2)将所述牛乳寡糖粗品溶于2份0.1％(v/v)TFA中，然后上样到Sep-Pak C18柱中，收集过柱液体，将收集的液体再次加入Sep-Pak C18中，再次收集过柱液体，重复2次，最后用30份0.1％TFA(v/v)冲洗Sep-Pak C18，也收集过柱液体，合并过柱液体得到所述纯化的牛乳寡糖液体。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，以体积份数计，所述步骤二中，利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖液体进行富集的具体方法包括：
2.3)首先用3倍柱体积的含有0.10(v/v)％TFA的乙腈溶液80％(v/v)和纯水依次通过石墨化柱体，然后将所述纯化的牛乳寡糖液体上样于所述石墨化柱体中，控制流速约0.5～1ml/min，收集过柱液体，将过柱液体重复通过所述石墨化柱体若干次；
2.4)用3倍柱体积的纯水通过所述石墨化柱体；
2.5)分别采用5份含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液10％(v/v)、含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液20％(v/v)和含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液40％(v/v)对所述石墨化柱体分步洗脱，收集洗脱液，得到所述富集的牛乳寡糖液体。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，所述步骤三中，以体积份数计，采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理的具体步骤包括：
3.1)将所述牛乳寡糖溶于0.5份浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮中，该2-氨基吖啶酮的溶剂为体积比为3:17的冰醋酸和二甲基亚砜；
3.2)加入0.5份新鲜配制的浓度为1M的硼氰化钠溶液，反应后经11000g离心3min，然后在45℃温度下反应4h，最后加入1.5份50％(v/v)的二甲基亚砜溶液，以用于步骤四中的测定。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的液相条件为：
流动相A为乙腈，流动相B为浓度为10mM的甲酸铵pH4.5，
采用梯度洗脱：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A；液相剩余部分为流动相B。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的质谱条件为：
ESI离子源，正离子模式喷雾电压为4.5kV，负离子模式喷雾电压为-3.5kV，一级、二级离子扫描设为m/z 300～1000和m/z 1000～2000，加热模块和曲形脱溶剂管温度均为200℃，氮气流速为1.5L/min，离子累计时间为10ms，高纯度氩气作为CID碰撞及冷却气，检测器电压为1.58kV，IT真空为1.1×10-2Pa，TOF真空1.2×10-4Pa。
优选的是，所述的牛乳寡糖测定方法中，所述步骤二中，所述干燥采用浓缩冻干。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明利用Sep-Pak C18柱和石墨化碳柱对已脱脂和除去蛋白质的牛乳进行分离纯化，并采用2-氨基吖啶酮(2-Aminoacridone,AMAC)衍生化试剂对其进行衍生化处理，最终采用高效液相串联离子阱飞行时间质谱(highperformance liquid ion trap tandemtime of flight-mass spectrometry,HPLC IT-TOF-MS)对牛乳中寡糖进行测定，鉴定了7种牛乳寡糖并实现了对该7种牛乳寡糖结构组成的分析。
本发明试验方法简单可行、结果稳定、可用于牛乳寡糖的分离和测定。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中质量扫描范围为300～1000D的寡糖的质谱图谱；
图2为本发明其中一个实施例中质量扫描范围为1000～2000D的寡糖的质谱图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种牛乳寡糖测定方法，包括如下步骤：
步骤一、提取牛乳寡糖粗品；
步骤二、首先利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化，得到纯化的牛乳寡糖液体，之后利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖体进行富集，得到富集的牛乳寡糖液体，最后将富集的牛乳寡糖液体干燥，得到牛乳寡糖；
步骤三、采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理；衍生化是因为糖不带发光基团，用2-AMAC使其带上荧光基团，便于检测，增加灵敏度。以及
步骤四、采用高效液相串联离子阱飞行时间质谱对衍生化的牛乳寡糖进行测定。高效液相串联离子阱飞行时间质谱是高分辨质谱，能够利用质荷比来初步定性，初步定性后可进行打二级质谱根据碎片来分析单糖组成。
在上述方案中，作为优选，以体积份数计，所述步骤一中，提取牛乳寡糖粗品的具体方法包括：
1.1)取100份牛乳，于10℃、10×104g条件下超高速离心90min，除去底部的酪蛋白和上层的脂肪；以及
1.2)取50份中间水层加入100份的无水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min条件下离心30min，重复离心两次后，取上清液，然后用浓缩仪浓缩干燥，得到所述牛乳寡糖粗品。
在上述方案中，作为优选，，以体积份数计，所述步骤二中，利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化的具体方法包括：
2.1)首先用50份甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用100份0.1％(v/v)TFA润洗Sep-Pak C18柱子；以及
