CN106170492B - 环状的Apelin类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物学领域，特别是，它涉及新的apelin类似物及其治疗用途。本发明提供的环状apelin类似物，其通式为X1‑X2‑X3‑X4‑X5‑X6‑X7‑X8‑X9‑X10‑X11‑X12‑X13‑X14，包含一种结构为Ala‑S‑Ala的羊毛硫氨酸桥，或者一种结构为Abu‑S‑Ala或Ala‑S‑Abu的甲基羊毛硫氨酸桥，其中所述(甲基)羊毛硫氨酸桥的大小为i、i+3；i、i+4；i、i+5或i、i+6。
Description
本发明涉及药物学领域，特别是，它涉及新的apelin类似物及其 治疗用途。
Apelin基因编码一种77个氨基酸的前原蛋白，该蛋白被加工产生 由36、17或13个氨基酸组成的生物活性肽(分别为apelin-36、apelin-17 和apelin-13)。两种主要的亚型是apelin-13和apelin-36。
Apelin受体APJ是一种G-蛋白偶联受体(GPCR)。典型apelin- 激活的APJ信号涉及激活百日咳毒素敏感的G-蛋白(Gi或Go)，导致 cAMP产生减少，同时激活磷脂酶C、蛋白激酶C和细胞外信号调节 激酶1和2。见O’Carroll等人(J.of Endocrinology(2013)219，R13～R35)对于apelin信号的最近的综述。此外，apelin相关的APJ激活导 致β-抑制蛋白(β-arrestin)的募集(Lee等人，Biochem Biophys Res Commun，2010；395：185～189)。如Ma和Pei所作综述(J.Cell Science (2007)120，213～218)，抑制蛋白形成一组支架蛋白，这些支架蛋 白不仅调节受体的脱敏和内化，而且激活GPCR的其它的非G-蛋白依 赖的下游信号通路。例如，在应答特定的GPCR激活时，β-抑制蛋白 从细胞质转移到细胞核，在靶基因的启动子处与转录辅因子如p300和 cAMP-应答元件结合蛋白(CREB)结合，启动转录。β-抑制蛋白也在 细胞质内与转录因子的调节子如ΙκΒα和MDM2相互作用，间接调节 转录。这种β-抑制蛋白介导的转录调节，似乎在细胞生长、凋亡和免 疫功能调控中起到重要作用。
与血管紧张素原和血管紧张素受体的模式相同，apelin和APJ广泛 表达于动物器官组织匀浆物中。Apelin广泛分布于中枢神经系统CNS 和外周神经系统，尤其是在心脏、肾脏、肺和乳腺。在脂肪细胞、胃 粘膜、内皮细胞和肝巨噬细胞(肝脏Kupffer细胞)，检测到apelin-样 的免疫反应性。
Apelin-13是APJ受体的内源性配体，以0.37nM的EC50值激活 该G蛋白偶联受体(apelin-17及apelin-36的EC50值分别为2.5nM和 20nM)。它主要作用于周围和中枢神经系统，在调节心血管功能、体 液平衡、高血压和胰岛素敏感性时发挥重要作用。与apelin-36不同， apelin-13不阻断人类免疫缺陷病毒进入细胞。
Apelin-13和apelin-36与APJ的结合抑制毛喉素诱导的cAMP产 生，介导非Ras依赖的细胞外信号调节激酶(ERK)的激活。Apelin-13 和apelin-36的结合都导致APJ内化，APJ可以再循环到细胞表面外层 (Zhou,N等，2003APJ.Virology 307，22～36)。
外源性给予apelin改变心血管功能、血压、体温、体液和涉及摄 食量和饮水量等行为。几种人类心血管疾病伴有心血管组织中apelin 和/或APJ的表达变化。在动物研究中，apelin发挥舒张血管和增强心 肌收缩力作用(正性肌力作用)。Apelin激活内皮型一氧化氮合酶，从 而刺激血管内皮细胞释放一氧化氮。Apelin也改善病理状态下心脏功 能预后，如实验性缺血和再灌注损伤(Lee,D.K.，George,S.R.和 O’Dowd,B.F.(2006)Trends inPharmacological Sciences 27，190～194)。 然而，由于Apelin多肽短暂的循环寿命，这些心血管效应也是短暂的。
在现有技术中已有人试图提高apelin的半衰期。例如， WO2012/125408公开了一种聚乙二醇化的Apelin，包含一个或多个聚 乙二醇分子(PEG)可操作地连接在一个Apelin的N-末端的至少一个 氨基酸残基上。相对于非聚乙二醇化的Apelin，发现聚乙二醇化的Apelin具有延长的循环寿命和收缩能效应。另一种提高apelin半衰期 的方法涉及环状突变体的产生。例如，apelin12的大环突变体(1-12； 1-7；7-12)已经被制成，它们表现出对毛喉素诱导环磷酸腺苷(cAMP) 累积的剂量依赖性抑制作用，最大的效果通过百日咳毒素(PTX)处 理而几乎消失(Hamada,J.(2008)International Journal of MolecularMedicine.22，547～552)。然而，相比于pE-apelin13，所有的环状类 似物的活性都有几个数量级的减少。
WO2013/111110公开了用于治疗心脏衰竭的合成的apelin模拟物。 Apelin突变体包括环状结构，其中氨基酸侧链通过硫化、二硫键或酰 胺键连接在一起。
因此，需要一种改进的Apelin类似物，以提高它们的循环寿命和 其他有益的特性。特别是，可取的是，这种类似物具有增加的半衰期， 并具有一个不同的生物学活性，比如它可以用于选择性地调节APJ受 体激活的其他通路。例如，感兴趣的是，有一种类似物，能够通过cAMP 活性表现出显著的(激动性的)信号，但在诱导β-抑制蛋白募集、APJ 受体内化和/或下调时不如内源性激动剂有效，这样的生物学活性是增 强的。相反地，鉴于β-抑制蛋白介导的转录调节和它在细胞生长、凋 亡和免疫功能调控方面的作用，更有效激活抑制蛋白募集的突变体也 提供有趣的偏向性激动剂。特别是，作用于β-抑制蛋白募集和Gi/Go激活可能导致不同的作用和/或细胞内不同动力学的效果。抑制蛋白似 乎不通过Akt途径，而Gi/Go则通过。G-蛋白依赖的ERK激活似乎是 迅速并短暂的，可以被百日咳毒素或PKA抑制剂阻断。相比之下，β- 抑制蛋白依赖的ERK激活开始更慢，持续更久，且对于β-抑制蛋白缺 失敏感，而对Gi/PKA抑制或Gs的缺失不敏感(Lan Ma 2006)。Gi/Go 激活MAPK和抑制蛋白支架对MAPK的作用对于ERK在细胞质/细胞 核的分布有不同影响，产生不同结果的细胞命运。
很惊讶的发现，通过提供新的环形apelin化合物，其特征为通过 一个跨越2、3、4或5个氨基酸残基的硫醚桥，以产生空间限制的生 物活性多肽，至少上述目标中的一些得到了满足。例如，向apelin中 引入一个硫醚桥，在信号活性保持的同时，导致其在细胞质中的稳定 性增加2至8倍。而且，许多有趣的突变体被确认，它们与天然的apelin 比较，相对于抑制蛋白，在cAMP介导的信号上表现出显著增加或减 少。
因此，本发明提供了一种apelin类似物，由一种多肽组成或者该 多肽的酰胺、酯或盐，该多肽的通式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，包含一种结构为Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸桥，或者一种结构为Abu-S-Ala或 Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸桥，其中
X1是该多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg；
X2不存在或选自pGlu、Gln和Ala；
X3是Arg或Ala；
X4是Pro、Ala、Pro-(me)Lan、Pro-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；
