CN106198953B - 白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肺源性急性肺损伤早期诊断试剂盒，其中对待检查的患者测定标志物IL‑33（白介素‑33）或其部分序列，特别用于对待检查的患者测定标志物HMGB1联合白介素‑33（IL‑33），明确患病目标群体，具有良好的应用前景。

Description

白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途

技术领域

本发明涉及白介素，具体涉及白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途。本发明还涉及HMGB1联合白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途。

背景技术

急性肺损伤是一种以双侧肺浸润性改变和非心源性低氧血症为主要表现的一种临床综合征，其实质主要表现为肺间质水肿、中性粒细胞浸润，肺泡上皮细胞的破坏以及炎症应激诱导的细胞凋亡，是严重威胁人类生命的一种肺部并发症。据目前最新研究发现急性肺损伤实质是机体的一种失控性炎症反应，通常是由严重的细菌性肺炎、重症急性胰腺炎、脓毒症以及多发伤等各种肺内和肺外因素所致。尽管经过近半个多世纪的研究，人们对急性肺损伤的发病机制、病理生理以及诊治有了深入的认识和理解，但由于急性肺损伤的发生机制十分复杂，涉及感染、炎症、免疫以及组织损害等一系列生理病理过程，当患者就诊时大多已处于急性肺损伤的严重阶段，在临床诊治过程中十分困难，在临床中，早期急性肺损伤的患者常常表现为呼吸稍急促(呼吸频率一般是小于30次/分)，其氧合指数一般是在200-300mmHg之间，机体缺氧尚不严重，基本能满足器官功能的正常需要或者其机体各项脏器功能处于代偿期，这个阶段患者症状不典型，往往会被临床医生所忽略，如果不能有效识别并采取有效的干预措施，患者往往会向着更严重的方向发展，发展为症状典型的ARDS阶段，这个阶段患者的病情往往较重，死亡率明显上升。目前在临床上如何早期识别急性肺损伤，降低病死率尚缺乏有效手段。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的是提供白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途。

本发明的目的是这样实现的：

检测白介素-33以及任选的其他标志物含量的试剂在制备诊断肺源性急性肺损伤疾病的试剂盒中的用途。

根据本发明的一个实施方案，上述诊断是对待检查的患者进行标志物白介素-33的测定。

根据本发明的一个实施方案，上述白介素-33的测定显示在＞4pg/ml。

术语“肺源性急性肺损伤疾病”特别包括这些适应症的共病现象，即存在基本疾病(指标疾病)，即肺源性急性肺损伤疾病外，还确定了存在的诊断可区分的疾病概况，即感染或炎症疾病，也就是存在可能导致不正确诊断或不正确解释的相关疾病概况，特别是由于症状的相似性(感染、炎症)，这是因为一种疾病概况与另一种疾病概况重叠。

根据本发明的一个实施方案，上述肺源性急性肺损伤疾病或包括这些适应症的共病现象为感染性腹泻、急性膀胱炎、尿道感染、骨盆骨折、转子间骨折、急性肾盂肾炎、溃疡性结肠炎、蜂窝组织炎、上呼吸道感染、支气管扩张伴感染、肺炎、吸入性肺炎、慢性支气管炎急性发作或肺挫伤中的一种或多种并发。

根据本发明的一个实施方案，上述肺源性急性肺损伤疾病或包括这些适应症的共病现象为骨盆骨折、溃疡性结肠炎、支气管扩张伴感染、肺炎、吸入性肺炎、慢性支气管炎急性发作或肺挫伤中的一种或多种并发。

可靠的诊断可通过本发明，以特别有利的方式进行，而且特别是在急诊和/或重症护理医学情况下。根据本发明能够进行临床决策，这产生迅速的治疗成功。这样的临床决策还包括通过处理或治疗肺源性急性肺损伤疾病的药物疗法进行的进一步治疗。

根据本发明的一个实施方案，本发明因此涉及抗生素治疗肺源性急性肺损伤疾病的治疗控制；即上述诊断用于借助药物的进一步进行治疗，所述药物用于肺源性急性肺损伤疾病的治疗或疗法，以及用于抗生素治疗的疗法控制。

