Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Purificacion de peptidos por medio de cromatografia de afinidad con iones metalicos.
ES2322338T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Thorkild Christensen Milton Thomas William Hearn Leone Spiccia Wei Jiang Jane Therese Mooney Bimbil Graham - Current Assignee
- Monash University
- Novo Nordisk AS
Description
translated from
Purificación de péptidos por medio de
cromatografía de afinidad con iones metálicos.
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, al campo del aislamiento y purificación de péptidos, sobre
todo polipéptidos, tales como proteínas recombinantes, por medio de
cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados.
Un aspecto importante de la producción de
péptidos recombinantes (creados genéticamente), incluyendo oligo y
polipéptidos, sobre todo proteínas, destinadas al uso terapéutico
en seres humanos o animales es la purificación de los péptidos en
cuestión hasta un nivel suficientemente alto de pureza, en
particular de manera que la proteína deseada esté esencialmente
completamente libre de contaminación con, en particular, (a)
cualesquiera proteínas extrañas que pueden originarse en el proceso
de producción (normalmente un proceso de fermentación o similar que
utilice una cepa seleccionada o modificada genéticamente de un
microorganismo apropiado) y (b) iones metálicos no deseables (sobre
todo iones metálicos pesados) que puedan ser introducidos en el
curso del proceso de producción.
La cromatografía de afinidad con iones metálicos
inmovilizados (IMAC) es un procedimiento de separación versátil que
aprovecha las diferencias en las afinidades mostradas por muchos
biopolímeros para iones metálicos. La técnica implica la quelación
de un ión metálico adecuado sobre una matriz de soporte sólida cuya
superficie haya sido modificada químicamente previamente con un
ligando polidentado. El resultante complejo quelante de iones
metálicos inmovilizados tiene entonces el potencial para coordinar
con uno o más grupos donantes de electrones residentes sobre la
superficie de la proteína de interacción (Sulkowski, E., Trends in
Biotechnology, 3 (1985) 1-6; Porath, J., Carlsson,
I., Olsson, I. and Belfrage, G., Nature, 258 (1975)
598-599; Kagedal, L., en "Protein
Purification" (Ed., J. C. Janson, and L. Ryden), VCH Publishers
(1989) págs. 227-251; Zachariou, M. and Hearn, M.
T. W., Biochemistry, 35 (1996) 202-211. La
selectividad de la separación es entonces conseguida con base en
diferencias en las estabilidades termodinámicas de los complejos de
iones metálicos inmovilizados/proteínas adsorbidas. Las proteínas
cuyos complejos de adsorción son los menos estables serán eluidas
primero, mientras que las proteínas que forman complejos más
estables serán eluidas más tarde. Cuanto mayor sea la diferencia en
las constantes de asociación de equilibrio, es decir, cuanto mayores
sean las diferencias en las constantes de disociación (K_{D}) de
los complejos respectivos de coordinación de iones metálicos
inmovilizados/proteínas adsorbidas, más alta será la resolución
obtenida. En consecuencia, la composición de aminoácidos, la
distribución en la superficie de residuos de aminoácidos
particulares, al igual que la conformación de la proteína,
representan todas ellas funciones importantes en la determinación
de la afinidad de una proteína para un sistema particular de IMAC.
Como resultado, las proteínas con propiedades muy similares
respecto a la carga, tamaño molecular y composición de aminoácidos,
pero con diferencias en sus estructuras terciarias, pueden ser
resueltas.
La mayor parte del interés de investigación en
el uso de la IMAC durante los últimos 20 años ha girado alrededor
de la aplicación de los iones metálicos de transición de primera
línea de dureza límite (vide infra), tales como Cu^{2+},
Zn^{2+} y Ni^{2+}. Estos iones metálicos demuestran constantes
de estabilidad intermedias de los iones metálicos, p. ej. valores
de log\beta entre 5 y 10, tanto para las aminas aromáticas como
alifáticas, al igual que para los grupos funcionales carboxilados
(Wong, J. W., Albright, R. L. and Wang, N. H. L., Separation and
Purification Methods, 20 (1991) 49-57; Zachariou,
M., Traverso, I., Spiccia, L. and Hearn, M.T.W., Journal of
Physical Chemistry, 100 (1996) 12680-12690). Varios
quelatos tridentados libres que muestran estas propiedades
aglutinantes de los iones M^{2+} pueden ser químicamente
inmovilizados sobre los materiales de soporte. A pesar de sus
limitaciones respecto a la magnitud de los valores de log\beta
correspondientes y de sus capacidades de selectividad resultantes
relativamente bajas, los tipos libres de los compuestos quelantes,
tal como el ácido iminodiacético (IDA), constituyen los principales
tipos de ligandos quelantes empleados hasta ahora en este tipo de
investigaciones de la IMAC [véase, p. ej., Kagedal, L., en
"Protein Purification" (Eds. J. C. Janson and L. Ryden), VCH
Publishers (1989) págs. 227-251]. Las aplicaciones
ilustrativas del uso de sistemas de IMAC basados en
M^{2+}-IDA inmovilizados incluyen la purificación
de \alpha-amilasas de trigo germinado usando
Cu^{2+}-IDA inmovilizado [Zawistowska, U.,
Sangster, K., Zawistowski, J., Langstaff, J. and Friessen, A. D.,
Cereal Chemistry, 65 (1988) 5413-5418]; y la
purificación del factor VII de la coagulación humana [Weeransinghe,
K. M., Scully, M. F. and Kadder, V. V., Biochimica Biophysica Acta,
839 (1985) 57-65] y proteinasas de
\alpha_{1}-tiol [Otsuka, S. and Yamanaka, T.
(Eds), "Metalloproteins-Chemical Properties and
Biological Effects" en "Bioactive Molecules", Kodansha Ltd,
Tokyo (1988), págs. 18-45] del plasma humano usando
Zn^{2+}-IDA inmovilizado. Una extensión del uso
de procedimientos de IMAC basados en IDA, es decir, la purificación
de proteínas recombinantes usando ácido
nitrilotriacético-Ni^{2+} inmovilizado
(Ni^{2+}-NTA) [Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli,
H. and Stuber, D., Bio/Technology, 6 (1988)
1321-1324] (siendo NTA un homólogo estructural de
IDA), reside en la incorporación a nivel del gen de una secuencia de
polinucleótidos correspondiente a un péptido de polihistidina,
normalmente hexa-His, que confiere a la proteína
una afinidad más alta para la unión al complejo quelante
inmovilizado Ni^{2+}-NTA, permitiendo así que la
proteína sea retenida selectivamente en este sorbente de IMAC. En
la aplicación presente, los términos "sorbente" y
"adsorbente" son usados principalmente para indicar un sustrato
de polímero funcionalizado (sustrato de polímero con ligando
inmovilizado a éste) con ion(es) metálicos enlazados de
forma coordinada, aunque estos términos son también empleados
ocasionalmente para indicar un sustrato de polímeros funcionalizado
sin ión(es) metálico(s) enlazados a éste.
Como será notado por la descripción de arriba de
las aplicaciones de los sistemas de IMAC basados en IDA y NTA, un
medio alternativo de alterar la selectividad de enlace de proteínas
a los sistemas de IMAC es posible a través de la variación en la
estructura de la ligadura quelante. En los últimos años, no
obstante, sólo ha sido introducido un número pequeño de ligaduras
nuevas quelantes de IMAC. Éstas incluyen sistemas basados en ácido
aminohidroxámico de queladores bidentados (AHM) y
8-hidroxiquinolina (8-HQ)
[Zachariou, M., Traverso, I., Spiccia, L. and Hearn, M.T.W.,
Journal of Physical Chemistry, 100 (1996)
12680-12690]; ácido
carboximetil-aspártico (CM-ASP) que
tiene una afinidad más alta con Ca^{2+} que IDA [Porath, J.,
Trends in Analytical Chemistry, 7 (1988), 254-256;
Mantovaara, T., Pertofz, H. and Porath, J., Biotechnology Applied
Biochemistry, 11 (1989), 564-569];
orto-fosfoserina (OPS), que es capaz de quelar
iones metálicos "duros", tales como Fe^{3+}, Al^{3+},
Ca^{2+} y Yb^{3+} debido a la participación del grupo de
fosfatos [Zachariou, M., Traverso, I. and Hearn, M. T. W., Journal
of Chromatography, 646 (1993), 107-115]; y otras
ligaduras tridentadas, tales como
(2-piridilmetil)aminoacetato (CPMA),
dipicolilamina (DPA) y cis o
trans-carboximetil-prolina [Chaouk, H.,
Middleton S., Jackson W.R. and Hearn, M.T.W., International Journal
of BioChromatography, 2 (1997) 153-190; Chaouk, H.
and Hearn, M.T.W., Journal of Biochemical and Biophysical Research
Methods, 39 (1999) 161-177]; ligandos tetradentados,
tales como el ácido nitrilotriacético (NTA) [Hochuli, E.,
Bannwarth, W., Dobeli, H., Gentz, R. and Stuber, D. Bio/Technology,
6 (1988) 1321-1325], que tienen afinidades más altas
para los Iones M^{2+} que IDA debido a su naturaleza
cuadridental, muestran constantes de asociación de unión a
proteínas inferiores debido a la pérdida de un sitio de
coordinación en comparación con las ligaduras tridentadas tipo IDA;
y ligandos pentadentados, tales como tetraetilenepenlamina (TEPA)
[Hldaka Y., Park, H. and Inouye, M., FEBS Letters, 400 (1997)
238-242] o
N,N,N'-tris(carboximetil)etileno-diamina
(TED) [Porath, J., Protein Expression & Purification, 3 (1992)
263-281], que coordinan los iones metálicos por
medio de cinco átomos donantes (es decir, dos átomos de nitrógeno
de los grupos primarios de amina y tres átomos de nitrógeno de
grupos secundarios de amina en el caso de TEPA, y dos átomos de
nitrógeno de los grupos secundarios de amina y tres átomos de
oxígeno a partir de los tres grupos carboxílicos en el caso de
TED).
Ha sido observada una fuga significativa de
iones metálicos en relación con sistemas de quelato de ácido
iminodiacético -(In-M^{n+}-IDA) de
iones metálicos inmovilizados cuando se usan condiciones de elución
relativamente moderadas en el proceso cromatográfico [Oswald, T.,
Hornbostel, G., Rinas, U. and Anspach, F.B., Biotechnology Applied
Biochemistry, 25 (1997) 109-115; Kagedal, L. in
Protein Purification (eds. J.C. Janson and L Ryden) VCH Publishers.
New York (1989), págs. 227-251]. Así, además de la
emisión de la modulación de selectividad, ha sido necesaria una
motivación adicional para el desarrollo de clases nuevas de
ligaduras quelantes para realizar aumentos significativos en las
constantes de estabilidad en comparación con los sistemas basados en
IDA o NTA que han sido empleados hasta ahora [Zachariou, M.,
Traverso, I., Spiccia, L. and Hearn, M.T.W., Analytical Chemistry,
69 (1996) 813-822].
Se ha descubierto sorprendentemente que la
resistencia y/o selectividad de la unión en coordinación de iones
metálicos de una proteína deseada en forma de una "proteína de
fusión" que, además de la cadena del polipéptido de la proteína
de interés, comprenden (como una extensión de la secuencia de
aminoácidos de la proteína deseada per se) una cadena del
oligopéptido enlazada de manera covalente (a veces denominada una
"etiqueta") incorporando uno o más residuos de aminoácidos
posicionados apropiadamente capaces de formar una coordinación
enlazados a un ión metálico, pueden ser aumentadas
significativamente utilizando, como una matriz para el ión metálico
o iones metálicos con los que tiene que tener lugar la unión de la
proteína de fusión, un sustrato de polímero funcionalizado con una
funcionalidad que comprende al menos un grupo cíclico de ligandos
de coordinación de iones metálicos. La resistencia generalmente
significativamente superior y/o selectividad de la unión de la
proteína de fusión a la matriz en comparación con aquella de la
unión de las proteínas extrañas facilita entonces la separación y
aislamiento de la proteína de fusión de una mezcla que contiene la
proteína de fusión junto con una o más proteínas extrañas.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
un sustrato de polímero funcionalizado con un ión metálico que
coordina la funcionalidad de la fórmula general (I)
donde n es 1, 2 o 3; cada uno de a,
b y c en cada anillo de triazacicloalcano, independientemente uno
del otro e independientemente de cualquier otro anillo de
triazacicloalcano, es 1, 2 o 3; uno o ambos átomos de hidrógeno de
cada grupo-CH_{2} en cada anillo de
triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
puede opcionalmente e independientemente ser sustituido por un
sustituyente; el átomo de hidrógeno de cada grupo -NH- en cada
anillo de triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
puede opcionalmente ser sustituido por un sustituyente; donde n es
1, R es un grupo bifuncional, comprendiendo dicho grupo bifuncional
opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones
metálicos; cuando n es 2 o 3, R es un grupo funcional (n+1),
comprendiendo dicho grupo funcional (n+1) opcionalmente uno o más
átomos donantes de coordinación de iones metálicos; y X es un grupo
de
enlazadores/separadores.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un proceso para preparar un sustrato de polímero funcionalizado
como se ha descrito anteriormente, que incluye las fases de:
seleccionar un sustrato de polímero con un grupo funcional reactivo
capaz de experimentar una primera reacción con un primer grupo
funcional de un reactivo bifuncional que tenga un primer y un
segundo grupo funcional, dando como resultado dicha primera
reacción una formación de enlace covalente entre dicho sustrato de
polímero y dicho reactivo bifuncional, siendo dicho segundo grupo
funcional del reactivo resultante enlazado de manera covalente
posteriormente capaz de experimentar una segunda reacción con un
grupo reactivo funcional presente en una especie de la fórmula
general (II):
donde n, a, b, c y R son tal como
se ha definido anteriormente; uno o ambos átomos de hidrógeno de
cada grupo-CH_{2} en cada anillo de
triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano
pueden opcionalmente e independientemente ser sustituidos por un
sustituyente, comprendiendo dicho sustituyente opcionalmente uno o
más átomos donantes de coordinación de iones metálicos; el átomo de
hidrógeno de cada grupo -NH- en cada anillo de triazacicloalcano,
con la excepción de H*, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
puede opcionalmente ser sustituido por un sustituyente,
comprendiendo dicho sustituyente opcional opcionalmente uno o más
átomos donantes de coordinación de iones metálicos; dando como
resultado dicha segunda reacción una formación de enlace covalente
entre dicha especie de fórmula general (II) y dicho reactivo
enlazado de manera covalente; reaccionando dicho sustrato de
polímero con dicho reactivo bifuncional; y reaccionando dicho
reactivo resultante enlazado de manera covalente con dicha especie
de la fórmula general
(II).
Otro aspecto de la invención se refiere a un
sustrato de polímero funcionalizado obtenible por un proceso como
se ha descrito anteriormente.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a un
proceso para preparar un sustrato de polímero funcionalizado como
se ha descrito anteriormente y comprendiendo además un ión metálico
coordinado por lo menos por uno de los grupos de ligandos de
triazacicloalcano en dicha funcionalidad, el proceso comprendiendo
el contacto de un sustrato de polímero funcionalizado como se ha
descrito anteriormente con una solución acuosa de una sal inorgánica
u orgánica de dicho ión metálico.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
sustrato de polímero funcionalizado con ión metálico obtenible por
este proceso.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a un
método para la purificación de una proteína de interés, incluyendo
el método las fases de: contactar una muestra de proteína que
contiene un polipéptido comprendiendo dicha proteína de interés, y
que además contiene otras proteínas, siendo dicho polipéptido una
proteína de fusión que comprende dicha molécula de proteína de
interés fusionada en su término amino o término carboxi a por lo
menos un oligopéptido con histidina que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- HHHNSWDHD!NR
- (SEC. ID Nº. 1)
- HTNIHQDQHNHFHR
- (SEC. ID Nº. 2)
- HAMLDRAHDHGTR
- (SEC. ID Nº. 3)
- SLHEHHSGDNLR
- (SEC. ID Nº. 4)
- THYNAVHSHNTLQ
- (SEC. ID Nº. 5)
- DIHHWTDHLQSSTH
- (SEC. ID Nº. 6)
- LYNHYSHTAHVNHL
- (SEC. ID Nº. 7)
con un sustrato de polímero
funcionalizado conteniendo ión metálico como se ha descrito
anteriormente bajo condiciones donde dicho polipéptido se une a
dicho sustrato de polímero funcionalizado conteniendo ión metálico
para formar un complejo con éste; el lavado del complejo con una
solución tamponada para eliminar dichas otras proteínas; y la
elución del polipéptido enlazado del complejo
lavado.
Como ya se ha indicado arriba, un primer aspecto
de la invención se refiere a un sustrato de polímero funcionalizado
con un ión metálico que coordina la funcionalidad de la fórmula
general (I)
donde n es 1, 2 o 3; cada uno de a,
b y c en cada anillo de triazacicloalcano, independientemente uno
del otro e independientemente de cualquier otro anillo de
triazacicloalcano, es 1, 2 o 3; uno o ambos átomos de hidrógeno de
cada grupo-CH_{2} en cada anillo de
triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
puede opcionalmente e independientemente ser sustituido por un
sustituyente; el átomo de hidrógeno de cada grupo -NH- en cada
anillo de triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
puede opcionalmente ser sustituido por un sustituyente; donde n es
1, R es un grupo bifuncional, comprendiendo dicho grupo bifuncional
opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones
metálicos; donde n es 2 o 3, R es un grupo funcional-(n+1),
comprendiendo dicho grupo funcional-(n+1) opcionalmente uno o más
átomos donantes de coordinación de iones metálicos; y X es un grupo
de
enlazadores/separadores.
Los sustratos de polímero útiles en el contexto
de la invención incluyen tanto polímeros hidrosolubles como
polímeros sustancialmente insolubles en agua, y pueden ser
seleccionados de una gama muy amplia de materiales poliméricos.
Ejemplos de estos son los siguientes:
Polisacáridos y derivados de los mismos,
incluyendo agarosas, dextranos, celulosas, hemicelulosas,
almidones, xilanos y similares, y derivados de estos polisacáridos.
Los derivados adecuados de polisacáridos, en general, incluyen
derivados donde alguna proporción de los grupos hidroxi del
polisacárido en cuestión es derivatizado para formar éteres (p. ej.
éteres de alquilo inferiores, tales como éteres de metilo) o
ésteres (p. ej. ésteres de ácido carboxílico inferiores, tales como
acetato, propionato y similares), al igual que los materiales donde
el polisacárido de partida o un derivado del mismo ha sido
entrecruzado por tratamiento con un reactivo de entrecruzamiento
apropiado.
En términos generales, los sustratos de polímero
funcionalizados de la invención basados en polímeros
sustancialmente insolubles en agua son, por ejemplo, adecuados para
el empaquetamiento en columnas de cromatografía, para la
introducción directa en un medio (uso de forma discontinua) y
similares, y los polisacáridos que son particularmente adecuados
para este tipo de aplicación en el contexto de la invención
incluyendo agarosas, dextranos y derivados de los mismos, una
variedad de tipos adecuados que están fácilmente disponibles
comercialmente. Así, por ejemplo, una variedad de productos de
agarosa son producidos por Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia, y comercializados bajo el nombre de Sepharose^{TM}; los
grados disponibles incluyen Sepharose^{TM} 2B, 4B y 6B. Derivados
entrecruzados de estos varios grados de agarosa (preparados por
entrecruzamiento de Sepharose^{TM} con 2,3-d
ibromopropanol) están también disponibles de la misma empresa, y
son comercializados como Sepharose^{TM} CL-2B,
CL-4B y CL-6B, Sepharose^{TM} 4 y
6 Fast Flow, Sepharose^{TM} 6MB, y Superose^{TM} 6 y 12,
respectivamente.
Varios materiales compuestos basados en dextrano
o dextrano-agarosa adecuados para el uso en el
contexto de la presente invención están también disponibles de
Amersham Pharmacia Biotech bajo los nombres de Sephadex^{TM}
Superdex^{TM} (p. ej. Superdex^{TM} 30, 75 y 200) y
Sephacryl^{TM}. Los productos de la gama de Sephadex^{TM} son
preparados por dextrano entrecruzado con epiclorohidrina y están
disponibles en los siguientes grados: Sephadex^{TM}
G-10; G-15; G-25;
G-50; G-75; G-100;
G-150 y G-200, el grado disminuyendo
el grado de entrecruzamiento con el aumento del número G. Los
productos en la gama de Sephacryl^{TM} son preparados por
entrecruzamiento de alilo-dextrano con N,N'
metileno-bisacrilamida, e incluyen Sephacryl^{TM}
S-100; S-200; S-300;
S-400; S-500 y
S-1000; estos últimos seis productos difieren
respecto a su gama del tamaño de la distribución del tamaño de los
poros y del tamaño de las partículas. Los productos de la gama
Superdex^{TM} son preparados por entrecruzamiento de
alilo-dextrano con derivados de agarosa de varias
composiciones.
Los polialquilenglicoles y derivados de los
mismos, incluyendo, en particular, politilenglicoles (PEG), es
decir, polímeros de condensación de etileno glicol que tienen la
fórmula general
HOCH_{2}(CH_{2}OCH_{2})_{n}CH_{2}OH o
H(OCH_{2}
CH_{2})_{n}OH y normalmente tienen un promedio de pesos moleculares en la gama de 200 a 6000. Varios PEGs (incluyendo PEGs de peso molecular con un promedio de 400, 600, 1500, 4000 y 6000, respectivamente) están disponibles bajo varios nombres (p. ej. Macrogol^{TM}, PEG^{TM}, Carbowax^{TM}, Nycoline^{TM}, Pluracol E^{TM}, Poly-G^{TM}, Polyglycol E^{TM}, Solbase^{TM}) de una variedad de fuentes comerciales. Los PEGs son generalmente solubles en o mezclables con agua, al igual que en etanol y varios otros solventes orgánicos, incluyendo hidrocarburos aromáticos. Cuanto más análogos son los polipropilenglicoles [que tienen la fórmula general H(OC_{3}H_{6})_{n}OH], inferior es el peso molecular, siendo sus elementos solubles en agua, siendo también de relevancia en el contexto de la invención. Los derivados pertinentes de los polialquilenglicoles incluyen derivados parcialmente eterificados, p. ej. derivados donde uno de los grupos hidroxi terminales haya sido convertido en un grupo alquil éter inferior, tal como un grupo metil éter.
CH_{2})_{n}OH y normalmente tienen un promedio de pesos moleculares en la gama de 200 a 6000. Varios PEGs (incluyendo PEGs de peso molecular con un promedio de 400, 600, 1500, 4000 y 6000, respectivamente) están disponibles bajo varios nombres (p. ej. Macrogol^{TM}, PEG^{TM}, Carbowax^{TM}, Nycoline^{TM}, Pluracol E^{TM}, Poly-G^{TM}, Polyglycol E^{TM}, Solbase^{TM}) de una variedad de fuentes comerciales. Los PEGs son generalmente solubles en o mezclables con agua, al igual que en etanol y varios otros solventes orgánicos, incluyendo hidrocarburos aromáticos. Cuanto más análogos son los polipropilenglicoles [que tienen la fórmula general H(OC_{3}H_{6})_{n}OH], inferior es el peso molecular, siendo sus elementos solubles en agua, siendo también de relevancia en el contexto de la invención. Los derivados pertinentes de los polialquilenglicoles incluyen derivados parcialmente eterificados, p. ej. derivados donde uno de los grupos hidroxi terminales haya sido convertido en un grupo alquil éter inferior, tal como un grupo metil éter.
Tales polímeros pueden ser inmovilizados
fácilmente para soportar materiales, produciendo de este modo
sustratos que pueden ser activados posteriormente y después
funcionalizados o derivatizados con ligandos macrocíclicos quelantes
de enlace a iones metálicos por procedimientos según la presente
invención.
Polímeros de polivinilo, incluyendo
alcoholes de polivinilo -es decir, los polímeros hidroxílicos
normalmente producidos por hidrólisis ("alcohólisis") de
varias fracciones de peso molecular de acetato de polivinilo,
normalmente por hidrólisis de base o ácida- y derivados de los
mismos. El grado de "alcohólisis" puede ser variado bien
permitiendo la hidrólisis de grupos éster de acetato en acetato de
polivinilo para proceder a la finalización sustancial, o para
detenerlo en un grado deseado de la alcohólisis. Los alcoholes de
polivinilo están normalmente comercialmente disponibles en cuatro
gamas de peso molecular, es decir. aprox.
250.000-300.000 (denominada viscosidad superalta),
aprox. 170.000-aprox. 220.000 (denominada
viscosidad alta), aprox. 120.000-150.000 (denominada
viscosidad media) y aprox. 25.000-aprox. 35.000
(denominada viscosidad baja). En general, cuanto más bajo es el
peso molecular de los alcoholes de polivinilo, más alta es su
sensibilidad al agua o facilidad de hidrosolubilidad; no obstante,
el grado de alcohólisis también juega un papel respecto a la
hidrosolubilidad y otras propiedades de los alcoholes de
polivinilo. Los alcoholes de polivinilo dentro de las categorías
perfiladas arriba son de relevancia en el contexto de la presente
invención, como son, por ejemplo, los derivados de éter de los
mismos, tales como los derivados de metil
éter.
éter.
Otros materiales poliméricos de polivinilo de
interés incluyen materiales tales como la gama de partículas de gel
porosas esféricas semi-rígidas de HW
Toyopearl^{TM}, diseñadas para cromatografía líquida de presión
media y baja. Tales materiales, después de la activación y
funcionalización/derivatización, proporcionan otra opción para la
preparación de sorbentes de IMAC de relevancia en el contexto de la
invención. Los geles Toyopearl^{TM} HW (obtenibles de Tosoh Corp,
Yamaguchi, Japón, y otros proveedores) son sintetizados a partir de
polímeros vinilhidrofílicos que contienen exclusivamente átomos de
C, H y O. Los grados disponibles (que difieren respecto al tamaño
de las partículas y de los poros) incluyen Toyopearl^{TM}
HW-40; HW-40C,
HW-40F, HW-40S,
HW-50; HW- 50F, HW-50S, HW 55;
HW-55F, HW-55S,
HW-65F, HW 65S y HW 75F.
Poliacrilamidas y derivados de las
mismas, incluyendo materiales compuestos basados en
poliacrilamida y agarosa, tales como geles de AcA Ultrogel^{TM}
(gel compuesto de poliacrilamida-agarosa en forma de
pestaña, disponible de, p. ej., Amersham Pharmacia Biotech). La
gama de gel de Ultrogel^{TM} AcA incluye AcA 22, AcA 34, AcA 44 y
AcA 54, donde el número se refiere al porcentaje de acrilamida y
agarosa, es decir, AcA 22 contiene un 2% de acrilamida y un 2% de
agarosa. La activación de los grupos hidroxílicos de estos
materiales de soporte proporciona una avenida a la preparación de
los sorbentes de IMAC.
Los sílices de superficie modificada,
incluyendo los sílices porosos de
glicidilpropoxi-modificado, tales como
LiChroSpher^{TM} Diol (E. Merck, Darmstadt, Alemania),
Toyosoda^{TM} TSKSW3000 (Tosoh Corp., Yamaguchi, Japón); sílice
amino-propil-modificado, preparado
por reacción (en la presencia de un catalizador adecuado) de
aminopropildi-etoxisilano con sílices de tamaño de
poros apropiado y diámetro de promedio apropiado; y
mercapto-propilsílices, preparado por reacción (en
la presencia de un catalizador adecuado) de
mercaptopropildietoxisilano con sílices de tamaño de poro apropiado
y diámetros de promedio apropiado. De forma alternativa, el
dextrano modificado o sílices modificados de copolímero de
butadieno-vinilo de tamaño de poro apropiado y
diámetros de promedio apropiados pueden ser empleados como
materiales de soporte cromatográfico. Los sílices porosos
"desnudos" adecuados para este tipo de derivatización y
modificación posterior para generar los sorbentes nuevos
respectivos de IMAC pueden ser obtenidos fácilmente de una variedad
de proveedores, incluyendo E. Merck, (Darmstadt, Alemania), Tosoh
Corporación, Yamaguchi, Japón), Eka-Nobel AB
(Góteborg, Suecia) y Grace Davison GmbH (Worms, Alemania).
Óxidos metálicos de superficie
modificada, incluyendo las titanias alúminas o circonas porosas
modificadas por glicidilpropoxi, al igual que
modificaciones/variantes de las mismas basadas en el óxido metálico
respectivo "mezclado" con un segundo óxido metálico; titania,
alúmina o circona modificadas por aminopropilo, preparadas por
reacción (en la presencia de un catalizador adecuado) de
aminopropildietoxisilano con la circona, titania o alúmina de tamaño
de poros apropiado y diámetro de promedio apropiado; y circona,
titania o alúmina modificadas por mercaptopropilo, preparadas por
reacción (en la presencia de un catalizador adecuado) de
mercaptopropildietoxisilano con circona, titania o alúmina de
tamaño de poros apropiado y diámetro de promedio apropiado. De
forma alternativa, la titania, alúmina o circona modificadas por
dextrano o modificadas por copolímero de
butadieno-vinilo, de tamaño de poros apropiado y
diámetros de promedio apropiado pueden ser empleadas como materiales
de soporte cromatográfico. La circona, titania o alúmina porosas
"desnudas" adecuadas para este tipo de derivatización y
modificación posterior para generar los respectivos sorbentes
nuevos de IMAC pueden ser obtenidas fácilmente de una variedad de
proveedores, incluyendo YMC Co. Ltd. (Kyoto, Japón), Grace Gmbh
(Worms, Alemania) y BioSepra Corp. (París,
Francia).
Francia).
Los sustratos de polímero adecuados en el
contexto de la invención incluyen agarosas, dextranos y derivados
de los mismos, p. ej. materiales seleccionados entre estos
perfilados arriba.
En un aspecto de la invención, el sustituyente
opcional mencionado arriba que sustituye un átomo de hidrógeno en
un grupo -CH_{2}- en el anillo y/o un grupo -NH- en el anillo en
una funcionalidad de la Fórmula (I) tal como se ha definido
anteriormente es seleccionado de manera adecuada entre grupos
alquilo inferiores sustituidos opcionalmente y grupos arilo
sustituidos opcionalmente; ejemplos adicionales de sustituyentes
opcionales apropiados para substitución de un átomo de hidrógeno
en, en particular, un del grupo -CH_{2}- en el anillo en una
funcionalidad de la Fórmula (I) tal como se ha definido
anteriormente incluyen opcionalmente grupos alcoxi sustituidos
inferiores. El(los) sustituyente(s)
opcional(es) en el grupo alquilo inferior, los grupos alcoxi
inferiores o grupo arilo en cuestión pueden opcionalmente
comprender uno o más átomos donantes de coordinación de iones
metálicos, en particular uno o más átomos donantes de N, O o S.
En el caso de los grupos alquilo inferiores
(metilo, etilo, propilo, etc.) como sustituyentes opcionales que
reemplazan el átomo de hidrógeno de uno o más grupos -NH- en el
anillo, los sustituyentes que contienen O como consecuencia de la
posible relevancia con respecto a los iones metálicos que coordinan
las propiedades de la funcionalidad respecto a iones metálicos
determinados [sobre todo, iones metálicos "duros" o iones
metálicos de "dureza límite" (vide infra), tales como
Ca^{2+}, Mg^{2+}, Fe^{3+} o Zn^{2+}] incluyen
carboxi/carboxilato (-COOH/-COO^{-}, dependiente de pH), y
ejemplos de tales sustituyentes en un átomo N en el anillo son por
tanto grupos alquilo inferiores sustituidos por carboxi, en
particular carboximetilo (-CH_{2}OOOH) (más particularmente la
correspondiente forma desprotonada, es decir, -CH_{2}OOO^{-})
De forma similar, los grupos pertinentes que contienen N, que
pueden estar presentes como sustituyentes en grupos alquilo
inferiores fijados a uno o más átomos de N en el anillo incluyen
grupos alquilo inferiores sustituidos por amino, en particular
2-aminoetilo (-CH_{2}CH_{2}NH_{2}) o
3-aminopropilo
(-CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}).
