CN106221939A - 一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用。该方法包括：1)将植物原料粉碎，加水和酶进行酶解，得到酶解液；2)将所述酶解液离心，收集滤液置于储水罐中，收集滤渣置于物料篮中，再对所述滤液和滤渣进行亚临界水萃取，得到提取液；3)将所述提取液冷却、破乳、萃取，收集有机层，干燥和除有机溶剂，得到所述植物精油。该方法工艺简单易操作，以廉价、无污染的水作为萃取剂，大大降低了成本，且减少了有机萃取剂的使用，绿色环保，此外还有时间短、提取效率高、精油提取得率高、能耗低和所得精油质量好等特点。所得植物精油具有超强的抗菌效果，应用前景广阔，且精油提取得率≥2.0％，远高于国内外现有植物精油的提取分离技术。

Description

一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物提取领域，具体涉及一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用。

背景技术

为追求经济回报，养殖生产中以往饲料添加剂的促生长作用被过分强调，而忽视其造成的动物性产品药物的残留、病原体耐药性等的长期危害。随着欧盟、美国等国家地区相继对激素、抗生素的禁用或限用，发展无公害畜牧业、生产绿色畜产品、增强畜产品的市场竞争力，已成为畜牧生产者的首要任务，寻求可以替代抗生素促生长剂的新型无公害、安全生物饲料添加剂也成为绿色养殖业的当务之急和全球饲料行业发展的热点。此外，近年来，人们对生命和健康的关注超过了以往任何年代，“回归自然”、“绿色”消费成为时尚，尤其是随着对抗生素耐药性和畜产品中抗生素及其他药物残留等问题的关注，新型绿色饲料添加剂——天然植物精油迎来了前所未有的发展机遇。

天然植物精油的兴起有其本身固有的特性，因化学药物的毒副作用大，易产生抗药性，而天然药物在这方面具有无可比拟的优势。因此，植物精油作为饲料添加剂在畜禽饲料生产和养殖上也越来越受到重视，在维护动物健康、促进动物生长和提高动物各种生产性能等方面，植物精油均有着非常显著的效果。

植物精油是指通过蒸馏、浸提或压榨等方式从在中草药或其他植物的花、叶、根、树皮、果实、种子和树脂中萃取而得的植物特有的芳香物质。植物精油作为新型的饲料添加剂，具有改善动物健康、提高动物生产性能等多重功效，是解决在逐步减少甚至禁用抗生素促生长剂的发展形势下，养殖过程中普遍面临的动物疫病频发、生产效率较低等养殖问题的重要手段之一。此外，植物精油来源于天然中草药，对动物无毒无害，在改善动物健康的同时，减少了抗生素使用和残留问题，满足了人们对绿色畜产品的消费需求。

然而，目前我国植物精油的分离提取技术较为落后，大多采用传统的压榨法、水蒸汽蒸馏法或有机溶剂萃取法，水蒸汽蒸馏法是目前应用最广泛的一种方法，但由于操作温度过高易引起其中的热敏性化合物的热分解和易水解成分的水解，而压榨法存在出油率低和成品保存时间短等缺点，有机溶剂萃取法虽然精油得率高，但存在有机溶剂残留、有毒、萃取时间长和后续分离干燥操作复杂的缺点。而且，目前我国缺乏相应的管理和监测，导致饲用植物精油产品中有效精油含量低和质量稳定性差，出现了许多使用有效性和安全性的问题，这亟需进一步改进提取制备植物精油的方法，并提高植物精油的功能性。

