CN106167826A - 一种黄颡鱼生长特性相关的snp位点及其检测和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄颡鱼生长特性相关的SNP位点，为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2100位，其碱基为A或G；或者为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2285位；其碱基为T或C；或者为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2822位，其碱基为A或G；本发明还通过筛选获得能够特异性检测出上述SNP位点的引物，本发明的SNP位点与黄颡鱼的全长性状密切相关，能够有效用于黄颡鱼的分子标记辅助育种，进而根据实际育种需求选择生长速度对黄颡鱼育种材料进行早期选择，能够进一步有效提高育种的效率和准确性。

Description

一种黄颡鱼生长特性相关的SNP位点及其检测和应用

技术领域

本发明涉及分子育种遗传标记技术领域，更具体地，涉及一种黄颡鱼生长特性相关的SNP位点及其检测和应用。

背景技术

黄颡鱼是我国广泛养殖的小型淡水经济鱼类；因其肉质细嫩、营养丰富、含肉率高深受消费者欢迎，黄颡鱼繁殖亲本主要是野生捕捞或培养数代的种群，没有经过人工选育，其生长速度、抗病能力和养殖性能较弱，因此开展黄颡鱼的两种选育工作具有实际的意义。

目前已有许多学者在黄颡鱼遗传育种方面进行了大量的研究，并取得了不少成果。随着生物技术的发展，鱼类遗传育种技术有了越来越多的方法，分子标记主要是指能够反映个体生物或群体间基因组中某些差异性的基因片段，具有多态性高、分布广泛、共显性等一系列优势，在鱼类遗传育种和遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定、种质资源研究等方面具有广泛的应用；利用分子标记培育生长性状优良的高产品种是提高经济效益的中药途径之一，获得与黄颡鱼生长特性相关的基因及基因位点可辅助高产黄颡鱼的选育，目前还没有与黄颡鱼生长特性相关的基因及基因位点的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种与黄颡鱼生长特性相关的SNP位点。

本发明的第二个目的是提供用于特异性检测上述SNP位点的引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP位点的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种与黄颡鱼生长特性相关的SNP位点，所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2100位，其碱基为A或G；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2285位；其碱基为T或C；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2822位，其碱基为A或G。

本发明首先通过同源克隆的方法获得黄颡鱼GH全长，混池测序发现GH基因的内含子4存在4个SNP位点，3’UTR存在1个SNP位点，分别将其命名为1674G>A、2100A>G、2154T>G、2285T>C、2822A>G。

申请人通过研究发现：1674G>A和2154T>G两个位点的基因型与各生长性状无显著差异；位点2100A>G中的基因型GG体厚显著厚于基因型AA（P<0.05），且基因型GG体厚极显著厚于基因型AG（P<0.01）；位点2285T>C中的基因型CC尾柄长显著长于基因型CT（P<0. 05）；位点2822A>G中的基因型GG全长显著长于基因型AG（P<0.05），基因型GG体长显著长于基因型AA型(P<0.05)，且极显著长于基因型AG（P<0. 01），基因型GG尾柄高显著高于基因型AA、AG（P<0. 05），基因型GG尾柄长显著长于基因型AA型（P<0. 05），且极显著长于基因型AG（P<0. 01）。

因此优选地，所述自5’端起第2100位，其碱基为A或G的SNP位点的GG基因型个体的体厚厚于AA和AG基因型个体。

优选地，所述自5’端起第2285位；其碱基为T或C的SNP位点的CC基因型个体的尾柄长大于CT和TT基因型个体。

优选地，所述自5’端起第2822位，其碱基为A或G的SNP位点的GG基因型个体的全长高于AA或AG基因型个体；GG基因型个体的体长高于AA和AG基因型个体；GG基因型个体的尾柄高高于AA和AG基因型个体；GG基因型个体的尾柄长大于AA和AG基因型个体。

本发明还提供一种用于检测所述与黄颡鱼生长特性相关的SNP位点的引物，其序列如SEQ ID NO：2～5所示；本发明还提供含有所述引物的试剂盒。

根据本发明实施例，可以通过检测黄颡鱼上述SNP，能够有效地确定其全长性状，因此，可用于黄颡鱼的遗传育种；因此，本发明还提供上述SNP位点或者用于检测上述SNP位点的引物或者含有所述用于检测上述SNP位点的引物的试剂盒在黄颡鱼遗传育种中的应用。

本发明还提供一种检测黄颡鱼全长性状的方法，是通过对黄颡鱼进行上述的SNP位点的检测，确定黄颡鱼的全长性状；具体是利用本发明的引物对能够有效地对待测黄颡鱼的上述与全长性状相关的SNP位点所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP位点的检测，确定待测黄颡鱼该SNP位点的基因型，进而能够有效确定待测黄颡鱼的全长性状。

