CN106172001A - 一种红美人桔子苗组培繁殖技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红美人桔子苗组培繁殖技术，所述红美人桔子苗组培繁殖技术，包括以下步骤：1)前处理，2)无菌组织建立，3)愈伤组织分化培养及扩大培养，4)增长培养，5)分化出根，6)移栽培养；本发明所提供的组培繁殖技术，具有繁殖系数高、生产周期短、程序简单易于操作、成本低廉等优点，适于红美人桔子苗的快速繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种红美人桔子苗组培繁殖技术。
背景技术
“红美人”桔子原名爱媛28号(南香×天草)，是象山县从日本引进的优质早熟杂柑品种，近年来在试点栽培过程中发现，该品种在树势、结果习性、外观、品质、成熟期等方面表现均较为突出，可替代‘象山红’成为象山县早熟杂柑主栽品种。幼树树姿较直立，结果后树姿开张，树势中等，枝梢粗壮，单果重200g，果实短卵圆形到球形，果皮橙红色，较光滑，减酸早，糖度高，可溶性固形物12％以上，果肉橙色，柔软多汁，囊衣薄，易剥皮，有香气，单性结实强，无核，质优。露地栽培10月中下旬即可采摘，贮藏性略差，如果设施完熟到第二年1月中旬采摘，可溶性固形物含量上升到14.5％以上，风味极佳。当前红美人桔子苗的组培繁殖技术存在操作复杂，繁殖周期长，成本较高等缺陷；因此红美人桔子苗组培繁殖技术的开发，是十分紧迫的任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红美人桔子苗组培繁殖技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种红美人桔子苗组培繁殖技术，包括以下步骤：
1)前处理
挑选健康无虫害15cm长左右的红美人桔子苗，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2％浓度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小苏打水冲洗15-20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h；
2)无菌组织建立
在无菌工作台上，将步骤1)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分；使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为：黑暗，20℃-26℃，培养8天-10天；
3)愈伤组织分化培养及扩大培养
将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为：1200Lx-1400Lx，24℃-26℃，光照时间14h-16h，黑暗时间10h-8h，培养8天-10天；愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
4)增长培养
将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为1000Lx，28℃-30℃，光照时间4h-8h，黑暗时间20h-16h；
5)分化出根
增长后的无根苗达到8cm-12cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为：开始的3天-5天，黑暗，24℃培养；1400Lx光照，28℃培养15天；
6)移栽培养
待苗生根3-5条，根长4-6cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8％浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度78％-82％，温度30℃-32℃，3600Lx光照，20h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
作为本发明进一步的方案：所述初代培养基主要成份为VW+1.3mg/L BA+1mg/L2,4-D+20mg/L芦荟胶+48mg/L肌醇+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8-6.1。
作为本发明进一步的方案：所述愈伤组织培养基主要成份为1/2MS+2mg/L 6-BA+2mg/L大蒜素+6mg/L TDZ+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8-6.1。
作为本发明进一步的方案：所述扩大培养基培养基主要成份为MS+1/2NLN+0.1mg/L NAA+0.3mg/L IBA+1mg/L C6-HSL+10mg/L山梨醇+320mg/L土壤浸提液+38g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8-6.4。
作为本发明进一步的方案：所述增长培养基主要成份为MS+0.8mg/L NAA+0.1mg/LKT+10mg/L尼生素+40mg/L肌醇+112mg/L泛酸+2g/L半乳糖+38g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH5.9-6.4。
作为本发明进一步的方案：所述生根诱导培养基主要成份为1/2MS+1/2ND+0.9mg/L NAA+0.4mg/L IBA+0.8mg/L CTK+1.4mg/L水飞蓟素+12.5mg/L银杏内酯+36g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0-6.3。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所提供的组培繁殖技术，具有繁殖系数高、生产周期短、程序简单易于操作、成本低廉等优点，适于红美人桔子苗的快速繁殖。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种红美人桔子苗组培繁殖技术，包括以下步骤：
1)前处理
挑选健康无虫害15cm长左右的红美人桔子苗，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2％浓度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小苏打水冲洗15min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h；
2)无菌组织建立
在无菌工作台上，将步骤1)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分；使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为：黑暗，20℃，培养8天；
3)愈伤组织分化培养及扩大培养
将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为：1200Lx，24℃，光照时间14h，黑暗时间10h，培养8天；愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
4)增长培养
将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为1000Lx，28℃，光照时间4h，黑暗时间20h；