X5是Arg、Ala、(me)Lan、Dhb、Arg-(me)Lan、Arg-Dhb、Ala-Dhb 或Ala-(me)Lan；
X6是Leu、Ala、(me)Lan、Dhb、Leu-(me)Lan、Leu-Dhb、Ala-Dhb 或Ala-(me)Lan；
X7是Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-(me)Lan、Ala-Dhb、Dhb-Ala或 (me)Lan-Ala；
X8是His、Ala、(me)Lan、Dhb、His-(me)Lan、His-Dhb、Ala-Dhb 或Ala-(me)Lan；
X9是Lys、Ala、(me)Lan、Dhb、Lys-(me)Lan、Lys-Dhb、Ala-Dhb 或Ala-(me)Lan；
X10是Gly、Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan；
X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan；
X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X13不存在或选自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan；
X14是C-末端，且不存在或选自Phe和Ala，除非X13不存在；
其中Dhb是脱氢氨基丁酸；
(me)Lan是Lan或meLan，其中Lan表示羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala) 的半个N-或C-末端，meLan表示甲基羊毛硫氨酸(Abu-S-Ala或 Ala-S-Abu)的半个N-或C-末端；
其条件是：
(i)该类似物最多包含两个Ala残基；
(ii)该序列X4至X13包含一对meLan或一对Lan，其共同形成 (甲基)羊毛硫氨酸桥；并且
(iii)其中所述的(甲基)羊毛硫氨酸桥的大小为i、i+3；i、i+4； i、i+5；或i、i+6；优选i、i+3或i、i+4；其中“i”表示参与硫醚桥形 成的N-末端氨基酸残基(例如X4)，且其中“i+…”表示参与硫醚桥 形成的C-末端氨基酸残基(例如，在i+3的情况下，为X7)。
在一个实施方案中，
X1是该多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg；
X2不存在或选自pGlu、Gln和Ala；
X3是Arg或Ala；
X4是Pro、Ala、Pro-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X5是Arg、Ala、(me)Lan、Arg-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X6是Leu、Ala、(me)Lan、Leu-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X7是Ala、(me)Lan、Ala-(me)Lan或(me)Lan-Ala；
X8是His、Ala、(me)Lan、His-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X9是Lys、Ala、(me)Lan、Lys-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X10是Gly、Ala、(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan；
X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan；
X13不存在或选自Pro、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan；
X14是C-末端，且不存在或选自Phe和Ala，除非X13不存在；
其中(me)Lan是Lan或meLan，其中Lan表示羊毛硫氨酸 (Ala-S-Ala)的半个N-或C-末端，meLan表示甲基羊毛硫氨酸 (Abu-S-Ala或Ala-S-Abu)的半个N-或C-末端；
其条件是：
(i)该多肽最多包含两个Ala残基；
(ii)该X4至X13序列包含共同形成甲基羊毛硫氨酸桥的一对 meLan，或共同形成羊毛硫氨酸桥的一对Lan；并且
(iii)所述的(甲基)羊毛硫氨酸桥的大小为i、i+3；i、i+4；i、 i+5；或i、i+6；其中“i”表示参与硫醚桥形成的N-末端氨基酸残基(例 如X4)，且其中“i+…”表示参与硫醚桥形成的C-末端氨基酸残基(例 如，在i+3的情况下，为X7)。换句话说，大小为i、i+3；i、i+4；i、i+5；或i、i+6表示在环下面有2个、3个、4个或5个残基。
发现一个大小为i、i+1的(甲基)羊毛硫氨酸桥结构很容易被蛋 白水解，而桥i、i+2则很难形成。对环化酶活性来说，i、i+5和i、i+6 不是很理想的底物，但是却赋予了更好的抗蛋白水解能力。在一个优 选的实施方案中，所述(甲基)羊毛硫氨酸桥的大小是i、i+3或i、i+4， 这样在环下面有2个或3个残基。
本发明涉及apelin的(甲基)羊毛硫氨酸突变体，其中硫醚桥的 形成通过：(i)替换天然序列中两个氨基酸；(ii)替换天然序列中一个 氨基酸，并在替换处的N-或C-末端一侧插入一个氨基酸；或者(iii) 插入两个氨基酸。
一个包含羊毛硫氨酸的突变体以Ala-S-Ala结构为特征，其通过在 X4-X13段中存在的两个“Lan”基团(通过替换或插入)形成。一个 包含甲基羊毛硫氨酸的突变体以Abu-S-Ala或Ala-S-Abu结构为特征， 其通过在X4-X13段中存在的两个“meLan”基团(通过替换或插入) 形成。因此，包含在X4-X13中的Lan对或meLan对的注解是指最终 的环状的结构。Lan和meLan残基来源于半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸 残基的生物合成。首先，选择的丝氨酸和苏氨酸残基被酶脱水分别形 成脱氢丙氨酸(Dha)和脱氢氨基丁酸(Dhb)残基。然后，半胱氨酸的巯基以迈克尔(Michael)方式亲核加成到Dha或Dhb残基上分别形 成Lan或MeLan残基。这种修饰在半胱氨酸的巯基和另一个残基的β- 碳原子上建立共价连接，从而形成硫醚桥。更具体地说，Ala-S-Ala结 构可以来自Dha和Cys，其中Cys可以位于Dha的N-末端或C-末端。Abu-S-Ala或Ala-S-Abu结构分别来自Dhb和Cys或者Cys和Dhb。
US2013/0196899提供了合成的apelin环状类似物及其制备方法。 US2013/0196899中的上述类似物的环是通过氨基酸侧链或末端分别形 成二硫键或酰胺键形成的。可是，二硫键和酰胺键的化学稳定性不如 硫醚键。而且，立体化学在羊毛硫氨酸形成中发挥了作用，使产生的 多肽结构的轮廓更分明，受体特异性更好。羊毛硫氨酸中的硫醚桥也比二硫桥和酰胺交联更短。因此，羊毛硫氨酸得到的结构和二硫键和 酰胺交联得到的结构是不同的。
Hamada等人(2008，Int.J.of Mol.Med.22：547～552)公开了apelin 片段RPRLSHKGPMPF(apelin-12)的环状类似物的合成，其中N-末 端连接到C-末端上，或其中侧链第7位Lys与N-末端或C-末端残基形 成环。在这个案例中也出现了环脲键，其稳定性不如硫醚桥。此外， Hamada等人的突变体没有游离的N-末端或游离的C-末端。
在本发明的多肽类似物中，X1至X14中的每一个都从一组选定的 选项中选择。
X1表示该多肽的N-末端，且其不存在或是Lys-Phe-Arg-Arg。在 一个优选的方面，X1不存在。