优选地，所述检测黄颡鱼全长性状的方法包括以下步骤：

（1）提取待测黄颡鱼的基因组DNA，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；（2）对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测黄颡鱼的所述SNP位点的基因型以及基于所述待测黄颡鱼的所述SNP位点的基因型，确定所述待测黄颡鱼的全长性状。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种黄颡鱼生长特性相关的SNP位点，所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2100位，其碱基为A或G；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2285位；其碱基为T或C；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2822位，其碱基为A或G；本发明还通过筛选获得能够特异性检测出上述SNP位点的引物，本发明的SNP位点与黄颡鱼的全长性状密切相关，能够有效用于黄颡鱼的分子标记辅助育种，进而根据实际育种需求选择生长速度对黄颡鱼育种材料进行早期选择，能够进一步有效提高育种的效率和准确性。

附图说明

图1为部分SNPs位点测序图，其中，图（a）为2154T>G；图（b）为2822A>G。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

本发明采用同源克隆的方法获得黄颡鱼GH全长，共3117bp，5个外显子（从5’端开始分别称为外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5），4个内含子（从5’端开始分别称为内含子1、内含子2、内含子3、内含子4），5’UTR为165bp，3’UTR为485bp。

实施例1 GH基因的SNP位点筛查分析

一、设计引物及合成

根据克隆获得的黄颡鱼生长激素基因全长序列设计两对引物，分别扩增GH基因的外显子4、内含子4、外显子5区域和GH基因3’UTR端区域。引物信息见表1。

二、SNPs位点的筛选

（1）DNA池的构建

选取试验黄颡鱼样品中体重高和低的各10条，用紫外分光光度计测量每个样品基因组DNA浓度，然后每个样品稀释到100ng/ul，各取10ul等量等浓度混合构建成品种DNA池，用以SNPs位点的筛选。

（2）混池反应体系，如表2

上述反应体系的PCR反应程序：（i）预变性94 ℃ 5 min；（ii）变性94 ℃ 30 s，退火53℃（或者57 ℃）30s，延伸72 ℃ 90s（或者40s）；共38个循环；（iii）延伸72 ℃ 10 min，4 ℃终止；产物进行1.5%琼脂凝胶电泳检测，目的条带符合送华大基因公司测序。

混池测序发现GH基因的内含子4存在4个SNP位点，3’UTR存在1个SNP位点，分别将其命名为1674G>A、2100A>G、2154T>G、2285T>C、2822A>G。设计引物扩增每个样本的内含子4和3’UTR，部分SNPs位点测序信息如图1。

三、SNPs位点的PCR反应体系

（1）反应体系如表3

（2）PCR反应程序：（i）预变性94 ℃ 5 min；（ii）变性94 ℃ 30 s，退火53℃（或者57℃）30s，延伸72 ℃ 90s（或者40s）；共38个循环；（iii）延伸72 ℃ 10 min，4 ℃终止；产物进行1.5%琼脂凝胶电泳检测，电泳结束后使用凝胶成像系统拍照并保存，将能扩增出目的条带的PCR产物送华大基因公司测

四、SNPs的分型

使用Lasergene软件对测序样品的GH扩增序列进行比对，将不同碱基比例大于 1/3 的位点判定为 SNPs 位点，统计每个样品SNPs位点的碱基，通过分析确定SNPs位点基因型。

根据PCR产物的测序结果，利用DNASTAR软件统计每个位点的基因型。位点1674G>A检测的样本130尾，纯合子AA基因型出现19尾，频率为0.1462；杂合子AG基因型出现62尾，频率为0.4769；纯合子GG基因型为49尾，频率为0.3769。等位基因A的频率为0.3846，等位基因G的频率为0.6154。位点2100A>G检测的样本119尾，纯合子AA基因型出现73尾，频率为0.6135；杂合子AG基因型出现41尾，频率为0.3445；纯合子GG基因型为5尾，频率为0.0421。等位基因A的频率为0.7857，等位基因G的频率为0.2143。位点2154T>G检测的样本118尾，杂合子GT基因型出现33尾，频率为0.2797；纯合子TT基因型为85尾，频率为0.7203。等位基因G的频率为0.1542，等位基因T的频率为0.8458。位点2285T>C检测的样本125尾，纯合子CC基因型出现3尾，频率为0.0240；杂合子CT基因型出现32尾，频率为0.2560；纯合子TT基因型为90尾，频率为0.7200。等位基因C的频率为0.1520，等位基因T的频率为0.8480。位点2822A>G检测的样本148尾，纯合子AA基因型出现67尾，频率为0.4527；杂合子AG基因型出现74尾，频率为0.5000；纯合子GG基因型为7尾，频率为0.0473。等位基因A的频率为0.7027，等位基因G的频率为0.2973。各SNPs位点基因型及频率见表4。

