CN110151793A - 鼠疫菌液体气溶胶肺递送感染小鼠模型 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠疫菌液体气溶胶肺递送感染小鼠模型。本发明提供了一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：通过液体气溶胶的方式将病原菌递送至动物的肺部，得到动物模型。所述病原菌为鼠疫菌；或所述动物为小鼠。本发明直接将受试物以气溶胶形式递送至小鼠肺部，构建了一种新的肺鼠疫小鼠感染模型，该模型针对性强，重复性好，可以准确定量研究受试物对小鼠的感染情况。

Description

鼠疫菌液体气溶胶肺递送感染小鼠模型

技术领域

本发明涉及一种小鼠感染模型的制备方法，尤其涉及一种液体气溶胶肺递送病原菌感染小鼠模型的构建方法。

背景技术

鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病，在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，夺去了上亿人的生命。鼠疫杆菌是鼠疫耶尔森氏菌属中能引起严重人类感染的细菌之一，人接触了感染动物的血液和组织，或暴露在有菌气溶胶环境中均有可能被感染，表现为淋巴腺红肿、败血症或肺鼠疫，其中后面两种症状有高度传染性，如果在出现症状的24小时内没有采取抗生素治疗，常会致死。现在鼠疫感染在许多国家和地区仍然严重威胁着公共健康。鼠疫菌致病机制的研究、疫苗效果的评价等研究都离不开鼠疫菌动物模型的建立。小鼠模型是应用较为普遍的鼠疫菌动物模型。

目前，针对液体气溶胶或干粉气溶胶等的研究多采用口鼻暴露和全身暴露，这两种方法虽然对实验动物无创伤，但是无法精确定量给药剂量，受试动物吸入剂量差异较大。而且由于样品气溶胶需充满容量较大的暴露塔或暴露舱中并达到一定浓度，因此样品需求量较大且损耗也较大，增加了生物安全防护负担。此外相关的仪器设备体积大、价格不菲。

经气管进行肺递送可以将样品直接到达肺部靶器官，作用直接，节约样品，因此经气管染毒或给药是动物毒理及免疫研究的不错手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备动物模型的方法。

本发明提供的制备动物模型(动物感染模型)，包括如下步骤：通过液体气溶胶的方式将病原菌递送至动物的肺部，得到动物模型。

上述方法中，所述病原菌为鼠疫菌；

或所述动物为小鼠。

上述方法中，所述递送为定量递送；

或，所述鼠疫菌以鼠疫菌菌液的方式传递；

或所述鼠疫菌菌液为将鼠疫菌悬浮在含有体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水中得到的菌液；

或所述鼠疫菌的递送量为2000CFU/体重为16-20g。

上述方法中，所述通过液体气溶胶的方式将病原菌递送至动物的肺部为将病原菌菌液通过液体气溶胶肺递送装置递送至动物的肺部。

上述方法制备的动物模型在筛选病原菌治疗药物中的应用也是本发明保护的范围。

上述液体气溶胶肺递送装置在制备病原菌感染动物模型中的应用也是本发明保护的范围；

或上述液体气溶胶肺递送和病原菌在制备病原菌感染动物模型中的应用也是本发明保护的范围。

本发明中实施经气管进行气溶胶肺递送时，借助小动物喉镜在视野内暴露小鼠会咽部位，将肺递送装置针头插入气管中，快速用力推动注射器针芯，使液体呈雾状。注意操作时动作轻柔、迅速，所有器械用后注意及时消毒除菌。

本发明直接将受试物以气溶胶形式递送至小鼠肺部，构建了一种新的肺鼠疫小鼠感染模型，该模型针对性强，重复性好，可以准确定量研究受试物对小鼠的感染情况。

附图说明

图1为小鼠生存曲线。

图2为攻毒后小鼠脏器和血中细菌载量。

图3为攻毒后不同时间点肺递送组小鼠血清及肺匀浆液中的急性期反应蛋白(C反应蛋白及穿透素2)水平。

图4为小鼠血清及肺匀浆液中细胞因子。

图5为91001感染后小鼠脾组织病理学。

图6为91001感染后小鼠肺组织病理学。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中实验动物采用BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，SPF级，体重16-20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