Otros tipos pertinentes de sustituyentes
opcionales que pueden estar presentes como sustituyentes que
reemplazan el átomo de hidrógeno sobre uno o átomos N en el anillo,
y que pueden ellos mismos ser de relevancia respecto a las
propiedades de coordinación de los iones metálicos de la
funcionalidad respecto a determinados iones metálicos [sobre todo
iones metálicos "duros" o iones metálicos de "dureza
límite" (vide infra), tales como Ca^{2+}, Mg^{2+},
Fe^{3+} o Zn^{2+}], incluyen -PO_{3}H_{2}, (o una forma
desprotonada de los mismos, p. ej. -PO_{3}H^{-}).
El término "grupo alquilo inferior" como se
empleado en el contexto de la presente invención está destinado a
designar cualquier grupo alquilo lineal (cadena lineal), ramificado
o cíclico que tenga de 1 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de grupos
alquilo lineales son metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y
hexilo; ejemplos de grupos alquilo ramificados son isopropilo,
sec-butilo, terc-butilo, isopentilo
e isohexilo; ejemplos de grupos alquilo cíclicos son ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. En general, los grupos
alquilo inferiores que tienen de 1 a 3 átomos de carbono serán
adecuados en el contexto de la invención.
El término "grupo alcoxi inferior" como se
emplea en el contexto de la presente invención está destinado a
designar cualquier grupo alcoxi lineal, ramificado o cíclico que
tenga de 1 a 6 átomos de carbono. Ejemplos de grupos alcoxi
lineales son metoxi, etoxi propoxi, butoxi, pentoxi y hexoxi;
ejemplos de grupos alcoxi ramificados son isopropoxi,
sec-butoxi, tert-butoxi, isopentoxi
e isohexoxi; ejemplos de grupos alcoxi cíclicos son ciclopropiloxi,
ciclobutiloxi, ciclopentiloxi y ciclohexiloxi. En general los
grupos alcoxi inferiores con 1 a 3 átomos de carbono serán bien
adecuados en el contexto de la invención.
\newpage
En el contexto presente, el término "arilo"
está destinado a designar cualquier grupo aromático e incluye tanto
grupos carbocíclicos como heterocíclicos aromáticos. Ejemplos de
los mismos son fenilo, naftilo, piridilo, tetrazolilo, tiazolilo,
imidazolilo, indolilo, quinoleínilo, pirimidinilo, tiadiazolilo,
pirazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tienilo, furanilo o
oxadiazolilo. Sustituyentes adecuados opcionales en grupos arilo en
el contexto de la invención incluyen halógeno, amino, hidroxi,
alquilo inferior y alcoxi inferior.
El término "halógeno" designa F, Cl, Br o
I.
Los sustituyentes que son de relevancia como
sustituyentes opcionales en un grupo -CH_{2}- en el anillo y/o en
un grupo -NH- en el anillo en una funcionalidad de Fórmula (I) tal
como se ha definido anteriormente incluyen por tanto grupos
heterocíclicos aromáticos, que comprenden uno o más átomos N, O o S
en el anillo heterocíclico. Además de esto, otros sustituyentes que
son pertinentes como sustituyentes opcionales en un grupo
-CH_{2}- en el anillo y /o en un grupo -NH- en el anillo en una
funcionalidad de la Fórmula (I) tal y como se ha definido
anteriormente incluyen grupos saturados heterocíclicos que
comprenden uno o más átomos de N, O o S en el anillo heterocíclico;
los grupos N-heterocíclicos serán frecuentemente
bien adecuados. Ejemplos de grupos saturados heterocíclicos que son
pertinentes en este contexto incluyen 2-aziridilo, 2
y 3-azetidilo, 2 y 3-pirrolidilo,
2, 3 y 4-piperidilo y similares. Uno o más
sustituyentes, p. ej. el alquilo inferior, el alcoxi o halógeno
inferior tal y como se ha definido anteriormente, pueden
opcionalmente estar presentes en tales grupos saturados
heterocíclicos.
El término "átomo donante de coordinación de
iones metálicos" como se emplea en el contexto presente denota
un átomo, sobre todo un átomo de N, O o S, que sea capaz -como
presente en el grupo/sustituyente donde ocurre- de formar una unión
coordinativa (unión del complejo, unión de donante) a un ión
metálico que es de relevancia en el contexto de la presente
invención. Los iones metálicos de interés particular en el contexto
presente son iones metálicos "duros" "blandos" y
"límites" (varios iones metálicos de transición y determinados
iones metálicos de no transición) tal y como se define aquí
(vide infra).
El grupo X enlazador o separador en una
funcionalidad de la Fórmula (I) tal como se ha definido
anteriormente puede ser cualquier tipo adecuado de enlazador o
separador, pero normalmente será uno que pueda ser derivado de un
compuesto orgánico bifuncional (p. ej. un compuesto orgánico con al
menos dos grupos funcionales reactivos seleccionados de grupos
tales como carboxilo, tiol, aminopropilo, halógeno y epoxi) por
reacción con, por una parte, una funcionalidad reactiva apropiada
sobre el sustrato de polímero y, por otra parte, una funcionalidad
reactiva apropiada -normalmente un grupo amino o amino sustituido-
sobre un ión metálico cíclico que coordina el grupo de ligando. Un
tipo de grupo X enlazador o separador que es generalmente muy útil
en el contexto de la presente invención es uno que puede ser
derivado de epiclorohidrina por reacción del extremo halógeno del
mismo con, p. ej., un grupo hidroxi en la superficie del sustrato
de polímero en cuestión y después la reacción del grupo epoxi del
mismo con un grupo amino o amino sustituido en un grupo de ligandos
cíclico. Esto está ilustrado esquemáticamente en el Esquema 8 en el
Ejemplo 122 de la presente (vide infra).
En aspectos muy versátiles de la invención, el
sustrato de polímero en un sustrato de polímero funcionalizado de
la invención es una agarosa o derivado de agarosa (p. ej. un gel
Sepharose^{TM}), y el ión metálico que coordina la funcionalidad
es del tipo ilustrado por la Fórmula (I), arriba, que comprende de 2
a 4 anillos de triazacicloalcano (es decir, n es 1, 2 o 3), tal
como una funcionalidad comprendiendo 2 o 3 anillos de
triazacicloalcano. Cada anillo de triazacicloalcano de este tipo
puede de manera muy adecuada ser un grupo 1
triazaciclonon-1-il [es decir, que
deriva de 1,4,7-triazaciclononano (tacn)], es decir,
uno donde los parámetros a, b y c [véase la Fórmula (I)] tengan
cada uno un valor de 2.
Cuando la funcionalidad contiene dos tales
anillos de este tipo (es decir, n = 1), R es muy de manera adecuada
elegido entre los siguiente:
-[CH_{2}]_{m}-, donde m es 2, 3 o
4,
y derivados sustituidos de los
mismos; sustituyentes pertinentes opcionales incluyen estos ya
mencionados
arriba.
\newpage
Cuando la funcionalidad en cuestión contiene
tres anillos de este tipo (es decir, n = 2), R es de manera
adecuada un grupo del tipo:
o un sustituido derivado del mismo;
nuevamente, sustituyentes pertinentes opcionales incluyen estos ya
mencionados
arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando la funcionalidad en cuestión contiene
cuatro anillos de este tipo (es decir, n = 3), R es adecuadamente
un grupo del tipo:
o un derivado sustituido del mismo;
nuevamente, los sustituyentes pertinentes opcionales incluyen
aquellos ya mencionados
arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
El grupo X enlazador o separador es muy
adecuadamente un grupo derivable de epiclorohidrina por reacción
del mismo con el sustrato de polímero en forma de una agarosa o
derivado de agarosa, y posterior reacción del producto resultante
con un grupo -NH- en el anillo de ese anillo de triazacicloalcano
que se enlaza a X.
Como es evidente de la descripción presente, una
característica importante de los materiales (sustratos de polímero
funcionalizados) empleados según la invención para aislar y
purificar una proteína deseada (proteína de interés) es la
presencia, en el material, de un ión metálico que en si mismo es
enlazado coordinadamente a un grupo cíclico de ligandos (p. ej. un
grupo triazacicloalquilo tal como un grupo
1,4,7-triazaciclonon-1-il)
en la funcionalidad, y que a su vez es capaz de unirse
coordinadamente, y de manera adecuada selectivamente, a átomos
donantes en los residuos de aminoácidos de la parte de la
"etiqueta" del oligopéptido de una proteína de fusión donde la
"etiqueta" del oligopéptido es fijada a la secuencia de
aminoácidos de la proteína de interés. Otro aspecto de la invención
se refiere por tanto a un sustrato de polímero funcionalizado como
se ha descrito anteriormente, donde al menos uno de los grupos
cíclicos de ligandos en la funcionalidad tiene un ión metálico
coordinado con este. En general, los iones metálicos divalentes (2+
cargas positivas) y trivalentes (3+ cargas positivas) (incluyendo
tanto iones metálicos de no transición como iones metálicos de
transición), tales como iones metálicos elegidos entre Ca^{2+},
Mg^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+}, Ni^{2+}, Mn^{2+}, Co^{2+},
Fe^{3+}, Al^{3+} y Cr^{3+}, son bien adecuados en este
contexto. Según está documentado por los ejemplos de funcionamiento
proporcionados en la presente (vide infra), se ha
descubierto que Cu^{2+} es un ión metálico particularmente
versátil a este respecto.
Como ya se ha indicado brevemente, otro aspecto
de la invención se refiere a un proceso para preparar un sustrato
de polímero funcionalizado según la invención, comprendiendo el
proceso las fases de:
la selección de un sustrato de polímero con un
grupo funcional reactivo capaz de experimentar una primera reacción
con un primer grupo funcional de un reactivo bifuncional que tiene
un primer y un segundo grupo funcional, dando como resultado dicha
primera reacción la formación de un enlace covalente entre dicho
sustrato de polímero y dicho reactivo bifuncional, siendo dicho
segundo grupo funcional del reactivo resultante enlazado de manera
covalente posteriormente capaz de experimentar una segunda reacción
con un grupo reactivo funcional presente en una especies de la
fórmula general (II):
donde n, a, b, c y R son tal como
se ha definido anteriormente en relación con el sustrato de
polímero funcionalizado según la invención; uno o ambos átomos de
hidrógeno de cada grupo -CH_{2}- en cada anillo de
triazacicloalcano, independientemente uno del otro e
independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano,
pueden opcionalmente e independientemente ser sustituidos por un
sustituyente, comprendiendo dicho sustituyente opcional
opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones
metálicos; el átomo de hidrógeno de cada grupo -NH- en cada anillo
de triazacicloalcano, con la excepción de H*, independientemente
entre si e independientemente de cualquier otro anillo de
triazacicloalcano, puede opcionalmente ser sustituido por un
sustituyente, comprendiendo dicho sustituyente opcional
opcionalmente que uno o más átomos donantes de coordinación de
iones metálicos; dando como resultado dicha segunda reacción la
formación de enlace covalente entre dicha especie de la fórmula
general (II) y dicho reactivo enlazado de manera covalente;
reaccionando dicho sustrato de polímero con dicho reactivo
bifuncional; reaccionando dicho reactivo resultante enlazado de
manera covalente con dicha especie de la fórmula general
(II).
En relación con el último proceso según la
invención, el sustrato de polímero empleado, y el ión metálico
cíclico que coordina el grupo ligando en la especie reactiva
empleada en el proceso, pueden ser elegidos entre aquellos ya
mencionados anteriormente en relación con los sustratos de polímero
funcionalizados según la invención. El reactivo bifuncional empleado
será normalmente un compuesto orgánico bifuncional, p. ej. un
compuesto orgánico que tenga al menos dos grupos funcionales
reactivos elegidos entre grupos tales como carboxilo, tiol,
aminopropilo, halógeno y epoxi. La epiclorohidrina es
particularmente útil como un reactivo bifuncional para varios tipos
de sustrato de polímero, incluyendo polisacáridos y derivados de
los mismos con grupos hidróxilo de superficie.
Como será evidente de la discusión de arriba en
relación con los sustratos de polímero funcionalizados según la
invención, la especie reactiva que contiene el ión metálico cíclico
que coordina el grupo de ligandos será de manera adecuada aquella
que esté a la altura de una funcionalidad (en el producto resultante
de sustrato de polímero funcionalizado) del tipo mostrado en la
Fórmula (I) de arriba.
Sustituyentes opcionales en el contexto presente
pueden asimismo de manera adecuada ser elegidos entre aquellos ya
mencionados arriba en relación con las funcionalidades de la
Fórmula (I).
Como será también evidente de la discusión
precedente, las agarosas y derivados de la agarosa (tales como los
productos Sepharose^{TM} como se ha descrito anteriormente) son
bien adecuados como sustratos de polímero en el contexto del
proceso descrito anteriormente según la invención, particularmente
en combinación con una especie de la Fórmula (II). Un reactivo
bifuncional bien adecuado será entonces la epiclorohidrina, y puede
ser ventajoso a este respecto para incorporar además un agente
reductor, tal como borohidruro sódico, en la mezcla reactiva cuando
reaccione el sustrato de polímero con epiclorhidrina.
El objetivo de la presente invención comprende
además sustratos de polímero funcionalizado obtenidos u obtenibles
por un proceso como se ha descrito anteriormente para preparar un
sustrato de polímero funcionalizado.
Además, el objetivo de la presente invención
también comprende un proceso para preparar un sustrato de polímero
funcionalizado que está de acuerdo con la invención, y que además
comprende un ión metálico coordinado a al menos uno de los iones
metálicos cíclicos que coordinan los grupos allí dentro, el proceso
comprendiendo el contacto de un sustrato de polímero funcionalizado
según la invención con una solución acuosa de una sal inorgánica
[p. ej. un nitrato, haluro (fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro),
sulfato, perclorato, tetrafluoroborato, hexafluorofosfato o sal de
fosfato] o sal orgánica [p. ej. un carboxilato (tal como formato,
acetato, propanoato o benzoato), tetrafenilborato o sal de
sulfonato] del ión metálico en cuestión (p. ej. uno de los iones
metálicos ya mencionados arriba). Un sustrato de polímero
funcionalizado que contiene un ión metálico obtenido u obtenible
por tal proceso está también dentro del campo de la presente
invención.
A: Criterios para la selección de ligandos
macrociclicos que coordinan el ión metálico: como ya se ha
indicado arriba, una aplicación muy importante y valiosa de los
sustratos de polímero funcionalizado tal y como se define en el
contexto de la presente invención es el uso de una forma de
realización de la misma que contiene un ión metálico en la
purificación de una proteína, teniendo la proteína en cuestión la
forma de una proteína de fusión donde la proteína de interés está
fusionada en su término amino o carboxi a una "etiqueta" del
oligopéptido, sobre todo un oligopéptido con histidina según la
invención. Además, la fusión simultánea de dos moléculas de una
proteína o polipéptido de interés, o de forma alternativa dos
proteínas o polipéptidos diferentes de interés enlazados en su
término amino o carboxi, respectivamente, a una "etiqueta" del
oligopéptido, sobre todo un oligopéptido que contenga histidina
según la invención, genera una nueva estructura proteica de fusión
donde la "etiqueta" del oligopéptido está localizada en una
endo-posición (es decir, una posición interna) que
enlazando las dos moléculas de la(s) proteína(s) o
polipéptido(s)
de interés. Sobre la base de los resultados obtenidos en las investigaciones realizadas por los inventores en relación con la presente invención, los inventores creen -sin estar atados o limitados por ninguna teoría particulas- que los fenómenos subyacentes en este aspecto de la invención pueden ser considerados de manera adecuada como un "módulo molecular" permitiendo interacciones moleculares entre el complejo de ión metálico/ligando y la secuencia complementaria de oligopéptidos presente dentro de la proteína de fusión como una "etiqueta" del oligopéptido N-terminal, C-terminal o endo-situado, y dictados por las dimensiones moleculares y orientación facial del complejo de ión metálico/ligando y su duplicado de enlace de cognado dentro de la secuencia de la "etiqueta" del péptido. Así, resulta que los atributos y ventajas clave de los sistemas quelantes de ligandos de enlace de iones metálicos en sustratos de polímero funcionalizado de la invención respecto a todos los sistemas quelantes descritos previamente para la captura de proteínas recombinantes por medio de una "etiqueta" del péptido introducido pueden estar relacionados al menos con la siguiente lista no exclusiva de características:
de interés. Sobre la base de los resultados obtenidos en las investigaciones realizadas por los inventores en relación con la presente invención, los inventores creen -sin estar atados o limitados por ninguna teoría particulas- que los fenómenos subyacentes en este aspecto de la invención pueden ser considerados de manera adecuada como un "módulo molecular" permitiendo interacciones moleculares entre el complejo de ión metálico/ligando y la secuencia complementaria de oligopéptidos presente dentro de la proteína de fusión como una "etiqueta" del oligopéptido N-terminal, C-terminal o endo-situado, y dictados por las dimensiones moleculares y orientación facial del complejo de ión metálico/ligando y su duplicado de enlace de cognado dentro de la secuencia de la "etiqueta" del péptido. Así, resulta que los atributos y ventajas clave de los sistemas quelantes de ligandos de enlace de iones metálicos en sustratos de polímero funcionalizado de la invención respecto a todos los sistemas quelantes descritos previamente para la captura de proteínas recombinantes por medio de una "etiqueta" del péptido introducido pueden estar relacionados al menos con la siguiente lista no exclusiva de características:
(a) los sistemas de ligandos quelantes de la
presente invención tienen constantes de estabilidad mucho más altas
(es decir, constantes de unión a iones metálicos) que son
alcanzables con sistemas basados en ácido iminodiacético (IDA),
ácido nitrilotriacético (NTA) y ligandos similares; como resultado,
los efectos adversos/no deseables debido a la fuga de ión metálico
inducido por tampón o colocación en bandas de proteínas son
reducidos en gran parte.
(b) La geometría de coordinación del complejo
que contiene iones metálicos en los sustratos de polímero
funcionalizado de la invención que contiene iones metálicos es
diferente de la observada con, p. ej., los ligandos quelantes IDA o
NTA. Así, para los iones metálicos (M) de carga n+, las geometrías
de coordinación de M^{n+}-IDA o
M^{n+}-NTA para n = 2 son frecuentemente
octahédricas (véase Esquema 1, abajo).
Las geometrías de coordinación correspondientes
al bipiramidal distorsionado trigonal o piramidal cuadrado pueden,
no obstante, surgir también. Esto significa que los sistemas de
ligandos quelantes tipo IDA o NTA pueden comportarse como sistemas
quelantes libres, con la consecuencia de que la selectividad que
puede ser conseguida es limitada e imprevisible. Se puede mencionar
también que con dichos sistemas de ligandos quelantes, Cu^{2+}
favorece una geometría de 5 o 6, mientras que Ni^{2+} adopta
principalmente 6 estructuras coordinadas. Por el contrario, la
geometría de coordinación adoptada con, por ejemplo, los sistemas
de los ligandos M^{n+}-tacn,
M^{n+}-dtne/-dtnp y, por ejemplo, los sistemas de
los ligandos bis-, tris- y tetrakis(tacn) [cuya preparación
y uso están descritos en la Sección Experimental (vide
infra) y que son sistemas de ligandos muy útiles en el contexto
de la invención] con, p. ej., Cu^{2+} es principalmente el
piramidal cuadrado con todos los iones metálicos que coordinan los
átomos donantes en el ligando en el mismo plano y que ocupan una
cara triangular del poliedro de coordinación. Con otros ligandos
macrocíclicos, p. ej. ligandos con 2 átomos donantes de nitrógeno y
1 átomo donante de oxígeno (N_{2}O), ligandos con 2 átomos
donantes de nitrógeno y 1 átomo donante de azufre (N_{2}S), y
ligandos con 1 átomo donante de nitrógeno y 2 átomos donantes de
azufre (NS_{2}), se obtienen geometrías "triangulares"
similares. Además, son adoptadas geometrías similares por los
sistemas de los ligandos bis(tacn) (N6), tris(tacn)
(N9) y tetrakis(tacn) (N12). Como consecuencia, los sistemas
de ligandos cíclicos o macrocíclicos empleados en la presente
invención resultan en estructuras de coordinación forzadas y
previsibles que son muy bien adecuadas para el uso en sistemas
nuevos de Cromatografía de Afinidad por Iones Metálicos (IMAC), y
que dependen de la naturaleza del ión metálico, componentes de
disolución/tampón que pueden interactuar con el ión metálico, e
incluso de la naturaleza y orientación del residuo de aminoácidos
dentro de la secuencia de un péptido, pueden ser dadas razones para
selección de las estructuras preferidas de los marcadores de
péptidos (oligopéptidos).
Uno de los principios de guiado en el diseño y
selección de secuencias de "etiqueta" del oligopéptido para el
uso en el contexto de la invención fue tal que prácticamente todos
estos complejos de iones metálicos derivados de tacn-,
bis(tacn)-, tris(tacn)- y
tetrakis(tacn)/ligandos macrocíclicos y sus análogos
estructuralmente relacionados y derivados tienen una geometría
triangular para el sitio de coordinación, es decir, al ser
coordinados con iones metálicos, prácticamente todos estos ligandos
macrocíclicos ocupan una cara triangular en el poliedro de
coordinación del ión metálico. Esta característica notable ha sido
factorizada en la invención y aprovechada para conseguir
especificidades/selectividades más altas para la unión a las
"etiquetas" del oligopéptido (o para este caso a residuos de
aminoácidos en la secuencia peptídica de la proteína de interés) de
las que hasta ahora han sido realizables. Una vez reconocidas por
los inventores, estas razones estructurales fueron así un principio
importante en el desarrollo de la invención descrita aquí. Esta
diferencia fundamental entre los sistemas de ligandos cíclicos o
macrocíclicos de la presente invención y los sistemas de ligandos
empleados previamente con respecto a la disposición de los enlaces
de coordinación significa que en el caso de los complejos de
ligandos cíclicos/macrocíclicos el ión metálico está situado en una
cara "doblada" del ligando macrocíclico, conduciendo a un
enfoque unidireccional y orientación para una "etiqueta" de
oligopéptido entrante de una disposición proteica "etiquetada"
(proteína de fusión). Los ejemplos de tales diferencias importantes
en la organización estructural pueden ser ilustrados comparando la
disposición mostrada como Esquema 2 abajo (que ilustra la
disposición orientativa de un grupo entrante de imidazoil de un
residuo de histidina respecto a un ligando tacn
N-carboximetilado que contiene M^{n+}
inmovilizado) con el sistema IDA o NTA previamente usado.
Este ejemplo de tacn
N-carboximetilado subraya otras posibilidades para
controlar el número de sitios disponibles para la "etiqueta"
del oligopéptido entrante y también para ajustar la carga global
sobre el complejo metálico inmovilizado, suministrando de este modo
oportunidades adicionales para controlar las interacciones de
enlace. Estructuras análogas pueden ser generadas para otros
macrociclos monocíclicos tridentados que forman parte de la presente
invención, que además subraya el hecho de que la combinación
apropiada del diseño de los ligandos y los iones metálicos permite
el control sobre interacciones de enlace con la "etiqueta" del
oligopéptido entrante. Además, los complejos de iones metálicos
análogos derivados de tacn, bis(tacn), tris(tacn) y
tetrakis(tacn)/ligandos macrocíclicos y sus análogos
estructuralmente relacionados y los derivados que crean fracciones
de enlace pendientes, tales como carboximetilo, aminoetilo,
aminopropilo, etc., pueden ser empleados también en el caso de
ligandos macrocíclicos mononucleados donde dos sitios de
coordinación metálicos son utilizados para formar complejos
hidro-hidratados o hidrolíticos. Por ejemplo, el
Esquema 3 muestra el conjunto orientacional para un complejo
(inmovilizado) di-cobre(II) de un ligando
tipo bis(tacn) enlazado por un puente
o-xilenilo que ilustra la posibilidad adicional de
interacción de enlace entre los sistemas de
\pi-electrón del anillo de fenilo (en el puente
o-xilenilo) y el anillo de imidazolilo (como
presentes en un residuo de histidina) de una "etiqueta" del
oligopéptido o proteína de fusión. La introducción adicional de una
estructura pendiente (químicamente fijada a uno o más de los grupos
amino secundarios), tales como una fracción de
N-carboximetilo, N-aminoetilo,
N-aminopropilo etc., proporcionará análogos
adicionales estructurales que pueden sufrir la quelación de los
iones metálicos, dependiendo del estado de la carga del brazo
pendiente.
En el caso de los sistemas bis, la cuestión de
si el complejo existe en la forma "abierta" (como se ilustra
en el Esquema 3) o en la forma de "sándwich" (véase Esquema 6)
como se ha encontrado para algunos sistemas Ni^{2+}, tiene que
ser tenida también en cuenta. Estas características muy especiales
de los ligandos macrocíclicos de los tipos en cuestión
-particularmente los ligandos tipo bis, tris y tetrakis- llevan a
flexibilidad considerable en cuanto a (a) la geometría de enfoque
para una "etiqueta" del oligopéptido entrante (o para ese caso
unos residuos de aminoácidos accesibles de superficies de la
proteína de interés per se); (b) la influencia del pH, (c)
la selectividad con respecto al enlace de las "etiquetas" del
oligopéptido que tienen secuencias de aminoácidos diferentes
preferidas en cuanto a la interacción de los efectos de los
donantes de O y/o N, (d) las consecuencias de interacciones de
iones tampón altamente específicos y el número de unidades anulares
macrocíclicas implicadas. Todas estas últimas características
contribuyen a la inventiva e importancia de la nueva invención
presente, y no han sido demostradas a nuestro conocimiento para los
sistemas precedentes de la IMAC para el uso con proteínas de fusión
de la "etiqueta" del oligopéptido.
(c) Con todos los iones metálicos con carga 2+ y
3+ investigados hasta la fecha, es decir, Cu^{2+}, Ni^{2+},
Zn^{2+}, Ca^{2+}, Mn^{2+}, Cr^{3+} y Fe^{3+}, nuestros
estudios referentes a la selección de las condiciones de elución
(véase la Sección Experimental) han mostrado concluyentemente que,
cuando están disponibles, el enlace de coordinación (donación de
electrones) entre los grupos donantes de enlace de iones metálicos
en la proteína entrante (es decir, en la "etiqueta" del
oligopéptido y/o en la proteína per se) y los sitios de
coordinación rellenables sobre el ión metálico (p. ej. los sitios
de coordinación inicialmente ocupados por una molécula de agua
fácilmente desplazable, ión haluro o similar) en el complejo
inmovilizado de ión metálico/ligando macrocíclico es el mecanismo
de enlace dominante, a pesar del hecho de que complejo de
ión metálico/ligando macrocíclico lleva formalmente una carga
positiva fraccional (aunque el complejo es globalmente
electroneutro). Esto es evidente a partir del hecho de que la
desorción de la proteína enlazada requiere condiciones de tampón de
elución altamente selectivas. Por comparación con, por ejemplo, los
sistemas previamente empleados de la IMAC basada en IDA o NTA,
pueden ser empleadas condiciones de elución mucho más selectivas,
lo que es indicativo de diferentes afinidades de enlace (más
altas), con interacciones mediadas por medio de efectos de enlace
cooperativos que implican más de un residuo de aminoácidos dentro de
la estructura de la "etiqueta" del oligopéptido. Así, fue muy
sorprendente observar un comportamiento de elución mucho más
favorable en términos de dependencia de la fuerza iónica y
dependencia del pH en comparación con los ligandos quelantes libres
previamente empleados tipo IDA o NTA. Como se ha notado en la
captura para el Esquema 3, con los sistemas bis (y también con los
sistemas tris y tetrakis), existe la posibilidad de interacción
simultánea de dos (o más) grupos donantes a partir de dos (o más)
residuos de aminoácidos diferencialmente visualizados accesibles en
las superficies dentro de una proteína con la clase presente de
ligandos de la IMAC. No obstante, para conseguir una interacción
óptima, el suministro de residuos de aminoácidos adecuados
apropiadamente separados dentro de la secuencia de la
"etiqueta" del oligopéptido es la opción preferida, puesto que
en este caso las secuencias de aminoácidos que resultan en una gama
deseada de afinidades pueden ser sintonizadas finamente respecto a
la interacción respectiva entre el ión metálico quelado y la
"etiqueta" específica del oligopéptido en cuestión. La
explotación de este concepto de grupos donantes separados de forma
orientativa dentro de las cadenas laterales de los residuos de
aminoácidos de la "etiqueta" del oligopéptido ha sido una de
las consideraciones subyacentes en el diseño y selección de modelos
preferidos de las secuencias de aminoácidos para las
"etiquetas" específicas de oligopéptidos que constituyen un
aspecto de la presente invención (véanse también las secciones B y
D, abajo)
Para la conveniencia y la simplicidad de la
presentación puede ser considerado este enfoque para formar un
sistema de casete molecular, donde tanto el sistema de iones
metálicos inmovilizados/ligandos y las propiedades de la secuencia
de aminoácidos confeccionada de la "etiqueta" del oligopéptido
forman un sistema de "pinzas moleculares" con los sitios de
enlace dentro del sistema de iones metálicos inmovilizados/ligandos
separados en las distancias atómicas correctas para permitir el
reconocimiento correcto de la secuencia cognada dentro de la
"etiqueta" del
oligopéptido.
oligopéptido.
(d) Como resultado de la adopción de una
estructura de coordinación "doblada" triangular orientada
facialmente, que ha demostrado ser una característica distintiva
para los iones M^{n+} cuando se enlazan al tipo presente de
ligando macrocíclico quelante, un comportamiento hidrolítico
diferente de aquel visto en los ligandos quelantes tipo IDA o NTA
con iones metálicos de "dureza" límite, p. ej. Cu^{2+} o con
iones metálicos "duros", p. ej. Fe^{3+}, es expuesto por
complejos macrocíclicos del tipo presente. Debería ser notado aquí
que el significado de los términos "duro", "dureza" y
"blando" según se emplea en la presente descripción en
relación con los iones metálicos es aquel según R.G. Pearson (véase,
p. ej., S.F.A. Kettle, Coordination Chemistry, Thomas Nelson and
Sons Ltd., 1969, págs. 48-49). En un extremo de la
escala los iones metálicos "duros" son aquellos que son
paralelos al protón respecto a su fijación a los ligandos, son
pequeños, son frecuentemente de carga alta, y que carecen de
electrones de la capa de valencia que sean fácilmente
distorsionados o eliminados; los iones metálicos duros incluyen, p.
ej., Ca^{2+}, Mg^{2+}, Mn^{2+}, Cr^{3+} y Fe^{3+}. En el
otro extremo de la escala los iones metálicos "blandos" son
grandes, de carga baja o tienen electrones de capa de valencia que
son fácilmente distorsionados o eliminados; los iones metálicos
blandos incluyen, p. ej., Cu^{+}, Ag^{+} y Cd^{2+}. Los iones
metálicos cuyas propiedades los posicionan en el límite entre duros
y blandos -es decir, son de dureza límite- incluyen, p. ej.,
Zn^{2+}, Fe^{2+}, Co^{2+}, Ni^{2+} y Cu^{2+}.