发明内容

本发明的目的为提供一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用。

本发明提供的制备植物精油的方法，包括如下步骤：

1)将植物原料粉碎，加水和酶进行酶解，得到酶解液；

2)将所述酶解液离心，收集滤液置于储水罐中，收集滤渣置于物料篮中，再对所述滤液和滤渣进行亚临界水萃取，得到提取液；

3)将所述提取液冷却、破乳、萃取，收集有机层，干燥和除有机溶剂，得到所述植物精油。

上述方法的步骤1)中，所述植物原料为富含酚醛类植物精油的植物原料；

所述植物原料具体选自丁香、柠檬草、牛至、月桂叶、肉桂、小茴香和百里香中的至少一种；

所述植物原料更优选肉桂、牛至和百里香中的至少一种；

所述植物原料最优选由质量比为2：2：1的肉桂、牛至和百里香组成的混合物；

所述粉碎步骤中，筛孔的目数为40-60目，具体为50目。

所述步骤1)酶解步骤中，所述酶选自木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶中的至少一种；具体为由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按质量比1：1：1组成的混合酶；

所述木瓜蛋白酶可购于美国Sigma公司，具体可为美国Sigma公司出售的产品编号为76218的木瓜蛋白酶；

所述木瓜蛋白酶的酶活为5-100U/mg，具体为12U/mg；

所述木瓜蛋白酶的酶活的定义如下：

在40℃和pH值7.2的条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，即为1个酶活力单位；

所述纤维素酶可购于美国Sigma公司，具体可为美国Sigma公司出售的产品编号为22178的纤维素酶；

所述纤维素酶的酶活为0.3-1.0U/mg，具体为0.8U/mg；

所述纤维素酶的酶活的定义如下：

在37℃和pH值5.0的条件下，1min分解羧甲基纤维素产生1μmol葡萄糖所需的酶量，即为1个酶活力单位；

所述果胶酶可购于美国Sigma公司，具体可为美国Sigma公司出售的产品编号为17389的果胶酶；

所述果胶酶的酶活为0.5-5.0U/mg，具体为1.0U/mg；

所述纤果胶酶的酶活的定义如下：

在50℃和pH值为4.0条件下，1min分解聚半乳糖醛酸产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量，即为1个酶活力单位；

所述酶与粉碎后的植物原料的质量比为0.8-1.4：100；具体为1：100。

所述步骤1)酶解步骤中，所述粉碎后的植物原料与水的料液比为1g：6-10mL；具体为1g：6mL、1g：8mL或1g：10mL；

所述酶解的时间为30-70min；具体为30min、50min或70min；

所述酶解的温度为40℃-60℃；具体为40℃、50℃或60℃；

所述酶解的pH值为4.0-6.0；具体为4.0、5.0或6.0。

在实际操作中，可先对植物原料按照如下方法进行筛选：

将植物原料分别粉碎后过筛，于蒸馏器中进行水蒸汽蒸馏，得到植物精油提取液，随后对植物精油粗提液进行抗菌效果对比，挑选抗菌效果优良的植物作为制备本植物精油的原料来源；

所述步骤过筛步骤中，筛孔的目数为40-60目，具体为50目；

所述步骤蒸馏步骤中，每种原料粉末称取量为80-120g，具体为100g；

蒸馏器为2000mL圆底烧瓶；

加入水后，粉碎后富含植物精油的植物原料与水的料液比为1g：8-10mL，具体为1g：8mL；

浸泡时间为0.5-1.5h，具体为1h；

蒸馏时间为5-10h，具体为6h；

所述步骤抗菌效果对比步骤中，将植物精油粗提液稀释成不同倍数，进行最小抑菌浓度试验，最后挑选抗菌效果前三的植物作制备植物精油的原料来源；

所述最小抑菌浓度试验步骤中，所用测试菌株为大肠杆菌和沙门氏菌中的至少一种；

其中，所述大肠杆菌菌粉可购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW23110，菌号为CMCC44102；

所述沙门氏菌菌粉可购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW2340L，菌号为CMCC50094；