X2不存在或选自pGlu、Gln和Ala。优选地，X1不存在且X2是 Glu或pGlu(焦谷氨酸)。在一个具体方面，X1是pGlu。在N-末端引 入焦谷氨酸可以保护类似物免受N-末端水解。焦谷氨酸(又名PCA、 5-羟脯氨酸、氧脯氨酸、或焦谷氨酸盐作为它的盐基形式)是一种不常 见的氨基酸衍生物，其中谷氨酸或谷氨酰胺的自由氨基环化形成一个 内酰胺。它是谷胱甘肽环被5-羟脯氨酸酶转化成谷氨酸时产生的代谢 物。焦谷氨酸被发现存在于包括细菌紫膜质的许多蛋白质中。谷氨酸 或谷氨酰胺残基的N-末端可以自发的环化成为焦谷氨酸。
X3是一种碱性氨基酸残基选自Arg和Ala，其中优选Arg。
X4选自Pro、Ala、Pro-(me)Lan、Pro-Dhb、Ala-Dhb或Ala-(me)Lan； 偏爱Pro、Ala、Pro-(me)Lan或Ala-(me)Lan。在一个实施方案中，X4 是Pro或Ala，其中优选Pro。在另一方面，X4参与硫醚桥的形成，且 选自Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X4可以是Pro-Lan或Ala-Lan，这 样与第二个Lan残基形成的硫醚桥是结构为Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。 或者，X4是Pro-meLan或Ala-meLan，这样与第二个meLan残基(例 如位于X8的(me)Lan、His-(me)Lan或Ala-(me)Lan)形成的硫醚桥是 结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。
X5是Arg、Ala、(me)Lan、Dhb、Arg-(me)Lan、Arg-Dhb、Ala-Dhb 或Ala-(me)Lan；例如X5是Arg、Ala、(me)Lan、Arg-(me)Lan或 Ala-(me)Lan。优选地，X5是Arg或Ala，其中优选Arg。在另一方面， X5参与硫醚桥的形成，且选自(me)Lan、Arg-(me)Lan和Ala-(me)Lan。 X5可以是Lan、Arg-Lan或Ala-Lan，这样与第二个Lan残基(例如位 于X9的Lan、Lys-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚桥是结构为Ala-S-Ala 的羊毛硫氨酸。或者，X5是meLan、Arg-meLan或Ala-meLan，这样 与第二个meLan残基形成的硫醚桥是结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu 的甲基羊毛硫氨酸。
X6选自Leu、Ala、(me)Lan、Dhb、Leu-(me)Lan、Leu-Dhb、Ala-Dhb 和Ala-(me)Lan。例如X6是Leu、Ala、(me)Lan、Leu-(me)Lan或 Ala-(me)Lan。优选地，X6是Leu或Ala，其中优选Leu。在另一方面， X6参与硫醚桥的形成，且选自(me)Lan、Leu-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X6可以是Lan、Leu-Lan或Ala-Lan，这样与第二个Lan残基(例如位 于X10的Lan或Ala-Lan)形成的硫醚桥是结构为Ala-S-Ala的羊毛硫 氨酸。或者，X6是meLan、Leu-meLan或Ala-meLan，这样与第二个 meLan残基形成的硫醚桥是结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛 硫氨酸。
X7选自Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-(me)Lan、Ala-Dhb、Dhb-Ala 和(me)Lan-Ala。例如，X7是Ala、(me)Lan、Ala-(me)Lan或(me)Lan-Ala。 优选地，X7参与硫醚桥的形成，且选自(me)Lan、Ala-(me)Lan和 Ala-(me)Lan。X7可以是Lan、Ala-Lan或Lan-Ala，这样与第二个Lan 残基(例如位于X11的Lan、Pro-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚桥是结 构为Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸。或者，X7是meLan、Ala-meLan或 meLan-Ala，这样与第二个meLan残基形成的硫醚桥是结构为 Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸。在一个具体方面，X7是 (me)Lan，任选与为Lys-(me)Lan的X9相结合、或与为(me)Lan或 Ala-(me)Lan的X10相结合、与为(me)Lan或Ala-(me)Lan的X11相结 合、与为(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan的X12相结合。
X8选自His、Ala、(me)Lan、Dhb、His-(me)Lan、His-Dhb、Ala-Dhb 和Ala-(me)Lan。例如，X8是His、Ala、(me)Lan、His-(me)Lan或 Ala-(me)Lan。优选地，X8是His或Ala，其中优选His。在另一方面， X8参与硫醚桥的形成，且选自(me)Lan、His-(me)Lan和Ala-(me)Lan.。X8可以是Lan、His-Lan或Ala-Lan，这样与第二个Lan残基(例如位 于X12的Lan、Met-Lan或Ala-Lan)形成的硫醚桥是结构为Ala-S-Ala 的羊毛硫氨酸。或者，X8是meLan、His-meLan或Ala-meLan，这样 与第二个meLan残基形成的硫醚桥是结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu 的甲基羊毛硫氨酸。优选X8由His组成或包含His。
X9选自Lys、Ala、(me)Lan、Dhb、Lys-(me)Lan、Lys-Dhb、Ala-Dhb 和Ala-(me)Lan。例如，X9是Lys、Ala、(me)Lan、Lys-(me)Lan或 Ala-(me)Lan。优选地，X9是Lys或Ala，其中优选Lys。在另一方面， X9参与硫醚桥的形成，且选自(me)Lan、Lys-(me)Lan和Ala-(me)Lan。X9可以是Lan、Lys-Lan或Ala-Lan，这样与第二个Lan残基(例如位 于X13的Lan、Pro-Lan和Ala-Lan)形成的硫醚桥是结构为Ala-S-Ala 的羊毛硫氨酸。或者，X9是meLan、Lys-meLan或Ala-meLan，这样 与第二个meLan残基形成的硫醚桥是结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu 的甲基羊毛硫氨酸。优选X9由Lys组成或包含Lys。在一个具体方面， X9是Lys-(me)Lan。
X10选自Gly、Ala、(me)Lan、Dhb、Ala-Dhb和Ala-(me)Lan。例 如，X10是Gly、Ala、(me)Lan或Ala-(me)Lan。在一个实施方案中， X10是Gly。在另一个实施方案中，X10是meLan。
X11是Pro、Ala、(me)Lan、Pro-Lan或Ala-(me)Lan。优选地，X11 是Pro或(me)Lan。
X12是Met、Ala、(me)Lan、Met-(me)Lan或Ala-(me)Lan。优选地， X12是Met。
X13不存在或选自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan。 优选地，X13选自Pro、Dhb、(me)Lan、Pro-(me)Lan和Ala-(me)Lan， 更优选地，选自Pro和(me)Lan。在一个具体方面，X13是Pro。在另 一个具体方面，X13是Dhb。