Esto significa que las dependencias del pH y de
la sal de los sistemas presentes de la IMAC son diferentes de
aquellas de los sistemas empleados previamente, y que la influencia
de la presencia de cualquier solvente(s) orgánico(s),
p. ej. etanol o acetonitrilo, en los tampones de carga o de elución
es también diferente. Además, los tipos de geometrías de
coordinación que los sistemas presentes de la IMAC pueden adoptar
son diferentes de aquellos encontrados para los sistemas menos
forzados de la IMAC tipo IDA o NTA. Estas características, tal y
como se ilustran para ejemplos de complejos de ligandos
bis(tacn) binucleares de estructura abierta Cu^{2+} y
Ni^{2+} en el Esquema 4, para estructuras mononucleares no
sándwich para Cu^{2+} y Ni^{2+} en el Esquema 5, y para
complejos sándwich mononucleares Cu^{2+} y Ni^{2+} de los
ligandos tacn y bis(tacn) en el Esquema 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Diferentes características de relevancia en la
presente invención pueden ser notadas. En primer lugar, las
geometrías de coordinación de los ligandos macrocíclicos presentes
inmovilizados quelantes resultan en modelos diferentes de efectos
esteri-electrónicos, y esto conduce a regímenes de
afinidad diferentes en términos de constantes de enlace de iones
metálicos. En segundo lugar, como es evidente de los Esquemas
4-6, la inmovilización de los complejos quelantes de
los iones metálicos para la estructura abierta mononuclear y
binuclear, las estructuras no sándwich y sándwich suponen
adsorbentes de propiedades fundamentalmente diferentes, con la
balanza de reconocimiento molecular desplazándose desde una
interacción puramente tipo coordinación a una interacción puramente
tipo intercambio aniónico, dependiendo -en particular- de la
naturaleza del ión metálico, la estructura química del ligando
quelante, las propiedades estéricas y conformacionales del grupo de
conexión R en las estructuras bis (así como las estructuras tris y
tetrakis), y la composición del solvente. Debería ser notado que el
control sobre la formación de las estructuras sándwich y no sándwich
puede ser conseguido por funcionalización de los macrociclos en un
grupo amino secundario con grupos de no coordinación. Todas estas
características tendrán impacto en la capacidad de estos sistemas de
IMAC para reconocer con afinidad alta los atributos de la secuencia
de las "etiquetas" del oligopéptido. De hecho, las
características del grupo de conexión R dictan varios aspectos
clave de estos sistemas nuevos de IMAC, incluyendo la distancia
molecular entre los centros de enlace de iones metálicos, el acceso
facial de los sitios de coordinación para la interacción entre los
centros de enlace de iones metálicos, la accesibilidad facial de
los sitios de coordinación para interacción con los residuos
específicos de aminoácidos en la secuencia de la "etiqueta" del
oligopéptido, la polarizabilidad y potencial
solvacional de estos centros, y las energías de enlace respectivas, y por tanto, afinidades, para estas interacciones
solvacional de estos centros, y las energías de enlace respectivas, y por tanto, afinidades, para estas interacciones
(e) Muchos de los complejos de iones metálicos
inmovilizados/macrociclos son coloreados, siendo las
características de sus espectros de absorción visibles bajo
ultravioletas distintivos para el ión metálico coordinado
particular; por lo tanto, los fenómenos de enlace proteínico al
igual que el estado/condición general de las columnas embaladas que
contienen el adsorbente inmovilizado pueden ser visualizadas
mejor.
(f) Una característica atractiva de los
conjuntos de la familia de los ligandos macrocíclicos presentes en
su relatividad "combinatoria" en cuanto a las vías para su
síntesis, así como en cuanto a sus propiedades de enlace
(funcional). Estas características traen como resultado la
disponibilidad de una gama de selectividades diferentes que pueden
ser generadas esencialmente sobre la base de los mismos tipos de
sistemas y químicas. Este tipo de oportunidad sintética no está
disponible con los sistemas conocidos tipo IDA y NTA y
similares.
(g) Como resultado de las diferentes
dependencias de pH, manifestadas por varios complejos de iones
metálicos inmovilizados/ligandos macrocíclicos quelantes, el uso de
iones metálicos diferentes con un ligando macrocíclico dado puede
generar selectividades nuevas que se refieren a los efectos de la
electronegatividad, de las geometrías vacantes
d-orbitales y del empaquetamiento del ión metálico;
así, el comportamiento de Cu^{2+} difiere del de Ni^{2+}, que a
su vez difiere del de Zn^{2+}, etc., de una manera sorprendente
[como está demostrado por numerosos ejemplos de funcionamiento aquí
(vide infra)].
(h) Como se ha mencionado anteriormente, las
características topológicas de los ligandos presentes
bis(macrociclos) (así como aquellas de los sistemas tris y
tetrakis) pueden ser "afinadas finamente" en cuanto a, por
ejemplo, su hidrofobicidad, las características
esteri-electrónicas, la distancia entre los centros
de enlace de iones metálicos, la carga intrínseca, la propensión
acusada para el ensamblaje supra-molecular, las
constantes de enlace de iones metálicos, o preferencias para iones
tampón diferentes o especies solvacionales diferentes de una forma
que no puede ser conseguida con los sistemas conocidos tipo IDA o
NTA o con sistemas basados en
N,N,N'-tris(carboximetil)etilenediamina
(TED) o con tipos relacionados de sistemas quelantes libres. A este
respecto, y como se ilustra por los ejemplos de funcionamiento
presentes (vide infra), es evidente que estas propiedades
pueden ser aprovechadas para conseguir una purificación muy
satisfactoria de proteínas/polipéptidos (nativos) "no
etiquetados" en muchos casos por elección juiciosa del ión
metálico, el sistema de ligando macrocíclico (p. ej. el sistema
bis, tris o tetrakis como se describe aquí) y condiciones (medio de
elución, pH etc.). Además, las propiedades en cuestión de
selectividad y enlace de los sistemas sorbentes de iones
metálicos/ligandos según la invención pueden producir el
seccionamiento de una "etiqueta" de una proteína de fusión
in situ en el sistema sorbente al que se enlaza (mejor que
en la solución después de la elución/purificación) tanto de forma
realizable como ventajosa.
(i) Las vías a la síntesis de los ligandos
presentes tipo mono, bis, tris y tetrakis son diferentes de
aquellas empleadas para los sistemas convencionales libres IDA,
NTA, etc., y las variantes de los tipos presentes de ligandos con
brazos pendientes que comprenden átomos donantes adicionales, p.
ej. variantes sustituidas por N-carboximetilo,
pueden ser preparadas fácilmente por síntesis combinatoria; así,
diferentes tipos de separadores (es decir, grupos de cadena lateral
que enlazan el ligando quelante macrocíclico al material de soporte,
o de forma alternativa -en el caso de los sistemas
bis(tacn), tris(tacn) y tetrakis(tacn)-
interponiendo fracciones estructurales que controlan la distancia
entre los iones metálicos en los complejos quelantes), geometrías de
ligandos diferentes al igual que densidades de ligandos diferentes
pueden, en principio, ser conseguidas. Así, además de la capacidad
para introducir diferentes tipos de separadores entre los
compartimentos macrocíclicos de los ligandos, el control de las
propiedades de coordinación de los ligandos puede ser conseguido
por funcionalización de los grupos secundarios de amina sobre los
macrociclos bien con grupos de coordinación o con grupos de no
coordinación
(j) Las mismas estructuras "nucleares"
pueden ser hechas con 3 átomos donantes de nitrógeno, es decir,
como ligandos N3 (N6 para los ligandos bis, N9 para los tris y N12
para los tetrakis), o como ligandos análogos N_{2}O, N_{2}S,
O_{2}N o S_{2}N (con múltiples apropiados de los mismos para
los ligandos correspondientes bis, tris y tetrakis). Debería ser
mencionado aquí que homólogos más altos (pentakis-, hexakis-,
heptakis- ....etc) de ligandos del tipo empleado en el contexto de
la presente invención son también realizables y de relevancia en
relación con la presente invención.
(k) Como ya se ha indicado en la sección (I),
arriba, el ligando "nuclear" inmovilizado macrocíclico puede
ser fácilmente derivatizado químicamente para introducir uno o más
sustituyentes pendientes que contengan un átomo donante; así,
pueden ser generadas diferentes clases de adsorbentes de IMAC,
nuevamente con propiedades que difieren respecto a la selectividad.
Tales sistemas -que contienen, p. ej., un grupo carboximetilo
pendiente- están dentro del campo de la invención y son
considerados como de valor, por ejemplo, como sistemas de IMAC
específicos de Ca^{2+}. Los tipos correspondientes de los sistemas
de ligandos con dichos sustituyentes pendientes no pueden ser
generados de una manera análoga a partir de IDA, NTA y otras clases
libres de sistemas quelantes.
B: Secuencia preferida y disposición
estructural de las etiquetas del péptido en relación con los
ligandos quelantes de iones metálicos macrocíclicos empleados en el
contexto de la invención: como se pela en la sección A arriba,
varios criterios objetivos fueron empleados para seleccionar
secuencias de aminoácidos adecuadas de una base de datos generada
por ordenador para la construcción de las "etiquetas" del
oligopéptido apropiadas. Diferentes características comunes o
genéricas de estas "etiquetas" del oligopéptido se distinguen
de otras clases de "etiquetas" del oligopéptido conocidas en
cuanto a la composición o estructura. Estas características comunes
o genéricas pueden ser resumidas como sigue:
(a) una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde un residuo de aminoácido acídico (tal como un
residuo de ácido aspártico o un residuo de ácido glutámico) está
localizado en una posición i \rightarrow i+1,
i \rightarrow i+2, i \rightarrow i+3
o i \rightarrow
i+4 con respecto a un residuo de histidina (u otro residuo donante de N apropiado) cuyo número de secuencia en la secuencia de aminoácidos de la "etiqueta" del oligopéptido es i, con la distancia de los átomos en la molécula entre la fracción de cadena lateral del residuo de aminoácido acídico en cuestión y el residuo de histidina (es decir, la distancia de promedio entre el residuo de aminoácido acídico y el residuo de histidina) correspondiendo o siendo similar a las distancias atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente tipo.
i+4 con respecto a un residuo de histidina (u otro residuo donante de N apropiado) cuyo número de secuencia en la secuencia de aminoácidos de la "etiqueta" del oligopéptido es i, con la distancia de los átomos en la molécula entre la fracción de cadena lateral del residuo de aminoácido acídico en cuestión y el residuo de histidina (es decir, la distancia de promedio entre el residuo de aminoácido acídico y el residuo de histidina) correspondiendo o siendo similar a las distancias atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente tipo.
(b) una disposición de secuencia de aminoácidos
donde un residuo de histidina está localizado en una posición de la
secuencia i \rightarrow i+1, i \rightarrow
i+2, i \rightarrow i+3 o i
\rightarrow i+4 con respecto a otro residuo de histidina
(u otro residuo donante de N apropiado), con las distancias
atómicas entre las fracciones de la cadena lateral de los dos
residuos de histidina correspondiendo o siendo similares a las
distancias atómicas que separan los sitios de enlace disponibles
dentro de un complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del
presente tipo.
(c) una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde un residuo de aminoácido no polar o neutro (tal
como un residuo de alanina, leucina, serina, treonina, asparagina o
glutamina) está localizado en una posición de la secuencia
i \rightarrow i+1, i \rightarrow i+2, i \rightarrow i+3 o i \rightarrow i+4 con respecto a otro residuo de histidina, con las distancias atómicas entre la fracción de la cadena lateral del residuo de aminoácido no polar o neutro en cuestión y el residuo de histidina correspondiendo o siendo similar a las distancias atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente tipo.
i \rightarrow i+1, i \rightarrow i+2, i \rightarrow i+3 o i \rightarrow i+4 con respecto a otro residuo de histidina, con las distancias atómicas entre la fracción de la cadena lateral del residuo de aminoácido no polar o neutro en cuestión y el residuo de histidina correspondiendo o siendo similar a las distancias atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente tipo.
(d) Una disposición de secuencia de aminoácidos
donde el primer, tercer, quinto, séptimo, noveno, ...(etc) residuo
de aminoácido es preferiblemente un residuo de histidina o un
residuo de aminoácido polar (tal como un residuo de serina, treonina
o tirosina), a condición de que la disposición de los residuos de
aminoácidos resulte en distancias atómicas entre las fracciones de
la cadena lateral del primer y tercer, y/o tercer y quinto, y/o
quinto y séptimo, y/o séptimo y noveno, ...(etc) residuos de
aminoácidos que corresponden o son similares a la separación de las
distancias atómicas los sitios de enlace disponibles dentro de un
complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente
tipo.
(e) Una disposición de secuencia de aminoácidos
donde el segundo, cuarto, sexto octavo, ...(etc) residuo de
aminoácido es preferiblemente un residuo de aminoácido ionizable o
polar (tal como un residuo de arginina, lisina, histidina o
tirosina) o un residuo de aminoácido no polar (tal como un residuo
de leucina, alanina, valina, fenilalanina, asparagina o glutamina),
a condición de que la disposición de los residuos de aminoácidos
resulte en las distancias atómicas entre las fracciones de la
cadena lateral del segundo y cuarto, y/o cuarto y sexto, y/o sexto
y octavo, y/o octavo y décimo, ...(etc) residuos de aminoácidos que
corresponden o son similares a la separación de las distancias
atómicas de los sitios de enlace disponibles dentro de un complejo
de ión metálico/ligando macrocíclico del presente tipo.
(f) Una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde el residuo de aminoácido
C-terminal es preferiblemente un residuo de
histidina o arginina o un residuo de aminoácido no polar (tal como
un residuo de leucina, asparagina o glutamina), a condición de que
la disposición de los residuos de aminoácidos resulte en distancias
atómicas entre las fracciones de cadena lateral de al menos dos de
los residuos de aminoácidos, preferiblemente el primer y tercer, y/o
tercer y quinto, y/o quinto y séptimo, y/o séptimo y noveno,
...(etc) residuos de aminoácidos, que corresponden o son similares
a las distancias atómicas que separan los sitios de enlace
disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando
macrocíclico del presente tipo.
(g) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido donde la posición
N-terminal del oligopéptido no es biosintéticamente
acetilada o acilada.
(h) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido por la cual el momento hidrofóbico
(3) [calculado y definido según Nozaki y Tanford (J. Biol. Chem.
238 (1963) 4074-4081; ibid 245 (1970)
1648-1652) y Eisenberg, D., Weiss, R.M. y
Terwilliger, T. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984)
140-144)] de la "etiqueta" del oligopéptido es
tal que 1 \leq \Im \leq 25, y el cambio global en
hidrofobicidad [calculado según Richards, F.M. (Annual Reviews of
Biophysics and Bioengineering 6 (1977) 151-176 ) y
Wilce, M.C.J., Aguilar, M.I. and Hearn, M.T.W. (Anal. Chem. 67
(1995) 1210-1219)] de la proteína de fusión
recombinante (proteína huésped con la "etiqueta" del
oligopéptido) no es superior a 0.3.
(i) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido por el cual la aportación global
de la secuencia de la "etiqueta" del oligopéptido hasta valor
del punto isoeléctrico (pI) para la proteína de fusión recombinante
no es superior a 0.5 cuando en comparación con el valor para la
proteína huésped (proteína de interés) tipo salvaje (no etiquetada)
correspondiente.
(j) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido que lleva una carga neta
(q) a pH 7.0 en el rango 1.55 \leq q \leq 1.0.
(k) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido donde el punto isoeléctrico (pI)
del oligopéptido está dentro del rango 5.8 \leqpI\leq8.5.
(l) Una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido donde -en solución libre o bajo
condiciones electroforéticas capilares zonales- el oligopéptido
muestra una afinidad para iones metálicos blandos, limítrofes o
duros con un constante de afinidad (K_{asoc}) en el rango de 100
nM \leqK_{asoc} \leq100 mM a un pH cerca de 7.0 y una fuerza
iónica (I) de \leq 50 mM.
(m) una secuencia de aminoácidos para la
"etiqueta" del oligopéptido por la cual, a una concentración
molar de \leq 300 \muM en suero salino tamponado con fosfato a
pH 7.0, el oligopéptido no forma una estructura superenrollada.
En un nivel más específico, si -como en un
aspecto muy útil de la invención- es preciso o importante poder
dividir la "etiqueta" del oligopéptido en cuestión de la
proteína de fusión por el uso de una aminopeptidasa (mejor que
emplear una endopeptidasa o proteasa, tal como enteroquinasa o
Factor IXa, o de forma alternativa un procedimiento químico basado
en el uso de, p. ej., bromuro cianógeno, hidroxilamina,
N-bromosuccinimida, ácido yodosobenzoico,
3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilsulfenil)-indolenina-escatol
u otro reactivo químico adecuado), luego aminopeptidasas adecuadas
incluyen una dipeptidil aminopeptidasa, tal como
DAP-1 (también conocida como
dipeptidil-peptidasa C o DPP I; E.C. 3.4.14.1.
Obtenible de, p. ej., Aldrich-Sigma, St Louis, MO,
E.E.U.U. o Unizyme Laboratories, Hørsholm, Dinamarca), donde las
propiedades deseables para una tal "etiqueta" para la
expresión de la proteína recombinante en E. coli y otros
sistemas/células huéspedes de expresión de células procarióticas
apropiados parecen satisfacer los criterios siguientes:
(n) Una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde el primer, tercer, quinto, séptimo,
noveno,...(etc) residuo de aminoácido no es un residuo de prolina,
arginina o lisina, a condición de que la disposición de los residuos
de aminoácidos resulte en distancias atómicas entre las fracciones
de la cadena lateral del primer y tercer, y/o tercer y quinto, y/o
quinto y séptimo, y/o séptimo y noveno, ...(etc) residuos de
aminoácidos que corresponden o son similares a las distancias
atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un
complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del presente
tipo.
(o) Una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde el segundo, cuarto, sexto, octavo,...(etc)
residuo de aminoácido no es un residuo de prolina, a condición de
que la disposición de los residuos de aminoácidos resulte en
distancias atómicas entre las fracciones de la cadena lateral del
segundo y cuarto, y/o cuarto y sexto y/o sexto y octavo y/o octavo
y décimo, ...(etc) residuos de aminoácidos que corresponden o son
similares a las distancias atómicas que separan los sitios de
enlace disponibles dentro de un complejo de ión metálico/ligando
macrocíclico del presente
tipo.
tipo.
\newpage
Adicionalmente, si -como en otro aspecto de la
invención- puede ser posible dividir la "etiqueta" del
oligopéptido en cuestión de la proteína de fusión por el uso de una
endopeptidasa, criterios apropiados para una tal "etiqueta"
incluyen los siguientes:
(p) Unión de la secuencia de aminoácidos de la
"etiqueta" del oligopéptido a la secuencia de aminoácidos de
la proteína de interés por medio de una secuencia de aminoácidos
corta que contiene un motivo de seccionamiento para una
endopeptidasa, p. ej. una endopeptidasa tal como factor IIa, Factor
Xa, enteroquinasa, estreptoquinasa, trombina, furina o Kex (tal
como Kex1 o Kex2). Además, si -como en un aspecto adicional de la
invención- puede ser posible dividir la "etiqueta" del
oligopéptido en cuestión de la proteína de fusión mediante una
reacción química, criterios apropiados para una tal "etiqueta"
incluyen el siguiente:
(q) Unión de la secuencia de aminoácidos de la
"etiqueta" del oligopéptido a la secuencia de aminoácidos de
la proteína de interés por medio de una secuencia de aminoácidos
corta que contiene un motivo de seccionamiento para un reactivo
químico, p. ej. un reactivo tal como hidroxilamina, bromuro de
cianógeno, N-bromosuccinimida, ácido yodosobenzoico,
3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilsulfenil)-indolenina-escatol
u otro reactivo químico adecuado.
Además, si -como en otro aspecto ulterior de la
invención- puede ser posible dividir la "etiqueta" del
oligopéptido en cuestión de la proteína de fusión mediante
reacciones pseudoenzimáticas de autoseccionamiento/autoeliminación
de intrones, tales como el uso de redisposición de autoligación con
aciltiol, los criterios apropiados para una tal "etiqueta"
incluirán el siguiente:
(r) Unión de la secuencia de aminoácidos de la
"etiqueta" del oligopéptido a la secuencia de aminoácidos de
la proteína de interés por medio de una secuencia de aminoácidos
que contiene un dominio de inteina de autoseccionamiento para
separaciones de afinidad (véase, p. ej., Wood, D.W., Derbyshire, V.,
Wu, W, Chartrain, M, Belfort, M. and Belfort, G. Biotechnology
Progress, 16 (2000) 1055-1063; Wood, D.W., Wu, W,
Belfort, G., Derbyshire, V. and Belfort, M. Nature Biotechnology,
17 (1999) 889-892).
En el caso de sistemas de expresión
eucarióticos, p. ej. células mamíferas, tales como células de
ovario de hámster chino (CHO), células Sf 9 de insecto
transfectadas con baculovirus de Spodoptera furgiperda, o
varias células de levadura importantes comercialmente (incluyendo
Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), usadas
para la producción de proteínas recombinantes, es posible emplear
con estos sistemas una secuencia de la "etiqueta" del
oligopéptido
con:
con:
(s) Una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde el primer residuo de aminoácidos es un residuo de
prolina, a condición de que la disposición de otros residuos de
aminoácidos en la "etiqueta" del oligopéptido resulte en
distancias atómicas entre las fracciones de la cadena lateral del
primer y tercer, y/o tercer y quinto, y/o quinto y séptimo, y/o
séptimo y noveno, ...(etc) residuos de aminoácidos, o el segundo y
cuarto, y/o cuarto y sexto, y/o sexto y octavo, ...(etc) residuos
de aminoácidos, que corresponden o son similares a las distancias
atómicas que separan los sitios de enlace disponibles dentro de un
complejo de ión metálico/ligando macrocíclico del tipo
presente;
(t) una disposición de la secuencia de
aminoácidos donde el segundo y todos los residuos de aminoácidos
ulteriores no son un residuo de prolina (en aquellos casos donde
seccionamiento enzimático que implica una aminopeptidasa tal como
DAP-1 representa la metodología preferida para la
eliminación de la "etiqueta" del oligopéptido).
Las "etiquetas" del oligopéptido muestran o
una o más de las características anteriores [(a) a (t)] están
dentro del campo de la presente invención.
C: El posicionamiento de la etiqueta del
péptido: utilizando enfoques y técnicas moleculares biológicos
bien conocidos, preferiblemente basadas en procedimientos de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la introducción de una
"etiqueta" del oligopéptido según la invención en una proteína
de interés es alcanzable en el amino terminal, en el carboxi
terminal o en (endo) posiciones internas. Como consecuencia, la
implementación de la "etiqueta" del oligopéptido localizado en
C-terminal además permite los procedimientos de IMAC
descritos que se deben emplear con los presentes sistemas de
ligandos quelantes macrocíclicos. Además, la "etiqueta" del
oligopéptido, sobre todo un oligopéptido con histidina según la
invención, puede ser simultáneamente fusionado a dos moléculas de
la proteína o polipéptido de interés, o de forma alternativa a dos
proteínas diferentes o polipéptidos de interés, en su término amino
o carboxi, respectivamente, de ese modo formando una nueva
estructura de proteína de fusión por la cual la "etiqueta" del
oligopéptido está localizada en una endo-posición
(es decir, en una posición interna) enlazando las dos moléculas de
las proteína(s) o polipéptido(s) de interés. Como se
describe en ejemplos de funcionamiento presentados aquí (véase la
sección experimental), se ha descubierto que las proteínas
recombinantes "etiquetadas" con oligopéptidos en
C-terminal pueden ser muy eficazmente capturadas por
los nuevos sistemas de IMAC y purificadas selectivamente. Para la
eliminación ulterior de una "etiqueta" del oligopéptido
localizada en la posición C-terminal de una proteína
recombinante, una carboxipeptidasa específica puede ser empleada, o
un único sitio de seccionamiento químico debe ser introducido en la
unión del residuo C-terminal de la proteína huésped
y el residuo N-terminal de la "etiqueta" del
péptido. Los criterios para la selección de las características
químicas de estos sitios de seccionamiento pueden ser anticipados
de la bibliografía científica, mientras que la optimización de la
cinética de seccionamiento de carboxipeptidasa puede estar basada
en la bibliografía precedente. Dependiendo de la secuencia de la
"etiqueta" del oligopéptido y de la naturaleza de la secuencia
de aminoácidos C-terminal de la proteína huésped,
carboxipeptidasas adecuadas pueden ser, por ejemplo, la
carboxipeptidasa de tipo serina (CpY) o la carboxipeptidasa
dependiente de zinc. Carboxipeptidasas adecuadas están disponibles
de varios proveedores, incluyendo Worthington Biochemicals
Corporation, Lakewood, New Jersey, E.E.U.U.
D: Requisitos de sustitución de etiquetas del
oligopéptido preferidas: como resulta de la sección B arriba,
especialmente subsecciones (a)-(c) de la misma, sustituciones de
aminoácidos aceptables pueden ser utilizadas para generar varias
variantes, generadas más fácilmente por medio de una estrategia
sintética combinatoria. Con respecto a la elección de los
aminoácidos preferidos, una guía puede ser buscada en los criterios
establecidos en la sección B, arriba, con referencia particular a
la susceptibilidad de la secuencia de aminoácidos de las variantes
combinatorias derivadas para seccionamiento por una exopeptidasa con
la "etiqueta" del oligopéptido localizada en el término N o C
de la proteína diana como se explica en la sección C o por una
diaminopeptidasa, p. ej. una dipeptidil aminopeptidasa tal como
DAP-1 (vide supra). Como consecuencia,
limitaciones moleculares considerables pueden ser introducidas en
cuanto a limitaciones en el número total de posibilidades
sintéticas que pueden ser utilizadas basándose en la definición
genérica de una ""etiqueta" del oligopéptido preferida";
por ejemplo, en el caso de sistemas de expresión procariótica tales
como las variantes conteniendo prolina de E coli están
generalmente excluidas. En el caso de variantes de la secuencia
donde el primer, tercer, quinto séptimo, ...(etc) residuo de
aminoácido es un residuo que está "prohibido" como resultado
de ello actuando como una secuencia de parada para el seccionamiento
por una diaminopeptidasa (tal como DAP-1), es
decir, es cinéticamente inapropiada para el seccionamiento en este
sitio después de la reacción de seccionamiento n-1
(Pro, Arg y Lys son ilustrativas de estos residuos de aminoácidos
"prohibidos"), o variantes de la secuencia donde el segundo,
cuarto, sexto, octavo, ...(etc) residuo de aminoácido no es
preferido porque es cinéticamente inapropiado para el
seccionamiento en este sitio (Met es ilustrativo de tal residuo de
aminoácido), luego tales variantes desde dentro de la biblioteca de
la "etiqueta" del oligopéptido están computacionalmente
excluidas. Teniendo estas consideraciones en cuenta, las
variaciones de biblioteca combinatoria completa por decir, las
secuencias HHHNSWDHDINR (de aquí en adelante referido como NT1) o
HTNIHQDQHNHFHR (de aquí en adelante denominada NT2) de la
"etiqueta" del oligopéptido, generadas a nivel del ADN por
medio de múltiples reacciones de PCR paralelas del ADNc
correspondiente, no serían consideradas como indicativas o
necesarias para el requisito de utilidad esperado. Más bien una
sub-biblioteca representaría un grupo adecuado de
variaciones estructurales para la generación de secuencias de la
"etiqueta" del oligopéptido que son capaces de maduración de
la afinidad, es decir, tienen las características deseadas de
afinidad para el ligando macrocílico específico y la capacidad para
ser eliminada por la peptidasa seleccionada, tal como
DAP-1, con un elemento de proteína específica (o
familia de proteínas relacionadas) como parte de sus interacciones
de unión con los nuevos complejos de iones metálicos/ligandos
macrocíclicos. El término "maduración de la afinidad" en este
contexto se refiere al uso selectivo de secuencias de la
"etiqueta" del oligopéptido que están relacionadas en
estructura primaria con (es decir, son variantes de) la
"etiqueta" del oligopéptido parental (tal como NT1 o NT2;
vide supra) (es decir, son variantes), de manera que estas
variantes de la "etiqueta" del oligopéptido representan
sustituciones de aminoácidos que dan afinidades de unión superiores
o inferiores con el complejo de afinidad del ión metálico elegido
como un casete de reconocimiento molecular, las propiedades de
afinidad de las variantes de la secuencia de la "etiqueta" del
oligopéptido seleccionadas y el complejo de afinidad del ión
metálico inmovilizado descrito arriba como un aspecto de esta
invención estando seleccionado conforme a las propiedades
específicas de la proteína diana de interés.
E: Requisitos de truncamiento de las
etiquetas del péptido preferidas: a condición de que el
criterio descrito en las secciones B, C y D arriba sean
satisfechas, después del truncamiento de la secuencia de aminoácidos
de una "etiqueta" del oligopéptido preferido según la
invención, p. ej. NT1 o NT2, de los términos N y/o C constituye
hechos permitidos con respecto a la eliminación de la
"etiqueta" del oligopéptido utilizando una dipeptidil
aminopeptidasa (p. ej. DAP-1, vide supra) u
otra aminopeptidasa, diaminopeptidasa o triaminopeptidasa. En este
caso, el truncamiento conduce al caso siguiente (ilustrado para una
estructura de "etiqueta" de des
uno-oligopéptido: 5'
1-2-3-4-5-6-7-.....-[proteína
diana] \rightarrow 5'
2-3-4-5-6-7-.....-[proteína
diana]). Un aspecto importante aquí es el hecho de asegurar que el
truncamiento no conduce a un cambio "desfasado" de la
secuencia de aminoácidos. Esto puede no tener ningún efecto en la
interacción entre la "etiqueta" del oligopéptido y el complejo
de ión metálico/ligando inmovilizado durante el procedimiento de
purificación, pero podría suponer una disposición desfavorable de
los residuos de aminoácidos que vuelve ineficiente el
seccionamiento proteolítico de la "etiqueta" del oligopéptido
de la proteína de fusión. Como tales, las variantes de truncamiento
"en fase" representan un subconjunto especial (el subconjunto
T) de la "biblioteca" de secuencias de la "etiqueta" del
oligopéptido parental, y están relacionadas con la "etiqueta"
del oligopéptido parental respectivo por medio de sus similitudes
en las características composicionales o secuenciales y por su
potencial de enlace de IMAC o características de seccionamiento con
enzimas.
F: Requisitos de eliminación de las etiquetas
del péptido preferidas: la eliminación de residuos de
aminoácidos internos perturbarán el orden definido de los residuos
de aminoácidos y por lo tanto tendrán dos consecuencias. La primera
consecuencia se refiere al efecto en el motivo de unión preferido
para el reconocimiento molecular de la "etiqueta" del
oligopéptido vestigial por el ión metálico/ligando quelante
macrocíclico inmovilizado. Este efecto estará manifestado como un
desplazamiento de fase en la secuencia de aminoácidos, con el
residuo de aminoácido "m" convirtiéndose en el residuo
"m-x" en la variante de deleción, donde
"x" es el aminoácido o secuencia de deleción. Tales cambios
pueden tener un segundo efecto, es decir que la propensión para el
seccionamiento de DAP-1 puede ser comprometido
inmensamente. En este caso, la eliminación conduce al caso
siguiente (ilustrada para una estructura de la "etiqueta" del
des dipéptido: 5'
1-2-3-4-5-6-7-.....-[proteína
diana] \rightarrow 5'
1-2-3-6-7-.....-[proteína
diana]).
A condición de que los criterios perfilados en
las secciones B, C y D arriba se siguen cumpliendo, no obstante,
luego la posibilidad de utilizar variantes de eliminación puede
también ser incorporada como parte de los requisitos de selección
para la secuencia(s) de aminoácidos de "etiquetas" del
oligopéptido preferidas. Como tales, las variantes de deleción
"en fase" representan un subconjunto especial (el subconjunto
D) de la "biblioteca" de secuencias de la "etiqueta" del
oligopéptido parental de la secuencia de la "etiqueta" del
oligopéptido parental, estando también relacionada por medio de sus
similitudes composicionales o secuenciales al potencial de unión de
IMAC o propiedades de seccionamiento enzimático de la secuencia de
la "etiqueta" del oligopéptido parental.
G: Requisitos de modularidad de las etiquetas
del oligopéptido preferido: conforme a las consideraciones
perfiladas en las secciones C, D, E y F arriba, el criterio de
modularidad de la secuencia de "etiqueta" del oligopéptido
puede ser invocado. En este caso la redisposición modular conduce al
caso siguiente (ilustrado para una estructura de "etiqueta"
del tetra-péptido redispuesta abajo:
5'
1-2-3-4-5-6-7-.....-14-15-16-17-[proteína
diana] \rightarrow 5'
1,2-3-14-15-16-17--4-5-6-7-.....-[proteína
diana]).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta consideración aumenta la posibilidad de
incluir también secuencias parciales fragmentales de una o más
"etiquetas" de longitud "completa" preferidas como una
base para el diseño de una "etiqueta" del péptido nueva. De
esta manera la secuencia sólo será alterada parcialmente, de modo
que los resultados representan un subconjunto adicional de la
secuencia parental (el subconjunto M). En este caso, el tamaño de
bloque para sustitución de las "etiquetas" del péptido
parental para generar la modularidad de la nueva "etiqueta" del
péptido tiene que observar los criterios descritos para la
interacción de IMAC y para el seccionamiento enzimático.
H: Direccionalidad de secuencia de etiquetas
del oligopéptido preferidas: con proteínas de fusión de
"etiqueta" del oligopéptido preparadas biosintéticamente, la
duda surge en cuanto a si el orden de los residuos de aminoácidos
en una secuencia preferida puede ser invertido. En el caso, por
ejemplo, de la secuencia NT2 de la "etiqueta" del oligopéptido
(vide supra), se generaría la secuencia
--R-H-F-H-N-H-Q-D-Q-H-I-N-T-H--.
A este respecto se debe destacar que este orden invertido de la
secuencia en muchos casos conducirá a un residuo desfavorecido en
la posición 1 (y posiblemente en otro lugar).
