CN106140118A

CN106140118A - 用于纯化抗体的亲和层析凝胶的生产工艺及使用

Info

Publication number: CN106140118A
Application number: CN201510124911.XA
Authority: CN
Inventors: 赵婷; 高再兴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明阐述了一种用于纯化抗体的新型亲和层析凝胶的制备方法，生产工艺，及其应用。本发明是以一种小分子配基交联到凝胶介质上，替代通用的抗体纯化介质，解决以大分子蛋白为配基的亲和凝胶的缺陷。

Description

用于纯化抗体的亲和层析凝胶的生产工艺及使用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域。本发明涉及生物化学、化学合成、蛋白分离纯化等技术。

背景技术

抗体作为药物用于疾病治疗已有很长历史。随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术用于抗体的改造，以被广泛认为是本世纪最具有发展力药物。

目前，约70-80％的抗体纯化使用Protein A、Protein G亲和层析。然而Protein A、Protein G、凝胶介质都具有共同的缺陷。Protein A、Protein G是生物大分子，对人体具有过敏反应，纯化抗体后，须除去残留；Protein A、Protein G、必须通过发酵法进行生产，其生产成本高，纯化难度大；会发生特异性的吸附，在洗脱的过程中，由于其结合能力过高，会出现将IgG的Fc片段拉扯出来的现象，从而破坏了蛋白的空间构象，导致抗体蛋白失去活性；Protein A、Protein G在分离纯化抗体过程中，使用20-30个循环后会失去活性，从而导致失去纯化作用，增加了纯化成本。

如何增加抗体药物的安全性，如何降低抗体药物的纯化成本，成为抗体纯化技术不得不面临的主要问题。针对以上原因，本发明提出以一种新型的小分子配基，替代大分子蛋白为配基产生的不利因素。

本发明采用小分子配基的氨基酸序列为：(RTY)₄K₂KG，可以模拟蛋白A的空间结构，制备一种新的亲和层析介质，对各种抗体都具有很强的亲和吸附性，只需要采用不同条件，就可以同时吸附不同的免疫蛋白。(RTY)₄K₂KG配基的凝胶介质可以非常好的解决Protein A、Protein G、凝胶介质的缺陷；(RTY)₄K₂KG是生物小分子，不会对人体产生过敏反应，没有毒性，抗体纯化后，去除残留简单。(2)(RTY)₄K₂KG采用多肽合成的方法生产，生产纯化简单，可放大生产。(3)(RTY)₄K₂KG为配基的亲和凝胶洗脱条件非常温和，不会出现洗脱时对抗体蛋白的构象产生破坏的现象。(4)(RTY)₄K₂KG分子量小，性能稳定，能够耐受碱性条件，从而增加使用周期，节省成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的亲和层析凝胶的制备方法，生产工艺和使用。本发明的新型亲和凝胶是以一种小分子的多肽(RTY)₄K₂KG，替代大分子的蛋白为配基，交联到活化后的琼脂糖凝胶介质上。

多肽(RTY)₄K₂KG，是通过多肽的化学合成：固相合成法合成，在通过HPLC纯化得到纯品。由于多肽作为配位体的分子量比目标蛋白的分子量小1～2个数量级，多肽配位体与目标蛋白键合不易接近，使用聚乙二醇占位剂生成PEG-HMBA，然后再和多肽结合，生成PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG，可以增加键合容量。

活化介质使用交联后的6B琼脂糖凝胶，采用CDI活化，偶联效率高，操作简便，偶联容易控制，而且产生的亲和吸附剂无离子交换剂作用，避免如溴化氢活化后的树脂带有较强电荷而导致非特异性吸附等缺点。并且易于放大生产。

将CDI活化后的交联后的琼脂糖凝胶和PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG反应，即可得到配基为PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG的琼脂糖亲和凝胶介质，然后再用三氟乙酸切断PEG-HMBA占位剂，得到配基为(RTY)₄K₂KG亲和层析凝胶。

具体实施方法

实施例1：(RTY)₄K₂KG配基的制备：

1)称取1克的Fmoc-Gly-wang resin，用10毫升二甲基甲酰胺溶胀40分钟，然后再用二甲基甲酰胺洗涤三次。

2)在Fmoc-Gly-wang resin中加入10毫升含20％的哌啶二甲基甲酰胺溶液作用20分钟，脱掉FMoc保护基团。再加入1倍量的Fmoc-Lys(FMoc)-OH，和1倍量的HOBT，DIC，以及10毫升的二甲基甲酰胺，反应45分钟。反应后用茚三酮检验连接效率。

