CN106198143A - 一种植物油料蛋白测定的快速消化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种植物油料蛋白测定中的快速消化方法，经粉碎样品、在高油植物样品中加入正已烷或石油醚，进行微波萃取，过滤除去油脂，再将剩余物干燥至粉状，加入浓硫酸和消化片，混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成植物油料的消化。采用上述方案是先微波萃取去大部分油脂，从而使半固体或糊状高油植物样成粉状样品，在消化过程中不易产生爆沸，其消化方法快速、简捷，使用的溶剂量小，省去碳化过程直接消化，不易产生爆沸，且不使用易挥发对人体有害的消泡剂正辛醇或双氧水。本发明方便、快捷，成本低。

Description

一种植物油料蛋白测定的快速消化方法
技术领域
本发明涉及一种植物油料蛋白测定中的快速消化方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
在油料植物提取、植物成分分析中，常常涉及到植物材料的消化及蛋白质的测定。
凯氏消化中的一个最常见的问题是在消化的初期会产生一些泡沫。对于高脂肪、高油、高碳水化合物含量或者一些含有表面活性剂的样品将会产生更多的泡沫。控制泡沫的另一个方法是加入过氧化氢。过氧化氢有两种效能，它即是氧化剂又是消泡剂。过氧化氢虽然能改善发泡，但据有关报导它的使用会引起氮的损失。另一减少泡沫的方法是在消化之前，在装有样品的消化管中加入所有的试剂，把试管在常温下放置一夜，这种方法消化时间延长，提取效率低。
因此，现有技术中油料植物的消化常存在的繁琐、复杂操作、费时、费力，且要使用有害、有毒试剂，成本高，资源浪费严重等不足。常规高油植物消化方法为：高油植物消化中需加入2片凯尔特催化片Se3.5（7gK2SO4和7mgSe）和20ml浓硫酸。在每个消化管中还需小心加入10ml双氧水防止起泡，为防止发生起泡现象，要采用逐步升温的方法在4h内将温度升高至420℃。
现有的技术标准也都以繁琐、复杂的操作，且需要更多的催化剂的配合来进行油料植物的消化，处理效果不理想，会出现消化时爆沸，消化管破裂等一系列安全事故，且试样消化不完全，出现所测结果远离真实值。消化需要的时间要取决于许多因素，这些因素有：样品类型、使用酸的多少、加入盐的量、所用的催化剂、氧化剂、还原剂以及消化装置设定的温度等等。
因此，完全有必要对现有技术加以改进。
发明内容
为解决常规消化存在的繁琐、复杂操作、费时、费力，且要使用有害、有毒试剂，成本高，资源浪费严重等不足，本发明提供一种植物油料蛋白测定中的快速消化方法。
本发明通过下列技术方案实现：一种植物油料蛋白测定中的快速消化方法，经过下列步骤：
A、粉碎样品：将高油植物样品在室温下研磨至粒度小于或等于1mm；由于高油植物样一般为半固体和糊状样品，难处理，尤其是样品粒度范围较宽或某些组分比较坚硬时更难处理。根据具体样品的类型可用匀浆、液化或球磨的方法处理以获得适当的分析样品，本发明采用室温研磨为粒度小于或等于1mm的样品；
B、按高油植物样品与溶剂的固液比g/mL计为1:10，在步骤A的高油植物样品中加入正已烷或石油醚，以80℃、600W的条件进行微波萃取10min，过滤除去油脂，此时能去除50%以上的油脂，再将剩余物干燥至粉状，利于分散消化；
C、取步骤B所得粉状样品0.5～0.8g、浓硫酸9～12mL和消化片1片，混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成植物油料的消化。
所述步骤B的干燥是在90～95℃下进行干燥。
所述步骤C的消化片是每片含3.5g k2SO4 +0.4g CuSO4·5H2O。
所述步骤B的正已烷或石油醚为色谱纯。