下述实施例中菌株为鼠疫菌91001菌株(宋亚军，童宗中，王津等。鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析。解放军医学杂志，2004，29(3)：192-198)，本实验室保存。

下述实施例中试剂：泊洛沙姆购自SIGMA公司(P5556)；BHI培养基购自BD公司；小鼠CRP检测试剂盒、小鼠穿透素2检测试剂盒购自R&D公司、小鼠细胞因子检测试剂盒购自eBioscience公司、HRP标记的山羊抗鼠IgG、IgG1、Ig2a、IgA、IgM抗体购自abcam公司。

生理盐水为质量百分含量为0.9％的Nacl水溶液；

含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水为将泊洛沙姆和生理盐水混匀得到的溶液，且泊洛沙姆在溶液中的体积百分含量为0.05％。

实施例1、一种液体气溶胶肺递送感染小鼠模型的构建方法

一、鼠疫菌培养及菌液制备

(1)活化将-80度冰箱保存的甘油菌种鼠疫菌91001化冻后吸取20μl接种于20ml的BHI肉汤中，26℃摇床200rpm培养36h，使鼠疫菌生长至平台期。此为第一代菌。

(2)预培养将菌液20倍稀释转接于20ml的BHI肉汤中，26℃摇床200rpm培养菌液至OD₆₀₀为1.0。此为第二代菌。

(3)正式培养将菌液100倍稀释转接于20ml的BHI肉汤中，26℃下200rpm培养菌液至OD₆₀₀为1.0，此为第三代菌。将第三代菌液转移至37℃摇床200rpm培养3h，此时菌体处于对数期中期。

(4)菌液制备收集适量(3)得到的菌液至无菌EP管中，3000g离心10min集菌，吸弃培养基上清，用含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水重悬菌体，并用含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水将菌液OD₆₀₀调整为1.0，按理论菌量10⁸CFU/ml稀释菌液至所需浓度进行后续实验，得到鼠疫菌91001菌液。

同时将菌液5倍倍比稀释后涂BHI固体平板，平板在26℃倒置培养3天后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量。

二、液体气溶胶肺递送鼠疫菌感染小鼠半数致死量测定

本实验用2中攻毒途径攻毒小鼠(BALB/c、北京维通利华实验动物技术有限公司)，分为肺递送组和滴鼻组，共分为2组，每组30只小鼠。先注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后攻毒，攻毒方法如下：

肺递送不同剂量组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将上述一得到的91001菌液(含0.05％泊洛沙姆)递送至小鼠肺部；肺递送为每只小鼠50μl菌液；每只小鼠(体重为16-20g)的攻毒剂量为下表1。

肺递送生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)对照组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将含0.05％泊洛沙姆的生理盐水递送至小鼠肺部；肺递送为每只小鼠50μl菌液。

滴鼻不同剂量组：将上述一得到的91001菌液(含0.05％泊洛沙姆)滴鼻小鼠；剂量如下表1。

滴鼻生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)对照组：将含0.05％泊洛沙姆的生理盐水滴鼻小鼠。

每种途径设8个不同剂量组及生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)对照组，观察并记录了攻毒后14天内小鼠临床症状及小鼠生存情况，使用Graphad软件分别计算两种攻毒途径的小鼠半数致死量。

表1小鼠生存情况统计表

计算得出肺递送组LD50为20CFU，滴鼻组LD50为100CFU，肺递送途径LD50仅为滴鼻途径的1/5。肺递送途径可用更低的攻毒剂量达到常规滴鼻途径等同的致死率，可见是一种更有效的呼吸道攻毒途径。

三、液体气溶胶肺递送鼠疫菌攻毒

1、攻毒

本实验用肺递送途径攻毒小鼠(BALB/c、北京维通利华实验动物技术有限公司)，分为菌液实验组和含0.05％泊洛沙姆的生理盐水对照组，共分为2组，每组30只小鼠。先注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后攻毒，攻毒方法如下：

菌液实验组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将91001菌液(含0.05％泊洛沙姆)递送至小鼠肺部；肺递送为每只小鼠50μl菌液；每只小鼠(体重为16-20g)的攻毒剂量为2000CFU。