所述步骤2)离心步骤中，所述离心力为4000-6000g；具体为5000g；

所述离心的时间为10-30min；具体为15min；

所述亚临界水萃取所用萃取罐的体积为1L；

所述滤渣的装料量为125g；

所述滤液和滤渣的输送流速为150-250mL/min，具体为200mL/min。

将离心所得滤液注入储水罐，通过压力泵输送至预加热器快速加热，至温度达设定值后以一定流速输送至萃取罐中；

所述方法还包括如下步骤：在所述步骤2)离心之后，所述亚临界水萃取步骤之前，将所述滤液预加热；

所述预加热的温度为80℃-120℃；具体为80℃、100℃、120℃、130℃、140℃、150℃或160℃。

所述步骤2)亚临界水萃取步骤中，提取温度80℃-120℃；具体为80℃、100℃、120℃、130℃、140℃、150℃或160℃；

压强为1-13MPa；具体为1、3、5、7、9、11或13MPa；

萃取时间为10-40min；具体为10、15、20、25、30、35或40min。

所述步骤2)亚临界水萃取步骤具体可为：即将酶解液离心后的滤渣置于萃取罐的物料篮中，将滤液注入储水罐预热好后以一定的流速输送到萃取罐中，直至萃取罐充满水，当萃取罐中的物料处于设定的压强和温度进行萃取。

所述步骤3)冷却步骤中，冷却方式为冷却器中冷却水循环冷却；

所述破乳步骤中，破乳剂为NaCl；

所述破乳剂的添加量为每kg提取液中添加80-100mg，具体为每kg提取液中添加80mg；

所述萃取步骤中，萃取剂为石油醚；

萃取的静置时间为10-30min；具体为20min；

所述干燥步骤中，干燥方式为无水硫酸钠干燥；

所述除有机溶剂步骤中，除有机溶剂方式为旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发。

所述方法还包括如下步骤：

在所述步骤1)粉碎步骤之前，将所述植物原料进行清洁除杂。

另外，按照上述方法制备得到的植物精油及以上述方法制备得到的植物精油为活性成分的产品或抗菌产品及该植物精油或产品在抗菌中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述菌具体可为大肠杆菌或沙门氏菌。更具体的，所述大肠杆菌菌粉可购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW23110，菌号为CMCC44102；

所述沙门氏菌菌粉可购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW2340L，菌号为CMCC50094。

本发明提供的植物精油的制备方法，挑选精油提取液抗菌效果优良的植物作为原料，通过酶辅助-亚临界水萃取法，再经冷却、破乳、分离和干燥制备具有超强抗菌效果的植物精油，所得植物精油的精油提取得率≥2.0％。

本发明的方法具有以下优点：

1)本发明提供的植物精油的制备方法工艺简捷易操作，有利于产业化的应用。而且针对性挑选了精油提取液具有超强抗菌作用的植物作为制备本植物精油的原料来源，制备的植物精油抗菌效果强，应用前景广阔；

2)相比于目前商业化中常用的有机溶剂萃取法和水蒸汽蒸馏法，亚临界水萃取法采用低成本、无污染的水作为萃取剂，避免了有机溶剂萃取导致的大量有机溶剂排放污染问题，并降低了成本；同时，亚临界状态下，水极性由强极性逐步转变为非极性，促进了精油分子的溶解，且增加了精油分子在水中的溶解度，精油萃取率远高于水蒸汽蒸馏法；

3)本发明采用了酶辅助-亚临界水萃取的方法，利用高度专一性的酶将细胞壁成分降解或水解，破坏细胞壁结构，增大了细胞膜的通透性，再通过亚临界水萃取时，加速了细胞内成分向胞外的传质过程，大大提高了植物精油的提取效率和提取得率，缩短了提取时间和大幅度第提高了精油收率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下述实施例中所述含量如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中，所用富含酚醛类植物精油的植物原料为：

丁香(学名为Syringa Linn)为产自中国西南和西北的藏南丁香、云南丁香、西蜀丁香和四川丁香等丁香的叶片、花蕾和茎部，丁香又名紫丁香，为落叶灌木或小乔木植物；