I: Posibilidad de secuencia de la casete de
las etiquetas del péptido preferidas La emisión del
comportamiento de la interacción complementaria es mencionada
anteriormente respecto a una secuencia de la "etiqueta" del
oligopéptido preferido y la naturaleza de los ligandos específicos
empleados de la IMAC. Un criterio dominante (aunque no exclusivo)
para la selección de la secuencia de aminoácidos se refiere a la
distancia entre, y orientación angular de, las cadenas laterales de
residuos de aminoácidos con respecto a la angular complementaria y a
capacidades de energía de enlace de los correspondientes sistemas
complejos de iones metálicos/ligandos a un nivel molecular mejor que
a un nivel en masa. Por esta razón, la elección de la
"etiqueta" del oligopéptido preferido es dependiente también
de la elección del ligando de IMAC, por cuya razón el concepto de
interacciones de la casete que implican las dos parejas de cognado
fue mencionado antes, arriba. Este concepto genérico ha ayudado en
la caracterización de muchas de las propiedades especiales de
enlace de los sistemas nuevos de la "etiqueta" del
oligopéptido descrito aquí.
En relación con la discusión de arriba, pero en
un nivel más específico, las "etiquetas" del oligopéptido que
se presentan muy bien adecuadas para el uso en las estrategias de
purificación de proteínas donde el seccionamiento de la
"etiqueta" del oligopéptido de la proteína de fusión (que es en
si mismo un polipéptido) tiene que tener lugar por medio de la
agencia de una aminopeptidasa, p. ej. una
dipeptidil-aminopeptidasa tal como
DAP-1, incluyen oligopéptidos que comprenden una
secuencia de aminoácidos elegida entre las siguientes:
- HHHNSWDHDINR {}\hskip1cm (abreviada aquí como NT1)
- (SEC. ID Nº 1)
- HTNIHODOHNHFHR {}\hskip0.6cm (abreviada aquí como NT2)
- (SEC. ID Nº 2)
- HAM LDRAHDHGTR
- (SEC. ID Nº 3)
- SLHEHHSGDNLR
- (SEC. ID Nº 4)
- THYNAVHSHNTLQ
- (SEC. ID Nº 5)
- DIHHWTDHLQSSTH
- (SEC. ID Nº 6)
- LYNHYSHTAHVNHL
- (SEC. ID Nº 7)
\vskip1.000000\baselineskip
Será entendido que tal "etiqueta" del
péptido (oligopéptido) puede comprender, además de una de las
secuencias de aminoácidos mostradas, uno o más residuos de
aminoácidos adicionales, tal como de 2 a 6 o más residuos de
aminoácidos adicionales, fijados al extremo C- o
N-terminal de la "etiqueta" del oligopéptido.
Tal extensión de la secuencia puede, por ejemplo, ser de manera
adecuada una unidad dipeptídica tal como Met-Lys
localizada en las posiciones -2 y -1 (donde la posición -1, Lys, es
el primer residuo amino numerado del N-término de la
"etiqueta" del oligopéptido) cuando la extensión está en el
N-término de la "etiqueta" del oligopéptido y
el sistema de "etiquetas" está destinado a ser utilizado con
un sistema de expresión procariótico, tal como E. coli, para
la producción de una proteína recombinante; en el caso de los
sistemas de expresión procariótica sin secreción periplásmica, los
primeros residuos preferidos de aminoácidos de una extensión
N-terminal de la "etiqueta" del oligopéptido
comprenden la secuencia Met-Xaa donde Xaa es
cualquier residuo de aminoácidos diferente de la prolina. La
inclusión de estas extensiones de la secuencia de aminoácidos
podrían conducir potencialmente a ventajas adicionales de expresión
aumentada de la proteína diana en las células huésped
procarióticas.
En el caso de los sistemas de expresión
eucariótica, una extensión N-terminal de la
"etiqueta" del oligopéptido contendrá muy adecuadamente como
mucho diez, frecuentemente menos de diez residuos de aminoácidos,
normalmente con la condición de que el segundo residuo de
aminoácidos de la extensión no sea un residuo de prolina.
De una manera análoga, una extensión de la
secuencia puede, por ejemplo, ser adecuadamente una unidad
dipéptida tal como Val-Asp localizada en las
posiciones +1 y +2 (donde la posición +1, Val, es el primer residuo
amino numerado del C-término de la "etiqueta"
del oligopéptido) cuando la extensión está en el
C-término de la "etiqueta" del oligopéptido y
el sistema de "etiqueta" está destinado a ser utilizado como
un sistema de expresión procariótica, tal como E. coli, para
la producción de una proteína recombinante.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a un
método para la depuración de una proteína de interés, incluyendo el
método las fases de:
el contacto de una muestra de proteína que
contenga un polipéptido que comprenda dicha proteína de interés, y
que además contenga otras proteínas, siendo dicho polipéptido una
proteína de fusión que comprenda dicha molécula proteica de interés
fusionada en su terminal amino o terminal carboxi a al menos un
oligopéptido con histidina que comprenda una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
- HHHNSWDHDINR
- (SEC. ID nº. 1)
- HTNIHQDQHNHFHR
- (SEC. ID nº. 2)
- HAMLDRAHDHGTR
- (SEC. ID nº. 3)
- SLHEHHSGDNLR
- (SEC. ID nº. 4)
- THYNAVHSHNTLQ
- (SEC. ID nº. 5)
- DIHHWTDHLQSST
- (SEC. ID nº. 6)
- LYNHYSHTAHVNHL
- (SEC. ID nº. 7)
con un sustrato de polímero
funcionalizado con ion metálico como se ha descrito anteriormente
bajo condiciones donde dicho polipéptido se enlaza a dicho sustrato
de polímero funcionalizado con ión metálico de manera que forma un
complejo con éste; el lavado del complejo con una solución
tamponada para eliminar dichas otras proteínas; y la elución del
polipéptido enlazado del complejo
lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
Este último método puede además comprender una
fase donde el oligopéptido (la "etiqueta") sea seccionado del
polipéptido o proteína de interés, p. ej. por medios químicos o
mediante una enzima (tal como una
dipeptidil-aminopeptidasa en el caso, por ejemplo,
de una "etiqueta" que comprenda una secuencia de aminoácidos
entre aquellas catalogadas como SEC. IDs Nºs.
1-7).
Como se ha indicado antes, un aspecto de la
invención se refiere al método para la purificación, donde la
secuencia de aminoácidos de dicho oligopéptido con histidina tiene
una extensión N-terminal que comprende la secuencia
de aminoácidos Met-Xaa donde Xaa es un residuo de
aminoácidos distinto de un residuo de prolina. Otro aspecto se
refiere al método para la purificación, donde la secuencia de
aminoácidos de dicho oligopéptido con histidina tiene una extensión
N-terminal que comprende una secuencia de
aminoácidos con como mucho diez residuos de aminoácidos.
Otro aspecto se refiere al método para la
purificación, donde el terminal amino y el terminal carboxi de la
secuencia de aminoácidos de dicho oligopéptido con histidina están
fusionados cada uno a una molécula de proteína de interés. En aún
otro aspecto la invención se refiere al método para la purificación,
donde la secuencia de aminoácidos de dicho oligopéptido que
contiene histidina es flanqueado por sitios de seccionamiento
seleccionados del grupo que consiste en sitios de seccionamiento
enzimático y químico. En otro aspecto adicional la invención se
refiere al método para purificación, donde dichas dos moléculas
proteicas de interés son moléculas de la misma proteína o donde
dichas dos moléculas proteicas de interés son diferentes.
Otro aspecto se refiere al método para la
purificación, donde dicho polipéptido es obtenible por cultivo de
una célula huésped que comprenda un constructo polinucleótido que
codifique dicho polipéptido en un medio de crecimiento apropiado
bajo condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido, y
recuperar dicho polipéptido del medio de cultivo. En aún otro
aspecto la invención se refiere al método para la purificación,
donde dicha célula huésped es una cepa de Escherichia
coli.
Los polipéptidos o proteínas (polipéptidos o
proteínas de interés) que son de relevancia en relación con la
metodología de purificación enseñada en el contexto de la presente
invención incluyen los siguientes: proteínas de mamífero, tal como,
p. ej., hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del
crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; el factor
de liberación de la hormona del crecimiento; la hormona
paratiroidea: la hormona estimuladora de la tiroides;
lipoproteínas;
\alpha-1-antitripsina; cadena A de
insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora
del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores
de coagulación, tal como el Factor VII (incluyendo el factor Vlla),
Factor VIII, Factor IX, factor tisular, y el factor von Willebrands;
los factores de anti-coagulación tal como la
proteína C; el factor natriurético atrial; el agente surfactante de
pulmón; un activador plasminógeno, tal como la uroquinasa o el
activador plasminógeno tipo-tejido
(t-PA); bombesina; trombina;
factor-\alpha y -\beta de la necrosis tumoral;
encefalinasa; RANTES (célula T expresada y segregada regulada
normalmente por activación); proteína inflamatoria de macrófagos
humanos (MIP-1-\alpha); albúmina
de suero, tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora
mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina;
prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; DNsa; una
activina (p. ej. activina A, activina B, activina C, activina D o
activina E); una inhibina (p. ej. inhibina A o inhibina B); factor
de crecimiento vascular endotelial (VEGF); receptores de hormonas o
factores de crecimiento; una integrina; proteína A o D; factores
reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico
derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3; -4; -5,
o -6 (NT-3, NT-4,
NT-5 o NT-6), o un factor de
crecimiento nervioso tal como NGF-\beta; factor de
crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento
de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento
epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF), tal
como TGF-\alpha y TGF-\beta,
incluyendo TGF-\beta1,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4 y o TGF-\beta5;
factor-I y II de crecimiento tipo insulina
(IGF-I y IGE-11);
des(1-3)-IGF-1
(IGF-I del cerebro); proteínas de enlace del factor
de crecimiento tipo insulina; proteínas CD, tal como CD3, CD4, CD8;
CD19 o CD20; eritropoyetina (EPO); trombopoyetina (TPO); factores
osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso
1-7 (BMP 1-7); un interferón, tal
como interferon-\alpha, \beta o \gamma;
factores estimulantes de colonias (CSFs), p. ej.,
M-CSF, GM-CSF o
G-CSF; interleuquinas (ILs), p. ej.,
IL-1 a IL-12; superóxido dismutasa;
receptores de células T; proteínas de la membrana de superficie;
factor de aceleramiento del deterioro (DAF); un antígeno vírico,
tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del SIDA;
proteínas de transporte; receptores de homing; adresinas; proteínas
reguladoras; immunoadhesinas; anticuerpos; y fragmentos
biológicamente activos o variantes de cualquiera de los polipéptidos
o proteínas catalogadas arriba.
El término "polinucleótido" como se
empleado aquí denota un polímero de cadena única o bicatenario de
bases de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos leídas del
extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden
ser aislados a partir de fuentes naturales, sintetizadas in
vitro, o preparados a partir de una combinación de moléculas
naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleótida
es dada en términos de nucleótidos (abreviado "nt") o pares de
bases (abreviado "bp"). El término "nucleótido" se usa
tanto para moléculas de cadena única como bicatenarias, donde el
contexto lo permita. Cuando el término es aplicado a moléculas
bicatenarias es usado para indicar la longitud total y será
entendido como equivalente al término "pares de bases". Será
reconocido por los expertos en la técnica que las dos cadenas de un
polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y
que los extremos de las mismas pueden ser empalmados como resultado
del seccionamiento enzimático; de forma que todos los nucleótidos
dentro de una molécula de polinucleótido bicatenario no pueden ser
emparejados. Las extremidades de este tipo no emparejadas no
excederán en general de 20 nt de longitud.
El término "célula huésped" como se emplea
aquí indica cualquier célula, incluyendo una célula híbrida, donde
puede ser expresado el ADN heterólogo. Las células huésped típicas
incluyen, pero no se limitan a células bacterianas, células de
insectos, células de levadura y células mamíferas, incluyendo
células humanas, tales como células BHK, CHO, HEK, y COS.
El término "vector" como se emplea aquí
denota cualquier entidad de ácido nucleico capaz de amplificación
en una célula huésped. Por tanto, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que al ser introducido en una célula
huésped, sea integrado en el genoma de la célula huésped y se
replique junto con el(los) cromosoma(s) en el que ha
sido integrado. La elección del vector dependerá a menudo de la
célula huésped en la que ha de ser introducido. Los vectores
incluyen, pero no se limitan a vectores plásmidos, vectores
fágicos, vectores víricos o cósmidos. Los vectores normalmente
contienen un origen de replicación y al menos un gen seleccionable,
es decir, un gen que codifique un producto que sea fácilmente
detectable, o cuya presencia sea esencial para el crecimiento
celular.
En la presente descripción, los residuos de
aminoácidos son representados usando abreviaturas aprobadas por la
Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB
(CBN). Respecto a los aminoácidos, aquellos representados por las
siguientes abreviaturas están en la forma L de origen natural.
Además, los extremos izquierdo y derecho de una secuencia de
aminoácidos de un péptido son, respectivamente, los terminales N y C
a menos que se especifique de forma contraria.
La clasificación enzimática empleada en la
presente descripción con reivindicaciones está conforme con las
Recomendaciones (1992) del Comité de Nomenclatura de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, cuya versión
actualizada (incluyendo suplementos) está disponible en la web en
http://www.chem.gmul.ac.uk/iubmb/
enzyme/.
enzyme/.
La presente invención está ilustrada con mayor
detalle con referencia a las figuras anexas, que son como
sigue:
Fig. 1. El comportamiento de unión de las
proteínas séricas humanas en las columnas de
in-M^{n+}-dtne y
in-M^{n+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B usando un tampón de enlace de 20 mM de tampón
carbonato sódico/0,1 M de NaCl, pH 9.5 y iones metálicos
diferentes, donde M^{n+} = Cu^{2+}, Co^{2+}, Zn^{2+} y
Ni^{2+}, respectivamente. La elución fue realizada usando el
procedimiento resumido en la tabla 1 en los ejemplos de
funcionamiento aquí (véase infra). Porcentaje de proteína
eluida = (cantidad total de proteína eluida/cantidad total de
proteína cargada) x 100%.
Fig. 2. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones seleccionadas recogidas de columnas batch de
in-Cu^{2+}-dtne y
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B bajo condiciones de carga diferentes. Fila 1
= muestra de suero humano; Fila 2 y 3 = fracciones de
ruptura/lavado y eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 4 y 5 =
fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5; Fila 6 y 7
= fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 8 a 11
= fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5. La elución
fue conseguida con un aumento de la concentración de NaCl y una
reducción del pH; Fila 9 = 1 M de NaCl y pH 9.5, Fila 10 = pH 4.0,
Fila 11 = pH 4.0 y 250 mM de imidazol; Fila 12 representa los
estándares de peso molecular, miosina 212 kDa,
\alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa,
\beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa,
y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 3. El comportamiento de unión del suero
humano en las columnas in-M^{n+}-dtne y
in-M^{n+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B con iones metálicos diferentes, donde M^{n+}
= Cu^{2+}, Co^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+}, respectivamente, y
cuando el tampón de enlace fue 20 mM de tampón fosfato potásico/0,1
M de NaCl, pH 7.0. La elución fue realizada usando el procedimiento
de la Tabla 2. Porcentaje de proteína eluida = (cantidad total de
proteína eluida/cantidad total de proteína cargada) x 100%.
Fig. 4. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones seleccionadas recogidas de columnas batch
in-Cu^{2+}-dtne y
in-Cu^{2+}-dtnp and
in-Ni^{2+}-dtne y
in-Ni^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el pH de enlace fue 7.0. La elución fue
conseguida con una concentración en aumento de NaCl a 1,0 M y una
aplicación de 0,2 M de EDTA, pH 4.2. Fila 1 = muestra de suero
humano; Fila 2 y 3 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la
columna in-Ni^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 4 = fracción de ruptura/lavado de la
columna de in-Ni^{2+}-dtnp; Fila 5 y 6 =
fracciones eluidas de la columna de in-Ni^{2+} -dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B usando tampón pH 7.0 con 1 M
de NaCl o 0,2 M de EDTA pH 4.2; Fila 7 = fracción de ruptura/lavado
de la columna de in-Cu^{2+}-dtne; Fila 8 y
9 = fracciones eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón pH 7.0 con 1 M de NaCl o 0,2 M
de EDTA pH 4.2; Fila 10 = fracción de ruptura/lavado de la columna
de in-Cu^{2+}-dtnp; Fila 11 y 12 =
fracciones eluidas de columna de
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón pH 7.0 con 1 M de NaCl o 0,2 M
de EDTA pH 4.2; Fila 13 representa los estándares de peso
molecular, Miosina 212 kDa,
\alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa,
\beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa,
y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 5. El comportamiento de enlace del suero
humano en las columnas in-M^{n+}-dtne y
in-M^{n+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B cuando el tampón de enlace fue 20 mM de
tampón de acetato sódico/0,1 M de NaCl, pH 4.0 y con iones metálicos
diferentes, donde M^{n+}= Cu^{2+}, Co^{2+}, n^{2+} y
Ni^{2+}, respectivamente. La elución fue realizada usando el
procedimiento de la Tabla 3. Porcentaje de proteína eluida =
(cantidad total de proteína eluida/cantidad total de proteína
cargada) x 100%.
Fig. 6. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones recogidas de columnas batch de
in-Ni^{2+}-dtne y
in-Ni^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B bajo condiciones de carga. Fila 1 = muestra de suero humano; Fila 2 y 3 = fracciones de ruptura/lavado y de elución de la columna in-Ni^{2+}-dtne cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 4 y 5 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Ni^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5; Fila 6 y 7 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna in-Ni^{2+}-dtnp cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 8 a 13 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Ni^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5. La elución fue conseguida con una concentración en aumento de NaCl y una disminución del pH; Fila 9 = 1 M de NaCl y pH 9.5, Fila 10 = pH 8.0; Fila 11 = pH 7.0; Fila 12 = pH 6.0; Fila 13 = pH 4.0 y 250 mM de imidazol; Fila 14 representa los estándares de peso molecular, Miosina: 212 kDa, \alpha_{2}-macroglobulina reducida: 170 kDa, \beta-galactosidasa: 116 kDa, transferrina: 76 kDa, y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Sepharose^{TM} CL-6B bajo condiciones de carga. Fila 1 = muestra de suero humano; Fila 2 y 3 = fracciones de ruptura/lavado y de elución de la columna in-Ni^{2+}-dtne cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 4 y 5 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Ni^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5; Fila 6 y 7 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna in-Ni^{2+}-dtnp cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 8 a 13 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Ni^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5. La elución fue conseguida con una concentración en aumento de NaCl y una disminución del pH; Fila 9 = 1 M de NaCl y pH 9.5, Fila 10 = pH 8.0; Fila 11 = pH 7.0; Fila 12 = pH 6.0; Fila 13 = pH 4.0 y 250 mM de imidazol; Fila 14 representa los estándares de peso molecular, Miosina: 212 kDa, \alpha_{2}-macroglobulina reducida: 170 kDa, \beta-galactosidasa: 116 kDa, transferrina: 76 kDa, y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 7. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones recogidas de columnas batch de
in-Zn^{2+}-dtne y
in-Zn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B bajo condiciones de carga. Fila 1 = muestra de suero humano; Fila 2 y 3 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 4 y 5 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de las columnas de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5; Fila 6 y 7 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 8 y 9 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5. Fila 10 y 11 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 7.0; Fila 12 y 13 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 7.0; Fila 14 = los estándares de peso molecular, Miosina 212 kDa, \alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa, \beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa, y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Sepharose^{TM} CL-6B bajo condiciones de carga. Fila 1 = muestra de suero humano; Fila 2 y 3 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 4 y 5 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de las columnas de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5; Fila 6 y 7 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 4.0; Fila 8 y 9 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 9.5. Fila 10 y 11 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de columna de in-Zn^{2+}-dtne Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 7.0; Fila 12 y 13 = fracciones de ruptura/lavado y eluidas de la columna de in-Zn^{2+}-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B cuando el pH de carga fue pH 7.0; Fila 14 = los estándares de peso molecular, Miosina 212 kDa, \alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa, \beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa, y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 8. Perfil de elución para proteínas séricas
humanas separadas en columna de
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B (50 mm x 5 mm i.d.) usando los procedimientos
de elución siguientes: (I) un gradiente de pH de pH 9.5 a pH 4.0,
(II) un gradiente de concentración de NaCl de 100 mM a 1000 mM, y
(III) un gradiente de concentración de imidazol de 0 a 250 mM. El
nivel de flujo fue 0,5 ml/min. Tampón de equilibrado fue 20 mM de
tampón de carbonato sódico que contiene 100 mM de NaCl, pH 9.5.
Fig. 9. El Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones seleccionadas en la Fig. 8. Fila 1 representa
muestra de suero humano; Fila 2 representa fracciones de
ruptura/lavado; Fila 3 y 4 representan los picos de elución bajo
elución de gradiente de pH por medio del pH de pH 9.5 a pH 4.0.
Fila 5 representa el pico de elución bajo elución de gradiente de
NaCl; Fila 6 representa el pico de elución bajo elución de
gradiente de imidazol; Fila 7 representa los estándares de peso
molecular, Miosina 212 kDa,
\alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa,
\beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa,
y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 10. Perfil de elución para proteínas
séricas humanas separadas en columna de
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B (50 mm x 5 mm i.d.) usando los procedimientos
de elución siguientes: (I) un gradiente de pH de pH 9.5 a pH 4.0,
(II) un gradiente de concentración de NaCl de 100 mM a 1000 mM, y
(III) un gradiente de concentración de imidazol de 0 a 250 mM. El
nivel de flujo fue 0,5 ml/min. tampón de equilibrado fue 20 mM de
tampón carbonato sódico conteniendo 100 mM de NaCl, pH 9.5.
Fig. 11. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones seleccionadas en Fig. 10. Fila 1 representa muestra
de suero humano; Fila 2 y 3 representa fracciones de
ruptura/lavado; Fila 4 y 5 representan los picos de elución bajo
elución de gradiente de pH por medio del pH de pH 9.5 a pH 4.0;
Fila 6 a 8 representan el pico de elución bajo elución de gradiente
de NaCl; Fila 9 a 11 representan el pico de elución bajo elución de
gradiente de imidazol; Fila 12 representa los estándares de peso
molecular, Miosina 212 kDa,
\alpha_{2}-macroglobulina reducida 170 kDa,
\beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76 kDa,
y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 12. Perfil de elución para proteínas
séricas humanas separadas en columna de
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B (50 mm x 5 mm i.d.) usando una elución
combinada de un gradiente de concentración de NaCl y gradiente de
pH. La línea continua (------) indica la absorbencia UV de las
fracciones a una longitud de onda de 280 nm. La línea discontinua
(- - -) indica concentración de NaCl. La línea de
guión-punto-punto-guión
(- \bullet \bullet -\bullet\bullet-) indica el pH. El nivel
de flujo fue 0.5 ml/min. Tampón de equilibrado fue 20 mM de tampón
carbonato sódico conteniendo 100 mM de NaCl, pH 9.5.
Fig. 13. Perfil de SDS-PAGE de
fracciones seleccionadas en Fig. 12. Fila 1 representa muestra de
suero humano; Fila 2 representa fracción de ruptura/lavado; Fila 3
representa el pico de elución bajo elución de gradiente de NaCl;
Fila 4 representa el pico de elución bajo elución con tampón pH 9.5
que contiene 1 M de NaCl; Fila 5 representa el pico de elución bajo
elución de gradiente de pH de pH 9.5 a pH 6.75 con una
concentración de NaCl de 1 M; Fila 6 representa el pico de elución
bajo elución con tampón pH 6.75 que contiene 1 M de NaCl; Fila 7
representa el pico de elución bajo gradiente de pH de pH 6.75 a pH
4.0, y elución isocrática con tampón pH 4.0 que contiene 1 M de
NaCl; Fila 8 representa los estándares de peso molecular, Miosina
212 kDa, \alpha_{2}-macroglobulina reducida 170
kDa, \beta-galactosidasa 116 kDa, transferrina 76
kDa, y glutamina deshidrogenasa 53 kDa.
Fig. 14. El porcentaje de proteína total y
actividad enzimática presente en las fracciones recuperadas de un
extracto de células de E. coli de la expresión de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
que se enlazó a columnas diferentes obtenidas a partir de los
adsorbentes de in-Cu^{2+}-, in-Ni^{2+}- y
in-Zn^{2+}-tacn, -dtne y -dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B y el adsorbente de
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B usando procedimientos de adsorción en batch.
El tampón de equilibrado para estos estudios de unión fue 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/300 mM de NaCl y 10% de glicerol, pH 8.0.
Fig. 15. Esta figura muestra la cantidad de
proteína enlazada (como un porcentaje de la proteína cargada sobre
la columna) que podría ser eluida de las columnas de
in-Cu^{2+}-, in-Ni^{2+}- y
in-Zn^{2+}-tacn, -dtne y -dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B y la columna de
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B con 125 mM y 250 mM de imidazol en el tampón
de elución (50 mM de Na_{2}HPO_{4}/300 mM de NaCl y 10% de
glicerol, pH 7.0) y las actividades específicas de GST
correspondientes de las fracciones recuperadas del fraccionamiento
de un extracto de células de E. coli de la expresión de la
glutationa S-transferasa recombinante
(r-GST).
Fig. 16. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones de ruptura de columna brutas y eluidas de la
separación cromatográfica del extracto bruto de E. coli
contiene la proteína
GST-\deltaATPasa-His_{6}
recombinante. Los estándares de peso molecular fueron los
siguientes: ovalbumina, 46 kDa,
carbonato-deshidratasa, 30 kDa, inhibidor de
tripsina, 21,5 kDa, lisozima, 14,3 kDa, aprotinina 6,5 kDa, y cadena
B de insulina, 3,4 kDa. Las trazas en el panel (a) corresponden a:
Fila 1, extracto bruto de E. coli; Fila 2 a 4, fracciones de
ruptura obtenidas de las columnas de
in-Cu^{2+}-tacn, -dtne y -dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B, respectivamente; Fila 5,
estándares de proteína; Fila 6 a 9, fracciones de ruptura obtenidas
de las columnas de in-Zn^{2+}-tacn,
in-Zn^{2+}-dtne,
in-Zn^{2+}-dtnp,
in-Ni^{2+}-tacn y
in-Ni^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B, respectivamente. De forma similar, las pistas
en el panel (b) corresponden a: Fila 1 a 3, fracciones eluidas de
las columnas de in-Cu^{2+}-tacn, -dtne y
-dtnp Sepharose^{TM} CL-6B, respectivamente; Fila
4, estándares de proteína; Fila 5 a 7, fracciones eluidas de las
columnas de in-Ni^{2+}-tacn,
in-Ni^{2+}-dtnp, y
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B, respectivamente; Fila 8 y 9, fracciones de
ruptura de las columnas de in-Ni^{2+}-NTA
y in-Ni^{2+}-dtnp, respectivamente. La
posición de migración de la proteína recombinante
GST-\deltaATPasa-His_{6}, está
indicada por la flecha.
Fig. 17. Separación cromatográfica de la
proteína recombinante
GST-\deltaATPasa-His_{6} de
otras proteínas en el extracto bruto de E. coli usando el
adsorbente de in-Ni^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B equilibrado con 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/300 mM de NaCl y 10% de glicerol, pH 8.0, a un
nivel de flujo de 0,5 ml/min. El extracto bruto de E. coli
(2 ml de extracto bruto de E. coli por ml de adsorbente)
conteniendo la proteína de
GST-\deltaATPasa-His_{6}
recombinante fue cargado sobre la columna preparada. Las proteínas
no enlazadas o débilmente enlazadas fueron lavadas con 15 volúmenes
del tampón de equilibrado. Las proteínas enlazadas fueron luego
eluidas usando un gradiente lineal de 0 a 250 mM de imidazol en el
tampón de equilibrado después de 20 minutos. Después de la
finalización de la elución del gradiente, la columna fue enjuagada
con una solución de 200 mM de EDTA en el tampón de elución. La
actividad GST en las fracciones recuperadas fue determinada y está
indicada por la línea discontinua (- - -). La línea de
guión-punto-punto-guión
(- \bullet \bullet - \bullet \bullet -) y línea continua
(------) indican el gradiente del imidazol y la absorbencia UV de
la proteína en las fracciones a una longitud de onda de 280 nm,
respectivamente.
\newpage
Fig. 18. Perfil de SDS-PAGE del
extracto bruto de E. coli (Fila 2) y la fracción eluida
conteniendo la proteína recombinante
GST-\deltaATPasa-His_{6} (Fila
3) que fue recogida de la separación cromatográfica del extracto
bruto de E. coli en la columna de
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B (mostrado en Fig. 17). Los estándares de peso
molecular (Fila 1) fueron los siguientes: ovalbumina, 46 kDa,
carbonato-deshidratasa, 30 kDa, inhibidor de
tripsina, 21.5 kDa, lisozima, 14.3 kDa.
Fig. 19. La actividad enzimática de la catepsina
L5 de Fasciola hepatica etiquetada con hexahistidina
C-terminal recombinante (rF.h catepsina L5)
indicada por lectura de fluorescencia usando el sustrato
fluorescente
N-carbobenzoxi-Phe-Arg-7-amino-4-metilcumarina,
en las fracciones recogidas de la separación cromatográfica de la
rF.h catepsina L5 purificada de la columna de
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B y el sobrenadante bruto de levadura usando las
columnas de in-Cu^{2+}-tacn y
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. El procedimiento de lavado fue realizado con
el tampón de equilibrado de 50 mM de Na_{2}HPO_{4}/150 mM de
NaCl, pH 8.0. Los procedimientos de elución 1 a 4 fueron realizados
con un tampón de elución de 50 mM de Na_{2}HPO_{4}/500 mM de
NaCl, pH 6.0 conteniendo 0 mM, 125 mM, 250 mM o 500 mM de
imidazol.
Fig. 20. Perfil de elución de la separación de
la catepsina L5 de Fasciola hepatica recombinante
C-terminal etiquetada con hexahistidina (rF.h
catepsina L5) de otras proteínas en el sobrenadante bruto de S.
cerevisiae usando el adsorbente de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. El sobrenadante de levadura bruto fue cargado
sobre la columna preparada equilibrada con 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/150 mM de NaCl, pH 8.0 a un nivel de flujo de 0.2
ml/min durante toda la noche. Las proteínas no enlazadas o
débilmente enlazadas fueron lavadas con 50 volúmenes del tampón de
equilibrado y tampón de lavado (50 mM de Na_{2}HPO_{4}/500 mM de
NaCl, pH 6.0), respectivamente. Luego las proteínas enlazadas
fueron eluidas con un gradiente lineal a 0.5 ml/min de 0 a 500 mM
imidazol en el tampón de lavado (50 mM de Na_{2}HPO_{4}/500 mM
de NaCl, pH 6.0). Después de la finalización de la elución de
gradiente, la columna fue lavada con 200 mM de EDTA en el tampón de
elución. La actividad de rF.h catepsina L5 en las fracciones
recuperadas fue determinada por ensayo de fluorescencia e indicada
por la línea guión-punto-guión (-
\bullet\bullet-\bullet\bullet-). La línea
discontinua (- - -) y la línea continua (------) indican el
gradiente de concentración de imidazol y concentración de proteína
en las fracciones, respectivamente.
Fig. 21. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones de la catepsina L5 Fasciola hepatica
recombinante C-terminal etiquetada con hexahistidina
(rF.h catepsina L5) purificado en una columna de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B como se muestra en la figura 20. Fila 1 =
muestra bruta, sobrenadante de levadura; Fila 2 = fracción de
ruptura; Fila 3 = fracción de lavado usando tampón de equilibrado
(50 mM de Na_{2}HPO_{4}/150 mM de NaCl, pH 8.0); Fila 4 =
fracción de lavado usando tampón de lavado (50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/500 mM de NaCl, pH 6.0); Fila 5 = fracción de
elución usando un gradiente de concentración de imidazol de 0 a 500
mM en el tampón de lavado, donde las bandas menores en el rango
molecular de aprox. 28.5 kDa a aprox. 34.1 kDa fueron las bandas de
fragmento debido a autolisis de rF.h catepsina L5. A
concentración de proteína baja, estas bandas no pueden ser
identificadas en el SDS-PAGE. Fila 6 = estándares de
peso molecular, fosforilasa B 103 kDa, albúmina de suero bovino 81
kDa, ovalbumina 46.9 kDa, carbonato-deshidratasa
34.1 kDa, inhibidor de tripsina de semilla de soja 28.5 kDa, y
lisozima 20.2 kDa; Fila 7 = fracción de la rF.h catepsina L5
obtenida de la columna de in-Ni^{2+}-NTA
Sepharose^{TM} CL-6B.