含0.05％泊洛沙姆的生理盐水对照组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将含0.05％泊洛沙姆的生理盐水递送至小鼠肺部；肺递送为每只小鼠50μl含0.05％泊洛沙姆的生理盐水。

2、检测

1)、生存曲线绘制

每组取10只小鼠，在攻毒后0d、1d、2d、2.5d、3d、3.5d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d时间点，记录小鼠死亡只数，绘制生存曲线。

结果如图1所示，可以看出，肺递送实验组小鼠在6天内全部死亡，对照组小鼠全部存活。

2)、临床症状观察

每组取的10只小鼠同时在攻毒后0d、1d、2d、2.5d、3d、3.5d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d时间点，观察并记录小鼠病症(耸毛、呼吸困难、强迫性腹部呼吸、被触摸或外部刺激后反应迟钝)。

经观察记录，肺递送实验组小鼠在攻毒后第二天均有耸毛现象，第三天部分症状严重小鼠可见眼角有分泌物、外部刺激后反应迟钝等症状，随后小鼠症状逐渐加重，可见强迫性腹部呼吸，最后小鼠全部死亡。对照组小鼠无明显症状。

3)、动物解剖及样本处理

每组剩余的20只小鼠，在攻毒后1h、24h、48h、60h时间点，每组随机取4只存活小鼠摘眼球取小鼠全血，然后进行解剖，取小鼠脾和肺，小部分脾和肺用10％甲醛溶液固定后用于病理学检测，剩余脾和肺分别放入2ml无菌生理盐水中匀浆得到匀浆液。留出适量血和肺匀浆液用于涂板检测细菌载量，剩余血和肺匀浆液3000g离心10min，将上清分装至新的EP管中，于-20度冰箱保存。具体如下：

(1)、载菌量检测

测定各个攻毒后时间点的全血、脾、肺中细菌载量，方法为：将全血、肺匀浆液和脾匀浆液用无菌生理盐水进行5倍倍比稀释后，每个稀释度涂3个重复，每个重复10μl稀释液，将平板倒置于26度培养箱中培养3天，统计不同稀释度的菌落数。后面几个时间点需要多涂几个稀释度，避免菌量太多无法计数。

检测了不同采样时间点小鼠肺、脾和血中的细菌载量，结果如图2所示，☆表示肺递送组和肺递送对照组相比有显著差异，△表示和肺递送组1h相比有显著差异，A.肺载菌量；B.脾载菌量；C.血载菌量；可以看出，对照组用的是生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)，所以没有检测到细菌；肺递送实验组肺中细菌在攻毒后1h检测到，脾中细菌在攻毒后24h检测到，血中细菌在攻毒后48h检测到。感染后72h肺递送实验组和对照组肺、脾、血中细菌载量有显著差异。血和脏器中细菌载量随着时间的推移都呈递增趋势，表明鼠疫菌感染小鼠后，在其体内不断繁殖。

