CN106171991B - 一种北五味子的扩繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组培领域，特别涉及一种北五味子的扩繁方法，包括以下步骤：将消毒后的北五味子休眠芽暗培养，得到愈伤组织；将愈伤组织切割，培养得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织进行生物反应器暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8‑3.2的基质培养基中，培养后进行移栽。本发明利用体细胞胚发生途径获得北五味子再生植株，实现了北五味子植株的快速扩繁，培养时间缩短，培养效率提高，可以大规模的获得植株，有助于进行品种化生产；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培领域，具体而言，涉及一种北五味子的扩繁方法。
背景技术
北五味子是我国东北部名贵的道地药材，主产于东北三省及内蒙、河北等地，其果实可以入药，味酸、甘，性温，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功效。北五味子除药用外，还可用于饮料和保健品，深受国内外消费者的青睐。随着北五味子需求量逐步增加，北五味子的人工栽培面积急剧扩大，但由于目前育成的优良品系较少，野生五味子种子培育的实生苗生物学特性以及品质等群体间变异较大，丰产稳产性极差，良种繁育体系欠缺，严重制约了北五味子栽培业的发展。
现有技术主要采用以下两种方式进行繁殖：一、利用带腋芽的嫩茎段进行组培快繁；但这种繁殖方式生根率极低并且丛生芽扩繁几次后出现大面积死亡。二、利用种子无菌播种苗的下胚轴进行体细胞胚诱导；该方式存在以下缺陷：由种子产生的后代遗传特性不稳定，不能够遗传母本优良品质。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种北五味子植株的扩繁方法，该方法通过胚性愈伤组织的扩繁和体细胞胚的诱导，可以缩短培养时间，提高培养效率；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
(a)、将消毒后的北五味子休眠芽放入诱导培养基进行暗培养，得到愈伤组织；
(b)、将所述愈伤组织切割，然后放入诱导胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；
(c)、将所述胚性愈伤组织转移到液体培养基中进行暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；
(d)、将所述球形胚转移到半固体培养基上进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；
(e)、将所述生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8-3.2的基质培养基中，培养后进行移栽；
其中，所述诱导培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D1.8-3.2mg/L、TDZ0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。
本发明提供的一种北五味子植株的扩繁方法，先对北五味子的休眠芽诱导培养得到愈伤组织，诱导率为95％以上；然后将愈伤组织进行切割，进行胚性愈伤组织的诱导，胚性愈伤组织诱导得到的体细胞胚再进行萌发得到生根苗，即本发明利用体细胞胚发生途径获得北五味子再生植株，实现了北五味子植株的快速扩繁，培养时间缩短，培养效率提高，可以大规模的获得植株，有助于进行品种化生产；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。
其中，诱导培养基中的2,4-D在MS培养基中的含量可以为1.8mg/L、2.2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、3.2mg/L等等。
优选地，在步骤(a)中，所述消毒为：取北五味子休眠芽体，先在自来水下冲洗，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分钟，最后用无菌水冲洗3-4次，剥去外鳞片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。通过逐步的消毒，以得到无菌的并且无损伤的北五味子休眠芽，以便于下一步的诱导培养。
外鳞片一般通过无菌的镊子和刀片进行剥除。暗培养一般在盛有30-40ml诱导培养基的100ml的三角瓶进行，每个三角瓶中一般放置3-4个消毒的休眠芽，然后进行暗培养。
为了暗培养得到的愈伤组织活力强，分化能力强，易于存活，优选地，在步骤(a)和步骤(c)中，所述暗培养的温度为25±2℃，所述暗培养的时间为25-30天。
本发明中，采用以上诱导培养基培养，一个休眠芽诱导得到的愈伤组织为0.5±0.025g。
为了诱导胚性愈伤组织得到的胚性愈伤组织活力强，分化能力强，易于存活，优选地，在步骤(b)中，所述诱导胚性愈伤组织培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。