Fig. 22. Perfil de Western blot de las
fracciones que contienen la proteína (AMA-1) del
antígeno-1 de la membrana apical etiquetada con
hexahistidina recogida de columnas de
in-Ni^{2+}-tacn (a),
in-Cu^{2+}-tacn (b),
in-Cu^{2+}-dtnp (c), y
in-Ni^{2+}-dtnp (d) Sepharose^{TM}
CL-6B. Fila 1 = peso molecular, Miosina 209 kDa,
\beta-galactosidasa 124 kDa, albúmina de suero
bovino 80 kDa, y ovalbumina 49 kDa; Fila 2 = fracción de lavado
usando tampón de equilibrado (50 mM de Na_{2}HPO_{4}/150 mM de
NaCl, pH 8.0); Fila 3 = fracción eluida usando tampón que contiene
50 mM de Na_{2}HPO_{4}1500 mM de NaCl, pH 6.0; Fila 4 =
fracción eluida usando tampón que contiene 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/500 mM de NaCl y 125 mM de imidazol, pH 6.0: Fila
5 = fracción eluida usando tampón que contiene 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/500 mM de NaCl y 250 mM de imidazol, pH 6.0; Fila
6 = fracción eluida usando tampón que contiene 50 mM de
Na_{2}HPO_{4}/500 mM de NaCl y 500 mM de imidazol, pH 6.0; Fila
7 = muestra cargada, levadura sobrenadante; Fila 8 = muestra de
control, lisado de Plasmodium chabaudi adami. La proteína
recombinante AMA-1 fue expresada en el
Saccharomyces cerevisiae de levadura.
Fig. 23. Perfil de SDS-PAGE de
las fracciones recuperadas de descarboxilasa de ácido glutámico de
proteína recombinante etiquetada con hexahistidina (GAD67/65)
aislada de la cepa BJ3505 de Saccharomyces cerevisiae usando
las columnas de in-Ni^{2+}-tacn y
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. El perfil de SDS-PAGE implicó
el análisis de las siguientes fracciones:
Grupo 1 = fracciones eluidas de la columna de
in-Ni^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 125 mM de imidazol;
Grupo 2 = fracciones eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 125 mM de imidazol;
Grupo 3 = fracciones eluidas de la columna de
in-Ni^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 250 mM de imidazol;
Grupo 4 = fracciones eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 250 mM de imidazol;
Grupo 5 = fracciones eluidas de la columna de
in-Ni^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 500 mM de imidazol;
Grupo 6 = fracciones eluidas de la columna de
in-Cu^{2+}-tacn usando el tampón que
contiene 500 mM de imidazol;
Grupo 7 = fracción de proteína no enlazada de la
columna de in-Ni^{2+}-tacn;
Grupo 8 = fracción de proteína no enlazada de la
columna de in-Cu^{2+}-tacn;
Grupo 9 = muestra cargada, proteína GAD67/65
recombinante aislada por la columna de
in-Ni^{2+}-NTA;
Grupo 10 = fracciones de lavado de la columna de
in-Ni^{2+}-tacn obtenidas usando el tampón
de lavado con una concentración de imidazol de 40 mM; y
Grupo 11 = fracciones de lavado de la columna de
in-Cu^{2+}-tacn obtenida usando tampón de
lavado con una concentración de imidazol de 40 mM.
Fig. 24. SDS-PAGE y perfiles de
Western blot de las fracciones que contienen la descaboxilasa
(GAD67/65) de ácido glutámico de la proteína recombinante etiquetada
con hexahistidina recuperada aislada de la cepa BJ3505 de
Saccharomyces cerevisiae usando las columnas de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. La muestra cargada fue aislada de Pichia
pastoris usando la columna de
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B. (A): SDS-PAGE de experimento
1: Fila 1: estándares de peso molecular; Fila 2: muestra cargada
que fue purificada por in-Ni^{2+}-NTA
Sepharose^{TM} CL-6B; Fila 3: fracción de ruptura
de in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 4: fracción de lavado de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón de equilibrado; Fila 5:
fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B usando el tampón conteniendo
250 mM de imidazol; (B): SDS-PAGE del experimento
2: Fila 1: estándares de peso molecular; Fila 2: muestra cargada
que fue purificada por in-Ni^{2+}-NTA
Sepharose^{TM} CL-6B; Fila 3: fracción de ruptura
de in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 4: fracción de lavado de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón de equilibrado; Fila 5 y 6:
fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B usando el tampón conteniendo
250 mM de imidazol; Fila 7: fracción de elución de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando el tampón conteniendo 0,1 M de
histidina; Fila 8: fracción de elución de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón conteniendo el 1% de SDS. (C):
SDS-PAGE del experimento 3: Fila 1: estándares de
peso molecular; Fila 2: muestra cargada que fue purificada por
in-Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 3: fracción de ruptura de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 4: fracción de lavado de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón de equilibrado; Fila 5:
fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B usando el tampón que
contiene 250 mM de imidazol; Fila 6: fracción de elución de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón que contiene 0.2 M de EDTA; (D)
Western blot de experimento 3: Fila 1: muestra cargada que fue
purificada por in-Ni^{2+}-NTA
Sepharose^{TM} CL-6B; Fila 2: fracción de ruptura
de in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B; Fila 3: fracción de lavado de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B usando tampón de equilibrado; Fila 4:
fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B usando tampón conteniendo 250
mM de imidazol;
Fila 5: fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM} CL-6B usando el tampón que contiene 0,2 M EDTA.
Fila 5: fracción de elución de in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM} CL-6B usando el tampón que contiene 0,2 M EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 25. El enlace de la mioglobina de músculo
de caballo (HMYO) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones del tampón usadas fueron:
1000 - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500 mM de
NaCl, pH 4.0. 1001 - - tampón B, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0.
1002 - - tampón C, 20 mM de fosfato potásico/500
mM de NaCl, pH 7.0. 1004 - - tampón D, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0.
1005 - - tampón E, 20 mM de bicarbonato
sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y (q*/c*), como el factor de
capacidad, indica la afinidad aparente de adsorbentes de IMAC para
proteínas basadas en la parte de la cantidad de proteína enlazada
en el adsorbente y la cantidad de proteína en la solución en
equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 26. La unión de mioglobina de músculo de
caballo (HMYO) para adsorbentes
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón usadas fueron:
1000 - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500 mM de
NaCl, pH 4.0; 1001 - - tampón B, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0;
1002 - - tampón C, 20 mM de fosfato potásico/500
mM de NaCl, pH 7.0; 1004 - - tampón D, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0;
1005 - - tampón E, 20 mM de bicarbonato
sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y, la constante de enlace
relativa, K_{rel} (1/\mumol), indica la capacidad de enlace
relativa basada en por mol de ión metálico inmovilizado en
adsorbentes en equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 27. El enlace de citocromo c de corazón de
caballo (HCC) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón usadas fueron:
1000 - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500 mM de
NaCl, pH 4.0; 1001 - tampón B, 20 mM de fosfato
potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0; 1002 - - tampón
C, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 7.0;
1004 - tampón D, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de
NaCl, pH 8.0; 1005 - tampón E, 20 mM de bicarbonato
sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y q*/c*, como el factor de
capacidad, indica la afinidad aparente de adsorbentes de IMAC para
proteínas basadas en la proporción de la cantidad de proteína
enlazada en el adsorbente y la cantidad de proteína en solución en
equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 28. El enlace de cictocromo c de corazón de
caballo (HCC) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón usadas fueron:
1000 - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500 mM de
NaCl, pH 4.0; 1001 - tampón B, 20 mM de fosfato
potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0; 1002 - tampón C, 20
mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 7.0; 1004 -
tampón D, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0;
1005 - - tampón E, 20 mM de bicarbonato
sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y, constante de unión
relativa, K_{rel} (1/\mumol), indica la capacidad de unión
relativa basada en por mol de ión metálico inmovilizado en
adsorbentes en equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 29. El enlace de lisozima de clara de huevo
de gallina (HEWL) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón fueron:
1000 - - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500
mM de NaCl, pH 4.0; 1001 - - tampón B, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0; 1002 -
tampón C, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 7.0;
1004 - tampón D, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de
NaCl, pH 8.0; 1005 - - tampón E, 20 mM de
bicarbonato sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y q*/c*, como el
factor de capacidad, indica la afinidad aparente de adsorbentes de
IMAC para proteínas basadas en la parte de la cantidad de proteína
enlazada en el adsorbente y la cantidad de proteína en solución en
equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 30. El enlace de lisozima de clara de huevo
de gallina (HEWL) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón fueron:
1000 - - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500
mM de NaCl, pH 4.0; 1001 - tampón B, 20 mM de fosfato
potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0; 1002 - tampón C, 20
mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 7.0; 1004 -
tampón D, 20 mM de fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0.
1005 - tampón E, 20 mM de bicarbonato sódico/500 mM de
NaCl, pH 9.5. El eje Y, Kre1 (1/\mumol), indica la capacidad de
enlace relativa basada en por mol de ión metálico inmovilizado en
adsorbentes en equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 31. El enlace de
a-lactalbumina bovina (LAC) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón fueron:
1000 - - tampón A, 20 mM de acetato sódico/500
mM de NaCl, pH 4.0; 1001 - - tampón B, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 6.0;
1002 - - tampón C, 20 mM de fosfato potásico/500
mM de NaCl, pH 7.0; 1004 - tampón D, 20 mM de fosfato
potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0; 1005 - - tampón
E, 20 mM de bicarbonato sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y
q*/c*, como el factor de capacidad, indica la afinidad aparente de
adsorbentes de IMAC para proteínas basadas en la parte de la
cantidad de proteína enlazada en el adsorbente y la cantidad de
proteína en solución en equilibrio
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 32. El enlace de
a-lactalbumina bovina (LAC) a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose
CL-6B bajo condiciones de pH diferentes. En este
estudio, las condiciones de tampón fueron: 1000 -
tampón A, 20 mM de acetato sódico/500 mM de NaCl, pH 4.0;
1001 - - tampón B, 20 mM de fosfato potásico/500
mM de NaCl, pH 6.0; 1002 - - tampón C, 20 mM de
fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 7.0;
1004 - - tampón D, 20 mM de fosfato potásico/500
mM de NaCl, pH 8.0; 1005 - - tampón E, 20 mM de
bicarbonato sódico/500 mM de NaCl, pH 9.5. El eje Y, K_{rel}
(1/\mumol), indica la capacidad de enlace relativa basada en por
mol de ión metálico inmovilizado en adsorbentes en equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 33. Influencia de la fuerza iónica en el
enlace de la proteína HMYO modelo a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Iones metálicos inmovilizados fueron los
siguientes: Cu^{2+} 1006 , Ni^{2+}
1007 , Zn^{2+} 1008 , y Co^{2+}
1009 . Las condiciones del tampón fueron: tampón A,
20 mM de tampón fosfato potásico/100 mM de NaCl, pH 8.0; tampón B,
20 mM de tampón fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0; tampón C,
20 mM de tampón fosfato potásico/1 M de NaCl, pH 8.0; tampón D, 20
mM de tampón fosfato potásico/2 M de NaCl, pH 8.0; tampón E, 20 mM
de tampón fosfato potásico/3 M de NaCl, pH 8.0.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 34. Influencia de la fuerza iónica en el
enlace de la proteína HCC modelo a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose ^{TM}
CL-6B. Iones metálicos inmovilizados fueron los
siguientes: Cu^{2+} 1006 , Ni^{2+}
1007 , Zn^{2+} 1008 y Co^{2+}
1009 . Las condiciones del tampón fueron: tampón A,
20 mM de tampón fosfato potásico/100 mM de NaCl, pH 8.0; tampón B,
20 mM de tampón fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0; tampón C,
20 mM de tampón fosfato potásico/l M de NaCl, pH 8.0; tampón D, 20
mM de tampón fosfato potásico/2 M de NaCl, pH 8.0; tampón E, 20 mM
de tampón fosfato potásico/3 M de NaCl, pH 8.0.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 35. influencia de la fuerza iónica en el
enlace de la proteína HEWL modelo a adsorbentes de
in-M^{2+}-dtne y
in-M^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Los iones metálicos inmovilizados fueron los
siguientes: Cu^{2+} 1006 , Ni^{2+}
1007 , Zn^{2+} 1008 , y Co^{2+}
1009 . Las condiciones del tampón fueron: tampón A, 20
mM de tampón fosfato potásico/100 mM de NaCl, pH 8.0; tampón B, 20
mM de tampón fosfato potásico/500 mM de NaCl, pH 8.0; tampón C, 20
mM de tampón fosfato potásico/1 M de NaCl, pH 8.0; tampón D, 20 mM
de tampón fosfato potásico/2 M de NaCl, pH 8.0; tampón E, 20 mM de
tampón fosfato potásico/3 M de NaCl, pH 8.0.
Fig. 36. Análisis de SDS-PAGE de
varios clones después de la expresión a pequeña escala de la
proteína de fusión GST-CT1 de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada N-terminalmente con (His)_{6}.
Partes alícuotas del lisado celular (véase el Ejemplo 90 y 105)
fueron mezcladas con tampón de carga SDS (reductor) y calentadas
durante 1 min. a 100ºC. Las muestras fueron luego cargadas sobre un
gel SDS-poliacrilamida al 12% y realizadas durante
un periodo de tiempo apropiado. Aproximadamente 60 \mul de lisado
celular y 30 \mul de los marcadores de peso molecular [BenchMark
Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.) y 10 kDa de
Protein Ladder (Gibco BRL))] fueron cargadas sobre el gel. Un
transformante pGEX3XGST (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia)
sirvió como control positivo. El componente de r-GST
de la proteína de fusión r-GST etiquetada en
N-terminal está truncada por 1 aminoácido en el
extremo C-terminal. El GST parental es expresado
como la proteína de longitud total con 14 aminoácidos adicionales
C-terminales. Consecuentemente, el GST parental
contiene 15 aminoácidos adicionales en su extremo
C-terminal y en consecuencia es hecho fluir aprox.
1.65 kDa más que el componente de GST de la proteína de fusión de
r-GST etiquetada en N-terminal. Las
células de la cepa JM105 de E. coli transformadas con pTrc
sirvieron como control negativo. Para visualizar las bandas, el gel
fue coloreado con azul de Coomassie.
Clave para gel 1 mostrado como Fig. 36
Fila 1, GST-CT1 clon nº. 1; Fila 2,
GST-CT1 clon nº. 2; Fila 5, GST-CT1
clon nº. 3; Fila 6, GST-CT1 clon nº. 4; fila 7,
GST-CT1 clon nº. 5; Fila 11,
GST-CT1 clon nº. 6; Fila 12, GST- CT1 clon nº. 7;
Fila 13, GST-CT1 clon nº. 8; Fila 14,
GST-CT1 clon nº. 9; Fila 15, GST-CT1
clon nº. 10; Fila 8, control negativo que consiste en JM105 de
E. coli transformada con pTrc; Fila 9, control positivo que
consiste en JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST.
Marcadores de peso molecular están mostrados en las Filas 3, 4 y
10.
Fig. 37. Análisis de SDS-PAGE de
varios clones después de la expresión a pequeña escala de la
proteína de fusión GST-CT2 de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His-Gln)_{6}
N-terminalmente. Partes alícuotas de lisado celular
(véase ejemplo 90 y 105) fueron mezcladas con tampón de carga SDS
(reductor) y calentadas durante 1 min. a 100ºC. Las muestras fueron
luego cargadas sobre un gel de SDS-poliacrilamida
al 12% y hechas fluir durante un periodo temporal apropiado.
Aproximadamente 60 \mul de lisado celular y 30 \mul de los
marcadores de peso molecular [BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL,
Bethesda, MD, E.E.U.U.) y 10 kDa de Protein Ladder (Gibco BRL)]
fueron cargadas sobre el gel. Un transformante pGEX3XGST (Amersham
Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control positivo. El
componente de r-GST de la proteína de fusión
r-GST etiquetada en N-terminal es
truncado por 1 aminoácido en el extremo C-terminal.
La GST parental es expresada como la proteína de longitud total con
14 aminoácidos adicionales C-terminales.
Consecuentemente, la GST parental contiene 15 aminoácidos
adicionales en su extremo C-terminal y en
consecuencia es hecha fluir aprox. 1.65 kDa más que el componente de
GST de la proteína de fusión de r-GST etiquetada en
N-terminal. Las células de la cepa JM105 de E.
coli transformadas con pTrc sirvieron como control negativo.
Para visualizar las bandas, el gel fue coloreado con azul de
Coomassie.
Clave para gel 2 mostrado como Fig. 37:
Fila 1, GST-CT2 clon nº. 1; Fila 2,
GST-CT2 clon nº. 2; Fila 3, GST-CT2
clon nº. 3; Fila 6, GST-CT2 clon nº. 4; Fila 7,
GST-CT2 clon nº. 5; Fila 11, GST-CT2
clon nº. 6; Fila 12, GST-CT2 clon nº. 7; Fila 13,
GST-CT2 clon nº. 8; Fila 14, GST-CT2
clon nº. 9; Fila 15, GST-CT2 clon nº. 10; Fila 8,
control negativo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; Fila 9, control positivo que consiste en
JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST. Marcadores de
peso molecular están mostrados en las Filas 4, 5 y 10.
Fig. 38. Análisis de SDS-PAGE de
varios clones después de la expresión a pequeña escala de la
proteína de fusión GST-NT1 de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada N-terminalmente. Partes alícuotas del
lisado celular (véase ejemplo 90 y 107) fueron mezcladas con tampón
de carga SDS (reductor) y calentadas durante 1 min. a 100ºC. Las
muestras fueron luego cargadas sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 12% y hecho fluir durante un
periodo temporal apropiado. Aproximadamente 60 \mul de lisado
celular y 30 \mul de los marcadores de peso molecular [BenchMark
Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.) y 10 kDa Protein
Ladder (Gibco BRL)] fueron cargados sobre el gel. Un transformante
pGEX3XGST (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control
positivo. El componente de r-GST de la proteína de
fusión r-GST etiquetada en
N-terminal está truncado por 1 aminoácido en el
extremo C-terminal. La GST parental es expresada
como la proteína de longitud total con 14 aminoácidos adicionales
C-terminales. Consecuentemente, la GST parental
contiene 15 aminoácidos adicionales en su extremo
C-terminal y en consecuencia funciona aprox. 1.65
kDa más grande que el componente de GST de la proteína de fusión de
r-GST etiquetada en N-terminal. Las
células de la cepa JM105 de E. coli transformada con pTrc
sirvió como control negativo. Para visualizar las bandas, el gel
fue coloreado con azul de Coomassie.
Clave para gel 3 mostrada como Fig. 38:
Fila 1, GST-NT1 clon nº.1; Fila 2,
GST-NT1 clon nº. 2; Fila 3, GST-NT1
clon nº. 3; Fila 4 GST-NT1 clon nº. 4; Fila 7,
GST-NT1 clon nº. 5; Fila 11,
GST-NT1 clon nº. 6; Fila 12, GST-NT1
clon nº. 7; Fila 13, GST-NT1 clon nº. 8; Fila 14,
GST-NT1 clon nº. 9; Fila 15, GST-NT1
clon nº. 10; Fila 8, control negativo que consiste en JM105 de
E. coli transformada con pTrc; fila 9, control positivo que
consiste en JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST.
Marcadores de peso molecular están mostrados en las Filas 5, 6 y
10.
Fig. 39. Análisis de SDS-PAGE de
varios clones después de la expresión a pequeña escala de la
proteína de fusión GST-NT2 de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal. Partes alícuotas de lisado
celular (véase Ejemplo 90 y 108) fueron mezcladas con tampón de
carga SDS (reductor) y calentadas durante 1 min. a 100ºC. Las
muestras fueron luego cargadas sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 12% y funcionaron durante un
periodo temporal apropiado. Aproximadamente 60 \mul de lisado
celular y 30 \mul de los marcadores de peso molecular [BenchMark
Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.) y 10 KDa Protein
Ladder (Gibco BRL)] fueron cargados sobre el gel. Un transformante
pGEX3XGST (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control
positivo. El componente de r-GST de la proteína de
fusión r-GST etiquetada en
N-terminal es truncado por 1 aminoácido en el
extremo C-terminal. La GST parental es expresada
como la proteína de cuerpo entero con 14 aminoácidos adicionales
C-terminales. Consecuentemente, la GST parental
contiene 15 aminoácidos adicionales en su extremo
C-terminal y en consecuencia funciona aprox. 1.65
kDa más grande que el componente de GST de la proteína de fusión
r-GST etiquetada en N-terminal. Las
células de la cepa JM105 de E. coli transformadas con pTrc
sirvieron como control negativo. Para visualizar las bandas, el gel
fue teñido con azul de Coomassie.
Clave para gel 4 mostrada como Fig. 39:
Fila 1, GST-NT2 clon nº. 1; Fila 2,
GST-NT2 clon nº. 2; Fila 3, GST-NT2
clon nº. 3; Fila 4 GST-NT2 clon nº. 4; Fila 5,
GST-NT2 clon nº. 5; Fila 11,
GST-NT2 clon nº. 6; Fila 12, GST-NT2
clon nº. 7; Fila 13, GST-NT2 clon nº. 8; Fila 14,
GST-NT2 clon nº. 9; Fila 8, control negativo que
consiste en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila 9,
control positivo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST. Marcadores de peso molecular están
mostrados en las Filas 6, 7 y 10.
Fig. 40 Análisis de SDS-PAGE de
lisados celulares brutos después de la expresión de proteína a
pequeña escala de las proteínas de fusión de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetadas en N-terminal de clones seleccionados
por sus niveles de expresión altos. Partes alícuotas de lisado
celular (véase Ejemplo 90 y 108) fueron mezclados con tampón de
carga SDS (reductor) y calentadas durante 1 min. a 100ºC. Las
muestras fueron luego cargadas sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 12% y hecho fluir durante un
periodo temporal apropiado. Aproximadamente 2 \mul de lisado
celular y 1 \mul del marcador de peso molecular [BenchMark
Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.)] fueron cargados
sobre el gel. Un transformante pGEX3XGST (Amersham Pharmacia,
Uppsala, Suecia) sirvió como control positivo. El componente de
r-GST de la proteína de fusión r-GST
etiquetada en N-terminal está truncada por 1
aminoácido en el extremo C-terminal. La GST parental
es expresada como la proteína de longitud total con 14 aminoácidos
adicionales C-terminales. Consecuentemente, la GST
parental contiene 15 aminoácidos adicionales en su extremo
C-terminal y en consecuencia funciona aprox. 1.65
kDa más grande que el componente de GST de las proteínas de fusión
r-GST etiquetadas en N-terminal.
Las células de la cepa JM105 de E. coli transformadas con
pTrc sirvieron como control negativo. Para visualizar las bandas, el
gel fue teñido de plata.
Clave para gel 5 mostrada como Fig. 40:
Fila 1, GST-CT1 clon nº. 7; Fila 2,
GST-CT2 clon nº. 6; Fila 6, GST-NT1
clon nº. 1; Fila 7, GST-NT2 clon nº. 7; Fila 4,
control negativo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; Fila 5 control positivo que consiste en
JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST. El marcador de
peso molecular está mostrado en la fila 3.
Fig. 41 Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación batch de la proteína
de fusión GST-CT1 de la glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His)_{6} en N-terminal
obtenida de clones seleccionados para sus niveles de expresión.
Partes alícuotas de lisado celular y fracciones recogidas de la
purificación de lote (véase Ejemplo 93) fueron mezcladas con tampón
de carga SDS (reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos.
Aproximadamente 10 \mul de muestras de fracciones de purificación,
5 \mul de lisado celular de control positivo y negativo y 1.25
\mul de lisado celular que contiene la proteína de fusión
recombinante y 1 \mul del marcador de peso molecular [BenchMark
Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.)] fueron cargados
sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y
realizada durante un periodo temporal apropiado. Para visualizar
bandas, el gel fue teñido de plata. Un transformante pGEX3XGST
(Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control positivo.
El componente de r-GST de la proteína de fusión
r-GST etiquetada en N-terminal está
truncado por 1 aminoácido en el extremo C-terminal.
La GST parental es expresada como la proteína de longitud total con
un 14 aminoácidos adicionales C-terminales.
Consecuentemente, la GST parental contiene 15 aminoácidos
adicionales en su extremo C-terminal y en
consecuencia funciona aprox. 1.65 kDa más grande que el componente
GST de las proteínas de fusión r-GST etiquetadas en
N-terminal. Las células de la cepa JM105 de E.
coli transformada con pTrc sirvió como control negativo.
Clave para Gel 6 mostrado como Fig. 41:
Filas 3-5 contienen muestras GST-CT1
recogidas de una columna de Ni^{2+}-tacn
Sepharose^{TM} CL-6B mientras que las filas
6-8 contienen muestras de una columna de
Ni^{2+}-NTA Sepharose^{TM}
CL-6B. Las filas 3 y 6, corresponden a la fase de
lavado 2; las filas 4 y 7 corresponden a la fase de elución 1; las
Filas 5 y 8, corresponden a la fase de elución 2; la Fila 1,
control negativo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; la Fila 2, control positivo que consiste en
JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST; la Fila 10,
lisado celular bruto. Marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 9.
Fig. 42. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación batch de la proteína
de fusión GST-CT2 glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His-Gln)_{6} en
N-terminal obtenido de clones seleccionados para
partes alícuotas de niveles de expresión altos de lisado celular y
fracciones recogidas de la purificación batch (véase Ejemplo 111)
fueron mezcladas con tampón de carga SDS (reductor) y calentado a
100ºC durante 90 segundos. Aproximadamente 10 \mul de muestras de
fracciones de purificación, 5 \mul de lisado celular de control
positivo y negativo y 1.25 \mul de lisado celular que contiene la
proteína de fusión recombinante y 1 \mul de los marcadores de peso
molecular [BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD,
E.E.U.U. ))] fueron cargados sobre un gel de
SDS-poliacrilamida al 12% y hecho fluir durante un
periodo temporal apropiado. Para visualizar las bandas, el gel fue
teñido de plata. Un transformante pGEX3XGST (Amersham Pharmacia,
Uppsala, Suecia) sirvió como control positivo. El componente de
r-GST de la proteína de fusión r-GST
etiquetada en N-terminal es truncado por 1
aminoácido en el extremo C-terminal. La GST
parental es expresada como la proteína de longitud completa con 14
aminoácidos C-terminales adicionales.
Consecuentemente, la GST parental contiene 15 aminoácidos
adicionales en su extremo C-terminal y en
consecuencia funciona aprox. 1.65 kDa más grande que el componente
GST de las proteínas de fusión r-GST etiquetadas en
N-terminal. Las células de la cepa JM105 de E.
coli transformadas con pTrc sirvieron como control
negativo.
Clave para Gel 7 mostrado como Fig. 42:
las Filas 3-5 contienen muestras de
GST-CT2 recogidas de una columna de
Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B mientras que las Filas 6-8
contienen muestras de una columna de Ni^{2+}-nta
Sepharose^{TM} CL-6B. Las Filas 3 y 6
corresponden a la fase de lavado 2; las Filas 4 y 7 corresponden a
la fase de elución 1; las Filas 5 y 8, corresponden a la fase de
elución 2; la Fila 1, control negativo que consiste en JM105 de
E. coli transformada con pTrc; la Fila 2, control positivo
que consiste en JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST;
la Fila 9, lisado celular bruto. Marcador de peso molecular está
mostrado en la Fila 10.
Fig. 43. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación batch de la proteína
de fusión GST-NT1 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal obtenida de clones
seleccionados por sus niveles de expresión. Partes alícuotas de
lisado celular y fracciones recogidas de la purificación batch
(véase ejemplo 112) fueron mezcladas con tampón de carga SDS
(reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos. Aproximadamente
10 \mul de muestras de fracciones de purificación, 5 \mul de
positivo y lisado de célula de control negativo y 1.25 \mul de
lisado de célula que contiene la proteína de fusión recombinante y
1 \mul de los marcadores de peso molecular [BenchMark Protein
Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.)] fueron cargados sobre un
gel de SDS-poliacrilamida al 12% y funcionan
durante un periodo temporal apropiado. Para visualizar bandas, el
gel fue teñido de plata. Un transformante pGEX3XGST (Amersham
Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control positivo. El
componente de r-GST de la proteína de fusión
r-GST etiquetada en N-terminal es
truncado por 1 aminoácido en el extremo C-terminal.
El GST parental es expresado como la proteína de longitud completa
con 14 aminoácidos adicionales C-terminales.
Consecuentemente, la GST parental contiene 15 aminoácidos
adicionales en su extremo C-terminal y en
consecuencia corre aprox. 1.65 kDa más grande que el componente GST
de las proteínas de fusión r-GST etiquetadas en
N-terminal. Las células de la cepa JM105 de E.
coli transformadas con pTrc sirvieron como control
negativo.
Clave para Gel 8 mostrado como Fig. 43:
las Filas 5-7 contienen muestras de
GST-NT1 recogidas de una columna de
Ni^{2+}-tacn Sepharose CL-6B
mientras que las Filas 8-10 contienen muestras de
una columna de Ni^{2+}-NTA Sepharose
CL-6B. Las Filas 5 y 8 corresponden a la fase de
lavado 2; las Filas 6 y 9 corresponden a la fase de elución 1; las
Filas 7 y 10, corresponden a la fase de elución 2; la Fila 1,
control negativo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; Fila 2, control positivo que consiste en
JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST; la Fila 3,
lisado celular bruto. Marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 4.
Fig. 44. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación batch de las
proteínas de fusión GST-NT2 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetadas en N-terminal obtenidas de clones
seleccionados por sus niveles de expresión. Partes alícuotas de
lisado celular y fracciones recogidas de la purificación batch
(véase Ejemplo 113) fueron mezcladas con tampón SDS de carga
(reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos.
Aproximadamente 10 \mul de muestras de fracciones de purificación,
5 \mul de lisado celular de control positivo y negativo y 1.25
\mul de lisado celular que contiene la proteína de fusión
recombinante y 1 \mul de los marcadores de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.)]
fueron cargados sobre un gel de SDS-poliacrilamida
al 12% y hecho fluir durante un periodo temporal apropiado. Para
visualizar las bandas, el gel fue teñido de plata. Un transformante
pGEX3XGST (Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) sirvió como control
positivo. El componente de r-GST de la proteína de
fusión r-GST etiquetada en
N-terminal es truncado por 1 aminoácido en el
extremo C-terminal. La GST parental es expresada
como la proteína de longitud completa con 14 aminoácidos
adicionales C-terminales. Consecuentemente, la GST
parental contiene 15 aminoácidos adicionales en su extremo
C-terminal y en consecuencia funciona aprox. 1.65
kDa más grande que el componente GST de las proteínas de fusión
r-GST etiquetadas en N-terminal. Las
células de la cepa JM105 de E. coli transformadas con pTrc
sirvieron como control negativo.
Clave para Gel 8 mostrado como Fig. 44:
las Filas 5-7 contienen muestras
GST-NT2 recogidas de una columna de
Ni^{2+}-tacn Sepharose CL-6B
mientras que las Filas 8-10 contienen muestras de
una columna de Ni^{2+}-NTA Sepharose
CL-6B. Las Filas 5 y 8 corresponden a la fase de
lavado 2; las Filas 6 y 9 corresponden a la fase de elución 1; las
Filas 7 y 10, corresponden a la fase de elución 2; la Fila 1,
control negativo que consiste en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; la Fila 2, control positivo que consiste en
JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST; la Fila 4,
lisado celular bruto. Marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 3.
Fig. 45. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de las
proteínas de fusión GST-CT1 glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetadas con (His)_{6} en N-terminal
obtenidas de clones seleccionados por sus niveles de expresión.
Muestras de las eluciones graduales del lisado celular conteniendo
GST-CT1, como se describe en el Ejemplo 97, fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC
durante 90 segundos. Partes alícuotas de 10 \mul desde el primer
1 ml de las fracciones eluidas y 2.5 \mul de lisado celular
fueron cargados en un gel de SDS-poliacrilamida al
12.5%. El gel fue hecho fluir durante un periodo temporal apropiado
y luego teñido de plata para visualizar las bandas como se describe
en las leyendas para las Figuras 35-44.