X14是C-末端，且不存在或选自Phe和Ala，除非X13不存在。 在一个实施方案中，X14和X13不存在。在另一个实施方案中，X14 是Phe或Ala，其中优选Phe。在一个具体方面，该肽突变体的C-末端 是酰胺化的，例如，其中X14是一个酰胺化的Phe(Phe-NH2)。
在一个具体的实施方案中，X1不存在，且序列X2-X3-X4-X5-X6 是Gln-Arg-Pro-Arg-Leu或pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu。在序列 X7-X8-X9-X10是(me)Lan-His-Lys-(me)Lan，优选 meLan-His-Lys-meLan，或序列X7-X8-X9-X10是 (me)Lan-His-Lys-(me)Lan-Gly，优选meLan-His-Lys-meLan-Gly时，得 到了非常好的结果。
在其它突变体中，序列X4-X5-X6-X7-X8是 Pro-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan或Pro-Arg-(me)Lan-Arg-Leu-Ala-(me)Lan。
优选示例性突变体包含那些其中C-末端4个残基是由序列 Pro-Met-Pro-Phe组成的。然而，在其他有用的突变体中，X14不存在 或者是Ala，例如，其中C-末端是Pro-Met-Pro，Pro-Met-Pro-Ala。在 另一个实施方案中，X11-X12-X13-X14是(me)Lan-Met-Pro-Phe。
也包含所述多肽的酰胺、酯或盐。优选地，该盐是一种药学上可 接受的盐，比如任意无毒的盐，例如，与无机酸的盐、与有机酸的盐、 与无机碱的盐、与有机碱的盐、与氨基酸的盐。本文中所用的“可接 受的盐”是指保持了寡肽或等效化合物所需活性的盐，但是优选不对 寡肽或使用该寡肽体系中其它成分的活性产生不利影响的盐。这样的 盐的例子是与无机酸形成的酸加成盐，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、 磷酸、硝酸等。也可以是与有机酸形成的盐，例如，醋酸、三氟乙酸、 草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、 抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、扑酸、海藻酸、聚谷氨酸等。盐可以是 与多价金属阳离子形成的，比如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、 镍等，或与由N,N’-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的， 或其组合(例如，丹宁酸锌盐)。
在一个实施方案中，本文提供的环状类似物，与apelin-13或 pyr-1-apelin-13相似，具有APJ受体的效力。在一个实施方案中，当检 测对cAMP产生的抑制、和/或对抑制蛋白募集的激活、和/或其他任何 对APJ介导的信号的检测时，本发明的环状的APJ受体激动剂具有小 于100nM的半最大效应浓度(EC50)。在另一个实施方案中，该EC50值小于50nM，优选小于25nM，更优选小于15nM。在另一个具体的 实施方案中，本发明的类似物具有小于10nM的EC50值。
该类似物优选具有优于apelin-13或pyr-1-apelin-13的血浆稳定性。 在一个实施方案中，其血浆稳定性的改进比从已知apelin中观察到的 至少高了2倍。稳定性可以用半衰期(t50)来表征，即保留最初酶活 性50％的时间。在一个实施方案中，本发明的类似物在血浆中的半衰 期(t50)至少为30分钟。在另一个实施方案中，本发明的多肽具有至 少10分钟的半衰期，优选至少40分钟，更优选至少60分钟。在一个 具体的实施方案中，血浆中的t50值超过1小时，优选超过2小时，最 优选至少4小时。
本发明具体的apelin类似物如表1所示。
表1
*自发环化产生的最常见的异构体
**自发环化产生的较不常见的异构体
还提供了一种提供根据本发明的apelin类似物的方法。在环肽中， 两个氨基酸侧链之间分子内的键可以通过化学或酶法形成。使用宿主 细胞，其包含一个或多个用于合成羊毛硫肽或羊毛硫抗生素的生物合 成酶，可方便地制备环状的apelin类似物(Arnison等人，2013Nat Prod Rep 30，108～160)。羊毛硫肽和羊毛硫抗生素(羊毛硫肽的一个亚群，具有抗菌活性)是包含内部桥的小肽，这些桥产生于(甲基)羊毛硫 氨酸或赖丙氨酰残基的形成(在McAuliffe等人，FEMS Microbiol.Rev. 25，285～308(2001)中综述)。羊毛硫氨酸(Lan)和甲基羊毛硫氨 酸(MeLan)分别产生于丝氨酸到脱氢丙氨酸(Dha)的脱水和苏氨酸到脱氢氨基丁酸(Dhb)的脱水，硫醚键的形成产生于这些氨基酸与同 一肽内半胱氨酸残基的相互作用。众所周知的羊毛硫抗生素的例子有 乳链菌肽、枯草菌素、Pep5和表皮菌素。羊毛硫抗生素作为无活性的 原肽在核糖体中合成，该原肽含有一个氨基末端前导肽和羧基末端前 肽。该前导肽对羊毛硫抗生素前体与羊毛硫抗生素酶的相互作用是必 要的。在产生的细胞内、或转运到细胞外的过程中或之后，该前导肽 被蛋白水解从前肽切除。该羊毛硫肽生物合成基因聚集在一起，并被 给予基因座名称lan。LanA是编码羊毛硫抗生素原肽的基因，lanB是 编码负责丝氨酸或苏氨酸脱水的酶的基因，lanC是编码负责环形成的 酶的基因。在某些情况下，LanB和LanC的活性合并在lanM编码的一 个双功能酶中。LanP和lanT基因编码涉及原肽加工和/或转运的酶。
因此，本发明提供了一种根据本发明的环状apelin类似物的酶法 制备方法，包括：
提供宿主细胞，其包含：
-核酸分子，其包含编码在羊毛硫肽或羊毛硫抗生素前体肽中发现 的N-末端前导肽的第一核酸片段，和编码apelin类似物的第二核酸片 段，其中所述第一和第二片段在所述核酸分子的同一开放阅读框内；
-核酸序列，其编码能够使丝氨酸和/或苏氨酸脱水的酶；
-任选的核酸序列，其编码转运蛋白；和
-核酸序列，其编码能够诱导羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸形成的 酶。
随着羊毛硫肽/羊毛硫抗生素前体发现的任意前导肽适用于制备根 据本发明的环肽类似物的方法。例如这样的前导肽是乳链菌肽、枯草 菌素、Pep5和表皮菌素的前导肽。在一个优选的实施方案中，使用了 乳链菌肽的前导肽。能够使丝氨酸和/或苏氨酸脱水的酶优选是LanB， 比如NisB、PepB、SpaB或它们的功能等效物。能够诱导羊毛硫氨酸 或甲基羊毛硫氨酸形成的酶优选是LanC，比如NisC、PepC、SpaC或 它们的功能等效物。在一个实施方案中，丝氨酸和/或苏氨酸脱水以及 羊毛硫氨酸和/或甲基羊毛硫氨酸形成被同一种酶诱导，该酶是LanM， 比如CinM、LtnM、LctM或它们的功能等效物。
在脱氢丙氨酸和半胱氨酸之间形成羊毛硫氨酸在室温下在能量上 是能够进行的，而且也可以自发地发生，而不用LanC或LanM酶的参 与。
因此，在一个实施方案中，提供了一种方法，用于以酶法制备根 据本发明的包含(甲基)羊毛硫氨酸桥的环状apelin类似物，其包括：
a)提供宿主细胞，其包含：
-核酸分子，其包含编码在羊毛硫肽/羊毛硫抗生素前体肽中发现的 N-末端前导肽的第一核酸片段，和编码apelin类似物的第二核酸片段， 其中所述第一和第二片段在所述核酸分子的同一开放阅读框内；
-核酸序列，其编码能够使丝氨酸和/或苏氨酸脱水的酶；
-(任选的)核酸序列，其编码转运蛋白；和
b)允许翻译所述第一核酸；
c)收获所述肽类似物，优选从培养基或者在宿主细胞裂解后从细 胞质中收获肽。
因此，通过丝氨酸和苏氨酸分别被酶脱水成α,β-不饱和残基2,3- 二脱氢丙氨酸(Dha)和(Z)-2,3-二脱氢氨基丁酸(Dhb)，接着通过半 胱氨酸巯基的分子内迈克尔型加成产生硫醚交联，(甲基)羊毛硫氨酸 基团可以在翻译后被插入到线型的前体肽中。这种方法使用生物合成 装置，可以在体外或细菌宿主中重建。