实施例2 SNP位点遗传特性分析

研究中5个SNP多态位点的黄颡鱼群体遗传特性分析见表5。其中5个位点的等位基因数都是2，位点1674G>A的有效等位基因数最高1.8989，位点2285T>C的有效等位基因数最低1.3473；位点2154T>G和 2285T>C为低度多态性，位点1674G>A、2100A>G和2822A>G为中度多态。

实施例3 SNPs多态性与生长性状的关联分析

利用SAS软件中的一般线性模型（GLM），对SNP位点基因型与黄颡鱼主要生长性状（体重、全长、体长、体高、体厚、头长、尾柄长、尾柄高）进行关联分析，经方差分析检验呈显著性差异的位点，使用Duncan法进行多重比较。结果表明，1674G>A和2154T>G两个位点的基因型与各生长性状无显著差异（表6和表8）； 位点2100A>G中的基因型GG体厚显著厚于基因型AA（P<0.05），且基因型GG体厚极显著厚于基因型AG(P<0.01)（表7）；位点2285T>C中的基因型CC尾柄长显著长于基因型CT（P<0. 05）（表9）；位点2822A>G中的基因型GG全长显著长于基因型AG（P<0.05），基因型GG体长显著长于基因型AA型(P<0.05)，且极显著长于基因型AG（P<0. 01），基因型GG尾柄高显著高于基因型AA、AG（P<0. 05），基因型GG尾柄长显著长于基因型AA型（P<0. 05），且极显著长于基因型AG（P<0. 01）（表10）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种黄颡鱼生长特性相关的SNP位点及其检测和应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3117