同样地，优选地，在步骤(b)中，所述愈伤组织切割的大小为0.35-0.55cm×0.35-0.55cm，所述培养的时间为25-30天。
本发明中，采用以上诱导胚性愈伤组织培养基培养，以每个休眠芽计，得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g。
优选地，在步骤(c)中，所述液体培养基的成分如下：1/2浓度的MS培养基中含有蔗糖18-22g/L；所述暗培养的温度为25±2℃，培养时间为40-45天。液体培养基培养是在气升式生物反应器中进行，气升式生物反应器的结构如图1所示，具体地，包括依次连接的电源插头1、气泵2、空气流量计3、过滤膜4、多孔喷嘴5、培养容器6、导管7、导管经过过滤膜4将气体排出；图1中箭头方向指示气体的进出方向。使用气升式生物反应器对胚性愈伤组织进行暗培养诱导体细胞胚，在培养的过程中通过通入过滤过的空气以满足植物生长需求，空气的通入量为0.2-0.3vvm，利用气流所引起的液体不断流动搅拌使植物组织能充分均匀的吸收营养物质，从而达到生长阶段同步均一的效果，并且提高诱导率；另外，培养基不需要加入琼脂，使生产成本降低60％；目前我们在用的最小的气升式生物反应器为3L，与固体培养基(每瓶培养基为50mL)相比操作简便，提高工作效率，节省劳动力成本。
本发明中，采用以上液体培养基培养，以每个休眠芽计，得到的体细胞胚的个数为68±3个。
优选地，在步骤(d)中，所述半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖28-32g/L，琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。经验证，该培养基进行体细胞胚的萌发培养萌发率高，得到的生根苗更为健壮。
本发明中，采用以上半固体培养基培养，以每个休眠芽计，得到的生根苗为34±2棵。
为了便于移植，并提高存活率，得到的所述生根苗有3-4片叶。
进一步地，在步骤(b)和(d)中，所述培养的条件为：培养温度为25±2℃，光照时间为15-16小时/天。经验证，步骤(b)和(d)以该培养条件进行培养，各组织能得到很好的生长。
进一步地，在步骤(e)中，所述生根苗移栽前先用水冲洗掉培养基，然后移栽至盛有所述述基质培养基的容器中，然后用塑料袋将容器罩上，放在温室内，温室保持在25±2℃，光照时间为15-16小时/天。
先进行套袋培养，以提高成活率，待该植株适应环境后，长出新叶，去掉塑料袋，进行移栽。
本发明中，以每个休眠芽计，得到的可移栽苗为24-28棵。
进一步地，所述北五味子的品种为嫣红、早红、金五味1号中的任一种。经验证，以上品种的北五味子诱导得到的再生植株与母本性状高度一致，且遗传稳定。
进一步地，步骤(b)中得到的胚性愈伤组织还包括：保存或继代培养的步骤，然后再将得到的胚性愈伤组织进行后续步骤；
其中，所述继代培养或保存所用的培养基的成分为：MS培养基中含有2,4-D 0.8-2.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6-7g/L，pH为5.7-6.0。
即本发明中得到的胚性愈伤组织可以直接进行后续的步骤，也可以直接进行继代培养以使胚性愈伤组织进行扩繁和保存再进行后续的步骤。继代培养和保存的条件均为：在温度为25±2℃进行培养，光照时间为15小时/天，每28-35天继代一次。
经多次试验，本发明采用继代培养后得到的胚性愈伤组织仍具有扩繁和产生体细胞胚的能力，并且每次继代培养的扩繁系数均为6倍以上，且对后续步骤基本无影响。并且已验证继代保存一年多仍具有一致的功能。
因此，本发明能够通过对胚性愈伤组织进行继代培养，得到大量的胚性愈伤组织，进而对胚性愈伤组织进行后续培养来得到大量的移栽植株。
本发明采用无性繁殖方式对北五味子优良品种进行选育，进行品种化建园，对其生产和质量进行规范化、标准化，是北五味子栽培产业发展的一个有效途径。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)申请号为200610009782.0的专利中提到的是先进行体细胞胚的诱导，再诱导胚性愈伤组织，体细胞胚的诱导率极低，仅为1.7％-3.5％；而本发明是先诱导愈伤组织，并且愈伤组织的诱导率达到95％以上，提高了诱导效率。
(2)本发明提供的北五味子植株的扩繁方法，通过胚性愈伤组织的扩繁和体细胞胚的诱导，可以快速并长期的得到北五味子的再生植株，缩短培养时间，大大提高了培养效率。
(3)本发明还提供了各阶段培养所用的培养基，与现有技术所用的培养基成分有所不同，以更好的实现北五味子的扩繁；并且在诱导体细胞胚阶段使用了气升式生物反应器进行液体培养，节省劳动时间和成本，提高了劳动效率。
(4)本发明利用五味子三个品种“嫣红”“早红”“金五味1号”的休眠芽为材料进行体细胞胚的诱导，再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。
(5)本发明还提供了对胚性愈伤组织进行继代培养或保存的具体参数步骤，以得到大量的胚性愈伤组织，进而对胚性愈伤组织进行后续培养来得到大量的移栽植株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中涉及的气升式生物反应器的结构示意图；