本发明具有下列优点和效果：消化过程的目的是要打破所有样品中氮的有机结合，并使所有类型的氮都转换成铵离子。采用上述方案是先微波萃取去大部分油脂，从而使半固体或糊状高油植物样成粉状样品，在消化过程中不易产生爆沸，其消化方法快速、简捷，使用的溶剂量小，省去碳化过程直接消化，不易产生爆沸，且不使用易挥发对人体有害的消泡剂正辛醇或双氧水。本发明只需一片消化片（3.5gk2SO4+0.4gCuSO4·5H2O），且消化时间缩短只需1.5h，而不需程序升温，整个消化过程温和无爆沸，硫酸铜作为催化剂能满足现代凯氏程序的需要，即速度、效率和环境的安全。消化时间相对于常规消化可节省4～5h，消化试剂可省3～10mL/样，且相对不除油的试样，可省去一半的催化剂。本发明方便、快捷，成本低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
本发明所使用的浓硫酸、盐酸、氢氧化钠及硼酸均为市购的分析纯产品。
实施例1
A、粉碎样品：将核桃仁干样品（含水量＜4%）约10g在室温下研磨至粒度小于或等于1mm的半固体状；
B、按高油植物样品与溶剂的固液比g/mL计为1:10，在步骤A的核桃仁干样品中加入色谱纯正已烷，置于微波萃取罐中以80℃、600W的条件进行微波萃取10min，过滤除去油脂，此时能去除60%以上的油脂，再将剩余物在95℃下真空干燥至粉状，利于分散消化；
C、取步骤B所得粉状样品0.5g、浓硫酸9mL和消化片1片（k2SO4 3.5g+CuSO4·5H2O0.4g），混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成核桃仁干的消化。
所得消化后的样品在进行蛋白测定时是经下列操作：
1、配制标准滴定液（该标准滴定液是以基准试剂无水碳酸钠标定的0.1mol/L的盐酸溶液，精度为万分之一）：
（1）取9mL浓盐酸溶于蒸馏水中，并定容至1000mL，得到盐酸标准液；
（2）为了获得准确的氮/蛋白质分析结果，必须保证盐酸的浓度符合要求，因此需按照下述方法或国标方法用碳酸钠滴定盐酸：
a）基准物质：
称取约10克无水碳酸钠（Na2CO3)，研成细粉，在265℃下干燥1小时或在200℃下干燥2小时，在干燥器中冷却后移入烧杯，盖紧，在干燥器中存放；
b）指示剂：
将0.1克甲基红溶于100mL浓度为95%的乙醇中得到甲基红指示剂，将0.1g溴甲酚绿溶解于100mL浓度为95%的乙醇中得到溴甲酚绿指示剂；
c）滴定和浓度计算：
用分析天平称取步骤a）所得基准Na2CO3约0.4克，记取重量（W1），移入锥形瓶，加40mL蒸馏水，再各加8滴步骤b）所得甲基红指示剂和溴甲酚绿指示剂，用步骤（1）所得盐酸标准液滴定至粉红色，记下所用盐酸标准液的毫升数（A1)；将锥形瓶中的溶液煮沸几分钟，再用自来水冲凉至室温，此时粉红色褪去，继续使用盐酸标准液滴定至粉红色复现，记下盐酸标准液的滴定毫升数（A2）；再将锥形瓶中的溶液煮沸几分钟，然后用自来水冲凉至室温，此时粉红色褪去，继续使用盐酸标准液滴定至粉红色复现，记下盐酸标准液的滴定毫升数（A3）；即得到标准滴定液，该标准滴定液的浓度按下式计算：
标准滴定液的摩尔浓度N=
注意：浓度必须精确到小数点后4位，例如0.1000mol/L。
备注：温度会影响标准滴定液的体积和浓度；使用标准滴定液时的温度应该和标定时的温度接近。如果需要对温度进行校正，可使用校正表。
本例所得标准滴定液的摩尔浓度N为0.1008mol/L。
2、称取实施例1所得消化后的样品，记录样品重量534mg，在消化管中用70mL蒸馏水稀释消化后的样品；按常规上FOSS凯氏定氮仪，工作条件是：消化管中加入质量浓度为40%的NaOH溶液50mL，接收瓶中加入质量浓度为1%的硼酸接收液30mL；这是因为消化后的样品中所有的氮将形成硫酸铵(NH4)2SO4，所以硫酸铵可以作为检验蒸馏器回收率的一种标准试剂；凯氏定氮仪蒸馏的原理是用氢氧化钠将NH4 +转化为氨，然后将氨蒸馏到一个含有硼酸的接收瓶中，之后再用步骤1所得标准滴定液对接收瓶中的溶液进行滴定，用比色法判断滴定终点，滴定终点为蓝/灰色；记录消化后样品滴定所耗用标准滴定液的量V1为0.336mL。
3、在消化管中加入浓硫酸9～12mL和消化片1片（k2SO4 3.5g+CuSO4·5H2O 0.4g），上FOSS凯氏定氮仪，其他操作同步骤2，记录空白样品滴定所耗用标准滴定液的量V空为0.05mL。
4、按下列公式计算得到植物油料的蛋白含量：