在一个实施方案中，一种方法包括构建一种带有质粒的宿主细胞， 该质粒编码羊毛硫肽修饰酶，其使丝氨酸/苏氨酸脱水并将形成的脱氢 氨基酸连接到半胱氨酸，且该质粒任选编码羊毛硫肽转运蛋白，另一 种质粒编码由N-末端羊毛硫肽前导肽和C-末端apelin类似物组成的结 构。
如上详述，(甲基)羊毛硫氨酸形成在脱水的丝氨酸或苏氨酸的侧 链与半胱氨酸之间，脱水的丝氨酸或苏氨酸例如分别为脱氢丙氨酸或 脱氢氨基丁酸。因此，一种apelin类似物(当环化时)包含至少一个 羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸，编码这种apelin类似物的核酸序列需 要有一种编码丝氨酸的核酸密码子(TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或 AGC)或编码苏氨酸的核酸密码子(ACT、ACC、ACA或ACG)，和 一种编码半胱氨酸的核酸密码子(TGT或TGC)，在肽类似物中这两 个氨基酸位点将形成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。
在一个实施方案中，编码apelin类似物的第二核酸片段编码选自 如下的多肽：
QRPTRLACKGPMPF、QRPSRLACKGPMPF、
QRPRTLACKGPMPF、
QRPSLAHCGPMPF、QRPRLTHKCPMPF、QRPRLSAHKCPMPF、
QRPRLSAHKCPMPF、QRPRLSAHKCGPMPF、
QRPRLSAHKCGPMPF、QRPRLTHKCGPMPF、
QRPRLTHKCGPMPF-NH2、QRPRLTHKCGPMP、
QRPRLSHKCGPMPF、QRPRLTHKGCPMPF、
QRPRLSHKGCPMPF、
QRPRLSHKGCPMPF、QRPRLAHSGPMCF、QRPRLSHKGCMPF、
QRPRLTHKGCMPF、QRPRLSHKGPCPF、QRPRLSHKGPCMPF、
KFRRQRPRLTHKCPMPF、KFRRQRPRLTHKCGPMPF、
KFRRQRPRLSAHKCPMPF、KFRRQRPRLSAHKCGPMPF、
KFRRQRPRLSHKGCPMPF、KFRRQRPRLAHSGPMCF、
QRPRLSHKGPMCF和QRPRLSHKGPMCPF。
假设该肽的N-末端残基是谷氨酰胺(Q)，优选地，该方法进一步 包括根据本领域已知方法将Q转化成pE，例如，如Rink等人所述的 方法(Journal of Pharmacological andToxicological Methods 61(2010) 210～218)。如果宿主细胞是一种革兰氏阳性菌，为了从培养基中收获 环肽类似物或还没有环化的脱水的肽类似物，特别优选的是存在一种 转运蛋白。优选地，所述的转运蛋白是LanT，比如NisT或其功能等 效物。在大肠杆菌中，不需要转运蛋白的存在，肽类似物的收获优选 跟随在细胞裂解之后。
在制备根据本发明的环状类似物的方法中，使用的宿主细胞优选 革兰氏阳性原核细胞、革兰氏阴性原核细胞或真核细胞。合适的宿主 细胞的例子包含乳酸菌，比如乳酸乳球菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌， 和革兰氏阴性菌E.coli。
代替脱氢氨基酸与半胱氨酸的酶法的环化偶联，环化也可能通过 在碱性pH下保温进行。这种pH-诱导的偶联在如下情况下可以方便地 用于形成(甲基)羊毛硫氨酸，例如当脯氨酸直接位于半胱氨酸前面 时，这阻碍了有效的环化酶活性。或者，在肽没有被环化酶NisC环化 的情况下，在脱氢丙氨酸和半胱氨酸之间的环化可以自发发生，-根据 不同的肽-，可以产生或不产生不同的异构体。因此，在本发明的另一 个实施方案中，环的闭合是以非酶的方式实现的，例如，通过使脱水 的类似物前体进行化学处理来诱导硫醚桥形成，该类似物前体在需要 的位点包含脱氢丙氨酸或脱氢氨基丁酸残基、和半胱氨酸残基。例如， 化学的环闭合可以涉及在pH8条件下暴露包含脱氢丙氨酸和半胱氨酸 的肽至少10分钟。(Burrage等人Chem Eur J，2000Biomimetic synthesis of lantibiotics，6，1455～1466)或在pH8～9条件下暴露带有脱氢氨 基丁酸和半胱氨酸的肽约10小时(Zhu等人2003Biomimetic studies on the stereoselective lanthionine formation，Org.Biomol.Chem，1，3304～ 3315)。
在另一个实施方案中，通过固载型化学合成，比如根据Knerr等人(J.Am.Chem.Soc，2012，134(18)，7648～7651)或其中引用的文 献描述的步骤，合成了apelin类似物。
鉴于它对以增加的稳定性结合的APJ受体的(差别性的)作用， 本文提供的环状apelin类似物容易发现其作为药物的用途。因此，还 提供了一种药物组合物，其包含至少一种根据本发明的apelin类似物 和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该类似物可以这样以实体 给药，或者以一种药学上可接受的酸或碱加成盐给药，该酸或碱加成 盐的形成通过与无机酸反应(比如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫 代氰酸、硫酸和磷酸)；或与有机酸反应(如甲酸、乙酸、丙酸、羟基 乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和富马酸)；或 通过与无机碱反应(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)；或与有机碱 反应(比如单、二、三烷基胺、芳基胺和取代的乙醇胺)进行。在发 明中，作为环肽化合物或其药学上可接受的盐，优选大体上纯化形式 的化合物或其药学上可接受的盐。更优选超过80％或更高的纯度。
该apelin受体APJ与心血管疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、缺血 性心血管疾病、病毒性心肌病、淋巴管稳定、内分泌系统和激素紊乱、 糖尿病性视网膜病变和代谢疾病、胃肠道和肝脏疾病、癌症疾病、炎 症性疾病、血液系统疾病、呼吸系统疾病、肌肉骨骼疾病、神经系统 疾病、泌尿系统疾病、皮肤疾病、伤口愈合和生殖障碍相关。
本发明提供了包含(甲基)羊毛硫氨酸的APJ受体激动剂和拮抗 剂，它们的选择性应用依赖于疾病。此外设想，羊毛硫氨酸apelin影 响已知治疗相关的APJ受体与AT1受体的异二聚体化。
对apelin受体激动剂，存在多个治疗领域。对于新血管形成特性， apelin的主要目标是心脏和腿部肌肉。APJ受体激活一般有心血管治疗 相关性。其他应用领域例如纤维质生成和神经保护作用，纤维质生成 (甲基)羊毛硫氨酸-apelin对纤维质生成可能具有回复的特性。Apelin 在新生儿高氧暴露时有治疗效果。在其他疾病例如病理性血管新生病例中apelin受体拮抗剂是有价值的：糖尿病肾病(Zhang 2013PLOS 8I Issue 4|e60457page 1～11)、抗肿瘤生长(Sorli 2006Drug discovery today 11，1100～1106)、缺血性视网膜病变。拮抗剂的获得例如通过用 ala13替换F13。阻断APJ受体，其为HIV感染的共受体，有助于预防 HIV感染。阻断APJ受体可能有助于减少在年龄相关性黄斑变性 (AMD)中的多余血管的病理形成。
因此，示例性的治疗应用包含所有已知的或提示与通过apelinergic 系统信号通路的信号相关的，例如与水平衡改变相关的病症、压力诱 导的紊乱比如焦虑和抑郁、心血管和代谢紊乱。