(2)急性期反应蛋白检测

测定各个时间点的血清、肺匀浆液中C反应蛋白和穿透素2含量(使用小鼠CRP检测试剂盒和小鼠穿透素2检测试剂盒，品牌为R&D)，具体检测方法如下：

C反应蛋白检测步骤：

1)试剂准备：使用前将所有试剂放在室温平衡。

小鼠CRP对照：对照中加入1ml去离子水溶解，混匀。

洗液：如果溶液结晶了，加热至室温，温和混匀至结晶溶解，取20ml的洗液加至去离子水中准备500ml的洗液。

底物溶液：使用前15min，试剂A和B应该等体积混合，避光放置。每孔需要100μl混合后的溶液。

标准稀释剂RD5P(1:5稀释)：取20ml标准稀释剂RD5P至80ml去离子水中得到100ml标准稀释剂RD5P。

2)稀释样品：肺匀浆上清样品高速离心13000rpm，5min，将原液5倍稀释；血清样品稀释2000倍；标准品2倍倍比稀释6个浓度。

3)每孔加入50μl RD1W溶液，再在相应孔加入50μl样品、标准品、对照样品，封好96孔板，室温孵育2h。

4)吸弃上清，洗板4次，每次加400μl稀释后的洗液，然后吸弃，每次需吸干净。

5)每孔加入100μl小鼠偶联抗体。

6)吸弃上清，洗板4次，每次加400μl稀释后的洗液，然后吸弃，每次需吸干净。

7)显色液A和B 1：1混合，在配制15min内使用。每孔加入100μl，显色液加入96孔板后，室温避光放置30min。

8)每孔加入终止液100μl，在30min以内读板(波长450nm和540nm)。

穿透素2检测步骤：

1)试剂准备：使用前将所有试剂放在室温平衡。

小鼠穿透素2对照：对照中加入1ml去离子水溶解，混匀。

洗液：如果溶液结晶了，加热至室温，温和混匀至结晶溶解，取20ml的洗液加至去离子水中准备500ml的洗液。

底物溶液：使用前15min，试剂A和B应该等体积混合，避光放置。每孔需要100μl混合后的溶液。

标准稀释剂RD5-60(1:5稀释)：取20ml标准稀释剂RD5-60至80ml去离子水中得到100ml标准稀释剂RD5-60。

2)稀释样品：肺匀浆上清样品高速离心13000rpm，5min，将原液5倍稀释；血清样品稀释2000倍；标准品2倍倍比稀释6个浓度。

3)每孔加入50μl RD5-60，再在相应孔加入样品、标准品、对照样品，封好96孔板，室温摇床300rpm孵育3h。

4)吸弃上清，洗板5次，每次加400μl稀释后的洗液，然后吸弃，每次需吸干净。

5)每孔加入100μl小鼠偶联抗体，室温摇床300rpm孵育1h。

6)吸弃上清，洗板5次，每次加400μl稀释后的洗液，然后吸弃，每次需吸干净。

7)显色液A和B 1：1混合，在配制15min内使用。每孔加入100μl，显色液加入96孔板后，室温避光放置30min。

8)每孔加入终止液100μl，在30min以内读板(波长450nm和540nm)。

检测结果如图3所示，☆表示肺递送组和肺递送对照组相比有显著差异，△表示和肺递送组1h相比有显著差异，A.血清及肺匀浆液中的C反应蛋白；B.血清及肺匀浆液中的穿透素2；可以看出，肺递送实验组C反应蛋白和穿透素2水平随时间的推移基本呈增长趋势。攻毒后48h和60h，肺递送实验组与对照组小鼠血清中的C反应蛋白水平有显著差异，攻毒后24h、48h、72h，肺递送实验组小鼠血清中的C反应蛋白水平与攻毒后1h有显著差异；攻毒后1h、24h和48h，肺递送实验组和对照组小鼠肺匀浆液中C反应蛋白水平有显著差异，攻毒后24h、48h、72h，肺递送实验组小鼠肺匀浆液中的C反应蛋白水平与攻毒后1h有显著差异。攻毒后48h和72h，肺递送实验组与对照组小鼠血清中的穿透素2水平有显著差异，攻毒后24h、48h、72h，肺递送实验组小鼠血清中的C反应蛋白水平与攻毒后1h有显著差异；攻毒后1h、24h、48h、72h，肺递送实验组和对照组小鼠肺匀浆液中的穿透素2水平有显著差异，攻毒后48h和72h，肺递送实验组小鼠肺匀浆液中的穿透素2与攻毒后1h有显著差异。

(3)、细胞因子检测

用试剂盒Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg Cytokine 17-Plex Mouse Panel，货号EPX170-26087-901，测定各个时间点的血清、肺匀浆上清中的17种细胞因子(IFN gamma、IL-12p70、IL-13、IL-1beta、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF alpha、GM-CSF、IL-18、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、IL-27、IL-9的滴度。

结果如图4所示，☆表示实验组和对照组相比有显著差异；△表示和肺递送实验组1h相比有显著差异；肺递送实验组和对照组IL-6、IL-18、IFN gamma、TNF alpha等细胞因子水平有明显差别。肺递送实验组和对照组在不同采样时间点，实验组细胞因子水平高于对照组(少数细胞因子除外)；攻毒后48h和60h细胞因子水平高于攻毒后1h和24h的细胞因子水平(少数细胞因子除外)。