5)分化出根
增长后的无根苗达到8cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为：开始的3天，黑暗，24℃培养；1400Lx光照，28℃培养15天；
6)移栽培养
待苗生根3条，根长4cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8％浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度78％，温度30℃，3600Lx光照，20h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
其中：
所述初代培养基主要成份为VW+1.3mg/L BA+1mg/L 2,4-D+20mg/L芦荟胶+48mg/L肌醇+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8。
所述愈伤组织培养基主要成份为1/2MS+2mg/L 6-BA+2mg/L大蒜素+6mg/L TDZ+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8。
所述扩大培养基培养基主要成份为MS+1/2NLN+0.1mg/L NAA+0.3mg/L IBA+1mg/LC6-HSL+10mg/L山梨醇+320mg/L土壤浸提液+38g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8。
所述增长培养基主要成份为MS+0.8mg/L NAA+0.1mg/L KT+10mg/L尼生素+40mg/L肌醇+112mg/L泛酸+2g/L半乳糖+38g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH 5.9。
所述生根诱导培养基主要成份为1/2MS+1/2ND+0.9mg/L NAA+0.4mg/L IBA+0.8mg/L CTK+1.4mg/L水飞蓟素+12.5mg/L银杏内酯+36g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0。
实施例2
一种红美人桔子苗组培繁殖技术，包括以下步骤：
1)前处理
挑选健康无虫害15cm长左右的红美人桔子苗，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2％浓度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小苏打水冲洗18min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h；
2)无菌组织建立
在无菌工作台上，将步骤1)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分；使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为：黑暗，23℃，培养9天；
3)愈伤组织分化培养及扩大培养
将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为：1345Lx，25℃，光照时间15h，黑暗时间9h，培养9天；愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
4)增长培养
将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为1000Lx，29℃，光照时间6h，黑暗时间18h；
5)分化出根
增长后的无根苗达到10cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为：开始的4天，黑暗，24℃培养；1400Lx光照，28℃培养15天；
6)移栽培养
待苗生根4条，根长5cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8％浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度80％，温度31℃，3600Lx光照，20h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
其中：
所述初代培养基主要成份为VW+1.3mg/L BA+1mg/L 2,4-D+20mg/L芦荟胶+48mg/L肌醇+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 6.0。
所述愈伤组织培养基主要成份为1/2MS+2mg/L 6-BA+2mg/L大蒜素+6mg/L TDZ+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.9。
所述扩大培养基培养基主要成份为MS+1/2NLN+0.1mg/L NAA+0.3mg/L IBA+1mg/LC6-HSL+10mg/L山梨醇+320mg/L土壤浸提液+38g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 6.1。
所述增长培养基主要成份为MS+0.8mg/L NAA+0.1mg/L KT+10mg/L尼生素+40mg/L肌醇+112mg/L泛酸+2g/L半乳糖+38g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH 6.3。
所述生根诱导培养基主要成份为1/2MS+1/2ND+0.9mg/L NAA+0.4mg/L IBA+0.8mg/L CTK+1.4mg/L水飞蓟素+12.5mg/L银杏内酯+36g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.2。
实施例3
一种红美人桔子苗组培繁殖技术，包括以下步骤：
1)前处理
挑选健康无虫害15cm长左右的红美人桔子苗，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2％浓度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小苏打水冲洗20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h；
2)无菌组织建立
在无菌工作台上，将步骤1)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分；使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为：黑暗，26℃，培养10天；
3)愈伤组织分化培养及扩大培养
将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为：1400Lx，26℃，光照时间16h，黑暗时间8h，培养10天；愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
4)增长培养
将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为1000Lx，30℃，光照时间8h，黑暗时间16h；
5)分化出根
增长后的无根苗达到12cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为：开始的5天，黑暗，24℃培养；1400Lx光照，28℃培养15天；