在一个实施方案中，apelin类似物产生内皮依赖性血管舒张、内皮 非依赖性血管收缩和/或心脏收缩力增加。在高氧治疗的老鼠幼崽中， apelin具有抗炎作用。本发明提供了一种环状的apelin类似物，用于治 疗或预防心血管病症，例如选自缺氧、缺血和肺动脉高压。在一个进 一步的实施方案中，发现该apelin类似物在调节例如在肿瘤中的血管 生成中的应用。
APJ也是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的一种共受体，apelin 通过APJ阻断HIV-1进入。表达CD4和受体的CHO细胞和NP-2细胞， 与apelin肽预培养后，抑制了HIV感染，支持APJ作为HIV和HIV-2 共受体的作用。CD4阴性而APJ阳性的细胞系，与可溶性CD4培养， 可以感染HIV。因此，在更进一步的实施方案中，一种本发明的环状 apelin用于HIV的治疗。
本文使用的“治疗”意思是缓解或治疗症状或疾病、和/或它的伴 随症状。“预防”意思是延缓或阻止症状或疾病、和/或它的伴随症状出 现的方法、阻止病人获得症状或疾病的方法、或减少病人获得症状或 疾病的风险的方法。
本发明的药物组合物是通过以合适的量适当地混合本发明的化合 物或其药学上可接受的盐，和至少一种或更多种药学上可接受的载体 等，按照在药物制备技术领域已知的方法生产的。在药物组合物中， 本发明的化合物或其药学上可接受的盐的含量改变，依赖于剂型、剂 量等，但是例如是整个药物组合物重量的0.1～100％。
“药物组合物”包含口服制剂比如片剂、胶囊、颗粒剂、粉末剂、 锭剂、糖浆、乳剂和混悬液，和肠胃外制剂比如外用制剂、栓剂、注 射剂、滴眼液、滴鼻剂、肺部制剂。“药学上可接受的载体”包含各种 常规有机或无机载体物质，例如，固体制剂中的物质比如赋形剂、崩解剂、粘合剂、助流剂、润滑剂，和液体制剂中的物质比如溶剂、增 溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和安抚剂。如果需要时使用添加剂， 比如防腐剂、抗氧化剂、着色剂和甜味剂。“赋形剂”包括例如，乳糖、 绵白糖、D-甘露醇、D-山梨醇、玉米淀粉、糊精、微晶纤维素、晶态 纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、低取代羟 丙基纤维素和阿拉伯树胶。助流剂包括，例如，轻质无水硅酸、硬脂 酸镁。润滑剂包括，例如、硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石。溶剂包括， 例如，纯净水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油。 增溶剂包括，例如，丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三乙 醇胺、碳酸钠和柠檬酸钠。“悬浮剂”包括，例如，苯扎氯铵、羧甲基 纤维素、羟丙基纤维素、丙二醇、聚维酮、甲基纤维素和单硬脂酸甘 油酯。缓冲剂包括，例如，磷酸氢二钠、醋酸钠、碳酸钠和柠檬酸钠。
本发明的药物组合物可以以治疗有效量口服或肠外给药(例如， 外用、直肠、静脉注射)到其他非人类的哺乳动物(例如，小鼠、大 鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、牛、马、羊、猴)和人类。然而 “治疗有效量”根据患者、疾病、症状、剂型、给药途径而改变，例 如，本发明的环状apelin类似物或其药学上可接受的盐作为活性成分， 口服给予患心血管疾病的成人病例(约60公斤重)时，剂量范围通常 每天使用约1毫克到1克。这样的量可以一天一次或几次对病人给药。
包含本发明化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分或激活剂 的药物组合物，及试剂盒(给药、治疗和/或预防试剂盒)、包装(包装 商品等)，和药物组(和/或，容器)，其包含关于药物组合物的药品说 明书，提示该药物组合物可以用于或应该用于治疗和/或预防，也都是 有用的。这样的试剂盒、包装和药物组可以与一个或多个容器一起被 提供，该容器填充有一种或多种活性成分和其他药物、或上述药物组 合物的药物(或成分)。作为这样的试剂盒、包装和药物组的例子，包 含针对治疗和/或预防一种目标疾病的适当的商业试剂盒和商业包装。 作为包含在这样试剂盒、包装和药物组中的药品说明书，包含负责监 管药品或生物制品制造、使用或销售的政府机构的说明，和表示政府 机构批准生产、使用或销售该给人用药相关产品的说明。在上述的试 剂盒、包装和药物组中，也可以包含包装的产品，可以包含采用合适 用药步骤(步骤)构成的体系，可以包含体系，其构成可以达到在更 优选药物上的治疗和/或预防包含目标疾病的治疗、预防。
本发明化合物或其药学上可接受的盐，可以通过目前在医药领域 使用的一般方法，结合(以下称为“联合治疗”)一个或多个其他药物 (以下称为“伴随药物”)使用。本发明的apelin类似物或其药学上可 接受的盐及其伴随药物的给药时间选择是不限的。它们可以以一种联 合药物对病人给药，或它们可以同时或以固定的时间间隔对病人给药。 可以使用一种药物试剂盒，其特征为由本发明的药物组合物和伴随药 物组成。伴随药物的剂量应符合临床使用的剂量，并且它可以根据患 者、疾病、症状、剂型、给药途径、给药时间及其联合进行适当地选 择。伴随药物的给药方式没有特别的限制，本发明的化合物或其盐和伴随药物应该仅仅是放在一起的。
伴随药物包含，例如，
(1)心血管疾病、动脉粥样硬化、再狭窄或缺血性心血管疾病的 治疗性药物和/或预防剂，
(2)内分泌系统和激素紊乱，糖尿病性视网膜病变或代谢性疾病 的治疗性药物和/或预防剂，
(3)癌症治疗性药物，
(4)炎症性疾病的治疗性药物和/或预防剂，和
(5)HIV的治疗性药物，
这些药物的任一种或多种与本发明化合物或其药学上可接受的盐可以 联合使用。
为了清楚的目的，本文描述了简洁的描述特征，作为相同或不同 实施方案的一部分，然而，应了解，本发明的范围可以包括具有描述 的所有或部分特征的组合的实施方案。考虑到本段落，如提交的权利 要求1中的突变体可以与如提交的本申请中描述的其他特征相结合， 尤其可以与从属权利要求中公开的特征相结合，这些权利要求通常与 本发明最优选的实施方案相关，这对技术人员来说是明显的。
实验部分
实施例1：合成羊毛硫氨酸稳定的apelin类似物
根据例如Kluskens,L.D.等人(2005)Post-translational Modification ofTherapeutic Peptides by NisB,the Dehydratase of the Lantibiotic Nisin，Biochemistry 44，12827～12834；Kluskens,L.D.等人(2009) Angiotensin-(1-7)withthioether-bridge:an ACE-resistant,potent Ang-(l-7) analogue，J.Pharmacol.Exper.Ther.328，849～854；Rink,R.等人(2007) NisC,the cyclase of theLantibiotic nisin,can catalyze cyclization of designed non-lantibioticpeptides，Biochemistry 46，13179～13189中描 述的既定的步骤，制备含有羊毛硫氨酸的apelin突变体。
简单地说，使用包含两种质粒系统的乳酸乳球菌。第一种质粒编 码羊毛硫抗生素乳链菌肽的前导肽MSTKDFNLDLVSVSKKDSG ASPR，从基因方面，将其C-末端融合到目的蛋白(甲基)羊毛硫氨酸 -apelin的前体上，该蛋白在i位置包含一个丝氨酸/苏氨酸，在i+3、i+4、 i+5或i+6位置包含一个半胱氨酸。或者，第一种质粒编码乳链菌肽前 导肽，之后连接乳链菌肽的前17个氨基酸和一个蛋白内切酶Glu-C酶 切位点(E)：MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTP GCKTGALMIE。N-末端甲硫氨酸通常被宿主剪切掉。