图1中：1-电源插头；2-气泵；3-空气流量计；4-过滤膜；5-多孔喷嘴；6-培养容器；7-导管。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
一、配置培养基：
1.诱导培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂，使2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为1.8mg/L、0.15mg/L、28g/L和6.5g/L，最后调整pH为5.7；
2.诱导胚性愈伤组织培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、蔗糖和琼脂，使2,4-D、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为2.8mg/L、28g/L和6.5g/L，最后调整pH为5.7；
3.液体培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖并使其终浓度为18g/L；
4.半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖28g/L，琼脂6.5g/L，pH为5.7；
以上培养基均进行高温高压灭菌，冷却后备用。
二、培养步骤：
于冬季十二月末一月初取嫣红品种的北五味子休眠芽，在自来水下冲洗4h，在超净工作台上用70％的酒精消毒28秒，倒出酒精，用0.1％升汞消毒22分钟，最后用无菌水冲洗4次；
将休眠芽放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下剥去外鳞片，得到消毒后的北五味子休眠芽；
将剥好的休眠芽接入盛有30ml诱导培养基的三角瓶中，三角瓶的规格为100ml，每瓶接入3个外植体，在温度为25±2℃下进行暗培养；
暗培养30天后，每个休眠芽得到的愈伤组织为0.5g±0.025g；将得到的愈伤组织切成大小为0.35-0.55cm×0.35-0.55cm小块转移到诱导胚性愈伤组织培养基中，在温度为25±2℃进行培养，光照时间为15小时/天；
培养30天后，以每个休眠芽计，诱导得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g；
将胚性愈伤组织转移到含有液体培养基的气升式生物反应器中暗培养诱导体细胞胚，培养温度为25±2℃；
暗培养45天后，以每个休眠芽计，诱导得到的球形胚个数为68±3个；
将球形胚挑出转移至半固体培养基中进行体细胞胚的萌发，培养温度为25±2℃，光照时间为15-16小时/天，培养至得到长有3～4片叶小苗，以每个休眠芽计，萌发得到的生根苗为34±2棵；
将长有3～4片叶小苗的根在流水下冲洗，以去掉培养基，然后将根系发达的小植株转移至含有灭过菌的珍珠岩与草炭重量比为1:2.8的基质培养基的小容器；
用塑料袋罩上小容器，放在温室内，培养室保持在25℃±2℃，光照时间为15-16小时/天；当植物有新叶长出时，拿掉塑料袋，将根和芽都生长良好的植株进行移栽，每个休眠芽最终得到的移栽的植株为24-26棵。
整个培养过程为8个月左右。
实施例2
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
一、配置培养基：
1.诱导培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂，使2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为2.5mg/L、0.2mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
2.诱导胚性愈伤组织培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、蔗糖和琼脂，使2,4-D、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为3mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
3.液体培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖并使其终浓度为20g/L；
4.半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8；
以上培养基均进行高温高压灭菌，冷却后备用。
二、培养步骤：
于冬季十二月末一月初取嫣红品种的北五味子休眠芽，在自来水下冲洗4h，在超净工作台上用70％的酒精消毒30秒，倒出酒精，用0.1％升汞消毒20分钟，最后用无菌水冲洗3次；
将休眠芽放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下剥去外鳞片，得到消毒后的北五味子休眠芽；
将剥好的休眠芽接入盛有30ml诱导培养基的三角瓶中，三角瓶的规格为100ml，每瓶接入3个外植体，在温度为25±2℃下进行暗培养；
暗培养28天后，每个休眠芽得到的愈伤组织为0.5g±0.025g；将得到的愈伤组织切成大小为0.25-0.35cm×0.25-0.35cm小块转移到诱导胚性愈伤组织培养基中，在温度为25±2℃进行培养，光照时间为16小时/天；