6)移栽培养
待苗生根5条，根长6cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8％浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度82％，温度32℃，3600Lx光照，20h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
其中：
所述初代培养基主要成份为VW+1.3mg/L BA+1mg/L 2,4-D+20mg/L芦荟胶+48mg/L肌醇+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 6.1。
所述愈伤组织培养基主要成份为1/2MS+2mg/L 6-BA+2mg/L大蒜素+6mg/L TDZ+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 6.1。
所述扩大培养基培养基主要成份为MS+1/2NLN+0.1mg/L NAA+0.3mg/L IBA+1mg/LC6-HSL+10mg/L山梨醇+320mg/L土壤浸提液+38g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 6.4。
所述增长培养基主要成份为MS+0.8mg/L NAA+0.1mg/L KT+10mg/L尼生素+40mg/L肌醇+112mg/L泛酸+2g/L半乳糖+38g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH 6.4。
所述生根诱导培养基主要成份为1/2MS+1/2ND+0.9mg/L NAA+0.4mg/L IBA+0.8mg/L CTK+1.4mg/L水飞蓟素+12.5mg/L银杏内酯+36g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.3。
综上所述，本发明采用上述组培繁殖技术后，生根率达98％以上，移栽成活率达98％以上。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，包括以下步骤：
1)前处理
挑选健康无虫害15cm长左右的红美人桔子苗，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2％浓度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小苏打水冲洗15-20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h；
2)无菌组织建立
在无菌工作台上，将步骤1)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分；使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为：黑暗，20℃-26℃，培养8天-10天；
3)愈伤组织分化培养及扩大培养
将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为：1200Lx-1400Lx，24℃-26℃，光照时间14h-16h，黑暗时间10h-8h，培养8天-10天；愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
4)增长培养
将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为1000Lx，28℃-30℃，光照时间4h-8h，黑暗时间20h-16h；
5)分化出根
增长后的无根苗达到8cm-12cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为：开始的3天-5天，黑暗，24℃培养；1400Lx光照，28℃培养15天；
6)移栽培养
待苗生根3-5条，根长4-6cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8％浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度78％-82％，温度30℃-32℃，3600Lx光照，20h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
2.根据权利要求1所述的红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，所述初代培养基主要成份为VW+1.3mg/L BA+1mg/L 2,4-D+20mg/L芦荟胶+48mg/L肌醇+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8-6.1。
3.根据权利要求1或2所述的红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，所述愈伤组织培养基主要成份为1/2MS+2mg/L 6-BA+2mg/L大蒜素+6mg/L TDZ+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.8-6.1。
4.根据权利要求3所述的红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，所述扩大培养基培养基主要成份为MS+1/2NLN+0.1mg/L NAA+0.3mg/L IBA+1mg/L C6-HSL+10mg/L山梨醇+320mg/L土壤浸提液+38g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8-6.4。
5.根据权利要求4所述的红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，所述增长培养基主要成份为MS+0.8mg/L NAA+0.1mg/L KT+10mg/L尼生素+40mg/L肌醇+112mg/L泛酸+2g/L半乳糖+38g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH 5.9-6.4。
6.根据权利要求4所述的红美人桔子苗组培繁殖技术，其特征在于，所述生根诱导培养基主要成份为1/2MS+1/2ND+0.9mg/L NAA+0.4mg/L IBA+0.8mg/L CTK+1.4mg/L水飞蓟素+12.5mg/L银杏内酯+36g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0-6.3。
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| 张俊娥等: "柑橘愈伤组织植株再生及其倍性鉴定", 《华中农业大学学报》 * |
| 张进仁等: "我国柑桔离体培养研究的进展", 《中国柑桔》 * |
| 柯甫志等: "日本柑橘新品种——红美人", 《浙江柑橘》 * |
| 梁倩华等: "沙田柚的组织培养", 《广西农业科学》 * |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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