由于这个原因，本发明也涉及划分患者危险度的方法，特别是划分患者的危险度用于临床决策，优选在重症医学或急诊医学中的临床决策方面——其中时间是关键。

根据本发明的一个实施方案，进行诊断用于预防、用于鉴别诊断的早期识别和鉴别诊断的识别、用于评估严重程度和用于评估与肺源性急性肺损伤疾病的伴随疗法的过程评估。

在根据本发明实施方案中，从待检查的患者取得血液，任选为全血、血清或血浆，并在体外/离体进行诊断，即在人或动物身体的外部。

在本发明的范围内，术语“肺源性急性肺损伤疾病”具体而言理解为细菌性肺炎、重症急性胰腺炎、脓毒症以及多发伤等各种肺内和肺外因素所致。

在本发明的范围内，术语“白介素-33”被理解为：氨基酸序列的人蛋白质或多肽，描述在Mato N,Bando M,Kusano A,Hirano T.Clinical significance of interleukin33(IL-33)in patients with eosinophilic pneumonia.Allergol Int.2013 Mar；62(1):45-52.以及Liew FY,Pitman NI,McInnes IB.Disease-associated functions of IL-33:the new kid in IL-1 familyNature reviews Immunology 2010；10(2)；103-106中。

在另一实施方案中，附加地，白介素-33的测定可以与另外的标志物一起进行，特别优选HMGB1(高迁移率族蛋白B1)。

在本发明的范围内，术语“HMGB1”被理解为：氨基酸序列的人蛋白质或多肽，描述在Kostova N,Zlateva S,Ugrinova I,et al.The expression of HMGB1protein and itsreceptor RAGE in human malignant tumors[J].Mol Cell Biochem,2010,337(1-2):251-8.以及Klune JR,Dhupar R,Cardinal J,et al.HMGB1:endogenous dangersignaling[J].Mol Med,2008,14(7-8):476-84中。

在本发明的另一实施方案中，HMGB1联合白介素-33在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中的用途。

在本发明的另一实施方案中，根据本发明的方法可以先测定HMGB1，再测定白介素-33，其中测定对于至少一个患者样品进行。

根据本发明的一个实施方案，上述HMGB1的测定显示在＞600pg/ml。

此外，本发明涉及对肺源性急性肺损伤疾病进行诊断或危险度划分的试剂盒，其包含用于测定标志物白介素-33或/和HMGB1的检测试剂。这样的检测试剂例如包括抗体、免疫荧光等。

有益效果

本发明研究发现在肺源性急性肺损伤和非肺源性急性肺损伤患者中检测到血标本IL-33表达却存在明显差异(在肺源性急性肺损伤中表达升高，在非肺源性急性肺损伤中表达不升高)，从而对早期肺源性急性肺损伤的诊断提供一种新的思路。IL-33(白介素-33)作为肺源性急性肺损伤的特异诊断标记物，在用于制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒中具有明显的用途，具有良好的应用前景。

在进一步实验中发现，HMGB1(一般距发病6小时HMGB1开始升高，并且在整个病程中高表达)联合白介素-33(IL-33)(IL-33一般是在发病后12小时开始升高)，作为肺源性急性肺损伤早期诊断标志物具有更加明显的特征，在肺源性急性肺损伤和非肺源性急性肺损伤患者中检测到血标本HMGB1均明显升高，IL-33表达却存在明显差异(在肺源性急性肺损伤中表达升高，在非肺源性急性肺损伤中表达不升高)，并且HMGB1的升高明显早于IL-33，因而HMGB1在急性肺损伤的诊断中可以作为一报警素，IL-33可作为肺源性急性肺损伤的特异诊断标记物。同时在临床实验中发现，在急性肺损伤早期，患者还未出现氧合指数下降时，HMGB1就已经出现了增高，发生急性肺损伤阶段；IL-33在肺源性急性肺损伤中升高，在非肺源性急性肺损伤中不升高，HMGB1均升高。因而HMGB1联合白介素-33(IL-33)在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒的用途中可以更加明确患病目标群体，更加节约诊断时间，具有良好的临床应用前景。

附图说明

下列附图中，Serm HMGB1为外周血的HMGB1含量，Serm IL-33为外周血IL-33的含量，Control为正常对照组，ARDS(CLP)为CLP模型诱导ARDS模型组，ARDS(LPS)为LPS模型诱导ARDS模型组，3h hours after modeling：造模3小时后，6h hours after modeling：造模6小时后，24h hours after modeling：造模24小时后。N:正常人对照组，ARDS：ARDS患者，Incidence of 6 hours：发病6小时后，pulmonary：肺源性ARDS患者，Extrapulmonary：非肺源性ARDS患者，Incidence of 24 hours：发病24小时后。附图中的“***”指的是数据具有统计学意义。