2.2)将所述牛乳寡糖粗品溶于2份0.1％(v/v)TFA中，然后上样到Sep-Pak C18柱中，收集过柱液体，将收集的液体再次加入Sep-Pak C18中，再次收集过柱液体，重复2次，最后用30份0.1％TFA(v/v)冲洗Sep-Pak C18，也收集过柱液体，合并过柱液体得到所述纯化的牛乳寡糖液体。
在上述方案中，作为优选，以体积份数计，所述步骤二中，利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖液体进行富集的具体方法包括：
2.3)首先用3倍柱体积的含有0.10(v/v)％TFA的乙腈溶液80％(v/v)和纯水依次通过石墨化柱体，然后将所述纯化的牛乳寡糖液体上样于所述石墨化柱体中，控制流速约0.5～1ml/min，收集过柱液体，将过柱液体重复通过所述石墨化柱体若干次；
2.4)用3倍柱体积的纯水通过所述石墨化柱体；
2.5)分别采用5份含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液10％(v/v)、含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液20％(v/v)和含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液40％(v/v)对所述石墨化柱体分步洗脱，收集洗脱液，得到所述富集的牛乳寡糖液体。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，以体积份数计，采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理的具体步骤包括：
3.1)将所述牛乳寡糖溶于0.5份浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮中，该2-氨基吖啶酮的溶剂为体积比为3:17的冰醋酸和二甲基亚砜；
3.2)加入0.5份新鲜配制的浓度为1M的硼氰化钠溶液，反应后经11000g离心3min，然后在45℃温度下反应4h，最后加入1.5份50％(v/v)的二甲基亚砜溶液，以用于步骤四中的测定。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的液相条件为：
流动相A为乙腈，流动相B为浓度为10mM的甲酸铵pH4.5，
采用梯度洗脱：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A；液相剩余部分为流动相B。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的质谱条件为：
ESI离子源，正离子模式喷雾电压为4.5kV，负离子模式喷雾电压为-3.5kV，一级、二级离子扫描设为m/z 300～1000和m/z 1000～2000，加热模块和曲形脱溶剂管温度均为200℃，氮气流速为1.5L/min，离子累计时间为10ms，高纯度氩气作为CID碰撞及冷却气，检测器电压为1.58kV，IT真空为1.1×10-2Pa，TOF真空1.2×10-4Pa。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述干燥采用浓缩冻干。
实施例
牛乳寡糖的提取
(1)取10ml的牛乳，于10℃、10×104g条件下超高速离心90min，除去底部的酪蛋白和上层的脂肪。
(2)取5ml中间水层加入10ml的无水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min条件下离心30min(重复两遍)后取上清液，然后用浓缩仪浓缩干燥，即为牛乳寡糖粗品。
牛乳寡糖的纯化及富集
(1)用5ml甲醇平衡Sep-Pak C18柱(购自waters公司)，然后用10ml 0.1％TFA(三氟乙酸)润洗Sep-Pak C18柱子。Sep-Pak C18用于除杂质和一些小肽。
(2)将干燥的牛乳寡糖粗品溶于200μl 0.1％TFA，然后上样到Sep-Pak C18柱。收集过柱液体，用200μl 0.1％TFA润洗收集试管，将收集的液体加入Sep-Pak C18中，收集过柱液体，此步骤重复2次。最后用3ml 0.1％TFA冲洗Sep-Pak C18，也收集过柱液体，所得到收集液体为牛乳寡糖样品。
(3)依次用3倍柱体积的80％乙腈溶液(含0.10％TFA)和纯水通过石墨化柱体；将上一步的收集液上样，控制流速约0.5～1ml/min(重复此步骤)。
(4)用3倍柱体积的纯水通过石墨化柱体，为吸附于柱底PGC填料上的寡糖除盐。
(5)最后用0.5ml的10％乙腈溶液(含0.10％TFA)，20％乙腈溶液(含0.10％TFA)，40％乙腈溶液(含0.10％TFA)将寡糖分步洗脱，收集洗脱液浓缩冻干用于衍生化。
牛乳寡糖2-氨基吖啶酮(2-AMAC)的衍生化
(1)纯化后干燥的牛乳寡糖溶于50μl 0.1M 2-氨基吖啶酮(用冰醋酸和二甲基亚砜按3:17的体积比溶解)。
(2)加入50μl新鲜配制的1M硼氰化钠溶液，反应后经11000g离心3min，然后在45℃温度下反应4h，最后加入150μl 50％的二甲基亚砜溶液直接用于高效液相串联离子阱飞行时间质谱分析。
高效液相串联离子阱飞行时间质谱分析条件
(1)液相条件
流动相A：乙腈，B：10mM甲酸铵(pH：4.5)
采用梯度洗脱：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；
31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A。剩余为B。
(2)质谱条件
ESI离子源，正离子模式喷雾电压为4.5kV，负离子模式喷雾电压为-3.5kV。一级、二级离子扫描设为m/z300～1000和m/z1000～2000两个范围。加热模块(BH)和曲形脱溶剂管(CDL)温度均为200℃。氮气流速为1.5L/min，离子累计时间为10ms。高纯度氩气作为CID碰撞及冷却气，检测器电压为1.58kV。IT真空为1.1×10-2Pa，TOF真空1.2×10-4Pa。
试验结果及分析