柠檬草(学名为Cymbopogon citratus(DC.)Stapf)为产自广东和海南的柠檬草全株，柠檬草又名柠檬香草、蜜蜂草或香茅草，为多年生草本植物；

牛至为干燥野牛至(学名为Origanum vulgare)的花部顶端，牛至又名止痢草、土香薷、小叶薄荷，为唇形科牛至属多年生草本植物；

月桂叶为常绿树月桂(学名为Laurus nobilis)的叶，月桂叶又名香叶、香桂叶或桂叶等；

肉桂(学名为Cinnamomum cassia Presl)为中国肉桂树的鲜枝叶、梗和树皮，肉桂又名玉桂、玉树、大桂或平安树等；

小茴香为伞形科植物茴香(学名为Foeniculum vuLgare Mill.)的干燥成熟果实；

百里香(学名为Thymus mongolicus Ronn)为产自中国甘肃、陕西、青海和山西等地的百里香植物的花朵和叶子，百里香在中国又名地椒、山椒或山胡椒等。

大肠杆菌菌粉购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW23110，菌号为CMCC44102；

沙门氏菌菌粉购自南京便诊生物科技有限公司，产品编号为BZW2340L，菌号为CMCC50094；

木瓜蛋白酶购自美国Sigma公司，产品编号为76218，酶活为12U/mg；

纤维素酶购自美国Sigma公司，产品编号为22178，酶活为0.8U/mg；

果胶酶购自美国Sigma公司，产品编号为17389，酶活为1.0U/mg。

按照如下方法测定下述实施例中所得植物精油及酚醛类物质的含量，以及计算精油提取得率和酚醛类得率：

植物精油提取液进行冷却、破乳、分离、干燥和除有机溶剂，得到透明的植物精油液体，准确称量精油的质量，重复3次，取平均值，则植物精油提取得率为：

酚醛类得率＝m₁/m×100％

式中：m₁为植物原料提取、干燥后所得植物精油的质量(mg)；m为植物原料的质量(mg)。

实施例1、不同植物原料精油提取液的抗菌效果比较

1)将丁香、柠檬草、牛至、月桂叶、肉桂、小茴香和百里香等富含酚醛类植物精油的植物原料分别粉碎，过50目筛。称取原料粉末100g于2000mL的圆底烧瓶中，加入800mL水，即使得粉碎后的植物原料与水的料液比为1g：8mL，浸泡1h。随后将圆底烧瓶置于加热套上缓缓加热至微沸，水蒸汽蒸馏6h，经冷凝管将蒸馏液收集进水分离器，上层的精油经水分离器的旋塞放出，得到植物精油提取液。

2)将步骤1)所得植物精油提取液分别用无菌水(95％乙醇助溶)倍比稀释成1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512等系列待测稀释液，用无菌吸管吸取各植物精油稀释液1mL，分别注入7.5cm无菌培养皿中，倒入已溶解的9mL无菌培养基，充分混匀并冷却制成含有植物精油的双碟平皿。编号后吸取已制备好的大肠杆菌或沙门氏菌悬浮液(每毫升菌悬浮液中约含10⁷个细菌)0.1mL于双碟平皿表面，涂布均匀，至37℃培养箱中培养24h，观察测试菌的生长情况，已完全没有菌生长的最低浓度作为该植物精油的最低抑菌浓度。

最后，挑选抗菌效果前三的植物作为制备本植物精油的原料来源。最小抑菌浓度试验的结果如表1所示。

表1不同植物原料精油提取液的抗菌效果比较

由表1可知，以大肠杆菌为测试菌株，七种植物提取的精油提取液的抗菌效果依次为肉桂＝牛至>百里香＝丁香>柠檬草>月桂叶>小茴香，其中以肉桂和牛至提取的精油提取液稀释成1:512仍可完全抑制大肠杆菌的生长；以沙门氏菌为测试菌株时，精油提取液的抗菌效果依次为肉桂＝牛至>百里香>丁香＝柠檬草＝月桂叶>小茴香，肉桂和牛至的精油提取液在1:512稀释倍数下同样也能完全抑制沙门氏菌的生长，百里香精油提取液对沙门氏菌的抑菌效果也较好。因此，通过表1可知，挑选抗菌效果最好的肉桂、牛至和百里香作为制备本植物精油的原料来源。