图1是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型3小时后血中HMGB1浓度变化图；

图2是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型3小时后血中IL-33浓度变化图；

图3是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型6小时后血中HMGB1浓度变化图；

图4是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型6小时后血中IL-33浓度变化图；

图5是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型24小时后血中HMGB1浓度变化图；

图6是CLP方式诱导小鼠ARDS模型和LPS方式诱导小鼠ARDS模型24小时后血中IL-33浓度变化图；

图7是人肺源性ARDS和非肺源性ARDS疾病中6小时后血中HMGB1浓度变化图；

图8是非肺源性ARDS疾病中6小时后血中IL-33浓度变化图；

图9是人肺源性ARDS疾病中6小时后血中HMGB1和IL-33浓度变化图；

图10是人肺源性ARDS和非肺源性ARDS疾病中24小时后血中HMGB1浓度变化图；

图11是人肺源性ARDS和非肺源性ARDS疾病中24小时后血中IL-33浓度变化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。本发明所用仪器、原料及试剂均为市售产品。

实施例1

动物实验建模

CLP诱导小鼠ARDS模型的建立(盲肠结扎穿刺术Cecal ligation and puncture,CLP)

成年C57小鼠，以100μl 1.5％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，固定于操作板，腹部用宠物电推剪剃毛，消毒皮肤，于腹正中做1cm长的切口，结扎盲肠，以26号注射器针头穿刺，最后缝合伤口，消毒皮肤。(具体参考：Daniel Rittirsch,Peter A Ward,etal.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation andpuncture.NatProtoc.2009；4(1):31–36)

脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)诱导小鼠ARDS模型的建立

成年C57小鼠，以100μl 1.5％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，固定于操作板，颈部用宠物电推剪剃毛，消毒皮肤，于颈正中做1cm长切口，采用1ml空针向小鼠气道内注射50ugLPS，造模成功，最后缝合伤口，消毒皮肤。(具体参考：Petroni RC,et al.HypertonicSaline(NaCl 7.5％)Reduces LPS-Induced AcuteLung Injury inRats.Inflammation.2015Dec；38(6):2026-35.)

试验方法与结果

将小鼠建模成功3h后，麻醉小鼠，固定，摘眼球提取小鼠血标本，血标本采用ELISA(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒方法检测HMGB1、IL-33。

采用ELISA试剂盒方法检测HMGB1、IL-33的具体检测方法为：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。

2.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为6ng/L，4ng/L，2ng/L，1ng/L，0.5ng/L)。

3.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

5.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

8.温育：操作同4。

9.洗涤：操作同6。

10.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

11.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

12.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

检测结果如图1、图2所示，结果为：建模3h后在小鼠血清中发现HMGB1明显升高，IL-33没有升高，表明在急性肺损伤中，HMGB1的升高早于IL-33。

将小鼠建模成功6h后，麻醉小鼠，固定，摘眼球提取小鼠血标本，血标本采用ELISA方法检测HMGB1、IL-33，其结果如图3、图4所示。结果显示：建模6h后HMGB1在小鼠血清中仍高表达明，IL-33在LPS诱导的ARDS小鼠模型中明显升高，在对照组和CLP诱导的ARDS小鼠模型组中没有升高，表明在肺源性急性肺损伤中IL-33具有明显的特异性。

将小鼠建模成功24h后，麻醉小鼠，固定，摘眼球提取小鼠血标本，血标本采用ELISA方法检测HMGB1、IL-33，其结果如图5、图6所示。结果显示：建模24h得出的结果与建模6h得出的结果基本一致，HMGB1在肺源性和非肺源性ARDS模型中均升高，IL-33在LPS诱导的肺源性ARDS小鼠模型中明显升高，在对照组和CLP诱导的非肺源性ARDS小鼠模型组中没有升高。