第一种质粒，编码包含乳链菌肽前导肽和(甲基)羊毛硫氨酸apelin 前体的融合肽，与第二种质粒pIL3BTC质粒，编码成熟酶NisB和NisC 以及转位酶NisT，在乳酸乳球菌中共表达。NisB使丝氨酸或苏氨酸脱 水，分别产生脱氢丙氨酸和脱氢氨基丁酸。接着，环化酶NisC将脱氢 氨基酸共价连接到半胱氨酸，分别产生羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。 在GM17培养基中添加4μg/ml红霉素和4μg/ml氯霉素，培养乳酸乳球 菌于30℃生长过夜(Kluskens LD，等人(2005)Post-translational modification of therapeuticpeptides by NisB,the dehydratase of the lantibiotic nisin，Biochemistry 44：12827～12834)。转移1/100体积到 基本培养基中，培养物30℃生长过夜(Rink R，等人(2005)Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides thatcan be modified by lantibiotic enzymes，Biochemistry 44：8873～8882)
离心(10分钟，12857g)收集上清液，并随后进行真空过滤(0.2μm)。 使用HiTrapSP HP离子交换色谱柱肽(GE Healthcare，瑞典)，从培养 基部分纯化肽。包含肽的收集部分除盐(PD10柱，Amersham)并真 空干燥。
于37℃，在50mM、pH7.6的磷酸钠缓冲剂中，以10U/ml蛋白内 切酶Glu-C酶切消化，释放(甲基)羊毛硫氨酸-apelin肽。在所述温 度保温48小时，结果N末端谷氨酰胺(Q)完全转化成为焦谷氨酸(pE)。 如果需要N-末端的谷氨酰胺，Glu-C消化的时间保持在最小值几个小 时。在反向高效液相色谱(HPLC)柱(Jupiter 4μm Proteo
C12， Phenomenex)中分离消化的融合肽。在0.1％三氟乙酸的存在下，以 1.0mL/min的流速，在milliQ水中以15％到40％的乙腈的梯度，进行 分离。收集峰的馏分(在214nm检测)，通过Maldi-TOF质谱(Voyager-DE Pro，Applied Biosystems)分析。
(甲基)羊毛硫氨酸的存在与否通过与CDAP孵育进行评估， CDAP加到未修饰的半胱氨酸上，而不加到(甲基)羊毛硫氨酸上(Rink 2007Biochemistry 46，13179～13189)
在某些情况下,脱水的丝氨酸以非酶方式连接到半胱氨酸，产生不 同的异构体。羊毛硫氨酸(Ala-S-Ala)表示为[Lan-Lan]；甲基羊毛硫 氨酸(Abu-S-Ala和Ala-S-Abu)表示为[meLan-meLan]。
实施例2：羊毛硫氨酸-apelin突变体结合到APJ受体
方法：APJ竞争性结合试验
[Glp65、Nle75、Tyr77][125I]-Apelin 13结合试验以SPA 96-孔的形式 进行。从稳定表达重组hAPJ或rAPJ的HEK293细胞制备本试验中使 用的膜。在试验缓冲液(25mM HEPES，10mM MgCl2，1mM CaCl2， 0.1％BSA，pH7.4)中含有0.06nM[Glp65、Nle75、Tyr77][125I]-Apelin13 和浓度递增的检测化合物(10个点浓度响应曲线)，向其中加入WGA PVT SPA珠(0.5mg/孔)和0.08μg膜的混合物，开始孵育。非特异性 结合在100nM apelin 17存在下被测定。样品在室温(22℃)孵育8小 时，然后在Microbeta Trilux中读取96-孔板。
结果：
表2
pE是焦谷氨酸。
结论：
-P到A或P到V的突变消除结合。然而，本文下面的实施例8中， QRPRLAHLanGPMLanF显示了显著的活性。因此，羊毛硫氨酸桥可以 模拟脯氨酸对螺旋的破坏作用。F到A的突变没有结合。
-两个包含羊毛硫氨酸的apelin保持了对APJ受体的结合能力。它 们的结合能力比野生型apelin 13低。然而应该注意的是，羊毛硫氨酸 apelin具有pE，而不是Q，这可能部分导致了受体结合的降低。
实施例3：羊毛硫氨酸apelin在表达APJ受体的细胞中影响cAMP 的水平
方法：毛喉素激活的cAMP试验
通过HTRF竞争性免疫试验，分析在表达重组APJ受体的HEK293 细胞中的环状AMP水平。细胞以4000个/孔的密度，将细胞重悬于试 验缓冲液中(HBSS含有Ca2+和Mg2+，添加0.1％BSA和5mM HEPES)， 加入到试验平板。加入含有10μΜ毛喉素和0.5mM IBMX的浓度递增 的化合物，室温孵育40分钟。根据制造商的说明，加入含有d2-标记 cAMP的裂解缓冲液终止反应，随后加入穴状化合物-标记的抗-cAMP 单克隆抗体。室温下在黑暗处孵育2小时后，使用Envision设备，在 620nm和665nm处测量时间分辨荧光。样品中cAMP含量通过cAMP标准曲线中的内推确定。
结果：
表3
结论：在实施例1中显示结合受体的两种突变体，对于cAMP水 平的调节是有活性的。
实施例4：羊毛硫氨酸apelin影响抑制蛋白募集
方法：hAPJ的β-抑制蛋白募集试验
使用DiscoveRx的PathHunterTM系统，研究hAPJ与β-抑制蛋白的 相互作用的激活。基因工程改造CHO-K1细胞系，使其共表达ProLink/ 酶供体(PK)-标记的APJ和酶激活子(EA)-标记的β-抑制蛋白融合 蛋白。在GPCR激活时，酶片段发生互补，产生一种有活性的β-Gal 酶。以15000个/孔的密度接种这些细胞。第二天，用有潜在激动剂性 质的化合物，以不同浓度，激发细胞。与化合物在37℃孵育90分钟后， 细胞被裂解，在室温与PathHunter试剂孵育1小时。然后以超灵敏的 发光步骤，使用Envision设备(PerkinElmer)读取样品。
结果：
表4
结论：在本试验中，pEApeM5突变体具有显著的活性。
实施例5：包含羊毛硫氨酸的apelin不与血管紧张素II型受体1 (AT1)相互作用
鉴于APJ和AT1受体的同源性，研究了羊毛硫氨酸-apelin是否与 血管紧张素II型受体1相互作用。例如，如果apelin的羊毛硫氨酸突 变体激活AT1受体，则对各种治疗应用将是不可取的。
方法：
通过AT1偶联β-抑制蛋白试验，测定羊毛硫氨酸apelin的激动作 用和拮抗作用。
结果：
表5
结论：羊毛硫氨酸apelin对AT1受体没有激活作用，也没有拮抗 作用。
实施例6：hAPJ受体内化试验
方法：
在实验前24小时，将HEK293细胞以50％细胞覆盖接种入2xF75 烧瓶中。第二天早晨，细胞被胰蛋白酶消化，涡旋搅拌60秒，过40 微米筛网过滤器。细胞在OptiMEM+2％FBS中以300,000个/毫升的密 度重悬，以1PFU/细胞的MOI加入Ad-GFP-hAPJ病毒。细胞被涡旋搅拌并以10,000个/孔的浓度分配到透明底的黑色96孔板中。细胞在室 温保持30分钟以使其粘附到板，然后在5％CO2培养箱中37℃孵育过 夜。第二天早晨，以浓度响应曲线(500nM为最大值)加入apelin类 似物。在Olympus FV的共聚焦显微镜下观察并记录APJ-GFP的转位。典型的转位运行在3小时内完成，大部分的作用在与化合物接触的最 初90分钟内被观察到。
结果：
表6
结论：由于内化可以反映脱敏，所以显示信号能力而减少了内化 的突变体是优选的。考虑到实施例2中的cAMP信号，在本系列中 pEApeM6是优选的。
实施例7：羊毛硫氨酸apelin对血浆中肽酶的抗水解性增加
方法：