实施例2、酶解条件对植物精油提取得率的影响

1)根据实施例1挑选所得抗菌效果前三的植物，以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料来源，加入常温清水，再加入酶，每100g原料(粉碎后的肉桂、牛至和百里香的混合原料)中加入1g由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按1：1：1组成的混合酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为12U/mg、0.8U/mg和1.0U/mg，在一定条件下进行酶解，得到酶解液。根据笔者研究，选取对植物精油提取得率影响较大的料液比、酶解pH、酶解温度和酶解时间等四因素进行L₉(3⁴)正交试验，设计的四因素三水平编码见表2，即：粉碎后的植物混合原料与常温清水的料液比为1g：6mL、1g：8mL或1g：10mL，酶解pH值为4.0、5.0或6.0，酶解温度为40℃、50℃或60℃下，酶解时间为30min、50min或70min。

2)将步骤1)中酶解后的混合液在离心力为5000g下离心15min，分别得到滤渣和滤液；

3)将所得滤渣，即酶解后植物原料，装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。将所得滤液注入亚临界提取装置的储水罐中，打开压力泵将滤液输送至预加热器中快速加热，当温度达到设定的120℃后，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水。当萃取罐中的物料处于设定的温度120℃和压力5MPa后，提取30min，得到精油提取液；

4)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定所得植物精油的质量，计算精油提取得率，结果如表3所示。

表2酶解条件设计因素水平编码表

表3酶解条件对植物精油提取得率的影响

根据表3可知，酶辅助-亚临界水萃取法在一定范围条件下，植物精油提取得率较高，可达2.0％及以上。其中，最为优选的酶解提取条件是料液比为1g：8mL，酶解pH值为6.0，酶解温度为40℃，酶解时间为50min，在此条件下，植物精油的提取得率可达2.10％。

实施例3、提取温度对亚临界水萃取植物精油得率的影响

1)以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料来源，加入常温清水，再加入酶，每100g原料(粉碎后的肉桂、牛至和百里香的混合原料)中加入1g由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按1：1：1组成的混合酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为12U/mg、0.8U/mg和1.0U/mg，在一定条件下进行酶解，得到酶解液。根据实施例2中最优酶解条件进行酶解，即：粉碎后的植物混合原料与常温清水的料液比为1g：8mL，酶解pH值为6.0，酶解温度为40℃，酶解时间为50min。得到酶解液。

2)将步骤1)中酶解后的混合液在离心力为5000g下离心15min，分别得到滤渣和滤液；

3)将所得滤渣，即酶解后植物原料，装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。将所得滤液注入亚临界提取装置的储水罐中，打开压力泵将滤液输送至预加热器重快速加热，当温度达到设定的温度后，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水。当萃取罐中的物料处于设定的温度80℃-160℃(具体为80℃、100℃、120℃、130℃、140℃、150℃或160℃)和压力5MPa后，提取30min，得到精油提取液；

4)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定所得植物精油的质量，计算精油提取得率，结果如表4所示。

表4提取温度对亚临界水萃取植物精油得率的影响

根据表4可知，提取温度是影响亚临界水萃取植物精油得率的一个重要因素，在140℃以前，随着提取温度的升高，精油提取得率不断提高，尤其是在100℃以下，精油提取得率受温度影响非常显著；超过140℃，精油提取得率随温度升高而下降。在提取温度为140℃时，精油提取得率最高，达到2.17％。

实施例4、压力对亚临界水萃取植物精油得率的影响

1)以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料来源，加入常温清水，再加入酶，每100g原料(粉碎后的肉桂、牛至和百里香的混合原料)中加入1g由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按1：1：1组成的混合酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为12U/mg、0.8U/mg和1.0U/mg，在一定条件下进行酶解，得到酶解液。根据实施例2中最优酶解条件进行酶解，即：粉碎后的植物混合原料与常温清水的料液比为1g：8mL，酶解pH值为6.0，酶解温度为40℃，酶解时间为50min。得到酶解液。