3)分别用Fmoc-tyr(otbu)-OH，Fmoc-thr(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH替代第二步骤中的Fmoc-Lys(FMoc)-OH，进行反应。

4)反应后的树脂用甲醇清洗，冻干，切割。通过HPLC纯化，得到纯度大于98％的产品，即为(RTY)₄K₂KG

实施例2：PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG的制备：

1)以安化聚乙二醇和HMBA反应生成占位剂，

2)PEG-HMBA于多肽反应生成PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG

实施例3：琼脂糖凝胶介质的活化

1)：取交联后的琼脂糖凝胶放入布式漏斗中，用去离子水洗去乙醇溶液。

2)：依次用3倍体积的水∶二甲基亚砜(4∶1)2次；水∶二甲基亚砜(3∶2)2次；水∶二甲基亚砜(2∶3)2次；水∶二甲基亚砜(1∶4)2次；水∶二甲基亚砜(0∶5)2次，混合溶液浸洗凝胶，再用二氧六环溶液清洗，置换出凝胶中的水。

3)：称取脱水后的5.0g的凝胶，悬浮于10ml的二氧六环溶液中，在室温下，加入含有CDI(羰基二咪唑)的二氧六环溶液10ml，然后再在室温下震荡30min。

4)：反应结束后立即用水∶二氧六环(1∶4)；水∶二氧六环(2∶3)；水∶二氧六环(3∶2)；二氧六环(4∶1)，大量的清洗。得到CDI活化琼脂糖凝胶介质。

根据上述反应做放大生产：

准确称量用二氧六环水溶液脱水后的琼脂糖凝胶5千克，放入反应釜中，悬浮于10L的二氧六环溶液，于30min匀速加入含有CDI的二氧六环溶液10L，搅拌均匀，在25℃下反应一小时，再用二氧六环水溶液和大量的水清洗。将得到的CDI活化的琼脂糖凝胶。

将放大生产后的CDI活化凝胶与上述的小实验所得的CDI活化凝胶取同体积，在含有0.015M的NaCl的pH10.0、0.2M的NaHCO₃缓冲溶液中偶联BSA，在4℃反应24h。测定偶联的BSA蛋白量为：小实验13.26mg/ml，放大生产12.87mg/ml。说明本实验方案易于放大，且放大生产后的CDI活化凝胶偶联效率没有明显变化。

实施例4：CDI活化琼脂糖凝胶与PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG的键合

将活化CDI琼脂糖凝胶10g，悬浮于20ml的0.01M的NaHCO₃缓冲溶液中，加入PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG，在室温下反应48h，反应结束后用大量的水清洗抽干，得到亲和凝胶。

在凝胶中加入1％的三氟乙酸溶液处理，切断PEG-HMBA占位剂，即可得到(RTY)₄K₂KG亲和层析凝胶。

纯化试验结果分析，小分子配基的(RTY)₄K₂KG亲和层析凝胶与Protein A、Protein G亲和层析对抗体具有同样纯化效果。

Claims

1.一种新型的亲和凝胶，特征是：亲和凝胶的配基为小分子多肽(RTY)₄K₂KG。

2.权利要求1所述的亲和凝胶的制备方法其特征在：首先通过交联琼脂糖凝胶的CDI活化。活化方法为脱水后的交联琼脂糖凝胶，悬浮于加入CDI的二氧六环溶液中，于室温下震荡0.5-1h，得到CDI活化琼脂糖凝胶。

3.权利要求1所述的亲和凝胶的制备方法，其特征在：配基(RTY)₄K₂KG和亲和固定相的键合是以配基PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG先结合，再通过三氟乙酸切断PEG-HMBA，得到亲和凝胶。

4.权利要求1所述的亲和凝胶的制备方法，特征在于：CDI活化后的琼脂糖凝胶，悬浮于加入PEG-HMBA-(RTY)₄K₂KG的0.01M的NaHCO₃缓冲溶液中，在室温下反应48h。

5.权利要求1、2、3、4所述的亲和凝胶的制备方法，其特征在于，固定相为琼脂糖，也可用葡聚糖、酰胺、共聚物、复合物、纤维素和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。