培养28天后，以每个休眠芽计，诱导得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g；
将胚性愈伤组织转移到含有液体培养基的气升式生物反应器中暗培养诱导体细胞胚，培养温度为25±2℃；
暗培养42天后，以每个休眠芽计，诱导得到的球形胚个数为68±3个；
将球形胚挑出转移至半固体培养基中进行体细胞胚的萌发，培养温度为25±2℃，光照时间为16小时/天，培养至得到长有3～4片叶小苗，以每个休眠芽计，萌发得到的生根苗为34±2棵；
将长有3～4片叶小苗的根在流水下冲洗，以去掉培养基，然后将根系发达的小植株转移至含有灭过菌的珍珠岩与草炭重量比为1:3的基质培养基的小容器；
用塑料袋罩上小容器，放在温室内，培养室保持在25℃±2℃，光照时间为16小时/天；当植物有新叶长出时，拿掉塑料袋，将根和芽都生长良好的植株进行移栽，每个休眠芽最终得到的移栽的植株为26-28棵。
整个培养过程为8个月左右。
实施例3
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
一、配置培养基：
1.诱导培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂，使2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为3.2mg/L、0.25mg/L、32g/L和7.5g/L，最后调整pH为6.0；
2.诱导胚性愈伤组织培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、蔗糖和琼脂，使2,4-D、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为3.2mg/L、32g/L和7.5g/L，最后调整pH为6.0；
3.液体培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖并使其终浓度为22g/L；
4.半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖32g/L，琼脂7.5g/L，pH为6.0；
以上培养基均进行高温高压灭菌，冷却后备用。
二、培养步骤：
于冬季十二月末一月初取嫣红品种的北五味子休眠芽，在自来水下冲洗4h，在超净工作台上用70％的酒精消毒35秒，倒出酒精，用0.1％升汞消毒18分钟，最后用无菌水冲洗3次；
将休眠芽放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下剥去外鳞片，得到消毒后的北五味子休眠芽；
将剥好的休眠芽接入盛有30ml诱导培养基的三角瓶中，三角瓶的规格为100ml，每瓶接入3个外植体，在温度为25±2℃下进行暗培养；
暗培养25天后，每个休眠芽得到的愈伤组织为0.5g±0.025g；将得到的愈伤组织切成大小为0.25-0.35cm×0.25-0.35cm小块转移到诱导胚性愈伤组织培养基中，在温度为25±2℃进行培养，光照时间为16小时/天；
培养25天后，以每个休眠芽计，诱导得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g；
将胚性愈伤组织转移到含有液体培养基的气升式生物反应器中暗培养诱导体细胞胚，培养温度为25±2℃；
暗培养40天后，以每个休眠芽计，诱导得到的球形胚个数为68±3个；
将球形胚挑出转移至半固体培养基中进行体细胞胚的萌发，培养温度为25±2℃，光照时间为16小时/天，培养至得到长有3～4片叶小苗，以每个休眠芽计，萌发得到的生根苗为34±2棵；
将长有3～4片叶小苗的根在流水下冲洗，以去掉培养基，然后将根系发达的小植株转移至含有灭过菌的珍珠岩与草炭重量比为1:3.2的基质培养基的小容器；
用塑料袋罩上小容器，放在温室内，培养室保持在25℃±2℃，光照时间为16小时/天；当植物有新叶长出时，拿掉塑料袋，将根和芽都生长良好的植株进行移栽，每个休眠芽最终得到的移栽的植株为24-26棵。
整个培养过程为8个月左右。
实施例4
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
一、配置培养基：
1.诱导培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂，使2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为2mg/L、0.2mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
2.诱导胚性愈伤组织培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、蔗糖和琼脂，使2,4-D、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为3mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
3.液体培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖并使其终浓度为20g/L；
4.半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8；
