CN106244676A

CN106244676A - 用于‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法

Info

Publication number: CN106244676A
Application number: CN201610578276.7A
Authority: CN
Inventors: 李桂花; 陈汉才; 王亭亭; 张艳; 黎庭耀
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2016-12-21

Abstract

本发明公开本发明公开了一种用于鉴定‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的SSR分子标记组，SSR分子标记组由S69和BOE135组成。利用该分子标记组中的S69和BOE135的引物序列进行PCR验证，可对‘秋盛芥蓝’杂交种子和其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。

Description

用于‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种用于‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。

背景技术

芥蓝是起源于华南地区的一种特色叶菜，为甘蓝的一个变种。‘秋盛芥蓝’是以Sb06M为母本，Sb06F为父本育成的国内首次通过品种审定的杂交种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的品种。但是由于有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现，使得品种间，尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之‘秋盛芥蓝’是利用自交不亲和系配制而成的杂交一代，在制种过程中母本有一定的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失。为了避免这种损失，需要对种子的纯度和真伪进行鉴定。目前品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法虽然从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但是在大规模检测中存在耗时较多，错误率较高的缺点，因而不利于大规模推广。

因此为了保证优良品种发产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。

发明内容

本发明的目的在于利用SSR分子标记技术提供一种用于快速、准确鉴定“秋盛芥蓝”杂交种子纯度的引物及方法。

本发明所采取的技术方案是：一种用于鉴定 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由S69和BOE135组成。

优选的，SSR 分子标记S69的引物对序列如下所示：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

优选的，SSR 分子标记BOE135的引物对序列如下所示：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)。

一种用于 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：

1）提取芥蓝幼苗基因组DNA；

以芥蓝基因组DNA为模板，使用S69和/或BOE135的SSR引物进行PCR扩增；

2）对扩增的产物进行凝胶电泳；

对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。

本发明的有益效果是：将‘秋盛芥蓝’杂交种与其母本、父本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

附图说明

图1为引物BOE135‘秋盛芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P1：母本；P2：父本：F1为杂交一代种子）；

图2为引物S69‘秋盛芥蓝’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P1：母本；P2：父本：F1为杂交一代种子）；

图3为秋盛芥蓝商品种种植后取叶片DNA进行电泳跑胶的图片，其中P1（c条带）为母本，P2（d条带）为父本，1-42分别对应商品种1-42株，其中41为假杂种。

具体实施方式

一种用于鉴定 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记S69，包括母本Sb06M和父本 Sb06F，其母本Sb06M的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，SSR分子标记S69引物对，其序列如下所示：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

一种用于鉴定 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记BOE135引物对，其序列如下所示：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 ‘秋盛芥蓝’ 杂交种子纯度检测方法的建立

（1）芥蓝DNA的提取

实验材料为‘秋盛芥蓝’商品种及其母本、父本幼嫩真叶DNA。步骤如下：

①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μL 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min（每隔5min摇动一次）。

②静置至室温后在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清（约800μL）转移到新的2ml离心管。

③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5mL离心管中。

④加2/3体积340μL预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次），置于－20℃下培养30min。

⑤在4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μL预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀（两次），微干。

⑥加入100μL无菌水溶解。

（2）SSR-PCR 扩增：

PCR体系（20μL）

DNA模板：5ng

引物-F：0.25 mmol•L^-1

引物-R：0.25 mmol•L^-1

dNTP：0.2mmol•L^-1

Mg2+：0.15mmol•L^-1

10×PCR buffe：2.0μL

Taq酶：0.2U

ddH20补足至20μL

PCR扩增程序

94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。

（3）凝胶电泳

扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgNO₃银染15min；银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃显色，显色后在灯箱上拍照分析。

（4）扩增结果

两种引物在‘秋盛芥蓝’父母本及杂交一代种子分别能扩增出两条特异带；其中BOE135引物母本p1扩增出的a条带，母本p2号扩增出b的条带；引物S69母本扩增出c条带，父本扩增出d条带。(见图1）

回收特异条带c和d，送上海生物工程有限公司测序。条带的序列如SEQ ID NO:1-2所示，杂交种子中与父本、母本扩增产物的序列相符。

实施例2 检测准确度验证

采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的50株‘秋盛芥蓝’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测（部分电泳图见图3），检测结果两个引物检测结果一致，种子纯度为98%，与田间调查结果一致，准确率为100%。

以上实施例表明，本发明的方法可将‘秋盛芥蓝’杂交种子与其父母本种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。并且选取任何一个引物均能准确鉴别。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 用于'秋盛芥蓝'杂交种子纯度的鉴定的引物及方法

<130> Cabbage mustard

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 280

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 1

ggatattttg tttttgatgg agacgaagca tagtcgtgat gatttggtgg atgtgcaaac 60

ttggcttggc tacgatagga tcatgactgt caatcctatt gggtacagcg gaggtctagc 120

cttgatgtgg aagaattctg taaatatcgg gtttaagttt gtagacaaga atcttgtaga 180

tttcggtgtg aagtttggca aagaatcttt ctttgtgtcg tgtgtctacg gtgaaccaat 240

ccaaggtaat agagcaaagg tgtgggaaag gttatctagg 280

<210> 2

<211> 258

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 2

taattaaaca ttagagaacc tcgatcacat caattaccaa aataacttcc gatcacatca 60

agtgataaga aactttgttt aatttgcagg cttcttgatg cataaatggg ttatgtgata 120

actattgaat caaagaacta tatttctcaa agaacgcttt gttaaaactc tctcaatgct 180

ttagaaaaca actcaaaaaa ctaaagctct caaactcata agatatgcaa acacccttgc 240

atctctttat ataacttt 258

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

tcgccaatag aacccaaaac tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 4

catctccatt gctgcatctg ct 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 5

cgtgggggat atggtggtgg tta 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 6

aatgcctgtg ttctcctgct cgtc 24

Claims

1.一种用于鉴定 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的 SSR 分子标记组，SSR分子标记组由S69和BOE135组成，SSR分子标记S69包括母本Sb06M和父本 Sb06F，其母本Sb06M的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，SSR分子标记BOE135可由引物对：BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’和BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’扩增得到。

2.一种用于鉴定 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度的引物组，由用于扩增SSR 分子标记S69的引物对和用于扩增SSR 分子标记BOE135的引物对共同组成。

3.根据权利要求2 所述的引物组，其特征在于：SSR 分子标记S69的引物对序列如下所示：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

4.根据权利要求2 或3所述的引物组，其特征在于：SSR 分子标记BOE135的引物对序列如下所示：

BOE135-F: 5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)。

5.一种用于 ‘秋盛芥蓝’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：

提取芥蓝幼苗真叶基因组DNA；

1）蓝基因组DNA为模板，使用权利要求3和/或4所述的SSR引物进行PCR扩增；

2）对扩增的产物进行凝胶电泳；

对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株为杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。