Clave para Gel 10 mostrado como Fig. 45:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 100 mM; Fila 3, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5,
250 mM; Fila 6, 300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450
mM y Fila 10: 500 mM. El lisado celular está mostrado en la Fila
2.
Fig. 46. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-CT2 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His-Gln)_{6} en
N-terminal obtenida de clones seleccionados por sus
niveles de expresión. Muestras de la elución gradual de lisado
celular que contienen GST-CT2, como se describe en
el ejemplo 98, fueron mezcladas con tampón de carga SDS (no
reductor) y calentado a 100ºC durante 90 segundos. Partes alícuotas
de 10 \mul desde el primer 1 ml de las fracciones eluidas y 2.5
\mul de lisado celular fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12.5%. El gel fue hecho fluir
durante un periodo temporal apropiado y luego teñido de plata para
visualizar las bandas como se describe en las leyendas para las
Figuras 35-44.
Clave para gel 11 mostrado como Fig. 46:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 3, 200 mM; Fila 4,
250 mM; Fila 6, 300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450
mM y Fila 10: 500 mM. Lisado celular está mostrado en la Fila
5.
Fig. 47. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-NT1 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal obtenida de clones
seleccionados por sus niveles de expresión altos. Muestras de la
elución gradual de lisado celular que contienen
GST-NT1, como se describe en el ejemplo 99, fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (no reductor) y calentada a 100ºC
durante 90 segundos. Partes alícuotas de 10 \mul desde el primer
1 ml de las fracciones eluidas y 2.5 RI de lisado celular fueron
cargados sobre un gel de SDS-poliacrilamida al
12.5%. El gel fue hecho fluir durante un periodo temporal apropiado
y luego teñido de plata para visualizar las bandas como se describe
en. las leyendas para las Figuras 35-44.
Clave para Gel 12 mostrado como Fig. 47:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 2, 100 mM; Fila 3, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5,
250 mM; Fila 6, 300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450
mM y Fila 10, 500 mM. Lisado celular está mostrado en la Fila
1.
Fig. 48. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-NT2 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal obtenida de clones
seleccionados por sus niveles de expresión. Muestras de la elución
gradual de lisado celular que contienen GST-NT2,
como se describe en el ejemplo 100, fueron mezcladas con tampón de
carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos.
Partes alícuotas de 10 \mul desde el primer 1 ml de las fracciones
eluidas y 2.5 \mul de lisado celular fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12.5%. El gel fue hecho fluir
durante un periodo temporal apropiado y luego teñido de plata para
visualizar las bandas como se describe en las leyendas para las
Figuras 35-44.
Clave para gel 13 mostrado como Fig. 48:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5,
250 mM; Fila 6, 300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450
mM y Fila 10: 500 mM. Lisado celular está mostrado en Fila 3.
Fig. 49. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-CT1 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His)_{6} en N-terminal
obtenido de clones seleccionados por sus niveles de expresión.
Muestras de la elución gradual del lisado celular que contienen
GST-CT1, como se describe en el ejemplo 101, fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC
durante 90 segundos. Aproximadamente partes alícuotas de 16 \mul
desde el primer 1 ml de cada fracción eluida y 0.5 \mul de
marcadores de peso molecular [BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL,
Bethesda, MD, E.E.U.U.)] fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12.5%. El gel fue hecho fluir
durante un periodo temporal apropiado y luego teñido de plata para
visualizar las bandas como se describe en la leyenda para las
Figuras 35-44.
Clave para Gel 14 mostrado como Fig. 49:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 2, 25 mM; Fila 3, 50 mM; Fila 4, 75 mM; Fila 5, 100
mM; Fila 6, 150 mM; Fila 7, 200 mM; Fila 8, 250 mM; Fila 9, 300 mM y
Fila 10, 350 mM. Marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 1.
Fig. 50. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-CT2 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada con (His-Gln)_{6}
N-terminal obtenida de clones seleccionados por sus
niveles de expresión altos. Muestras de la elución gradual de
lisado celular que contiene GST-CT2, como se
describe en el Ejemplo 102, fueron mezcladas con tampón de carga
SDS (no reductor) y calentado a 100ºC durante 90 segundos.
Aproximadamente partes alícuotas de 16 \mul desde el primer 1 ml
de cada fracción eluida y 0.5 \mul de marcadores de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD, E.E.U.U.)]
fueron cargados en un gel de SDS-poliacrilamida al
12.5%. El gel fue hecho fluir durante un periodo temporal apropiado
y luego teñido de plata para visualizar las bandas como se describe
en las leyendas para las Figuras 35-45.
Clave para Gel 15 mostrado como Fig. 50:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 25 mM; Fila 3, 50 mM; Fila 4, 75 mM; Fila 5, 100
mM; Fila 6, 150 mM; Fila 7, 200 mM; Fila 8, 250 mM; Fila 9, 300 mM y
Fila 10: 350 mM. Marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 2.
Fig. 51. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-NT1 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal obtenida de clones
seleccionados por sus niveles de expresión. Muestras de la elución
gradual de lisado celular que contiene GST-NT1,
como se describe en el ejemplo 103, fueron mezcladas con tampón de
carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos.
Partes alícuotas de aproximadamente 16 \mul desde el primer 1 ml
de cada fracción eluida y 0.5 \mul de marcadores de peso
molecular [BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL, Bethesda, MD,
E.E.U.U.)] fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12.5%. El gel fue hecho fluir
durante un periodo temporal apropiado y luego teñido de plata para
visualizar las bandas como se describe en las leyendas para las
Figuras 35-45.
Clave para Gel 16 mostrado como Figs. 51:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5,
250 mM; Fila 6, 300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450
mM y Fila 10: 500 mM. Marcador de peso molecular está mostrado en
la Fila 3.
Fig. 52. Análisis de SDS-PAGE de
varias fracciones recogidas de la purificación gradual de la
proteína de fusión GST-NT2 de glutationa
S-transferasa recombinante (r-GST)
etiquetada en N-terminal obtenida de clones
seleccionados por sus niveles de expresión. Muestras de la elución
gradual de lisado celular que contiene GST-NT2,
como se describe en el Ejemplo 104, fueron mezcladas con tampón de
carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC durante 90 segundos.
Partes alícuotas de aproximadamente 16 \mul desde el primer 1 ml
de cada fracción eluida y 0.5 \mul de marcadores de peso
molecular [BenchMark Protein Ladder] (Gibco BRL, Bethesda, MD,
E.E.U.U.) fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12.5%. El gel fue hecho fluir
durante un periodo temporal apropiado y luego teñido de plata para
visualizar bandas como se describe en las leyendas para las Figuras
35-45.
Clave para Gel 17 mostrado como Fig. 52:
las Fracciones fueron recuperadas usando el sistema de tampón A
(Tabla 1) suplementado con las concentraciones siguientes de
imidazol: Fila 1, 50 mM; Fila 2, 75 mM; Fila 3, 100 mM; Fila 5, 150
mM; Fila 6, 200 mM; Fila 7, 250 mM; Fila 8, 300 mM; Fila 9, 350 mM y
Fila 10: 400 mM. El marcador de peso molecular está mostrado en la
Fila 4.
Fig. 53. Espectro 1: espectro
MALDI-TOF MS para la proteína de fusión
GST(FL)-CT2 no tratada con
DAP-1, i.e. el control negativo. Muestra un único
pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de 28,013
\pm 3,21 Dalton. La masa molecular prevista teórica isotópica de
GST(FL)-CT2 es 28,007.3 Dalton. Por
comparación adjunta, la masa observada es así consistente con la
proteína GST(FL)-CT2 que está intacta.
Espectro 2: espectros MALDI-TOF MS obtenidos
para GST(FL)-CT2 digeridos con
DAP-1; el espectro demuestra masa molecular
disminuida después del tratamiento de la proteína de fusión con
DAP-1 durante 2 horas. Espectro 2 muestra un pico
más importante (2a) con un valor [M+H]^{+} promedio de
26,154 \pm 6 Dalton, y un pico menor (2b) con un valor
[M+H]^{+} promedio de 25,931 \pm 7,51 Dalton.
Fig. 54. Espectro 1: espectro
MALDI-TOF MS para la
GST(FL)-NT1 no tratada con
DAP-1, i.e. el control negativo. Muestra un único
pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de 27,972
\pm 3,51 Dalton; por comparación con la masa molecular prevista
teórica de 27,965.3 Dalton para GST(FL)-NT1
la masa observada es consistente con la proteína que está intacta.
Espectro 2: espectros MALDI-TOF MS obtenidos
para la GST(FL)-NT1 digerida con
DAP-1 (2 hr). El espectro demuestra una masa
molecular disminuida después del tratamiento con
DAP-1. Espectro 2 muestra un pico más importante
(2a) con un valor [M+H]^{+} promedio de 26,659 \pm 6,81
Dalton. También muestra un pico menor (2b) con un valor
[M+H]^{+} promedio de 25,934 \pm 3,21 Dalton, y otro
pico menor (2c) con un valor [M+H]^{+} promedio de 25,680
\pm 6,03 Dalton.
Fig. 55. Espectro 1: espectro
MALDI-TOF MS para la
GST(FL)-NT2 no tratada con
DAP-1, i.e. el control negativo. Muestra un único
pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de 28,223
\pm 2,89 Dalton; por comparación con la masa molecular prevista
teórica de 28,218.6 Dalton para GST(FL)-NT2
la masa observada es consistente con la proteína que está intacta.
Espectro 2: espectros MALDI-TOF MS obtenidos
para GST(FL)-NT2 digerida con
DAP-1 (2 hr). El espectro demuestra una masa
molecular disminuida después del tratamiento con
DAP-1. Espectro 2 muestra un pico más importante
(2a) con un valor [M+H]^{+} promedio de 25,910 \pm 9,16
Dalton, y un pico menor (2b) con un valor [M+H]^{+}
promedio de 25,648 \pm 12,86 Dalton.
Fig. 56. Clave para gel: Fila 4,
GST(FL)-CT2 antes del tratamiento con
DAP-1; Fila 5, GST(FL)-CT2
después del tratamiento con DAP-1; Fila 6,
GST(FL)-NT1 antes del tratamiento con
DAP-1; Fila 7, GST(FL)-NT1
después del tratamiento con DAP-1; Fila 8,
GST(FL)-NT2 antes del tratamiento con
DAP-1; Fila 9, GST(FL)-NT2
después del tratamiento con DAP-1. Filas 1: 3 y 10
fueron blancos. Marcadores de peso molecular están mostrados en la
Fila 2.
Fig. 57. Clave para gel: Fila 2,
GST-CT1 purificada en columna
Ni^{2+}-tacn; Fila 3, GST-CT2
purificada en columna de Ni^{2+}-tacn; Fila 4,
GST-NT1 purificada en columna
Ni^{2+}-tacn; Fila 5, GST-NT2
purificada en columna de Ni^{2+}-tacn; Fila 6,
GST-CT1 purificada en columna
Cu^{2+}-tacn; Fila 7, GST-CT2
purificada en columna Cu^{2+} tacn; Fila 8,
GST-NT1 purificada en columna
Cu^{2+}-tacn; Fila 9, GST-NT2
purificada en columna Cu^{2+}-tacn. Marcador de
peso molecular está mostrado en Fila 1.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique lo contrario, todos los
reactivos empleados fueron de pureza de grado reactivo de
laboratorio estándar o de mayor pureza y fueron obtenidos de
proveedores establecidos. CH_{3}CN fue secado en tamices
moleculares 4 A.
Sepharose^{TM} CL-4B y otros
tipos de Sepharose^{TM}, Superose^{TM} y productos basados en
agarosa relacionados fueron comprados a Amersham Pharmacia
(Uppsala, Suecia). Agua destilada o Milli-Q^{TM}
fue usada en todas partes.
El ligando 1,4,
7-triazaciclononano que coordina el ión metálico
(abreviado tacn o TACN) (que puede ser comprado a
Sigma-Aldrich Company, St. Louis, MO, EEUU) puede
ser preparado usando la reacción de Richman-Atkins
[J.E. Richman and T.J. Atkins, Journal of the American Chemical
Society, 96 (1974) 2268; J.E. Richman, W.F. Oettle and T.J. Atkins,
Organic Synthesis 58 (1978) 86]. La sal de trihidrobromuro de tacn
empleada en los siguientes se obtuvo por cristalización del ligando
libre de 5M de ácido bromhídrico.
1,2-Bis(1,4,7-triazaciclononanil)etano
(abreviado dtne, DTNE o L^{eth}) y
1,3-bis(1,4,7-triazaciclononanil)propano
(abreviado dtnp, DTNP o L^{prop}) puede ser preparado como se
describe por Wieghardt et al. [Inorg. Chem. 24 (1985) 1230].
1,4-Bis(1,4,7-triazaciclononanil)butano
(abreviado dtnb, DTNB o L^{but}) puede ser preparado como se
describe por Sessler et al [Inorganic Chemistry, 29 (1990)
4143] o por Zhang et al. [Inorganic Chemistry, 34 (1995)
2883]. Estos tres últimos compuestos fueron aislados como las sales
de hexakis-hidrobromuro.
Análogos de los últimos ligandos
bis(1,4,7-triazaciclononanil) con grupos de
conexión derivados de o-, m- o p-xileno, es
decir:
entre los dos grupos
1,4,7-triazaciclononanilo, en vez de
-(CH_{2})_{n}- puentes (n = 2,3 o 4), pueden ser
preparados, como las sales de hexakis-hidrobromuro,
como se describe por Graham et al. [Inorganic Chemistry 36
(1997) 6366] o por Farrugia, L.J., Lovatt, P.A. y Peacock, R.D.
[Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions (1997)
911-912]. Estos ligandos son abreviados aquí como
L^{ox}, L^{mx} y L^{px},
respectivamente.
Los ligandos
tris(1,4,7-triazaciclononanil)
correspondientes con tres grupos
1,4,7-triazaciclononanilo enlazados a un grupo
central derivado de mesitileno, es decir.
al igual que ligandos
tetrakis(1,4,7-triazaciclononanil) con cuatro
grupos 1,4,7-triazaciclononanilo enlazados a un
grupo central derivado de dureno, es
decir.
puede ser preparado, como las sales
nonakis- y dodecakis-hidrobromuro, respectivamente,
como se describe por Spiccia et al. [Journal of the Chemical
Society, Dalton Transactions (1997) 1092] y Graham et al.
[Inorganic Chemistry 39 (2000) 1092],
respectivamente.
Análisis de nitrógeno fueron realizados por
Dairy Technical Services Ltd., Melbourne, Australia. Análisis de
cobre y de níquel fueron realizados en un espectrómetro de
absorción atómica Varian AA-1475. Espectros
electrónicos de reflectancia difusa fueron registrados en un
espectrofotómetro Cary 5G. Espectros de ESR fueron registrados a
77K en un espectrómetro Varian E-12 a aprox. 9.6
GHz (Banda X) y referenciada como
\alpha,\alpha'-difenil-\beta-dipicrilhidrazil
(DPPH), que tiene un valor g de 2.0036. Las muestras fueron
realizadas en tubos ID de 3 mm normales y congeladas en un
criostato de flujo de nitrógeno líquido.
La primera fase en inmovilización del reactivo
quelante (tacn) en la matriz (sustrato) implicó la activación
covalente de la matriz con epiclorohidrina (u otro compuesto
activante adecuado, tal como carbonil-diimidazol).
Así, gel de Sepharose^{TM} CL-6B (10 g, peso
mojado) fue mezclado con 10 ml de 2 M de NaOH y 37.5 mg de
borohidruro de sodio (98%). Después de que la mezcla haya sido
incubada durante 2 horas a 25ºC, 12 ml de epiclorohidrina fueron
añadidos y la mezcla fue luego suavemente agitada durante toda la
noche a 25ºC. El gel de Sepharose^{TM} resultante activado con
epoxi fue recuperado por succión I filtración y luego lavado
íntegramente con agua Milli-Q^{TM} para eliminar
cualquier resto de epiclorohidrina sin reaccionar. Volúmenes de
soluciones de ligando de 0.1 M tacn fueron luego preparadas
disolviendo 5 mmol de la sal de trihidrobromuro de tacn en agua (30
ml), ajustando el pH a 11 por adición de NaOH sólido, y luego
haciendo el volumen final hasta 50 ml con agua. Partes alícuotas de
esta solución (20 ml) fueron luego añadidas a partes de 10 g (peso
secado por succión) del Sepharose^{TM} CL-6B
activada con epoxi preparada como arriba. Las suspensiones fueron
mezcladas durante toda la noche a 25ºC usando un baño de agua con
agitación. Las partes resultantes de gel funcionalizado fueron
recogidas por filtración de succión (usando una bomba de agua) y
lavadas extensivamente con agua Milli-Q^{TM} (5 x
200 ml), 50 mM de tampón de acetato sódico (50 ml) conteniendo 0.1
M de KNO_{3} (pH 4.0), y finalmente con agua
Milli-Q ' (5 x 200 ml). Las partes de adsorbente
in-tacn fueron posteriormente suspendidas en 20 ml de una
solución de etanol/agua 20% (v/v) y almacenadas a 4ºC hasta ser
usadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 1, excepto que el volumen final
de 0.1 M de solución de ligando dtne usado fue 25 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 1, excepto que el volumen final
de 0.1 M de solución de ligando de dtnp usado fue 25 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Normalmente, aproximadamente 5 g (peso mojado)
de adsorbente in-tacn fue incubado a 25º C durante 30
minutos con 50 ml de una solución de 50 mM de una sal de nitrato de
un ión metálico de dureza dudosa, es decir.
Cu(NO_{3})_{2}, Ni(NO_{3})_{2},
Zn(NO_{3})_{2}, Co(NO_{3})_{2},
Mn(NO_{3})_{2} o Cr(NO_{3})_{3},
respectivamente, preparada en agua Milli-Q^{TM}.
Los adsorbentes de ión metálico inmovilizados (geles) fueron luego
íntegramente lavados con agua Milli-Q^{TM} (5 x
200 ml). Para eliminar iones metálicos débilmente enlazados de los
adsorbentes, 50 mM de tampón acetato sódico que contiene 0.1 M
KNO_{3}, pH 4.0, fueron incubados durante 10 minutos con los
geles adsorbentes del metal inmovilizados en una proporción de 5 g
(peso mojado) de adsorbente a 50 ml de tampón. Los geles fueron
luego lavados extensivamente con agua
Milli-Q^{TM}. Las partes de los distintos
adsorbentes de ión metálico inmovilizados (geles) fueron
posteriormente suspendidas en 20 ml de una solución al 20% (v/v) de
etanol en agua y almacenadas a 4ºC hasta el uso.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento empleado fue completamente
análogo a aquel del ejemplo 4, pero usando partes de
aproximadamente 5 g (peso mojado) de adsorbente
in-dtne.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento empleado fue completamente
análogo a aquel del ejemplo 4, pero usando partes de
aproximadamente 5 g (peso mojado) de adsorbente
in-dtnp.
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra fresca de sangre humana (20 ml) fue
permitida para instalar durante 24 horas a 4ºC para eliminar los
glóbulos rojos y el fibrinógeno. El suero sobrenadante fue
centrifugado a 5000 x g y 4ºC durante 20 min, usando un
centrifugador refrigerado Sorvall^{TM} RT6000 (DuPont Co.,
Newtown, CT, E.E.U.U.). El sobrenadante fue eliminado y
centrifugado otra vez a 5000 x g y 4ºC durante 20 min. Partes
alícuotas (0.2 ml) del sobrenadante fueron dispensadas en tubos de
1.5 ml y almacenadas a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El adsorbente
in-Cu^{2+}-dtne (1 ml) fue
empaquetado en una Econo-columna
Bio-Rad ^{TM} [de este tipo como una columna 4.0
cm (longitud) x 0.8 cm (i.d., i.e. diámetro interno)] (Hércules,
CA, E.E.U.U.) y equilibrado con un tampón de equilibrado que
contiene 20 mM de carbonato sódico y 0.1 M de NaCl, pH 9.5 (cf.
Tabla 1). Una alícuota de suero humano (200 \mul), diluida cinco
veces con el tampón de equilibrado, fue añadida a la columna
equilibrada. Después de la carga de la muestra de suero humano en
un periodo de 5 minutos, el tampón de equilibrado (300 \mul) fue
añadido para lavar cualquier muestra de las paredes de las columnas
en el gel. Después de 5 minutos de tampón de equilibrado (5 ml) fue
introducido en el depósito de columna para eluir las proteínas no
enlazadas. Las fracciones recogidas (aprox. 5.5 ml) fueron
denominadas las fracciones no enlazadas. Proteínas séricas humanas
enlazadas fueron eluidas del adsorbente usando una serie de
tampones de elución (5 ml) catalogados en la Tabla 1. Las
fracciones recogidas fueron denominadas las fracciones eluidas.
\newpage
El contenido de proteína en las fracciones no
enlazadas y las fracciones eluidas fueron analizadas usando ensayos
de Bio-Rad ^{TM} Dye y ácido bicinconínico (BCA)
(Fig. 1). Proteínas en estas fracciones fueron identificadas por
SDS-PAGE (Fig. 2). Todos los procedimientos de
adsorción y de desorción fueron realizados a la temperatura
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 7, excepto que el tampón de
equilibrado usado fue un tampón fosfato potásico 20 mM que contiene
0.1 M de NaCl, pH 7.0 (cf. Tabla 2), y que las proteínas séricas
humanas enlazadas fueron eluidas de los adsorbentes con una serie
de tampones de elución (5 ml) que están catalogados en la Tabla 2.
Los resultados están mostrados en la Fig. 3 y Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el tampón de
equilibrado usado fue 20 mM de tampón acetato sódico que contiene
0.1 M de NaCl, pH 4.0 (cf. Tabla 3), y que las proteínas séricas
humanas enlazadas fueron eluidas de los adsorbentes con una serie
de tampones de elución (5 ml) que están catalogados en la Tabla 3.
Los resultados están mostrados en la Fig. 5 y Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Cu^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1 y Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Cu^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3 y Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Cu^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5 y Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1 y Fig. 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM}CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3 y Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5 y Fig. 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1 y Fig. 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3 y Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Ni^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5 y Fig. 6.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtne en
Sepharose CL-6B. Los resultados están mostrados en
la Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Co^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 7, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 1 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 8, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 3 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 9, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 5 y Fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Un sistema FPLC programado (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Suecia) fue usado a lo largo de estos
procedimientos de separación. El adsorbente
in-Cu^{2+}-dtne/Sepharose^{TM}
CL-6B (1 ml) fue empaquetado en columnas Amersham
Pharmacia^{TM} HR5/10 (volumen empaquetado 5 cm X 0.5 cm i.d.). Un
nivel de flujo de 0,5 ml/min fue empleado a lo largo de los
procedimientos cromatográficos. La columna fue equilibrada usando
tampón de equilibrado (véase abajo). La solución de suero humano
(200 \mul), diluida cinco veces con tampón de equilibrado, fue
cargada en la columna preparada a través de un bucle de inyección
de 200 \mul. Todos los procedimientos de elución de lavado y de
gradiente están descritos abajo. Un monitor single path de
Pharmacia^{TM} UV-1 (280 nm), una grabadora de
dos canales REC-482 y un registrador de datos
computarizado fueron empleados para controlar y registrar perfiles
cromatográficos de las proteínas séricas humanas. Todas las
fracciones fueron recogidas con un recolector de fracciones
FRAC-100 como fracciones de 1 ml, y analizadas
usando métodos de Bio-Rad^{TM} Dye y ácido
bicinconínico (BCA). Las fracciones
de valor máximo fueron analizadas por SDS-PAGE. Los resultados están mostrados en las Fig. 8 y Fig. 9.
de valor máximo fueron analizadas por SDS-PAGE. Los resultados están mostrados en las Fig. 8 y Fig. 9.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón equilibrado:
- de 20 mM de tampón carbonato sódico/0,1 M de NaCl, pH 9.5.
- Tampón de lavado:
- 15 ml de tampón de equilibrado
- Procedimientos de elución:
- 1) 10 ml de gradiente lineal de pH tras 20 min, de 20 mM de tampón carbonato sódico/100 mM de NaCl, pH 9.5, a 20 mM de tampón acetato sódico/100 mM. NaCl, pH 4.0;
- \quad
- 2) 10 ml de gradiente de concentración de sal lineal tras 20 min, de 0.1 M a 1.0 M de NaCl en 20 mM de tampón acetato sódico, pH 4.0;
- \quad
- 3) 10 ml de gradiente de concentración de imidazol lineal tras 20 min, de 0 a 250 mM de imidazol en 20 mM de tampón acetato sódico/1,0 M de NaCl, pH 4.0.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 31, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B y que el protocolo de elución siguiente fue
usado. Los resultados están mostrados en las Fig. 10 y Fig. 11.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de equilibrado:
- 20 mM de tampón carbonato sódico/0,1 M de NaCl, pH 9.5.
- Tampón de lavado:
- 5 ml de tampón de equilibrado
- Procedimientos de elución:
- 1) 5 ml de gradiente lineal de pH tras 10 min, de 20 mM de tampón carbonato sódico/0,1 M de NaCl, pH 9.5, a 20 mM de tampón acetato sódico/0.1 M de NaCl, pH 4.0;
- \quad
- 2) 2 ml de 20 mM de tampón acetato sódico/0,1 M de NaCl, pH 4.0;
- \quad
- 3) 7 ml de gradiente de concentración de sal lineal tras 14 min, de 0,1 M a 1,0 M de NaCl en 20 mM de tampón acetato sódico, pH 4.0;
- \quad
- 4) 1 ml de 20 mM de tampón acetato sódico/1,0 M de NaCl, pH 4.0;
- \quad
- 5) 5 ml de gradiente de imidazol lineal tras 10 min, de 0 a 250 mM de imidazol en 20 mM de tampón acetato sódico/1,0 M de NaCl, pH 4.0;
- \quad
- 6) 1 ml de 20 mM de tampón acetato sódico/1,0 M de NaCl y 250 mM de imidazol, pH 4.0.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 31, excepto que el adsorbente
usado fue in-Cu^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B y que el protocolo de elución
siguiente fue usado. Los resultados están mostrados en las Fig. 12
y Fig. 13.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón de equilibrado:
- 20 mM de tampón carbonato sódico/0,1 M de NaCl, pH 9.5.
- Tampón de lavado:
- 10 ml de tampón de equilibrado
- Tampones de elución:
- tampón A: 20 mM de tampón carbonato sódico/1,0 M de NaCl, pH 9.5;
- \quad
- tampón B: 20 mM de tampón acetato sódico/1,0 M de NaCl, pH 4.0.
- Procedimientos de elución:
- 1) 10 ml de gradiente de concentración de sal lineal tras 20 min, de 0,1 M a 1,0 M de NaCl en 20 mM de tampón carbonato sódico, pH 9.5;
- \quad
- 2) 1 ml de tampón A;
- \quad
- 3) 5 ml de gradiente lineal tras 10 min, de tampón A a tampón B; composición de tampón final: 50% tampón A y 50% tampón B;
- \quad
- 4) 8 ml de una mezcla 50:50 v/v de tampón A y tampón B;
- \quad
- 5) 5 ml de gradiente lineal tras 10 min, de tampón A 50/50 v/v + tampón B al 100% tampón B;
- \quad
- 6) 10 ml de 20 mM de tampón acetato sódico/1.0 M de NaCl, pH 4.0.
\vskip1.000000\baselineskip
Una Econo-columna
Bio-Rad^{TM} [normalmente una columna de tamaño de
4,0 cm (longitud) x 0,8 cm (i.d.) a 12 cm (longitud) x 1,5 cm
(i.d.)] (Hércules, CA, E.E.U.U.) conteniendo de 0,5 ml a 20 ml del
gel
in-Cu^{2+}-tacn/Sepharose^{TM}
CL-6B fue equilibrado con un tampón de equilibrado
comprendiendo 50 mM de tampón fosfato sódico, 300 mM de cloruro
sódico y 10% de glicerol, pH 8.0. Una alícuota de una proteína de
fusión parcialmente purificada,
GST-\deltaATPasa-His_{6}
(producida en una cepa K12 DH5alphaF' de E. coli. El origen
de la cepa DH5alfaF' y genotipo es como sigue: F',
80dlacZ\DeltaM15, endA1. recA1, hsdR17 (rk^{-}, mk^{+}),
supE44, thi-1, gyrA96, relA1,
\Delta(lacZYA-argF)U169, deoR,
\lambda-[véase
http://wheat.Dw.usda.gov/papaaes/probes/strains.html]. El
lisado celular de E. coli bruto, conteniendo la proteína
recombinante
GST-\deltaATPAsa-His_{6} diana
producida por ruptura celular del granulado celular recogido de
E. coli del sistema de expresión celular (0,3 ml para una
columna 4.0 cm X 0.8 cm, y partes alícuotas proporcionalmente más
grandes para columnas más grandes), fue cargada sobre la columna.
El tampón de equilibrado (5 ml para una columna de 4,0 cm X 0,8 cm,
y volúmenes proporcionalmente más grandes para columnas más grandes)
fue usado para eluir proteínas no enlazadas o débilmente enlazadas.
Cuando ninguna proteína adicional fue eluida, volúmenes de tampón
de equilibrado conteniendo 20 mM de imidazol, 40 mM de imidazol y
250 mM de imidazol, respectivamente (volúmenes de 2 ml para una
columna de 4,0 cm X 0,8 cm, y volúmenes proporcionalmente más
grandes para columnas más grandes) fueron luego aplicados
consecutivamente para eluir las proteínas enlazadas, con fracciones
de 1 ml siendo recogidas. La concentración de proteína de
fracciones no enlazadas y eluidas fue determinada por los métodos
de reactivo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, E.E.U.U.) de ácido
bicinconínico (BCA) y Bio-Rad^{TM} Dye (BioRad,
Richmond, CA, E.E.U.U.), y la actividad enzimática fue determinada
usando el sustrato GST de
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB). El porcentaje de la proteína de fusión GST-\deltaATPasa-His_{6} enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
(CDNB). El porcentaje de la proteína de fusión GST-\deltaATPasa-His_{6} enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-tacn en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4. Separación y
purificación de proteínas séricas humanas usando adsorbente
Ni^{2+}-dtnp inmovilizado con tampón de unión pH
4.0
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Zn^{2+}-tacn en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Co^{2+}-tacn en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Mn^{2+}-tacn en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cr^{3+}-tacn en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Zn^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Co^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Mn^{2+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cr^{3+}-dtne en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\newpage
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Zn^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Co^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Mn^{2+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\alphaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 34, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cr^{3+}-dtnp en
Sepharose^{TM} CL-6B. El porcentaje de la proteína
de fusión
GST-\deltaATPasa-His_{6}
enlazada al adsorbente está dado en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El extracto bruto de E. coli (3 ml)
obtenido como en el Ejemplo 34 fue mezclado con 1 ml de gel
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B que fue equilibrado en presencia de 50 mM de
tampón fosfato sódico conteniendo 300 mM de cloruro sódico y 10% de
glicerol, pH 8.0 (tampón de equilibrado). Tras la incubación a 4ºC
durante 30 min, las mezclas fueron centrifugadas a 3,000 x g, 4ºC
durante 5 min y el sobrenadante fue eliminado. El granulado de gel
fue lavado dos veces con 5 ml de tampón de equilibrado para
eliminar las proteínas no enlazadas o débilmente enlazadas. El gel
lavado fue luego empaquetado en una Econo-columna
Bio-Rad^{TM} (10 ml) (Hércules, CA, E.E.U.U.). El
tampón de equilibrado (20 ml) fue adicionalmente usado para eluir
las proteína no enlazadas o débilmente enlazadas. Elución de las
proteínas retenidas fue conseguida por usando 10 ml del tampón de
equilibrado que contiene 125 mM de imidazol, pH 7.0 (tampón de
elución A) y usando 5 ml del tampón de equilibrado que contiene 250
mM de imidazol, pH 7.0 (tampón de elución B). Todas las fracciones
(1 ml) fueron recogidas y analizadas para el contenido de proteína
y actividad enzimática. La concentración de proteína de fracciones
no enlazadas y eluidas fue determinada por el ácido bicinconínico
(BCA) reactivo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, E.E.U.U.) de
ácido bicinconínico (BCA) y Bio-Rad^{TM} Dye
(BioRad, Richmond, CA, E.E.U.U.) y la actividad enzimática fue
determinada usando el sustrato GST de
1-cloro-2
4-dinitrobenceno (CDNB). Los resultados están
mostrados en las Figs. 14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Zn^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtne
Sepharose^{TM} CL- 6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 52, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en las Figs.