大鼠血浆中apelin类似物的稳定性。Apelin(apelin终浓度为 0.1mg/ml)在10％大鼠血浆中于37℃孵育，该大鼠血浆以16mM pH7.4 的磷酸缓冲液缓冲。通过酸化到终浓度5％TFA使样品猝熄。在HPLC 上分析样品。相对于起始峰高度，标绘峰高。
结果：
表7
| 肽 | 在大鼠血浆中T50稳定性(hr) |
| QRPRLSHKGPMPF | 1 |
| pERPRLSHKGPMPF | 3 |
| 环状的apelin | |
| pEApeI3c | 2 |
| pEApeI4a | 2 |
| pEApeI5dS I | 2 |
| pEApeI5cS I | 3 |
| pEApeM12S | 3 |
| ApeM6deltaF | 3 |
| pEApeM7S I | 6 |
| pERPRL[AbuHKA]GPMPA | 7 |
| pEApeT8cS | 8 |
| pEApeM6 | 8 |
| pEApeM5 | 9 |
| pEApeM6deltaF | 10 |
| pERPRL[AbuHKA]GPMVF | 10 |
| pEApeM7 | 15 |
| pEApeM8 | 24 |
| pEApeM5T | 24 |
| pEApeM26I | ＞24 |
| pEApeM26II | ＞24 |
| pEApeM27I | ＞24 |
| pEApeM27II | ＞24 |
结论：带有pGlu和羊毛硫氨酸的肽显然比带有Q的线性肽更稳定。 pGlu和羊毛硫氨酸都有助于稳定。突变体pEApeM5T与pEApeM5的 比较证明了通过Dhb残基增强了稳定性。
实施例8：通过激活APJ受体，抑制cAMP通路并激活β-抑制蛋 白通路
用DiscoverX公司的cAMP和β-抑制蛋白试验检测(甲基)羊毛 硫氨酸apelin突变体。
表8
结论：
-以低于或略高于线性S-A对照的浓度，几种(甲基)羊毛硫氨酸 突变体激活cAMP通路。
-激活β-抑制蛋白通路的能力相当多样并且取决于肽。这表明几种 突变体强烈的活性差异；最后一列给出了两种通路的比值，该值的多 样性说明了这一点。
-特别是，羊毛硫氨酸突变体看起来是非常有活性的。
-不仅用羊毛硫氨酸的部分替换氨基酸，而且插入羊毛硫氨酸(的 部分)，都产生有活性的突变体。
-两种突变体激活β-抑制蛋白通路比激活cAMP通路更有效。
Claims (15)
1.一种环状apelin类似物，其具有通式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14或者其酰胺、酯或盐，包含一种结构为Ala-S-Ala的羊毛硫氨酸桥，或者一种结构为Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的甲基羊毛硫氨酸桥，其中：
X1不存在；
X2是pGlu；
X3是Arg；
X4是Pro；
X5是Arg；
X6是Leu；
X7是Ala、(me)Lan；
X8是His、(me)Lan；
X9是Lys、(me)Lan、Lys-(me)Lan；
X10是Gly、(me)Lan；
X11是Pro、(me)Lan、Pro-Lan；
X12是Met、(me)Lan、Met-(me)Lan；
X13不存在或选自Pro、Dhb、(me)Lan；
X14是C-末端，且不存在或Phe，除非X13不存在；
其中：
Abu是氨基丁酸，Dhb是脱氢氨基丁酸；
(me)Lan是Lan或meLan，其中Lan表示羊毛硫氨酸Ala-S-Ala的半个N-或C-末端，meLan表示甲基羊毛硫氨酸Abu-S-Ala或Ala-S-Abu的半个N-或C-末端；
其条件是：
(i)该类似物最多包含两个Ala残基；
(ii)该序列X7至X13包含一对meLan或一对Lan，其共同形成一个(甲基)羊毛硫氨酸桥；并且
(iii)其中所述的(甲基)羊毛硫氨酸桥的大小为在环下面包含2个、3个、4个或5个残基
其中相比于天然的apelin-13，所述环状apelin类似物表现出与β-抑制蛋白相关的apelin受体内化减少；
其中所述(甲基)羊毛硫氨酸桥是羊毛硫氨酸桥或甲基羊毛硫氨酸桥。
2.根据权利要求1所述的apelin类似物，其中X7或X9是(me)Lan。
3.根据权利要求1所述的apelin类似物，其中序列X7-X8-X9-X10是(me)Lan-His-Lys-(me)Lan，或其中序列X7-X8-X9-X10是(me)Lan-His-Lys-(me)Lan-Gly。
4.根据权利要求3所述的apelin类似物，其中序列X7-X8-X9-X10是Lan-His-Lys-Lan或Lan-His-Lys-Lan-Gly。
5.根据权利要求1所述的apelin类似物，其中序列X11-X12-X13-X14是(me)Lan-Met-Pro-Phe。
6.根据权利要求1所述的apelin类似物，选自：
pERPRLmeLanHKmeLanPMPF、pERPRLmeLanHKmeLanPMdhbF、
pERPRLLanAHKLanPMPF、pERPRLLanAHKLanGPMPF、
pERPRLmeLanHKmeLanGPMPF、
pERPRLmeLanHKmeLanGPMPF-NH2、
pERPRLmeLanHKmeLanGPMP、pERPRLLanHKLanGPMPF、
pERPRLmeLanHKGmeLanPMPF、pERPRLLanHKGLanPMPF、
pERPRLAHLanGPMLanF、
pERPRLLanHKGLanMPF、pERPRLmeLanHKGmeLanMPF、
pERPRLLanHKGPLanPF、pERPRLLanHKGPLanMPF、
pERPRLLanHKGPMLanF和pERPRLLanHKGPMLanPF。
7.根据权利要求1所述的apelin类似物，在表达apelin受体APJ的细胞中，能够以0.1～200nM的EC50值诱导cAMP产生。
8.根据权利要求1所述的apelin类似物，表现出在大鼠血浆中的T50稳定性T50为至少3小时。
9.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1～8中任一项所述的apelin类似物。
10.权利要求1～8中任一项所述的apelin类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与水平衡改变相关的病症、压力诱导的紊乱、心血管疾病或代谢紊乱的方法中。
11.根据权利要求10所述的用途，其中压力诱导的紊乱是焦虑或抑郁。
12.一种提供权利要求1～8中任一项所述的apelin类似物的方法，其包括：
a)提供宿主细胞，其包含：
-核酸分子，其包含编码在羊毛硫肽或羊毛硫抗生素的前体肽中发现的N-末端前导肽的第一核酸片段，和编码肽类似物的第二核酸片段，其中所述第一和第二片段在所述核酸分子的同一开放阅读框内；
-核酸序列，其编码能够使丝氨酸和/或苏氨酸脱水的酶；
b)允许翻译所述第一核酸片段；和
c)收获所述肽类似物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞还包含编码转运蛋白的核酸序列。
14.根据权利要求12所述的方法，其包含通过化学或酶法使环闭合。
15.根据权利要求12或14所述的方法，其中所述第二核酸片段编码选自如下的多肽：
QRPRLTHKCPMPF、
QRPRLSAHKCPMPF、QRPRLSAHKCGPMPF、
QRPRLTHKCGPMPF、QRPRLTHKCGPMPF-NH2、QRPRLTHKCGPMP、
QRPRLSHKCGPMPF、QRPRLTHKGCPMPF、
QRPRLSHKGCPMPF、QRPRLAHSGPMCF、QRPRLSHKGCMPF、
QRPRLTHKGCMPF、QRPRLSHKGPCPF、QRPRLSHKGPCMPF、
QRPRLSHKGPMCF和QRPRLSHKGPMCPF。
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