CN106220725A - 一种液泡膜蛋白1免疫原多肽及其用途 - Google Patents

一种液泡膜蛋白1免疫原多肽及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液泡膜蛋白1免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的液泡膜蛋白1免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR‑T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）促进CD8+免疫应答，（3）促进体内产生液泡膜蛋白1抗体，（4）促进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR‑T等细胞疗法。

Description

一种液泡膜蛋白1免疫原多肽及其用途
技术领域
本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的液泡膜蛋白1免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
背景技术
液泡膜蛋白1(Vacuole membrane protein 1，Vmp1)是新近发现的一类跨膜蛋白，在进化中高度保守，提示其可能参与蛋白间的相互作用和跨物种的重要生命活动。近年来的研究发现Vmp1为蛋白分泌、细胞器官形成及多细胞发育过程所必需，在诸多肿瘤相关的细胞学过程(包括细胞膜运输、生长增殖、自噬等)中发挥着关键的作用，提示Vmp1可能在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。更重要的是，Vmp1是细胞-细胞间连接及紧密连接形成的重要成分，其在调控细胞粘附能力方面的强大功能，提示Vmp1可能参与HCC侵袭转移过程。
目前已经有肿瘤的临床试验测试对抗液泡膜蛋白1受体的抗体。这种抗体不仅能杀死B淋巴细胞系肿瘤，同时也能健康的B细胞，从而削弱免疫系统。研究人员希望能够设计更有效的治疗方法，能选择性地杀死肿瘤细胞，同时保留健康的B细胞，产生更安全、有效的临床治疗效果。
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
液泡膜蛋白1可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，液泡膜蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的液泡膜蛋白1。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
发明内容
发明目的
本发明提供一种液泡膜蛋白1免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种液泡膜蛋白1免疫原多肽，序列为VAFIGAVPGIKKPSLQKPFQEYLEALLILHHKSEDDR(SEQ ID NO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
有益效果
本发明的液泡膜蛋白1免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞增殖，(2)促进CD8+免疫应答，(3)促进体内产生液泡膜蛋白1抗体，(4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合，(5)在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
用肿瘤模型检测液泡膜蛋白1免疫原多肽的体内活力。
6-8周龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立小细胞肺癌动物模型，在接种肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地提高荷瘤小鼠的生存率，高剂量多肽组的生存率达到85.92％。
实施例2
采用检测免疫动物体内液泡膜蛋白1免疫原抗体滴度的方法，评价液泡膜蛋白1免疫原多肽的免疫原性。BALB/c白鼠40只，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14、21、28天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部淋巴结附近多点注射。于28天，眼眶静脉丛定点取血，每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20℃低温保存备用。待室温溶解后，取0.1ml上清液间接ELISA检测血清中液泡膜蛋白1免疫原抗体滴度。以各样品实际A值(OD450)比阴性空白对照血清A值的值为抗体滴度。
结果表1所示：BALB/c小鼠单次静脉注射给予有效剂量的Vmp1免疫原多肽5-20mg/Kg后，多肽能促进体内Vmp1抗体产生，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
表1多肽对体内Vmp1抗体滴度的作用
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
实施例3
T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μl MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。
表2多肽对T淋巴细胞的增殖作用
*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。
实验结果见表2，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
实施例4
液泡膜蛋白1免疫原多肽的免疫原性测定：采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。6-8w龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。
表3多肽对CD8+T淋巴细胞的作用
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
实验结果见表3，与空白组比较，多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
实施例5
液泡膜蛋白1免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与小细胞肺癌细胞的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃上清，以Hank’s液调细胞浓度为3×106/ml。于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液500μl，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。37℃细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100μl/孔小细胞肺癌细胞(细胞浓度为1×106/ml，含10％胎牛血清)，混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清，加少量戊二醛，轻轻晃动，使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T细胞与小细胞肺癌细胞的结合率。每孔设5个平行。
实验结果见表4，与空白组比较，液泡膜蛋白1免疫原多肽可以显著性增加T细胞与小细胞肺癌细胞的结合率(P<0.01)。
表4多肽对T细胞结合的影响
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种液泡膜蛋白1免疫原多肽及其用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Ala Phe Ile Gly Ala Val Pro Gly Ile Lys Lys Pro Ser Leu Gln
1 5 10 15
Lys Pro Phe Gln Glu Tyr Leu Glu Ala Leu Leu Ile Leu His His Lys
20 25 30
Ser Glu Asp Asp Arg
35

Claims (4)

1.一种液泡膜蛋白1免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103570821A (zh) * 2012-07-27 2014-02-12 北京智飞绿竹生物制药有限公司 粘蛋白-1抗原性多肽及其作为肿瘤疫苗的用途
CN104341530A (zh) * 2014-10-28 2015-02-11 重庆沁涟生物医药科技股份有限公司 Vnsak多肽及其应用

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Non-Patent Citations (1)

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冯元怡等: "ConA刺激小鼠T淋巴细胞期事件研究", 《北京医科大学学报》 *

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