2)将步骤1)中酶解后的混合液在离心力为5000g下离心15min，分别得到滤渣和滤液；

3)将所得滤渣，即酶解后植物原料，装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。将所得滤液注入亚临界提取装置的储水罐中，打开压力泵将滤液输送至预加热器重快速加热，当达到实施例3最优温度140℃时，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水。当萃取罐中的物料处于设定的温度140℃和压力1-13MPa(具体为1MPa、3MPa、5MPa、7MPa、9MPa、11MPa或13MPa)后，提取30min。

4)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定所得植物精油的质量，计算精油提取得率，结果如表5所示。

表5压力对亚临界水萃取植物精油得率的影响

由表5可知，压力对亚临界水萃取植物精油得率的影响差异较小，在1-13MPa压力范围内均能获得较高的精油得率，其中，在7MPa压力下，精油得率最高，达到2.18％。

实施例5、提取时间对亚临界水萃取植物精油得率的影响

1)以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料来源，加入常温清水，再加入酶，每100g原料(粉碎后的肉桂、牛至和百里香的混合原料)中加入1g由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按1：1：1组成的混合酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为12U/mg、0.8U/mg和1.0U/mg，在一定条件下进行酶解，得到酶解液。根据实施例2中最优酶解条件进行酶解，即：粉碎后的植物混合原料与常温清水的料液比为1g：8mL，酶解pH值为6.0，酶解温度为40℃，酶解时间为50min。得到酶解液。

2)将步骤1)中酶解后的混合液在离心力为5000g下离心15min，分别得到滤渣和滤液；

3)将所得滤渣，即酶解后植物原料，装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。将所得滤液注入亚临界提取装置的储水罐中，打开压力泵将滤液输送至预加热器中快速加热，当达到实施例3最优温度140℃时，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水。当萃取罐中的物料处于设定的温度140℃和达到实施例4最优压力7MPa后，提取10-40min(具体为10min、15min、20min、25min、30min、35min或40min)。

4)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定所得植物精油的质量，计算精油提取得率，结果如表6所示。

表6提取时间对亚临界水萃取植物精油得率的影响

由表6可知，提取温度也能显著影响亚临界水萃取植物精油的得率大小，尤其是在提取时间较短，如小于20min时，随着提取时间的延长，精油得率明显提高；在30min时，精油得率达到最大值2.18％；超过30min后，精油得率随提取时间的延长而逐渐下降。

实施例6、提取时间对亚临界水萃取植物精油得率的影响

1)以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料来源，加入常温清水，再加入酶，每100g原料(粉碎后的肉桂、牛至和百里香的混合原料)中加入1g由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按1：1：1组成的混合酶，其中木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为12U/mg、0.8U/mg和1.0U/mg，在一定条件下进行酶解，得到酶解液。根据实施例2中最优酶解条件进行酶解，即：粉碎后的植物混合原料与常温清水的料液比为1g：8mL，酶解pH值为6.0，酶解温度为40℃，酶解时间为50min。得到酶解液。

2)将步骤1)中酶解后的混合液在离心力为5000g下离心15min，分别得到滤渣和滤液；

3)将所得滤渣，即酶解后植物原料，装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。将所得滤液注入亚临界提取装置的储水罐中，打开压力泵将滤液输送至预加热器重快速加热，当温度达到设定的温度后，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水，并在一定条件下进行亚临界水萃取植物精油，得到植物精油提取液。根据实施例3-实施例5，选取提取温度、压力和提取时间等三因素进行L₉(3³)正交试验优化提取条件，设计的三因素三水平编码简表7，即：提取温度为130℃、140℃或150℃，压力为5MPa、7MPa或9MPa，提取时间为20min、25min或30min。

4)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定所得植物精油的质量，计算精油提取得率，结果如表8所示。

表7亚临界水萃取条件设计因素水平编码表

表8正交试验优化提取条件对植物精油提取得率的影响

由表8可知，通过正交试验优化亚临界水萃取植物精油的提取条件为：提取温度140℃，压力为5MPa，提取时间为25min。与实施例5最优组合相比，在减少了压力和缩短了提取时间的同时，不影响精油得率，使得精油得率高达2.19％。