综上，通过ELISA对正常小鼠模型、CLP诱导的小鼠ARDS模型和LPS诱导的小鼠ARDS模型取3h、6h、24h血标本进行检测发现，3h时间点，HMGB1在CLP诱导的小鼠ARDS模型和LPS诱导的小鼠ARDS模型中明显升高，IL-33未出现升高，在正常小鼠模型中HMGB1、IL-33未见升高；6h、12h时间点，IL-33在LPS诱导的小鼠ARDS模型中显著升高，在正常小鼠模型和CLP诱导的小鼠ARDS模型中未发现升高，HMGB1在CLP诱导的小鼠ARDS模型和LPS诱导的小鼠ARDS模型中明显升高，在正常小鼠模型中HMGB1、IL-33未见升高。由于在肺源性急性肺损伤和非肺源性急性肺损伤中检测到血标本HMGB1均明显升高，IL-33表达在肺源性急性肺损伤中表达升高，在非肺源性急性肺损伤中表达不升高，并且HMGB1的升高明显早于IL-33，因而HMGB1在急性肺损伤的诊断中可以作为一报警素，IL-33可作为肺源性急性肺损伤的特异诊断标记物。HMGB1联合白介素-33(IL-33)在制备诊断肺源性急性肺损伤试剂盒的用途中可以更加明确患病目标群体，更加节约诊断时间。

实施例2

选取2015年2月-8月重庆医科大学附属第一医院重症监护室ARDS患者86例，采取离体血清标本以ELISA(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒方法检测HMGB1、IL-33。

检测结果见图7-11。其中图7-9为人肺源性ARDS和非肺源性ARDS疾病中发病6小时后血中HMGB1和IL-33浓度变化图，结果显示：HMGB1在人肺源性和非肺源性疾病中均升高，IL-33均未明显升高。图10、图11为人肺源性ARDS和非肺源性ARDS疾病中发病24小时后血中HMGB1和IL-33浓度变化图，结果显示：HMGB1在人肺源性和非肺源性疾病中仍明显升高，IL-33在肺源性ARDS中明显升高，在非肺源性ARDS未见明显升高。

综上，通过重症监护室临床病例发现在肺源性急性肺损伤和非肺源性急性肺损伤患者中检测到血标本HMGB1均明显升高，IL-33表达却存在明显差异(在肺源性急性肺损伤中表达升高，在非肺源性急性肺损伤中表达不升高)，并且HMGB1的升高明显早于IL-33。

实施例3

选取2016年3月重庆医科大学附属第一医院急诊留察室存在感染的22例患者(备注：选取的所有患者距发病6小时内就诊且诊断明确)。以发病6小时、发病12小时、发病24小时，分别采取离体血清标本以ELISA(酶联免疫吸附剂测定)试剂盒方法检测HMGB1、IL-33。发病6小时相关指标结果如下表1，发病12小时相关指标结果如下表2，发病24小时相关指标结果如下表3。

发病6小时相关指标

表1

发病12小时相关指标：

表2

发病24小时相关指标：

表3

实验显示：在急性肺损伤早期，尽管患者氧合指数尚正常，但HMGB1作为急性肺损伤的报警素已经出现了异常(HMGB1＞600pg/ml)，且升高时间早于IL-33,随着病情的进展患者无一例外出现急性肺损伤，均需要收入专科进行进一步治疗。而IL-33仅在肺源性急性肺损伤中明显升高(IL-33＞4pg/ml)，在非肺源性急性肺损伤中无明显增高，且滞后于HMGB1。

实验同时显示：HMGB1在超早期急性肺损伤中有明显升高，且过表达明显早于IL-33，IL-33作为促炎因子仅在肺源性急性肺损伤中升高，在非肺源性急性肺损伤中不升高，在作为肺源性急性肺损伤早期诊断标志物方面具有非常高的特异性和敏感性，因此HMGB1联合白介素-33(IL-33)作为肺源性急性肺损伤早期诊断标志物方面具有良好的临床应用前景。

Claims (5)

1.检测白介素-33以及HMGB1含量的试剂在制备诊断肺源性急性肺损伤疾病的试剂盒中的用途；所述诊断肺源性急性肺损伤为早期识别肺源性急性肺损伤疾病，是对待检查的患者进行特异性标志物白介素-33和报警素HMGB1的联合检测；所述白介素-33的测定显示在＞4pg/ml；所述HMGB1的测定显示在＞600pg/ml。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肺源性急性肺损伤疾病为细菌性肺炎、重症急性胰腺炎、脓毒症所致。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述诊断进行测定以根据危险度划分患者。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述诊断用于在重症医学或急诊医学中的临床决策。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述诊断用于借助药物的进一步治疗，所述药物用于肺源性急性肺损伤疾病的治疗，以及用于抗生素治疗的疗法控制。