将衍生化后的牛乳寡糖用优化好的流动相条件通过高效液相色谱联用离子阱-飞行时间-电喷雾质谱(HPLC IT-TOF-MS)测定，由于寡糖质量范围为300～2000D，为获得更好的精确度，根据质量分为两部分进行正负离子模式扫描。质量扫描范围为300～1000D和1000～2000D的质谱谱图如图1和图2所示。
在质量范围为300～1000D的质谱测定中共鉴定6种糖成分，其中4种为寡糖，其余为单糖和双糖；质量范围为1000～2000D的质谱测定中鉴定出3种乳寡糖。两个扫描段共测定出7种乳寡糖；实验所测得的7种乳寡糖结构如表1所示。
表1所得7种牛乳寡糖
○：Hex： Gal： Glc： NeuAc：◇NeuGc：
□：HexNAc： GalNAc： GlcNAc
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的XX的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种牛乳寡糖测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提取牛乳寡糖粗品；
步骤二、首先利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化，得到纯化的牛乳寡糖液体，之后利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖体进行富集，得到富集的牛乳寡糖液体，最后将富集的牛乳寡糖液体干燥，得到牛乳寡糖；
步骤三、采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理；以及
步骤四、采用高效液相串联离子阱飞行时间质谱对衍生化的牛乳寡糖进行测定。
2.如权利要求1所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，以体积份数计，所述步骤一中，提取牛乳寡糖粗品的具体方法包括：
1.1)取100份牛乳，于10℃、10×104g条件下超高速离心90min，除去底部的酪蛋白和上层的脂肪；以及
1.2)取50份中间水层加入100份的无水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min条件下离心30min，重复离心两次后，取上清液，然后用浓缩仪浓缩干燥，得到所述牛乳寡糖粗品。
3.如权利要求2所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，以体积份数计，所述步骤二中，利用Sep-Pak C18柱将牛乳寡糖粗品进行纯化的具体方法包括：
2.1)首先用50份甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用100份0.1％(v/v)TFA润洗Sep-PakC18柱子；以及
2.2)将所述牛乳寡糖粗品溶于2份0.1％(v/v)TFA中，然后上样到Sep-Pak C18柱中，收集过柱液体，将收集的液体再次加入Sep-Pak C18中，再次收集过柱液体，重复2次，最后用30份0.1％TFA(v/v)冲洗Sep-Pak C18，也收集过柱液体，合并过柱液体得到所述纯化的牛乳寡糖液体。
4.如权利要求1所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，以体积份数计，所述步骤二中，利用石墨化柱体将纯化的牛乳寡糖液体进行富集的具体方法包括：
2.3)首先用3倍柱体积的含有0.10(v/v)％TFA的乙腈溶液80％(v/v)和纯水依次通过石墨化柱体，然后将所述纯化的牛乳寡糖液体上样于所述石墨化柱体中，控制流速约0.5～1ml/min，收集过柱液体，将过柱液体重复通过所述石墨化柱体若干次；
2.4)用3倍柱体积的纯水通过所述石墨化柱体；
2.5)分别采用5份含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液10％(v/v)、含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液20％(v/v)和含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液40％(v/v)对所述石墨化柱体分步洗脱，收集洗脱液，得到所述富集的牛乳寡糖液体。
5.如权利要求1至4任一所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，所述步骤三中，以体积份数计，采用2-氨基吖啶酮衍生化试剂对步骤二中得到的牛乳寡糖进行衍生化处理的具体步骤包括：
3.1)将所述牛乳寡糖溶于0.5份浓度为0.1M的2-氨基吖啶酮中，该2-氨基吖啶酮的溶剂为体积比为3:17的冰醋酸和二甲基亚砜；
3.2)加入0.5份新鲜配制的浓度为1M的硼氰化钠溶液，反应后经11000g离心3min，然后在45℃温度下反应4h，最后加入1.5份50％(v/v)的二甲基亚砜溶液，以用于步骤四中的测定。
6.如权利要求1至4任一所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的液相条件为：
流动相A为乙腈，流动相B为浓度为10mM的甲酸铵pH4.5，
采用梯度洗脱：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A；液相剩余部分为流动相B。
7.如权利要求1至4任一所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，所述步骤四中，所述高效液相串联离子阱飞行时间质谱的质谱条件为：
ESI离子源，正离子模式喷雾电压为4.5kV，负离子模式喷雾电压为-3.5kV，一级、二级离子扫描设为m/z 300～1000和m/z 1000～2000，加热模块和曲形脱溶剂管温度均为200℃，氮气流速为1.5L/min，离子累计时间为10ms，高纯度氩气作为CID碰撞及冷却气，检测器电压为1.58kV，IT真空为1.1×10-2Pa，TOF真空1.2×10-4Pa。
8.如权利要求1所述的牛乳寡糖测定方法，其特征在于，所述步骤二中，所述干燥采用浓缩冻干。
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