以上培养基均进行高温高压灭菌，冷却后备用。
二、培养步骤：
于冬季十二月末一月初取早红品种的北五味子休眠芽，在自来水下冲洗4h，在超净工作台上用70％的酒精消毒30秒，倒出酒精，用0.1％升汞消毒20分钟，最后用无菌水冲洗3次；
将休眠芽放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下剥去外鳞片，得到消毒后的北五味子休眠芽；
将剥好的休眠芽接入盛有30ml诱导培养基的三角瓶中，三角瓶的规格为100ml，每瓶接入3个外植体，在温度为25±2℃下进行暗培养；
暗培养28天后，每个休眠芽得到的愈伤组织为0.5g±0.025g；将得到的愈伤组织切成大小为0.35-0.55cm×0.35-0.55cm小块转移到诱导胚性愈伤组织培养基中，在温度为25±2℃进行培养，光照时间为16小时/天；
培养28天后，以每个休眠芽计，诱导得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g；
将胚性愈伤组织转移到含有液体培养基的气升式生物反应器中暗培养诱导体细胞胚，培养温度为25±2℃；
暗培养42天后，以每个休眠芽计，诱导得到的球形胚个数为68±3个；
将球形胚挑出转移至半固体培养基中进行体细胞胚的萌发，培养温度为25±2℃，光照时间为16小时/天，培养至得到长有3～4片叶小苗，以每个休眠芽计，萌发得到的生根苗为34±2棵；
将长有3～4片叶小苗的根在流水下冲洗，以去掉培养基，然后将根系发达的小植株转移至含有灭过菌的珍珠岩与草炭重量比为1:3的基质培养基的小容器；
用塑料袋罩上小容器，放在温室内，培养室保持在25℃±2℃，光照时间为16小时/天；当植物有新叶长出时，拿掉塑料袋，将根和芽都生长良好的植株进行移栽，每个休眠芽最终得到的移栽的植株为26-28棵。
整个培养过程为8个月左右。
实施例5
一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：
一、配置培养基：
1.诱导培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂，使2,4-D、TDZ、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为2.8mg/L、0.2mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
2.诱导胚性愈伤组织培养基：以MS为基本培养基，添加2,4-D、蔗糖和琼脂，使2,4-D、蔗糖和琼脂在MS培养基中的终浓度分别为3mg/L、30g/L和7g/L，最后调整pH为5.8；
3.液体培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖并使其终浓度为20g/L；
4.半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH为5.8；
以上培养基均进行高温高压灭菌，冷却后备用。
二、培养步骤：
于冬季十二月末一月初取金五味1号品种的北五味子休眠芽，在自来水下冲洗4h，在超净工作台上用70％的酒精消毒30秒，倒出酒精，用0.1％升汞消毒20分钟，最后用无菌水冲洗3次；
将休眠芽放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下剥去外鳞片，得到消毒后的北五味子休眠芽；
将剥好的休眠芽接入盛有30ml诱导培养基的三角瓶中，三角瓶的规格为100ml，每瓶接入3个外植体，在温度为25±2℃下进行暗培养；
暗培养28天后，每个休眠芽得到的愈伤组织为0.5g±0.025g；将得到的愈伤组织切成大小为0.25-0.35cm×0.25-0.35cm小块转移到诱导胚性愈伤组织培养基中，在温度为25±2℃进行培养，光照时间为16小时/天；
培养28天后，以每个休眠芽计，诱导得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g；
将胚性愈伤组织转移到含有液体培养基的气升式生物反应器中暗培养诱导体细胞胚，培养温度为25±2℃；
暗培养42天后，以每个休眠芽计，诱导得到的球形胚个数为68±3个；
将球形胚挑出转移至半固体培养基中进行体细胞胚的萌发，培养温度为25±2℃，光照时间为16小时/天，培养至得到长有3～4片叶小苗，以每个休眠芽计，萌发得到的生根苗为34±2棵；
将长有3～4片叶小苗的根在流水下冲洗，以去掉培养基，然后将根系发达的小植株转移至含有灭过菌的珍珠岩与草炭重量比为1:3的基质培养基的小容器；
用塑料袋罩上小容器，放在温室内，培养室保持在25℃±2℃，光照时间为16小时/天；当植物有新叶长出时，拿掉塑料袋，将根和芽都生长良好的植株进行移栽，每个休眠芽最终得到的移栽的植株为26-28棵。
整个培养过程为8个月左右。
另外，本发明还将实施例1-5制得的胚性愈伤组织进行继代培养，条件为：在温度为25±2℃进行培养，光照时间为15小时/天，每28-35天继代一次；
然后将继代培养后得到的胚性愈伤组织进行后续的培养，继代培养所用的培养基的成分如下：
MS培养基中含有2,4-D 0.8-2.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6-7g/L，pH为5.7-6.0；