14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 52, excepto que el adsorbente
usado fue in-Zn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en las Figs. 14-16.
\vskip1.000000\baselineskip
El adsorbente
in-Ni^{2+}-tacn (1 ml) fue
empaquetado en columnas Pharmacia HR5/10 a una altura de 5 cm
(volumen empaquetado 5 cm X 0.5 cm i.d.). Un nivel de flujo de 0.5
ml/min fue empleado a lo largo de los procedimientos
cromatográficos. Después de que el gel ha sido equilibrado en
Econo-columns Bio-Rad^{TM} (10
ml) con el tampón de equilibrado (50 mM tampón de fosfato sódico
que contiene 300 mM de cloruro sódico y 10% de glicerol, pH 8.0), 2
ml del extracto de E. coli obtenido que se describe en el
ejemplo 52 fue cargado sobre la columna preparada por medio de un
bucle de inyección de 2 ml. El gel fue luego eluido con 15 ml del
tampón de equilibrado. Un gradiente lineal en aumento de 0 mM a 250
mM de imidazol en tampón de equilibrado (10 ml) tras un periodo de
20 minutos fue usado para este procedimiento de elución, seguido de
elución isocrática con 5 ml de tampón de equilibrado que contiene
250 mM de imidazol. Un monitor single path de Pharmacia^{TM}
UV-1 (280 nm), una grabadora de dos canales
REC-482 y un registrador de datos informatizados
fueron usados para controlar y registrar la curva cromatográfica
para las proteínas eluidas. Todas las fracciones (1 ml) fueron
recogidas con un recolector de fracciones
FRAC^{TM}-100. La concentración de proteína de
fracciones no enlazadas y eluidas fue determinada por los métodos
de reactivo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, E.E.U.U.) de ácido
bicinconínico (BCA) y Bio-Rad ^{TM} Dye (BioRad,
Richmond, CA, EEUU), y la actividad enzimática fue determinada
usando el sustrato GST de 1-cloro-2
4-dinitrobenceno (CDNB). Las fracciones de valor
máximo fueron caracterizadas por SDS-PAGE. Los
resultados están mostrados en las Figs. 17-18.
\vskip1.000000\baselineskip
El adsorbente
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B (1 ml), empaquetado en
Bio-Rad ^{TM} Econo-columns (10
ml), fue equilibrado con un tampón de equilibrado (50 mM tampón
fosfato sódico conteniendo 150 mM de cloruro sódico, pH 8.0). El
sobrenadante del caldo de levadura bruto (30 ml) obtenido de las
células de levadura de Saccharomyces cerevisiae modificado
creció en cultivo y que contenía el sistema de expresión para la
catepsina L5 recombinante de Fascicola hepatica (rF.h
catepsina L5) etiquetada con hexahistidina
C-terminal específica fue cargada en la columna de
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}.
Las fracciones de ruptura (fracciones no enlazadas) fueron
recogidas para determinación ulterior del contenido de proteína y
actividad enzimática. La columna fue luego lavada con 10 ml de
tampón de equilibrado para eliminar proteínas no enlazadas o
débilmente enlazadas. Una fase de lavado, usando 10 ml de 50 mM de
fosfato sódico que contiene 150 mM de NaCl, pH 6.0, fue luego
empleado para eluir las proteínas contaminantes. Luego, tres partes
alícuotas de 5 ml de este tampón de lavado adicional que contiene
125 mM de imidazol (tampón de elución A), 250 mM de imidazol (tampón
de elución B) y 500 mM de imidazol (tampón de elución C),
respectivamente, fueron usados para eluir las proteínas enlazadas.
Todas fracciones recogidas en los procedimientos de ruptura, de
lavado y de elución fueron analizados para el contenido de proteína
por BCA y ensayos de Bio-Rad^{TM} Dye y
SDS-PAGE. La actividad enzimática fue determinada
por un ensayo de fluorescencia que se describe por Barrett, A.J.
[Biochemical Journal, 187 (1980) 909-912] y por
Anastati, A., Brown, M.A., Kembhavi, A.A., Nicklin, M.J.H., Sayers,
C.A., Sunter, D.C. y Barrett, A.J. [Biochemical Journal, 211 (1983)
129-138 ]. Los resultados están mostrados en la
Fig. 19.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 62, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en la Fig.
19.
\vskip1.000000\baselineskip
El adsorbente
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B (0.5 ml) fue empaquetado en una columna HR5/5
de Pharmacia a una altura de 2.5 cm (volumen empaquetado 2,5 cm x
0,5 cm i.d.). El sobrenadante de levadura (conteniendo la catepsina
L5 de Fasciola hepatica etiquetada con hexahistidina
recombinante C-terminal (rF.h catepsina L5)) (246
ml) fue cargada sobre la columna preparada a un nivel de flujo de
0,2 ml/min. Un procedimiento de lavado fue realizado con 30 ml de
tampón de equilibrado (50 mM de tampón fosfato sódico conteniendo
150 mM de NaCl, pH 8.0) y 21 ml del tampón de elución A (50 mM de
fosfato sódico conteniendo 150 mM de NaCl, pH 6.0). La columna fue
luego eluida con un gradiente lineal (15 ml, sobre 30 min) de
tampón A a tampón B, seguido de una elución isocrática de 5 ml de
tampón B. El tampón de elución B fue 50 mM de fosfato sódico
conteniendo 150 mM de NaCl y 500 mM de imidazol, pH 6.0. todas las
fracciones (1 ml) fueron recogidas con un recolector de fracciones
FRAC-100. El contenido de proteína fue analizado por
el ensayo de Bio-Rad. La actividad enzimática fue
determinada por un ensayo de fluorescencia como en el Ejemplo 62.
Las fracciones de valor máximo fueron caracterizadas por
SDS-PAGE. Los resultados están mostrados en la Fig.
20 y Fig. 21.
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante bruto de las células de levadura
de Saccharomyces cerevisiae modificado conteniendo el
AMA-1 fue dializado a 4ºC durante toda la noche con
un tampón de diálisis (50 mM de fosfato sódico conteniendo 150 mM de
NaCl y 10% de glicerol, pH 8.0), y luego redializado dos veces con
tampón de diálisis fresco a 4ºC durante 4 horas. El adsorbente
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B (1 ml) fue empaquetado en una
Bio-Rad^{TM} Econo-column (10 ml).
La columna fue equilibrada con un tampón de equilibrado de 50 mM de
tampón fosfato sódico conteniendo 150 mM de cloruro sódico, pH 8.0.
El sobrenadante de levadura dializado (45 ml) fue cargado en esta
columna. Las fracciones rotas (no enlazadas) fueron recogidas para
ensayo de proteína. La columna fue luego lavada con 25 ml del
tampón de equilibrado para eliminar las proteínas no enlazadas y
débilmente enlazadas. Un total de 20 ml de tampón de lavado (50 mM
de fosfato sódico que contiene 150 mM de NaCl, pH 6.0) fueron luego
pasados a través de la columna dos veces para eluir las proteínas
contaminantes. Tres partes alícuotas de 5 ml de 50 mM de fosfato
sódico que contienen 150 mM de NaCl y 125 mM de imidazol, pH 6.0
(tampón de elución A), 50 mM de fosfato sódico que contiene 150 mM
de NaCl y 250 mM de imidazol, pH 6.0 (tampón de elución B) y 50 mM
fosfato sódico que contiene 150 mM de NaCl y 500 mM de imidazol, pH
6.0 (tampón de elución C), respectivamente, fueron usados
consecutivamente para eluir las proteínas enlazadas. Las fracciones
de ruptura y las fracciones de los procedimientos de lavado y de
elución fueron recogidos para análisis de western blot. Los
resultados están mostrados en la Fig. 22.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 65, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Cu^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en la Fig.
22.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 65, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en la Fig.
22.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 65, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-dtnp Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados están mostrados en la Fig.
22.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones usados en este estudio
incluyeron:
- Tampón de equilibrado:
- 50 mM de tampón de fosfato potásico que contiene 300 mM de cloruro potásico, 20 mM de imidazol y 0.12% de Triton^{TM} X-100, pH 8.0;
- Tampón de lavado:
- 50 mM de tampón fosfato potásico que contiene 1 M de cloruro potásico, 40 mM de imidazol y 0.12% de Triton^{TM} X-100, pH 8.0; y
- Tampón de elución
- A. 50 mM de tampón fosfato potásico que contiene 500 mM de cloruro potásico, 125 mM de imidazol y 0.12% de Triton^{TM} X-100, pH 8.0;
- \quad
- B. 50 mM de tampón fosfato potásico que contiene 500 mM de cloruro potásico, 250 mM de imidazol y 0.12% de Triton^{TM} X-100, pH 8.0 y
- \quad
- C. 50 mM de tampón fosfato potásico que contiene 500 mM de cloruro potásico, 500 mM de imidazol y 0.12% de Triton^{TM} X-100, pH 8.0.
\vskip1.000000\baselineskip
El adsorbente
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B fue equilibrado con tampón de equilibrado,
tras lo cual una parte de 0.2 ml fue dispensada en un tubo de
Eppendorf de 1.8 ml. La solución de proteína
semi-purificada (500 \mul), que ha sido
previamente separada usando una columna
in-N^{2+}-NTA (Chelating
Sepharose^{TM} Fast Flow, Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) y
la mezcla de proteína bruta obtenida después de la expresión en la
cepa BJ3505 de Saccharomyces cerevisiae, fue añadida al tubo
Eppendorf e incubada a 4ºC durante 90 min. después de que la mezcla
fuera centrifugada a 1000 x g durante 1 min, el sobrenadante fue
eliminado. El adsorbente fue lavado con 1 ml de tampón de
equilibrado, seguido de 5 x 1 ml del tampón de lavado para eliminar
las proteínas contaminantes. La elución de las proteínas enlazadas
fue conseguida usando 4 x 0.5 ml de tampón de elución A, tampón de
elución B y tampón de elución C consecutivamente. Las fracciones no
enlazadas, fracciones de lavado y fracciones de elución fueron
recogidas para análisis de SDS-PAGE. Los resultados
están mostrados en la Fig. 23.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 69, a excepción de que el
adsorbente usado fue
in-Ni^{2+}-tacn Sepharose^{TM}
CL-6B. Los resultados del análisis de
SDS-PAGE están mostrados en la Fig. 23.
\vskip1.000000\baselineskip
El gel
in-Cu^{2+}-tacn Sepharose
CL-6B (1 ml) empaquetado en un
Bio-Rad^{TM} Econo-column fue
equilibrado con tampón de equilibrado (50 mM de tampón fosfato
potásico que contiene 300 mM de cloruro potásico, 0.1 mM de bromuro
2-aminoetilisotiouronio, 1 mM de glutamina, 0.2 mM
de fluoruro fenilmetilsulfonilo, 20 \muM de
piridoxal-L-fosfato, y 2 mM
\beta-mercaptoetanol, pH 8.0, denominado
"tampón-Ni"). Los vectores de expresión para
la producción, en la cepa BJ3505 de S. cerevisiae y en una
cepa de Pichia pastoris, de la descarboxilasa de ácido
glutámico recombinante que contiene la "etiqueta" hexahistidina
"tag" C-terminal fueron generados usando
métodos establecidos [Law, R.H.P., Rowley, M.J., MacKay, I.R. and
Corner, B., Journal of Biotechnology 61 (1998)
57-68; Papakonstantinou, T., Law, R.H.P., Gardiner,
P., Rowley, M.J. and MacKay, I, Enzyme and Microbial Technology 26
(2000) 645-652 ]. La proteína de fusión bruta
GAD67/65 de lisado de P. pastoris fue
semi-purificada usando una columna Fast Flow
Chelating SepharoseTM in-Ni2+-NTA (Amersham
Pharmacia, Uppsala, Suecia). A pesar de extensos intentos de
optimización, la proteína de fusión GAD67/65 no podría ser obtenida
en una forma homogénea usando el sorbente
in-Ni^{2+}-NTA Chelating
Sepharose^{TM} Sepharose^{TM} Fast Flow. En el procedimiento de
separación usando la columna
in-Ni^{2+}-NTA, la elución de la
GAD67/65 enlazada fue conseguida incluyendo adicionalmente 250 mM
de imidazol en el tampón Ni. La concentración de imidazol en la
solución de proteína de fusión semi-purificada
GAD67/65 fue luego ajustada a 20 mM por dilución con Tampón Ni.
Esta solución fue luego cargada sobre la columna
in-Cu^{2+}-tacn a un nivel de
flujo de 0.2 ml/min. La fracción de ruptura (no enlazada) fue
recogida para determinación del contenido de proteína. La columna
fue lavada con 20 ml de tampón de lavado (40 mM de imidazol en
tampón Ni, pH 8.0) para eliminar las proteínas contaminante no
enlazadas o débilmente enlazadas. Las proteínas enlazadas fueron
eluidas con 250 mM de imidazol en tampón Ni, pH 8.0, y fracciones
(0.5 ml) fueron recogidas. Las fracciones de ruptura, fracciones de
lavado y fracciones de elución fueron recogidas para determinación
del contenido de proteína usando el ensayo
Bio-Rad^{TM}, análisis de
SDS-PAGE, y la actividad enzimática fue determinada
según los métodos de Papakonstantinou, T., Law, R.H.P., Gardiner,
P., Rowley, M.J. y MacKay, I, Enzyme and Microbial Technology 26
(2000) 645-652. Los resultados de
SDS-PAGE están mostrados en la Fig. 24.
\vskip1.000000\baselineskip
Partes alícuotas que contienen 1.0 mg/ml de
mioglobina de músculo esquelético de caballo (HMYO) fueron
preparadas pesando con precisión la proteína en una balanza de cinco
figuras Mettler^{TM} AE50 y diluyendose en los siguientes
tampones de equilibrado:
- Tampón A:
- 20 mM de tampón acetato sódico conteniendo 0.5 M de cloruro sódico, pH 4.0;
- Tampón B:
- 20 mM de tampón fosfato potásico conteniendo 0.5 M de cloruro sódico, pH 6.0;
- Tampón C:
- 20 mM de tampón fosfato potásico conteniendo 0.5 M de cloruro sódico, pH 7.0;
- Tampón D:
- 20 mM de tampón fosfato potásico conteniendo 0.5 M de cloruro sódico, pH 8.0. y
- Tampón E:
- 20 mM de tampón carbonato sódico conteniendo 0.5 M de cloruro sódico, pH 9.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Gel
in-M^{2+}-dtne Sepharose^{TM}
CL-6B secado por succión (aprox. 0.05 g) (donde
M^{2+} representa Cu^{2+}, Ni^{2+}, Zn^{2+} o Co^{2+}) fue
incubado en tubo de membrana de Durapore^{TM}
(Ultrafree^{TM}-CL, 0.1 \mum, Nihon Millipore,
Kogyo K.K, Japón) conteniendo 0.5 ml de la solución de proteína,
girando suavemente con un rotador que gira en el sentido de las
agujas del reloj (RATEK^{TM} Instruments, Mitcham, VIC,
Australia) a 25ºC durante 90 min. El sobrenadante fue luego
recuperado después del centrifugado de la mezcla a 3000 x g con un
centrifugador refrigerado Sorvall^{TM} RT6000 (DuPont Co.,
Newtown, CT, E.E.U.U.) y la muestra inmediatamente analizada para
concentración de proteína libre usando el método de HPLC de fase
analítica inversa (RP). Los resultados están mostrados en las Fig.
25 y Fig. 26.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 72, a excepción de que se
usaron adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en las Fig. 25 y Fig. 26.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el ejemplo 72, a excepción de que la
proteína fue lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL). Los
resultados están mostrados en las Fig. 27 y Fig. 28.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 74, a excepción de que se
usaron adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en las Fig. 27 y Fig. 28.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 72, a excepción de que la
proteína fue citocromo C de corazón de caballo (HHCC). Los
resultados están mostrados en las Fig. 29 y Fig. 30.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 76, a excepción de que se
usaron adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en las Fig. 29 y Fig. 30.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 72, a excepción de que la
proteína fue \alpha-lactalbúmina de leche de vaca
(aLAC). Los resultados están mostrados en las Fig. 31 y Fig. 32.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 78, a excepción de que
adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose' CL-6B fueron usados. Los resultados
están mostrados en las Fig. 31 y Fig. 32.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 72, a excepción de que los
tampones de equilibrado siguientes fueron usados.
- Tampón F:
- 20 mM de tampón fosfato potásico que contiene 0,1 M de cloruro sódico, pH 8.0;
- Tampón G:
- 20 mM de tampón fosfato potásico conteniendo 0,5 M de cloruro sódico, pH 8.0;
- Tampón H:
- 20 mM de tampón fosfato potásico que contiene 1,0 M de cloruro sódico, pH 8.0;
- Tampón I:
- 20 mM de tampón fosfato potásico que contiene 2,0 M de cloruro sódico, pH 8.0. y
- Tampón J:
- 20 mM de tampón fosfato potásico que contiene 3,0 M de cloruro sódico, pH 8.0.
Los resultados están mostrados en la Fig. 3
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 80, a excepción de que
adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B fueron usados. Los
resultados están mostrados en la Fig. 33.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 80, a excepción de que la
proteína fue lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL). Los
resultados están mostrados en la Fig. 34.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 82, a excepción de que se
usaron adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 34
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 80, a excepción de que la
proteína fue citocromo C de corazón de caballo (HHCC). Los
resultados están mostrados en la Fig. 35.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 84, a excepción de que se se
usaron adsorbentes in-Mn^{2+}-dtnp
Sepharose^{TM} CL-6B. Los resultados están
mostrados en la Fig. 35.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La fuente de la GST fue pGEX3XGST. Esta fue
digerida con las endonucleasas de restricción EcoRV y BamHI. Las
condiciones fueron: aprox. 3.45 Ixg de plásmido, 20 unidades de
BamHI, 20 unidades de EcoRV, 10 mM de tris-HCl, pH
8,0, 5 mM de MgCl_{2}, 100 mM de NaCl y 1 mM de
2-Mercaptoetanol en un volumen de 50 \mul. La
mezcla fue incubada a 37ºC durante 2 horas. Los dos fragmentos de
ADN fueron separados en un gel al 1% de agarosa y el fragmento
deseado fue aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
Cantidades de 50 y 25 ng del fragmento de ADN
que codifica la GST fueron añadidas a una mezcla conteniendo: 60
pmol de cebador directo, 60 pmol de cebador inverso, 2,5 unidades
de ADN-polimerasa, 0,5 mM de dNTP's, 10 mM de
tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM de MgCl_{2} y 50 mM de
KCl. El volumen de las mezclas de reacción fue 50 \mul. El ADNc
de GST fue amplificado por PCR. Brevemente, esto implicó aplicar
las mezclas de reacción a un termo-mezclador usando
las condiciones siguientes: una fase de desnaturalización inicial a
95ºC durante 5 minutos, luego 2 ciclos de 94ºC, 50ºC y 72ºC durante
1, 2 y 3 minutos respectivamente, seguidos de 40 ciclos de 94ºC,
55ºC y 72ºC durante 1, 2 y 3 minutos, seguidos de una fase de
extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Las mezclas de reacción
fueron hechas fluir sobre un gel al 1% de agarosa y los productos
de PCR fueron aislados.
El cebador directo tiene la secuencia:
5'-TTAATCATGAAACACCACCACAACTCCTGGGACCACGACATCAA
CCGTGTCGA CCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3'.
CCGTGTCGA CCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3'.
El cebador inverso tiene la secuencia:
5'-TAAAAGCTTTTACAGATCCGATTAAGG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Aprox. 300 ng de la muestra de productos de PCR
aislados anteriormente descrito fue añadida a una mezcla reactiva
de 100 \mul conteniendo: 3 unidades de T4
ADN-polimerasa, 10 unidades de T4 polinucleótido
quinasa, 1 mM de rATP, 0,5 mM de dNTP, 50 mM de Tris, pH 7,5, 10 mM
de MgCl_{2}, 1 mM de ditiotreitol (DTT) y 5 \mug de BSA. La
reacción se efectuó durante 1 hora a 37ºC. Después de esto, 0,5
\mul de 0.5M de EDTA fue añadida a la mezcla, que fue luego
incubada a 75ºC durante 10 mins y luego enfriada en hielo. El ADN
fue recuperado mediante la realización de una extracción de
fenol/cloroformo seguida de una precipitación de etanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Reacciones de 10 \mul conteniendo varias
cantidades de los productos de PCR modificados (aprox. 36 ng, 12 ng
y 4 ng) fueron mezcladas con: 50 ng del vector transportador
PBluescript II SK+ (que fue cortado en SmaI y defosforilado), 2,5
unidades de T4 ADN-ligasa, 40 mM de
Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT
y 0,5 mM de ATP. Las reacciones de ligación fueron incubadas a
temperatura ambiente durante toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células DH5\alpha de E. coli
tratadas con cloruro de rubidio fueron transformadas con 5\mul de
las mezclas de reacción de ligadura arriba usando técnicas
estándares. Diluciones diferentes de las mezclas de transformación
fueron colocadas en placas LB Amp (triptona 10 extracto de levadura
5 g/l, NaCl 10 g/l con agar 15 g/l añadido y sometido a autoclave,
luego complementado con ampicilina 100 mg/l) que fue extendido con
cantidades de 800 \mug de IPTG
(isopropil-\beta-d-tiogalactósido)
y X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido)
las placas fueron incubadas a 37ºC durante toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido modificado fue aislado de
los transformantes DH5\alpha anteriormente descritos usando
técnicas estándares. El ADN del plásmido de distintos clones fue
digerido con varias endonucleasas de restricción para identificar
aquellos clones con posibilidad de contener plásmidos conteniendo el
inserto deseado. El ADN del plásmido de varios clones fue digerido
con la endonucleasa de restricción PvuII. Las condiciones
fueron: aprox. 300 \mug de ADN, 10 unidades de
Pvu II, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10
mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl y 1 mM de DTE en un volumen de 20
\mul. La temperatura fue 37ºC y el tiempo de reacción fue de 3
horas. Los fragmentos de ADN fueron separados en un gel al 1% de
agarosa permitiendo la identificación de plásmidos conteniendo
fragmentos de tamaño correcto. Los plásmidos seleccionados del
cribaje enzimático PvuII fueron seleccionados una segunda
vez usando la endonucleasa de restricción BspHI. Las
condiciones fueron: aprox. 300 \mug de ADN, 10 unidades de
BspHI, 50 mM de acetato potásico, 20 mM de
Tris-acetato, 10 mM de acetato magnésico y 1 mM de
DTT, pH 7,9 en un volumen de 20 pl. La temperatura fue 37ºC y el
tiempo de reacción fue de 2 horas. El ADN digerido fue hecho fluir
en un gel al 1% de agarosa, y los plásmidos conteniendo los
fragmentos de tamaño correcto fueron identificados.
La secuenciación del ADN de los insertos
plásmidos, de los clones seleccionados de ambos cribajes
enzimáticos, fue realizado como sigue. Aprox. 100 ng del fragmento
de plásmido deseado aislado de la digestión con PvuII de los
clones seleccionados fue usado como molde para las reacciones de
secuenciación del ADN. Las reacciones de secuenciación fueron: 100
ng de ADN del plásmido, 5 pmol de cebador y 8 \mul de premezcla
del terminador en un volumen de 20 \mul.
Se prepararon mezclas duplicadas de las
reacciones anteriores, un grupo conteniendo el cebador pBluescript
T3 con la secuencia
5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3', y el
otro conteniendo el cebador pBluescript T7, con la secuencia
3'-CGGGATATCACTCAGC ATAATG-5'. Las
mezclas de reacción fueron aplicadas a un
termo-mezclador usando las condiciones siguientes:
una fase de desnaturalización inicial a 96ºC durante 1 minuto, luego
25 ciclos de 96ºC, 50ºC y 60ºC durante 30 segundos, 15 segundos y 4
minutos, respectivamente. Los productos de extensión fueron
recuperados mediante la realización de una precipitación de acetato
de etanol/sodio usando técnicas estándares, y los granulados fueron
secados y sometidos a secuenciación del ADN.
Se identificó un clon conteniendo el inserto
plásmido deseado codificando la GST-NT1. La
secuenciación del ADN demostró que la secuencia fue correcta.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido del clon positivo (pBluescript con
el inserto deseado) fue incubado con las endonucleasas de
restricción BspHI y HindIII. Las condiciones fueron:
aprox. 500 ng de ADN del plásmido, 20 unidades de BspHI, 40
unidades de HindIII, 50 mM de acetato potásico, 20 mM de
Tris-acetato, 10 mM de acetato magnésico y 1 mM de
DTT, pH 7,9 en un volumen de 70 \mul. La temperatura fue 37ºC y
el tiempo de reacción fue de 2,5 horas. Los fragmentos de ADN fueron
separados en un gel de agarosa al 2% y el fragmento deseado
aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido de expresión pTrc 99A (Pharmacia
Biotech) fue incubado con las endonucleasas de restricción
NcoI y HindIII. Las condiciones fueron: aprox. 4.25
\mug de plásmido, 20 unidades de NcoI, 20 unidades de
HindIII, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM de
MgCl_{2}, 100 mM de NaCl y 1 mM de
2-Mercaptoetanol en un volumen de 200 \mul. La
temperatura fue 37ºC y el tiempo de reacción fue de 2 horas. Los 2
fragmentos de ADN fueron separados en un gel al 1% de agarosa y el
fragmento deseado fue aislado.
Para controlar que el plásmido fuera
completamente digerido por ambas enzimas, el fragmento aislado fue
ligado y luego usado para transformar células DH5\alpha de E.
coli. Brevemente, esto fue realizado como sigue: Se preparó una
reacción de 10 \mu conteniendo: aprox. fragmento aislado de 50 ng,
2,5 unidades de T4 ADN-ligasa 40 mM de
Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT
y 0,5 mM de ATP. Las reacciones de ligación fueron incubadas a 16ºC
durante toda la noche. Se transformaron células DH5\alpha de
E. coli tratadas con cloruro de rubidio con 5 \mul de la
reacción de ligación usando técnicas estándares. Diferentes
diluciones de las transformaciones fueron colocadas en placas LB
Amp. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante toda la noche. Una
ausencia de colonias transformadas confirmó que el plásmido de
expresión había sido completamente digerido por ambas enzimas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon reacciones de 10 \mul
conteniendo varias cantidades del inserto de ADN prep (aprox. 25
ng, 8,3 ng y 2,75 ng) mezclado con: aprox. 50 ng de plásmido de
expresión pTrc 99A (corte en NcoI/HindIII), 2,5
unidades de T4 ADN-ligasa, 40 mM
tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT
y 0,5 mM de ATP. La temperatura fue de 16ºC y el tiempo de reacción
fue al menos 1 día. Se usaron 5 \mul de esta mezcla reactiva para
la transformación de células DH5\alpha de E. coli. El
plásmido de expresión modificado fue aislado e identificado mediante
la realización de un cribaje enzimático usando las endonucleasas de
restricción EcoRV/HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Células de E. coli tratadas con cloruro
de rubidio, cepa JM105, fueron transformadas con aprox. 100 ng del
plásmido de expresión modificado, usando técnicas estándares.
Diferentes diluciones de las células transformadas fueron colocadas
en placas LB-Amp para selección de células
conteniendo el plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue esencialmente el mismo que
se describe en el Ejemplo 86, con la excepción de que el cebador
directo tenía la secuencia:
5'-TAAATCATGAAACATCACCATCACCATCACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN plasmídico de varios clones fue incubado
con la endonucleasa de restricción PvuII. Las condiciones
fueron: aprox. 150 \mug de plásmido, 10 unidades de PvuII,
10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl_{2}, 50
mM NaCl y 1 mM de DTE en un volumen de 20 \mul. La temperatura
fue 37ºC y el tiempo de reacción fue de 1 hora. Los 2 fragmentos de
ADN fueron separados en un gel de agarosa al 1%, permitiendo la
identificación de los plásmidos conteniendo los fragmentos de
tamaño correcto. Un segundo cribaje enzimático fue luego realizado
en estos plásmidos seleccionados con las endonucleasas de
restricción HindIII y SalI. Las condiciones de esta
digestión doble fueron: aprox. 150 p,g de plásmido, 20 unidades de
HindIII, 20 unidades de SalI, 50 mM de
Tris-HCl, pH 7,05, 10 mM de MgCl_{2}, 100 mM de
NaCl y 1 mM de DTE en un volumen de 40 \mul. La temperatura fue
37ºC y el tiempo de reacción fue de 4 horas. El ADN digerido fue
realizado en gel de agarosa al 1% y los plásmidos conteniendo los
fragmentos de tamaño correcto fueron identificados. Aprox. 300 ng
del ADN no cortado de los plásmidos seleccionados fue usado como
molde donde la secuenciación del ADN fue realizada. Otras
condiciones de secuenciación fueron iguales a las que se describen
en el Ejemplo 86.
Un clon conteniendo el inserto plásmido deseado
que codifica la GST-CT1 fue identificado. La
secuencia fue demostrada como correcta con las excepciones
siguientes: una mutación puntual de GST de base 28 de A a G que
resultó en una substitución conservadora de isoleucina con valina
en el aminoácido 10 de GST (AAT a GTT). Una mutación puntual de GST
de base 342 de C a T, dando como resultado una mutación
imperceptible de ácido aspártico (GAC a GAU). Una posible mutación
puntual de GST a base 645 de T a C, dando como resultado una
mutación imperceptible de histidina (CAT a CAC).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido del clon positivo fue
incubado con las endonucleasas de restricción BspHI y
HindIII. Las condiciones fueron: aprox. 150 ng de plásmido,
30 unidades de BspHI, 60 unidades de HindIII, 50 mM de
acetato potásico, 20 mM de Tris-acetato, pH 7,9, 10
mM de acetato magnésico y 1 mM de DTT, en un volumen de 100 \mul.
La temperatura fue 37ºC y el tiempo de reacción fue de 22
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue esencialmente el que se
describe en el Ejemplo 86, con la excepción de que el cebador
directo que codifica la CT2 tenía la secuencia:
5'-TAAATCATGAAACACCAACACCAACATCAACATCAACATCAACAT
CAAGTCGACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3'.
CAAGTCGACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido modificado de distintos
clones fue digerido sólo con la endonucleasa de restricción
PvuII.
Las condiciones fueron: aprox. 300 \mug de
plásmido, 20 unidades de PvuII, 10 mM de
Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl
y 1 mM de DTE en un volumen de 30 \mul. La temperatura fue 37ºC y
el tiempo de reacción fue de 3 horas. Los 2 fragmentos de ADN
fueron separados en un gel de agarosa al 1% permitiendo la
identificación de los plásmidos conteniendo fragmentos de tamaño
correcto. El fragmento deseado fue aislado, y aprox. 100 ng fue
usado como el molde, que fue secuenciado en ADN.
Un clon conteniendo el inserto plásmido deseado
que codifica GST-CT2 fue identificado. La
secuenciación del ADN demostró que la secuencia fue correcta.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido del clon positivo fue
incubado con las endonucleasas de restricción BspHI y
HindIII. Las condiciones fueron: aprox. 150 ng de plásmido,
30 unidades de BspHI, 60 unidades de HindIII, 50 mM de
acetato potásico, 20 mM de Tris-acetato, pH 7,9, 10
mM de acetato magnésico y 1 mM de DTI en un volumen de 100 \mul.
La temperatura fue 37ºC y el tiempo de reacción fue de aprox. 22
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 86, con la excepción de que el
cebador directo que codifica el NT2 tenía la secuencia:
5'-TAAATCATGAAACACACCAACATCCACCAGGACCAGCACAACCACTTCCACCGTGTCGACCAGATG
TCCCCTATACTAGGT-3.