对比例

以实施例6中优选组为本发明处理组；

此外，还有目前最常用的水蒸汽蒸馏组和未加酶处理的亚临界水萃取组，方法如下：

水蒸汽蒸馏法：

1)将经过清洁除杂后的植物原料粉碎，过50目筛，称取肉桂、牛至和百里香按1：1：1组成的原料粉末100g于2000mL的圆底烧瓶中，加入800mL水，即使得粉碎后的含植物原料与水的料液比为1g：8mL，浸泡1h。随后将圆底烧瓶置于加热套上缓缓加热至微沸，水蒸汽蒸馏6h。

2)经冷凝管将蒸馏液收集进水分离器，上层的精油经水分离器的旋塞放出，得到植物精油提取液，加入无水硫酸钠干燥，得到植物精油。

亚临界水萃取法：

1)以粉碎后过筛的肉桂、牛至、百里香按1：1：1组成原料底料，将其装入容积为1L的萃取罐的物料篮内，装料量为150g。打开压力泵将储水罐中的水输送至预加热器重快速加热，当温度达到设定的温度140℃后，将热水以200mL/min的流速输送到萃取罐中，直至1L萃取罐充满热水。当物料达到提取温度为140℃和压力为7MPa后，开始进行亚临界水萃取植物精油，提取40min后，得到精油提取液。

2)将提取后的精油提取液由萃取罐底部流入冷却器中进行循环冷却水冷却至常温，加入80mg/kg的NaCl进行破乳，并加入石油醚，静置20min后分离得到有机层，用无水硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发出去有机溶剂，得到浅黄色透明的植物精油。

测定不同提取方法所得植物精油的质量，并计算精油得率。结果比较见表9所示。同时，将所得植物精油提取液分别用无菌水(95％乙醇助溶)倍比稀释成1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512等系列待测稀释液，用无菌吸管吸取各植物精油稀释液1mL，分别注入7.5cm无菌培养皿中，倒入已溶解的9mL无菌培养基，充分混匀并冷却制成含有植物精油的双碟平皿。编号后吸取已制备好的大肠杆菌或沙门氏菌悬浮液(每毫升菌悬浮液中约含10⁷个细菌)0.1mL于双碟平皿表面，涂布均匀，至37℃培养箱中培养24h，观察测试菌的生长情况，已完全没有菌生长的最低浓度作为该植物精油的最低抑菌浓度。结果比较见表10所示。

表9不同提取方法对植物精油提取得率的影响

表10不同植物原料精油提取液的抗菌效果比较

由表9可知，本发明处理组酶辅助-亚临界水萃取方法制备的植物精油提取得率显著高于未加酶处理的亚临界水萃取法和水蒸汽蒸馏法制备的植物精油的提取得率，分别提高了19.67％和41.29％。

与未添加酶-亚临界水萃取法相比，本发明方法通过添加高度专一性的酶将细胞壁成分降解或水解，破坏细胞壁结构，增大了细胞膜的通透性，加速了细胞内成分向胞外的传质过程。较大幅度地提高了植物精油的提取效率和提取得率。

与水蒸汽蒸馏法相比，本发明提供的制备方法不仅能够大大提高植物精油的得率，同时，显著的缩短了提取时间和改善了精油的质量，且具有提高精油提取效率和降低能耗的优点。

此外，由表10可知，本发明处理组酶辅助-亚临界水萃取方法制备的植物精油对大肠杆菌和沙门氏菌的抗菌效果也明显优于未加酶处理的亚临界水萃取法和水蒸汽蒸馏法制备的植物精油。这可能优于本发明方法提高了植物精油提取的率，得到植物精油中有效成分含量较高。