<212> DNA

<213> GH基因

<400> 1

tgatgttatt gtggaaggtg tgaggtgtct catgtcgatg cattaagcat gtagagatca 60

ggtataaaaa ttggacctgc tagcaggagg gaaatcattg tctgaaagtc ggcgtctgat 120

ttttcagtga aaattcgaac caagtttctt cagagagatt ctaaaatggc tcgaggtaag 180

gctctgacct ggtgttacat tacgactgtg atgttacagt gaggaacttt tattgaygtt 240

tttgttttat aagattacta ttagattttc aaattacttt ctgtataaaa tccaccacta 300

gacctgtttt attttgtgcc taatttcaga attatccttg tagatgtatc ctcacagtac 360

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacat 420

actgtatatg cattatataa tgtatgctac tctcctgctg ttcttcctct tccacagggt 480

tagtgttgct ctctgtggtg ttggtgagtt tgttctttag ccaaggcgcg acatttgaga 540

accagaggct cttcaacaac gccgtcattc gtgtgcaaca ccttcatcag ctggctgcca 600

agatgatgga tgactttgta agctgacttt acatcattta cagatgttta gtttactgaa 660

gtatgcttta gctaacatgg ttgctgtgct gcaaatataa aggaggaagc tctgttacct 720

gatgaacgca aacagctcag caagatcttc cccctgagtt tctgcaactc ggactccatc 780

gaagctccgg caggcaaaga cgagacccag aaaagctctg tgagtcacaa aactgcctca 840

agaattcatg cgattttaat atatatatat ttaaagatat ttgttattgt gataacgaat 900

ttggtgattt aatgatcatt agctgtgaca caaatgattt aaaggagcaa tatgtaatat 960

ataaaagtgc ttcaatactc ataaaaaatt gaatcatgtc aaagatgctt taaaatgttc 1020

aaaaaaatgt aataaagtag ttgttttact gtttttacag tttctttgat taaggcttct 1080

acttaattaa ttacccaata aaatatcccc cccccaatat ttaaatgttt cttaaaagaa 1140

ataactaaaa aacattactt tttctgaatt ttttaagagt agccctgcaa tgcaaggtat 1200

ctattttaaa gtttcagtta acatttttct ggcccagaaa caagctccac tgtttttttt 1260

tttttttgta aaaggcagct taagagtcaa acatgtctag ctagtagttg atgttttcat 1320

tgctctctta gcgtgatgaa tattgtgatt tacgtgctac agtctcatgc taaagatcgt 1380

ttataagcaa acatgagcat cggagagaag aatactgctt tgcatctctg tgaactttaa 1440

acgagtctgt tttttaacca ggtgctgaag ctactgcaca cttcctaccg tctgatcgag 1500

tcatgggagt tccccagcaa gaacctcggc aaccctaacc atatctctga gaagctggct 1560

gacctgaaga tgggcatcgg cgtgcttatc gaggtgagca cgagcgccac agatcagaca 1620

ccgagtcact gcaatgtgtg cagggagaac agaagagtta atagaatgtg ttagttaaca 1680

tgtatgagta tgtatttccc gtatggacct gtgtgcacaa aaatgatgtt ttgtacaact 1740

tggatgaaag tgtttttttt gtgtcattcc ccatccattt ctctataact aatacatgct 1800

ctggtgctct gggtggctca gaacttgcga tctaagtaca agacttagca gtacaagaaa 1860

cccgtcagtt cattcagcta tatgcggttt taaaacttaa aactaatcag aatagtagct 1920

atttatttac tgttggtaga atctgaccgt tcattcattc aatggaaaag ttggtaaggt 1980

aataataatg taacttttgt aactgtaagt ttgcagttct gatcaattga aataatttta 2040

atcattaaaa tgtaaatgtt tacaccatat gttgtagtct caggaggata aactcttcat 2100

accttccagc cctattaacg tccccggctc agacccggag ctctgctcct ttacacatga 2160

gtgaaattta aacagtaaca attattagta ttatttagat cattttctcc agtattgtag 2220

tttttatata gcgcaggttg gatttattta actcctacat gttaataaac acaataacca 2280

acaggcgtac ttaaggtggt cgttatttat gatcaattca tgtattgtta ttataaagtg 2340

tttcagttat gcagtatgat aaagtttagt gaaaattgtc tagttttatt gtagcaaggc 2400

ttataaagtc actctgctca ctccataggg atgtctggac ggacagacca gcatggacga 2460

gaacgacgct ctggctccgc cattcgagga tttctaccag accttgagcg agggaaacct 2520

gaggaagagc ttccgtctgc tgtcctgctt caagaaggac atgcacaagg tggagaccta 2580

tctaagcgtg gccaagtgca ggagatccct ggattccaac tgcaccctgt agaatgagag 2640

agagagagag agagagagag agagagagag attgattgat tgattgacta gtcacagtct 2700

gggatctctc caggcatgac tatcatcttt ctttctttct ttctttcctt ttgtttcttt 2760

gggtttaatt tctgtcttta tgtatttatt ctcctccatt cacctgttta acagatttct 2820

ccatctcagc aaccttaagg atgtaacata tgggaccagt ttcacgatgg tgctatgcaa 2880

attcagcttt atatcaaata acgaataaga aaatggatta aacgtaatta atttagaaat 2940

ggacgaggac gctcctggct aatgaatgta aaatattcag agggtatatt ttcctatcaa 3000

agtctatact cttctaattt taattatggc ctatttctgt gtgaagcttt gactgtctct 3060

gtgtgaaaat ctctctcatt gcttttttgt ggatttccaa taaacctaat ccctggg 3117

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 扩增外显子4、外显子5和内含子4中的SNP位点的正向引物

<400> 2

caggtgatgt tttcattgct ctc 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 扩增外显子4、外显子5和内含子4中的SNP位点的反向引物

<400> 3

tgcagttgga atccaggga 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增3'UTR端内SNP位点的正向引物

<400> 4

gtggagacct atctaagcgt gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增3'UTR端内SNP位点的反向引物

<400> 5

ggcaatccac aaaaaagcaa tg 22

Claims (8)

1.一种与黄颡鱼生长特性相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2100位，其碱基为A或G；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2285位；其碱基为T或C；或者所述SNP位点为SEQ ID NO：1所示GH基因自5’端起第2822位，其碱基为A或G。

2.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，所述自5’端起第2100位，其碱基为A或G的SNP位点的GG基因型个体的体厚厚于AA和AG基因型个体。

3.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，所述自5’端起第2285位；其碱基为T或C的SNP位点的CC基因型个体的尾柄长大于CT和TT基因型个体。

4.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，所述自5’端起第2822位，其碱基为A或G的SNP位点的GG基因型个体的全长高于AA或AG基因型个体；GG基因型个体的体长高于AA和AG基因型个体；GG基因型个体的尾柄高高于AA和AG基因型个体；GG基因型个体的尾柄长大于AA和AG基因型个体。

5. 一种用于检测权利要求1所述与黄颡鱼生长特性相关的SNP位点的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：2～5所示。

6.含有权利要求5所述引物的试剂盒。

7.权利要求1所述SNP位点或者权利要求5所述引物或者权利要求6所述试剂盒在黄颡鱼遗传育种中的应用。

8.一种检测黄颡鱼全长性状的方法，其特征在于，通过对黄颡鱼进行权利要求1至4任一项所述的SNP位点的检测，确定黄颡鱼的全长性状。