对得到的胚性愈伤组织进行继代培养或保存，扩繁效果好，每次扩繁系数均为6倍以上，并且扩繁得到的胚性愈伤组织仍具有产生体细胞胚的能力，对后续步骤无影响，后续步骤结果与直接进行后续培养的胚性愈伤组织结果一致。并且，已经验证胚性愈伤组织保存15个月仍具有扩繁和产生体细胞胚的能力，扩繁效果和诱导效果基本无变化。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、将消毒后的北五味子休眠芽放入诱导培养基进行暗培养，得到愈伤组织；
(b)、将所述愈伤组织切割，然后放入诱导胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；
(c)、将所述胚性愈伤组织转移到液体培养基中进行暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；
(d)、将所述球形胚转移到半固体培养基上进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；
(e)、将所述生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8-3.2的基质培养基中，培养后进行移栽；
其中，所述诱导培养基的成分如下：MS培养基中的额外成分为2,4-D 1.8-3.2mg/L、TDZ0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0；
在步骤(b)中，所述诱导胚性愈伤组织培养基的成分如下：MS培养基中的额外成分为2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0；
在步骤(c)中，所述液体培养基的成分如下：1/2浓度的MS培养基中的额外成分为蔗糖18-22g/L，在培养的过程中通入过滤过的空气,空气的通入量为0.2-0.3vvm；
在步骤(d)中，所述半固体培养基的成分如下：MS培养基中的额外成分为蔗糖28-32g/L，琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。
2.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述消毒为：取北五味子休眠芽体，先在自来水下冲洗，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分钟，最后用无菌水冲洗3-4次，剥去外鳞片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。
3.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(a)和步骤(c)中，所述暗培养的温度为25±2℃，所述暗培养的时间为25-30天。
4.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述愈伤组织切割的大小为0.35-0.55cm×0.35-0.55cm，所述培养的时间为25-30天。
5.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述培养的时间为40-45天。
6.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(d)中，得到的所述生根苗有3-4片叶。
7.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(b)和(d)中，所述培养的条件为：培养温度为25±2℃，光照时间为15-16小时/天。
8.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述生根苗移栽前先用水冲洗掉培养基，然后移栽至盛有所述基质培养基的容器中，然后用塑料袋将容器罩上，放在温室内，温室保持在25±2℃，光照时间为15-16小时/天。
9.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，所述北五味子的品种为嫣红、早红、金五味1号中的任一种。
10.根据权利要求1-9任一项所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，步骤(b)中得到的胚性愈伤组织还包括：保存或继代培养的步骤，然后再将得到的胚性愈伤组织进行后续步骤；
其中，所述继代培养和保存所用的培养基的成分均为：MS培养基中的额外成分为2,4-D0.8-2.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6-7g/L，pH为5.7-6.0。
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| 不同基因型北五味子资源的鉴定及离体再生体系的建立;孙丹;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20141015(第10期);D047-59，尤其是正文第三章第1.2.1-1.2.5节 * |
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