结论

本发明提供的植物精油的制备方法，工艺简捷易操作，有利于产业化的应用，而且，针对性挑选了精油提取液具有超强抗菌作用的植物作为制备本植物精油的原料来源，制备的植物精油抗菌效果强，应用前景广阔。其次，相比于目前商业化中常用的有机溶剂萃取法和水蒸汽蒸馏法，亚临界水萃取法以低成本、无污染的水作为萃取剂，有效避免了有机溶剂排放污染问题，并明显提高了精油提取得率和提取效率。此外，本发明还采用了酶辅助的方法，进一步提高了植物精油的提取得率和提取效率，具有明显的技术优势。

Claims (10)

1.一种制备植物精油的方法，包括如下步骤：

1)将植物原料粉碎，加水和酶进行酶解，得到酶解液；

2)将所述酶解液离心，收集滤液置于储水罐中，收集滤渣置于物料篮中，再对所述滤液和滤渣进行亚临界水萃取，得到提取液；

3)将所述提取液冷却、破乳、萃取，收集有机层，干燥和除有机溶剂，得到所述植物精油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述植物原料为富含酚醛类植物精油的植物原料；

所述植物原料具体选自丁香、柠檬草、牛至、月桂叶、肉桂、小茴香和百里香中的至少一种；

所述植物原料更优选肉桂、牛至和百里香中的至少一种；

所述植物原料最优选由质量比为2：2：1的肉桂、牛至和百里香组成的混合物；

所述粉碎步骤中，筛孔的目数为40-60目，具体为50目。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)酶解步骤中，所述酶选自木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶中的至少一种；具体为由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按质量比1：1：1组成的混合酶；

所述木瓜蛋白酶的酶活具体为5-100U/mg；更具体为12U/mg；或，

所述纤维素酶的酶活具体为0.3-1.0U/mg；更具体为0.8U/mg；或，

所述果胶酶的酶活具体为0.5-5.0U/mg；更具体为1.0U/mg；

所述酶与粉碎后的植物原料的质量比为0.8-1.4：100；具体为1：100。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)酶解步骤中，所述粉碎后的植物原料与水的料液比为1g：6-10mL；具体为1g：6mL、1g：8mL或1g：10mL；或，

所述酶解的时间为30-70min；具体为30min、50min或70min；或，

所述酶解的温度为40℃-60℃；具体为40℃、50℃或60℃；或，

所述酶解的pH值为4.0-6.0；具体为4.0、5.0或6.0。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)离心步骤中，所述离心力为4000-6000g；具体为5000g；或，

所述离心的时间为10-30min；具体为15min；

所述亚临界水萃取所用萃取罐的体积为1L；或，

所述滤渣的装料量为125g；

所述滤液和滤渣的输送流速为150-250mL/min，具体为200mL/min。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述步骤2)离心之后，所述亚临界水萃取步骤之前，将所述滤液预加热；

所述预加热的温度为80℃-120℃；具体为80℃、100℃、120℃、130℃、140℃、150℃或160℃。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)亚临界水萃取步骤中，提取温度80℃-120℃；具体为80℃、100℃、120℃、130℃、140℃、150℃或160℃；或，

压强为1-13MPa；具体为1、3、5、7、9、11或13MPa；或，

萃取时间为10-40min；具体为10、15、20、25、30、35或40min。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)冷却步骤中，冷却方式为冷却器中冷却水循环冷却；或，

所述破乳步骤中，破乳剂为NaCl；或，

所述破乳剂的添加量为每kg提取液中添加80-100mg，具体为每kg提取液中添加80mg/kg；

所述萃取步骤中，萃取剂为石油醚；或，

萃取的静置时间为10-30min；具体为20min；

所述干燥步骤中，干燥方式为无水硫酸钠干燥；

所述除有机溶剂步骤中，除有机溶剂方式为旋转蒸发仪真空状态下旋转蒸发。

9.权利要求1-8中任一所述方法制备得到的植物精油；或者，

以权利要求1-8任一所述方法制备得到的植物精油为活性成分的产品或抗菌产品。

10.权利要求9所述植物精油或产品在抗菌中的应用。

所述菌具体可为大肠杆菌或沙门氏菌。