V1——消化后样品滴定所耗用标准滴定液的量（mL）；
V空——空白样品滴定所耗用标准滴定液的量（mL）；
N——标准滴定液的摩尔浓度（精确到0.0001mol/L）；
5.3——高油植物蛋白质理论系数；
14.007——氮的原子量；
样品重量——消化后的样品重量（mg）。
本例计算得到核桃仁干的蛋白含量为40.08%。
对比例1：同实施例1，仅省略步骤B。
对比例2：步骤A同实施例1，之后在步骤A的高油植物样品中加入2片凯尔特催化片Se3.5（7gK2SO4+7mgSe）和20mL浓硫酸。在每个消化管中小心加入10mL双氧水防止起泡。将消化管上FOSS凯氏定氮仪就位，打开水抽气泵或排废装置。为防止发生起泡现象，采用逐步升温的方法在4h内将温度升高至420℃，然后保持在420℃下消化30min。消化后将消化管至少冷却15min。
将对比例1、2按上述蛋白测定方法进行测定，得如下结果：其中对比例2硒的结果不稳定，回收不完全或有氮的损失，是个有争议的催化剂，且硒比其他催化剂较难使用，因为它对酸、盐比例的作用更为敏感。
实施例2
A、粉碎样品：将油橄榄干样品（含水量＜4%）10g在室温下研磨至粒度小于或等于1mm的糊状；
B、按高油植物样品与溶剂的固液比g/mL计为1:10，在步骤A的高油植物样品中加入色谱纯石油醚，置于微波萃取罐中以80℃、600W的条件进行微波萃取10min，过滤除去油脂，此时能去除50%以上的油脂，再将剩余物90℃下干燥至粉状，利于分散消化；
C、取步骤B所得粉状样品0.6g、浓硫酸10mL和消化片1片（k2SO4 3.5g+CuSO4·5H2O0.4g），混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成油橄榄干的消化。
同实施例1，对所得消化后的样品在进行蛋白测定。
对比例3同对比例1的操作，仅替换植物油料样品。
对比例4同对比例2的操作，仅替换植物油料样品。
得如下结果：本例标准滴定液的摩尔浓度N为0.1008mol/L。
实施例3
A、粉碎样品：将油茶干样品（含水量＜4%）10g在室温下研磨至粒度小于或等于1mm的糊状；
B、按高油植物样品与溶剂的固液比g/mL计为1:10，在步骤A的高油植物样品中加入色谱纯石油醚，置于微波萃取罐中以80℃、600W的条件进行微波萃取10min，过滤除去油脂，此时能去除50%以上的油脂，再将剩余物90℃下干燥至粉状，利于分散消化；
C、取步骤B所得粉状样品0.6g、浓硫酸10mL和消化片1片（k2SO4 3.5g+CuSO4·5H2O0.4g），混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成油茶干的消化。
同实施例1，对所得消化后的样品在进行蛋白测定。
对比例5同对比例1的操作，仅替换植物油料样品。
对比例6同对比例2的操作，仅替换植物油料样品。
得如下结果：本例标准滴定液的摩尔浓度N为0.1008mol/L。

Claims (4)

1.一种植物油料蛋白测定中的快速消化方法，其特征在于经过下列步骤：
A、粉碎样品：将高油植物样品在室温下研磨至粒度小于或等于1mm；
B、按高油植物样品与溶剂的固液比g/mL计为1:10，在步骤A的高油植物样品中加入正已烷或石油醚，以80℃、600W的条件进行微波萃取10min，过滤除去油脂，再将剩余物干燥至粉状；
C、取步骤B所得粉状样品0.5～0.8g、浓硫酸9～12mL和消化片1片，混合后升温至420℃后保温1h，至消化液呈透明的蓝绿色，冷却后即完成植物油料的消化。
2.根据权利要求1所述的植物油料蛋白测定中的快速消化方法，其特征在于：所述步骤B的干燥是在90～95℃下进行干燥。
3.根据权利要求1所述的植物油料蛋白测定中的快速消化方法，其特征在于：所述步骤C的消化片是每片含3.5g k2SO4 +0.4g CuSO4·5H2O。
4.根据权利要求1所述的植物油料蛋白测定中的快速消化方法，其特征在于：所述步骤B的正已烷或石油醚为色谱纯。
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