(4)、组织病理分析

将各个时间的10％甲醛溶液固定的脾、肺进行病理解剖和组织病理分析。具体方法如下：

1)组织样本，取材3mm厚，梯度酒精脱水70％、80％、95％、100％各30min，二甲苯两瓶各20min，石蜡浸蜡两缸各12min，包埋，切片4微米，烤片。

2)染色

苏木素伊红(hematoxylin eosin，HE)染色步骤：

a.脱蜡，三瓶二甲苯每瓶脱蜡8min；两瓶100％酒精每瓶8min；90％酒精、80％酒精、60％酒精各8min；

b.苏木素染色4min，流水清洗；

c.盐酸酒精分化2-3s，流水清洗；

d.0.5％氨水20s，流水清洗，上镜观察；

e.0.5％伊红染色1min；

f.80％酒精、90％酒精各分化3-5s；95％酒精5min；三瓶100％酒精各5min；两瓶二甲苯各5min；

g.中性树脂胶封固；光镜观察并显微照相。

对肺递送实验组和对照组小鼠攻毒后1h、72h两个时间点脾和肺进行病理检测。各组在攻毒后1h脾没有肉眼可见的病变，脾脏被膜不增厚，红髓及白髓分布均匀，红髓内散在可见红细胞及其它细胞成分，白髓内散在可见以脾小梁为主体的及其它各型淋巴细胞,白细胞系统及巨细胞系统形态与结构基本正常。肺递送实验组攻毒后72h脾的白髓中，生发中心边缘，可见明显炎性坏死改变(图5，(A)肺递送对照组，攻毒后1h，正常脾；(B)肺递送实验组，攻毒后1h，正常脾；(C)肺递送对照组，攻毒后72h，正常脾；(D)肺递送实验组，攻毒后72h，脾炎性改变(箭头所示))。各组在攻毒后1h肺膜光滑，不增厚，肺膜下散在可见分布均匀的肺泡组织，部分肺泡壁稍有增厚，大都有支气管周围炎；肺递送实验组攻毒后72h，深部支气管及支气管周围明显可见水肿及炎性改变，其中尤以水肿更为明显，同时有出血现象，部分肺泡内明显充满淡粉色透明液体，部分区域病变较为弥漫，部分区域病变较为局限(图6，(A)肺递送对照组，攻毒后1h，正常肺；(B)肺递送实验组，攻毒后1h，正常肺；(C)肺递送对照组，攻毒后72h，正常肺；(D)肺递送实验组，攻毒后72h，肺水肿(上面箭头所示)及出血(下面箭头所示))。上述实验结果表明，鼠疫菌91001感染小鼠后，小鼠的机体损伤、病理变化、免疫反应及病原体分布等都表明91001可以成功感染小鼠，并且有很强的致病力。

上述结果证明，经气管以气溶胶方式肺递送给予小鼠91001菌液成功建立了鼠疫菌感染BALB/c小鼠的动物模型，为鼠疫菌的相关研究奠定了基础。

鼠疫菌感染BALB/c小鼠的动物模型的应用：鼠疫菌致病机制研究、疫苗效果评价、筛选鼠疫菌治疗药物、选择治疗方案等。

以上对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不局限于上述实施例。对于本领域技术人员而言，在不违背发明创造精神的前提下可以对本发明进行等同修改和替代，这些等同的修改和替代均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：通过液体气溶胶的方式将病原菌递送至动物的肺部，得到动物模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病原菌为鼠疫菌；

或所述动物为小鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述递送为定量递送；

或，所述鼠疫菌以鼠疫菌菌液的方式传递；

或所述鼠疫菌菌液为将鼠疫菌悬浮在含有体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水中得到的菌液；

或所述鼠疫菌的递送量为2000CFU/体重为16-20g。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述通过液体气溶胶的方式将病原菌递送至动物的肺部为将病原菌菌液通过液体气溶胶肺递送装置递送至动物的肺部。

5.权利要求1-4中任一所述方法制备的动物模型在筛选病原菌治疗药物中的应用。

6.液体气溶胶肺递送装置在制备病原菌感染动物模型中的应用；

或液体气溶胶肺递送和病原菌在制备病原菌感染动物模型中的应用。