TCCCCTATACTAGGT-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Un clon conteniendo el inserto plásmido deseado
que codifica GST-NT2 fue identificado. La
secuenciación del ADN demostró que la secuencia fue correcta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron las células de E. coli
de la cepa JM105 descritas para los Ejemplos 86-89,
al igual que con el vector de expresión inmodificado pTrc 99A y con
el vector pGEX3XGST de GST parental. Las células transformadas
fueron propagadas en placas petri conteniendo medio
LB-Amp a 37ºC durante toda la noche. El medio LB
(triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l y
sometido a autoclave) complementado con 100 \mug/ml de ampicilina
fue inoculado con colonias individuales de las placas petri e
incubado a 37ºC con agitación durante toda la noche. Se inocularon
5 ml de 2 x medio YT (triptona 16 extracto de levadura 10 g/l, NaCl
5 g/l, pH 7,0 y sometido a autoclave) complementado con 100
\mug/ml de ampicilina (2 x YTA) con una dilución 1/10 de los
cultivos durante toda la noche y luego se incubó a 37ºC con
agitación hasta que se logró una absorbencia a 600 nm (A600) de
0,6-1,0 para transformantes pTrc o
0,6-0,8 para transformantes pGEX3XGST. La expresión
genética fue inducida por la adición de IPTG a una concentración
final de 1 mM (transformantes pTrc) o 0,1 mM (transformante
pGEX3XGST). Las células de 1,5 ml de cultivo fueron cosechadas 5
horas (transformantes pTrc) o 1 hora (transformantes pGEX3XGST)
tras la inducción. Las células fueron resuspendidas en 300 \mul de
1 X PBS enfriado en hielo (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de
Na_{2}HPO_{4}, 1,8 mM de KH_{2}PO_{4}, pH 7,3) y lisadas
por sonicación. Después de la granulación, el lisado celular fue
recogido y congelado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron clones individuales de cada una
de las proteínas de fusión GST etiquetadas para usarlos en la
expresión de la proteína a gran escala. Esto se realizó
esencialmente como se describe en el Ejemplo 90, con las
excepciones siguientes: 100 ml de medios (2 X YTA) fueron inoculados
con una dilución 1/100 de cultivo durante toda el noche. Después de
la inducción, los cultivos fueron incubados durante otras 6 horas
antes de la recogida de las células. Las células fueron luego
resuspendidas en 5 ml 1X PBS (a excepción de aquellas conteniendo
GST-CT2, que fueron resuspendidas en 10 ml) y
lisadas por sonicación. Se añadió Triton X-100 a
una concentración final de 1%, seguido de incubación durante 30 min
para ayudar en la solubilización de las proteínas de fusión.
Después de la granulación, se recogió el lisado celular y se
congeló.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensayo fiable para la actividad funcional de
GST es el ensayo de CDNB
(1-cloro-2,4-dinitrobenceno),
donde GST cataliza la derivatización de CDNB con glutationa; este
complejo puede ser vigilado por mediciones de densidad óptica a una
longitud de onda de 340 nm. El ensayo fue realizado como se perfila
en el folleto de información GST Gene Fusion System, 3ª edn.,
Revisión 1, de Pharmacia Biotech. Poco después se añadieron 10
\mul de muestras de lisado celular de cada una de las proteínas
de fusión GST recombinantes, que se describe en los Ejemplos 90 y
91, a 190 pul de una mezcla reactiva conteniendo 100 mM de
KH_{2}PO_{4}, pH 6,5, 1 mM de
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB) y 1 mM de glutationa reducida en una placa de 96 pocillos, y
la absorbencia a 340 nm fue medida en un lector de placas durante 5
min a intervalos de 1 minuto. Las cuatro proteínas de fusión
recombinantes presentaron actividad funcional de GST determinada
por este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó el lisado celular bruto (véase
Ejemplo 91) usando columnas Ni^{2+}-tacn y
Ni^{2+}-NTA. Cada columna tenía un volumen de
lecho de 0,5 ml y fue equilibrada con tampón B (tampón B = tampón A
complementado con 10 mM de imidazol pH 8,4; tampón A = 445 mM de
NaCl, 7,5 mM de Na_{2}HPO_{4} y 2.5 mM de
NaH_{2}PO_{4}.2H_{2}O, pH 7,2). Las columnas fueron cargadas
con 125 \mul de lisado celular bruto (que fue diluido 1 en 4 con
tampón B a un volumen total de 0,5 ml). Las columnas fueron luego
lavadas dos veces con tampón B antes de la elución. Dos
procedimientos de elución fueron usados: elución con tampón 1
(tampón 1 = tampón A complementado con 500 mM de imidazol, pH 9,71)
(1 ml) seguido de una segunda elución con 200 mM de solución de
malonato de sodio (1 ml) que fue ajustada a pH 8,0 con 10 M de
hidróxido sódico.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 93.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 93.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 93.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplicó el lisado celular bruto (véase Ejemplo
91) a una columna Ni^{2+}-tacn. La columna tenía
un volumen de lecho de 0,5 ml, y fue equilibrada con tampón C
(tampón C = tampón B + 50 mM de imidazol, pH 9,0). La columna fue
cargada con 0,5 ml de muestra conteniendo 125 \mul de lisado
celular bruto diluido 1 en 4 con tampón C. Después de que la
muestra hubiera pasado a través de la columna, la columna fue
lavada con tampón C (5 ml). Se realizó una serie de eluciones
graduales (isocráticas), cada una consistiendo en 3 aplicaciones de
partes alícuotas de 1 ml de tampón A complementado con varias
concentraciones de imidazol. La elución inicial se efectuó usando
tampón A complementado con 100 mM de imidazol, pH 9,3. La
concentración de imidazol fue aumentada por incrementos de 50 mM
con cada elución sucesiva. Partes alícuotas del primer ciclo de las
varias condiciones de elución fueron luego aplicadas a geles de
SDS-poliacrilamida para su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 97.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 97.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue el mismo que se describe en
el Ejemplo 97.
\vskip1.000000\baselineskip
Una segunda serie de eluciones graduales
(isocráticas) fue realizada. Una columna
Ni^{2+}-tacn con un volumen de lecho de 0,5 ml fue
equilibrada con tampón B. La columna fue cargada con una muestra de
2,5 ml conteniendo 500 \mul de lisado celular bruto, descrito en
los Ejemplos 90 y 91, diluido 1 en 5 con tampón D (tampón D =
tampón A + 12,5 mM de imidazol, pH 8,5). La fracción de flujo
continuo fue reaplicada a la columna dos veces. Luego se aplicó
tampón B (5 ml) a la columna. Después se realizó una serie de
eluciones graduales (isocráticas), cada una consistiendo en 3
aplicaciones de partes alícuotas de 1 ml de tampón A complementado
con varias concentraciones de imidazol. La elución inicial se
efectuó usando tampón A + 25 mM de imidazol. La concentración de
imidazol fue aumentada por incrementos de 25 mM con cada elución
sucesiva hasta alcanzar una concentración de 100 mM aumentando
luego por incrementos de 50 mM. Partes alícuotas desde el primer
ciclo de las varias condiciones de elución fueron luego aplicadas a
geles de SDS-poliacrilamida para el análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 101, a excepción de que la
columna fue cargada con una muestra de 5 ml conteniendo 1 ml de
lisado celular bruto diluido 1 en 5 con tampón D.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el Ejemplo 101, a excepción de que
la columna fue cargada con una muestra de 1,5 ml conteniendo 300
\mul de lisado celular bruto diluido 1 en 5 con tampón D.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el Ejemplo 101, a excepción que la
columna fue cargada con una muestra de 0,5 ml conteniendo 100
\muI de lisado celular bruto diluido 1 en 5 con tampón D.
\vskip1.000000\baselineskip
Partes alícuotas de lisado celular (véase
Ejemplo 90) fueron mezcladas con tampón de carga SDS (reductor) y
calentadas durante 1 min a 100ºC. Las muestras fueron luego
cargadas en un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y
hechas fluir durante un periodo de tiempo apropiado. 60 \mul de
lisado celular y 30 \mul de los marcadores de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL) y 10 kDa de Protein Ladder
(Gibco BRL)] fueron cargados en el gel. El transformante pGEX3XGST
sirvió como control positivo. El componente GST de las proteínas de
fusión GST etiquetadas en N-terminal está truncado
por 1 aminoácido en el extremo C-terminal. La GST
parental es expresada como la proteína de longitud completa con 14
aminoácidos adicionales en el C-terminal.
Consecuentemente, la GST parental contiene 15 aminoácidos
adicionales en su extremo C-terminal y en
consecuencia se hace aprox. 1.65 kDa más grande que el componente
GST de las proteínas de fusión GST etiquetadas en
N-terminal. La cepa JM105 de E. coli
transfor-
mada con pTrc sirvió como control negativo. Para visualizar las bandas, el gel fue teñido con azul de Coomassie.
mada con pTrc sirvió como control negativo. Para visualizar las bandas, el gel fue teñido con azul de Coomassie.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para gel 1, mostrada en Fig.
36:
Fila 1, GST-CT1 clon nº. 1; Fila
2, GST-CT1 clon nº. 2; Fila 5,
GST-CT1 clon nº. 3; Fila 6, GST-CT1
clon nº. 4; fila 7, GST-CT1 clon nº. 5; Fila 11,
GST-CT1 clon nº. 6; Fila 12,
GST-CT1 clon nº. 7; Fila 13, GST-CT1
clon nº. 8; Fila 14, GST-CT1 clon nº. 9; Fila 15,
GST-CT1 clon nº. 10; Fila 8, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
9, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST. Los marcadores de peso molecular están
mostrados en las Filas 3, 4 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 105.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 2. mostrada en Fig.
37:
Fila 1, GST-CT2 clon nº. 1; Fila
2, GST-CT2 clon nº. 2; Fila 3,
GST-CT2 clon nº. 3; Fila 6, GST-CT2
clon nº. 4; Fila 7, GST-CT2 clon nº. 5; Fila 11,
GST-CT2 clon nº. 6; Fila 12,
GST-CT2 clon nº. 7; Fila 13, GST-CT2
clon nº. 8; Fila 14, GST-CT2 clon nº. 9; Fila 15,
GST-CT2 clon nº. 10; Fila 8, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
9, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST. Los marcadores de peso molecular están
mostrados en las Filas 4, 5 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 105.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 3, mostrada en Fig.
38:
Fila 1, GST-NT1 clon nº. 1; Fila
2, GST-NT1 clon nº. 2; Fila 3,
GST-NT1 clon nº. 3; Fila 4, GST-NT1
clon nº. 4; Fila 7, GST-NT1 clon nº. 5; Fila 11,
GST-NT1 clon nº. 6; Fila 12,
GST-NT1 clon nº. 7; Fila 13, GST-NT1
clon nº. 8; Fila 14, GST-NT1 clon nº. 9; Fila 15,
GST-NT1 clon nº. 10; Fila 8, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
9, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST. Los marcadores de peso molecular están
mostrados en las Filas 5, 6 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 105.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 4, mostrada en la Fig.
39:
Fila 1, GST-NT2 clon nº. 1; Fila
2, GST-NT2 clon nº. 2; Fila 3,
GST-NT2 clon nº. 3; Fila 4, GST-NT2
clon nº. 4; Fila 5, GST-NT2 clon nº. 5; Fila 11,
GST-NT2 clon nº. 6; Fila 12,
GST-NT2 clon nº. 7; Fila 13, GST-NT2
clon nº. 8; Fila 14, GST-NT2 clon nº. 9; Fila 8,
control negativo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pTrc; Fila 9, control positivo consistente en JM105
de E. coli transformada con pGEX3XGST. Los marcadores de peso
molecular están mostrados en las Filas 6, 7 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 105, con la excepción de que 5
pl de lisado celular y 1 \mul de marcador de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL)] fueron cargados en el gel.
Para visualizar las bandas, el gel fue teñido de plata.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 5. mostrada en Fig.
40:
Fila 1, GST-CT1 clon nº. 7; Fila
2, GST-CT2 clon nº. 6; Fila 6,
GST-NT1 clon nº. 1; Fila 7, GST-NT2
clon nº. 7; Fila 4, control negativo consistente en JM105 de E.
coli transformada con pTrc; Fila 5, control positivo consistente
en JM105 de E. coli transformada con pGEX3XGST. El marcador
de peso molecular está mostrado en la Fila 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Partes alícuotas de lisado celular y fracciones
recogidas de la purificación discontinua (véase Ejemplo 93) fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (reductor) y calentadas a 100ºC
durante 90 segundos. 10 \mul de muestras de fracciones de
purificación, 5 \mul de lisado celular de control positivo y
negativo y 1,25 \mul de lisado celular conteniendo la proteína de
fusión recombinante y 1 \mul de marcadores de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL)] fueron cargados en un gel de
SDS-poliacrilamida al 12% y hechos fluir durante un
periodo de tiempo apropiado. Para visualizar las bandas, el gel fue
teñido de plata.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 6, mostrada en Fig.
41:
Filas 3-5 contienen muestras
recogidas de una columna Ni^{2+}-tacn, mientras
que las Filas 6-8 contienen muestras de una columna
Ni^{2+}-NTA. Filas 3 y 6, lavado 2. Filas 4 y 7,
elución 1; Filas 5 y 8, elución 2; Fila 1, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
2, control positivo consistente en JM1 05 de E. coli
transformado con pGEX3XGST; Fila 10, lisado celular bruto. El
marcador de peso molecular está mostrado en la Fila 9.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el Ejemplo 110, con la excepción de
que las partes alícuotas de lisado celular y las fracciones
recogidas de la purificación discontinua que se describe en el
Ejemplo 94 fueron aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 7, mostrada en Fig.
42:
Las Filas 3-5 contienen muestras
recogidas de una columna Ni^{2+}-tacn mientras
que las Filas 6-8 contienen muestras de una columna
Ni^{2+}-NTA. Filas 3 y 6, lavado 2; Fila 4 y 7,
elución 1; Filas 5 y 8, elución 2; Fila 1, control negativo
consistente en JM1 05 de E. coli transformado con pTrc; Fila
2, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST; Fila 9, lisado celular bruto. El
marcador de peso molecular está mostrado en Fila 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 110, con la excepción de que
partes alícuotas de lisado celular y fracciones recogidas de la
purificación discontinua que se describe en el Ejemplo 95 fueron
aplicadas al gel.
\newpage
Clave para Gel 8, mostrada en Fig.
43:
Las Filas 5-7 contienen muestras
recogidas de una columna Ni^{2+}-tacn mientras
que las Filas 8-10 contienen muestras de una columna
Ni^{2+}-NTA. Filas 5 y 8, lavado 2; Filas 6 y 9,
elución 1; Filas 7 y 10, elución 2; Fila 1, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
2, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST; Fila 3, lisado celular bruto. El
marcador de peso molecular está mostrado en la Fila 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 110, con la excepción de que
partes alícuotas de lisado celular y fracciones recogidas de la
purificación discontinua que se describe en el Ejemplo 96 fueron
aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 9. mostrada como Fig.
44:
Las Filas 5-7 contienen muestras
recogidas de una columna Ni^{2+}-tacn mientras
que las Filas 8-10 contienen muestras de una columna
Ni^{2+}-NTA. Las Filas 5 y 8, lavado 2; Filas 6 y
9, elución 1; Filas 7 y 10, elución 2; Fila 1, control negativo
consistente en JM105 de E. coli transformada con pTrc; Fila
2, control positivo consistente en JM105 de E. coli
transformada con pGEX3XGST; Fila 4, lisado celular bruto. El
marcador de peso molecular está mostrado en la Fila 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras desde la primera serie de eluciones
graduales isocráticas de lisado celular conteniendo
GST-CT1, descritas en el Ejemplo 97, fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC
durante 90 segundos. Partes alícuotas de 10 \mul desde el primer
1 ml de las fracciones eluidas y 2,5 \mul de lisado celular
fueron cargados en un gel de SDS-poliacrilamida al
12,5%. El gel fue hecho fluir durante un periodo de tiempo apropiado
y luego teñido de plata para visualizar las bandas.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 10, mostrada en Fig.
45:
Las eluciones fueron realizadas con tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 100 mM; Fila 3, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5, 250 mM; Fila 6,
300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450 mM y Fila 10,
500 mM. El lisado celular está mostrado en la Fila 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 114, con la excepción de que
partes alícuotas de lisado celular y fracciones recogidas de la
elución gradual (isocrática) que se describe en el Ejemplo 98
fueron aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 11, mostrada como Fig.
46:
Las eluciones fueron realizadas con tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 3, 200 mM; Fila 4, 250 mM; Fila 6,
300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450 mM y Fila 10,
500 mM. El lisado celular está mostrado en la Fila 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 114, con la excepción de que
partes alícuotas del lisado celular y fracciones recogidas de la
elución gradual (isocrática) que se describe en el Ejemplo 99
fueron aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para gel 12, mostrada en la Fig.
47:
Las eluciones fueron realizadas con tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
2, 100 mM; Fila 3, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5, 250 mM; Fila 6,
300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450 mM y Fila 10,
500 mM. El lisado celular está mostrado en la Fila 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 114, con la excepción de que
partes alícuotas de lisado celular y fracciones recogidas de la
elución gradual (isocrática) que se describe en el Ejemplo 100
fueron aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para gel 13, mostrada en Fig.
48:
Las eluciones fueron realizadas con tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5, 250 mM; Fila 6,
300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450 mM y Fila 10,
500 mM. El lisado celular está mostrado en la Fila 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de la segunda serie de eluciones
graduales (isocráticas) de lisado celular conteniendo
GST-CT1, que se describen en el ejemplo 101, fueron
mezcladas con tampón de carga SDS (no reductor) y calentadas a 100ºC
durante 90 segundos. Partes alícuotas de 16 \mul desde el primer
1 ml de las fracciones eluidas y 0,5 \mul de marcadores de peso
molecular [BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL)] fueron cargadas en
un gel de SDS-poliacrilamida al 12,5%. El gel fue
hecho fluir durante un periodo de tiempo apropiado y luego teñido de
plata para visualizar las bandas.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 14, mostrada en Fig.
49:
Las eluciones fueron realizadas usando un tampón
A complementado con las concentraciones siguientes de imidazol:
Fila 2, 25 mM; Fila 3, 50 mM; Fila 4, 75 mM; Fila 5, 100 mM; Fila
6, 150 mM; Fila 7, 200 mM; Fila 8, 250 mM; Fila 9, 300 mM y Fila
10, 350 mM. El marcador de peso molecular está mostrado en la Fila
1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 118, con la excepción de que
partes alícuotas de fracciones recogidas de la purificación gradual
(isocrática) que se describe en el Ejemplo 102 fueron aplicadas al
gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para Gel 15, mostrada en la Fig.
50:
Las eluciones fueron realizadas usando tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 25 mM; Fila 3, 50 mM; Fila 4, 75 mM; Fila 5, 100 mM; Fila 6, 150
mM; Fila 7, 200 mM; Fila 8, 250 mM; Fila 9, 300 mM y Fila 10, 350
mM. El marcador de peso molecular está mostrado en la Fila 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el Ejemplo 118, con la excepción de
que las partes alícuotas de fracciones recogidas de la purificación
gradual (isocrática) que se describe en el Ejemplo 103 fueron
aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para gel 16, mostrada en Fig.
51:
Las eluciones fueron realizadas usando tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 100 mM; Fila 2, 150 mM; Fila 4, 200 mM; Fila 5, 250 mM; Fila 6,
300 mM; Fila 7, 350 mM; Fila 8, 400 mM; Fila 9, 450 mM y Fila 10,
500 mM. El marcador de peso molecular está mostrado en la Fila
3.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el Ejemplo 118, con la excepción de
que las partes alícuotas de las fracciones recogidas de la
purificación gradual (isocrática) que se describe en el Ejemplo 104
fueron aplicadas al gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Clave para gel 17, mostrada en Fig.
52:
Las eluciones fueron realizadas usando tampón A
complementado con las concentraciones siguientes de imidazol: Fila
1, 50 mM; Fila 2, 75 mM; Fila 3, 100 mM; Fila 5, 150 mM; Fila 6,
200 mM; Fila 7, 250 mM; Fila 8, 300 mM; Fila 9, 350 mM y Fila 10,
400 mM. El marcador de peso molecular está mostrado en la Fila
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo enseña metodologías para la
inmovilización de ligandos preconstruidos sobre la superficie
de
Sepharose^{TM} CL-4B. El ligando tacn (= 1,4,7-triazaciclononano), al igual que varios ligandos bis(tacn) (denominados L^{eth}, L^{prop} L^{but}, L^{ox}, L^{mx} y L^{Px}) que fueron inmovilizados están mostrados abajo en el Esquema 7. La fijación (fijación covalente) de estos macrociclos y bis(macrociclos) para Sepharose^{TM} CL-4B emplearon técnicas que son más bien de aplicabilidad general para la fijación de moléculas que contienen uno o más grupos amino para la superficie de un sustrato de polímero hidroxílico, tal como un sustrato tipo polisacárido (ejemplificado aquí por Sepharose^{TM} CL-4B). La primera fase en el proceso en cuestión implica el tratamiento del sustrato (en este caso gel Sepharose^{TM} CL-4B) con epiclorohidrina, bajo condiciones básicas, para producir un sustrato polimérico epoxi-activado (en este caso gel epoxi-activado Sepharose^{TM} CL-4B ). La fijación covalente de los ligandos pueden luego ser conseguida por medio de la reacción de grupos de amina secundaria nucleofílica presentes en sus estructuras con los grupos electrofílicos de superficie epóxida. El Esquema 8 (abajo) muestra una representación esquemática de la superficie del sustrato polimérico en cuestión (p. ej Sepharose^{TM} CL-4B), con la fijación de los ligandos produciéndose por medio de un único grupo separador en cada caso. Dada la presencia de más de un grupo de amina secundaria dentro de los ligandos, se pueden formar enlaces de inmovilización múltiples hasta cierto punto, es decir, un pequeño porcentaje de los ligandos pueden fijarse a la superficie del sustrato polimérico por reacción con dos o más grupos epóxidos.
Sepharose^{TM} CL-4B. El ligando tacn (= 1,4,7-triazaciclononano), al igual que varios ligandos bis(tacn) (denominados L^{eth}, L^{prop} L^{but}, L^{ox}, L^{mx} y L^{Px}) que fueron inmovilizados están mostrados abajo en el Esquema 7. La fijación (fijación covalente) de estos macrociclos y bis(macrociclos) para Sepharose^{TM} CL-4B emplearon técnicas que son más bien de aplicabilidad general para la fijación de moléculas que contienen uno o más grupos amino para la superficie de un sustrato de polímero hidroxílico, tal como un sustrato tipo polisacárido (ejemplificado aquí por Sepharose^{TM} CL-4B). La primera fase en el proceso en cuestión implica el tratamiento del sustrato (en este caso gel Sepharose^{TM} CL-4B) con epiclorohidrina, bajo condiciones básicas, para producir un sustrato polimérico epoxi-activado (en este caso gel epoxi-activado Sepharose^{TM} CL-4B ). La fijación covalente de los ligandos pueden luego ser conseguida por medio de la reacción de grupos de amina secundaria nucleofílica presentes en sus estructuras con los grupos electrofílicos de superficie epóxida. El Esquema 8 (abajo) muestra una representación esquemática de la superficie del sustrato polimérico en cuestión (p. ej Sepharose^{TM} CL-4B), con la fijación de los ligandos produciéndose por medio de un único grupo separador en cada caso. Dada la presencia de más de un grupo de amina secundaria dentro de los ligandos, se pueden formar enlaces de inmovilización múltiples hasta cierto punto, es decir, un pequeño porcentaje de los ligandos pueden fijarse a la superficie del sustrato polimérico por reacción con dos o más grupos epóxidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que los ligandos son el único componente
conteniendo nitrógeno de los sorbentes, la extensión de
inmovilización del ligando podría ser determinada por medio de
análisis de nitrógeno (Tabla 5, abajo). Una cobertura de superficie
superior (densidad de superficie de ligando) fue observada para el
sorbente tacn inmovilizado comparado con los ligandos
bis(tacn). Esto es a pesar de la disponibilidad de un número
superior de grupos amina secundaria dentro de los ligandos de
bis(tacn), que estarían previstos para favorecer
estadísticamente la reacción con los grupos epóxidos de la
superficie electrofílica. Las coberturas de superficie inferior
para los ligandos bis(tacn) pueden ser debidas al alcance
superior de los ligandos bis(tacn) que permiten que mayores
cantidades de ligandos reaccionen con grupos múltiples epóxidos,
aumentando los niveles de reticulación dentro de la estructura del
gel. Además, los ligandos bis(tacn) más voluminosos no
pueden acceder a tantos grupos epóxidos como lo hace el ligando
tacn más compacto estéricamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo enseña una metodología -que está
considerada de amplia generalidad- para ensamblar un ligando
bis(tacn) en la superficie de un sustrato polimérico hidroxílico, tal como un sustrato tipo polisacárido (ejemplificado aquí por Sepharose^{TM} CL-4B). La estrategia está considerada de amplia generalidad puesto que otros análogos derivados y estructurales bis(tacn), tris(tacn), tetrakis(tacn).., etc, de los mismos pueden estar ensamblados a través de la fijación a un poli(electrófilo) apropiado en la superficie del soporte polimérico. Para un ligando bis(tacn) la estrategia sintética implica el tratamiento de una superficie de sustrato polimérico aminada con uno de los grupos electrofilicos de un tris(electrófilo), seguido de la reacción de los dos grupos electrofílicos restantes con macrociclos de tacn (véase Esquema 9, abajo). El sustrato polimérico en cuestión (en este caso gel Sepharose^{TM} CL-4B) es primero epoxi-activado como se ha descrito antes (véase, p. ej., Ejemplo 122, arriba) y reaccionado con un exceso de metialemina para producir una superficie aminada. El sustrato polimérico activado es luego tratado con un exceso grande (abreviado XS) de 1,3,5-tris(bromometil)benceno con el objetivo de producir una reacción entre sólo uno de los grupos electrofílicos de esta molécula y la superficie aminada del gel, dejando dos grupos electrofílicos disponibles para una reacción ulterior con tacn para producir un ensamblaje de ligando bis(tacn) inmovilizado. La fijación del derivado bencílico altamente reactivo puede ser realizada sin la adición de base (que es consistente con la espectativa de que el protón liberado tras la condensación entre el grupo bromometilo y un grupo amina secundaria inmovilizada protonará la amina terciaria resultante, suministrando un cierto grado de protección a partir de la reacción adicional para producir un nitrógeno cuaternario central).
bis(tacn) en la superficie de un sustrato polimérico hidroxílico, tal como un sustrato tipo polisacárido (ejemplificado aquí por Sepharose^{TM} CL-4B). La estrategia está considerada de amplia generalidad puesto que otros análogos derivados y estructurales bis(tacn), tris(tacn), tetrakis(tacn).., etc, de los mismos pueden estar ensamblados a través de la fijación a un poli(electrófilo) apropiado en la superficie del soporte polimérico. Para un ligando bis(tacn) la estrategia sintética implica el tratamiento de una superficie de sustrato polimérico aminada con uno de los grupos electrofilicos de un tris(electrófilo), seguido de la reacción de los dos grupos electrofílicos restantes con macrociclos de tacn (véase Esquema 9, abajo). El sustrato polimérico en cuestión (en este caso gel Sepharose^{TM} CL-4B) es primero epoxi-activado como se ha descrito antes (véase, p. ej., Ejemplo 122, arriba) y reaccionado con un exceso de metialemina para producir una superficie aminada. El sustrato polimérico activado es luego tratado con un exceso grande (abreviado XS) de 1,3,5-tris(bromometil)benceno con el objetivo de producir una reacción entre sólo uno de los grupos electrofílicos de esta molécula y la superficie aminada del gel, dejando dos grupos electrofílicos disponibles para una reacción ulterior con tacn para producir un ensamblaje de ligando bis(tacn) inmovilizado. La fijación del derivado bencílico altamente reactivo puede ser realizada sin la adición de base (que es consistente con la espectativa de que el protón liberado tras la condensación entre el grupo bromometilo y un grupo amina secundaria inmovilizada protonará la amina terciaria resultante, suministrando un cierto grado de protección a partir de la reacción adicional para producir un nitrógeno cuaternario central).
Los análisis de nitrógeno realizados en geles
Sepharose^{TM} CL-4B que han sido primero
aminados y luego completamente funcionalizados de esta manera
revelaron un acoplamiento exitoso de tacn a la superficie de gel,
como se ha visto por un aumento triple en el contenido de nitrógeno
del material (Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según el esquema de inmovilización presentado en
el Esquema 9 (véase arriba), podría preverse que el
contenido de nitrógeno del gel final fuera aproximadamente siete
veces aquel del gel simple aminado. Hay dos explicaciones
concebibles para el contenido de nitrógeno inferior. En primer
lugar, es posible que ocurriera una reacción incompleta en una o
ambas de las dos fases sintéticas después de la aminación de la
superficie del gel con metialemina. Consecuentemente, el gel final
puede poseer varios grupos metilamina no reaccionada y/o
bromometilo en su superficie. En segundo lugar, la reticulación
podría haber ocurrido durante cualquiera de las tres fases
sintéticas mostradas en el Esquema 9 conduciendo a especies
reticuladas tales como aquellas mostradas en el Esquema 10, abajo.
Resulta muy interesante que la densidad de superficie del ligando
inmovilizado corresponda bien con aquellas determinadas para todos
los geles obtenidos a partir de ligandos bis(tacn)
preensamblados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la inmovilización de iones
Cu^{2+} y Ni^{2+} sobre los nuevos geles funcionalizados, y la
caracterización de los productos. La inmovilización fue conseguida
mezclando el gel en cuestión con una solución de la sal de nitrato
de metal apropiado, seguido de lavado con tampón de acetato (pH 5)
para eliminar los iones poco enlazados. La absorción rápida de iones
Cu^{2+} por los geles fue inmediatamente aparente por un cambio
del color del gel a azul, mientras que para la unión de Ni^{2+},
la incubación a temperaturas elevadas resultó ser necesaria para
impartir una coloración azul morado claro a los geles dentro de una
longitud de tiempo razonable. Así, la reacción entre iones Ni^{2+}
y los ligandos inmovilizados en cuestión parece ser bastante lenta.
Tras la incubación a 60ºC durante 1 h, se descubrió que los niveles
de absorción de Cu^{2+} y Ni^{2+} por los geles eran aprox. 70%
y 40%, respectivamente, de la absorción máxima esperada basándose
en las densidades de superficie de ligando correspondientes (Tabla
7, véase abajo). En el caso de los geles tratados con Ni^{2+}, la
presencia de átomos donantes de ligandos no coordinados fue
confirmada por el hecho de que las muestras de los geles se volvió
azul cuando se mezcló con una solución de iones Cu^{2+}; la
inercia cinética conocida de complejos de níquel(II) tacn
excluye la posibilidad de que ésta se deba al desplazamiento de los
iones Ni^{2+} por iones Cu^{2+} [véase, p. ej.: Yang, R. and
Zompa, L.J., Inorganic Chemistry, 15 (1976) 1499; y Murphy, L.J.
and Zompa, L.J. Inorganic Chemistry, 18 (1979) 3278]. Suponiendo
que se espere que sólo los niveles bajos de especies de complejos de
níquel(II) binucleares inmovilizados se hubieran formado
bajo cargas tan bajas, y que una motivación importante para
estudiar la aplicación de ligandos bis(tacn) a IMAC (de la
manera según la presente invención) fuera el hecho de explorar la
unión de proteínas a complejos binucleares, resulta que los
soportes cargados con Ni^{2+} son menos ventajosos que los
sorbentes cargados con Cu^{2+} correspondientes; además, desde un
punto de vista práctico, la absorción máxima de iones metálicos por
un sorbente IMAC debe ser conseguido lo bastante rápidamente de modo
que no se gasten cantidades de tiempo excesivas en la preparación
del sorbente para el uso. Basándose en tales observaciones y
consideraciones, el mayor enfoque experimental se centró en
consecuencia en los sorbentes cargados con Cu^{2+} de capacidad
superior.
Para confirmar la absorción aparente rápida de
iones Cu^{2+} por los geles funcionalizados, se realizó una serie
de experimentos a pequeña escala para establecer el período de
incubación necesario para conseguir el equilibrado. Los resultados
indicaron que el equilibrado fue alcanzado rápidamente, con un
aumento pequeño o no detectable en la absorción ocurriendo después
de 30 min de mezcla a temperatura ambiente. Las curvas de absorción
representativas están mostradas en el esquema 11. Basándose en los
resultados de este estudio, se eligió un tiempo de adsorción
estándar de 30 minutos para las preparaciones ulteriores de
soportes cargados con Cu^{2+}.
Es interesante considerar las cuestiones
posibles para los grados sub- máximos observados de la unión de
Cu^{2+}, que, a diferencia de la absorción de Ni^{2+}, no
parecen deberse a un logro lento del equilibrado. Mientras que las
proporciones de ión metálico:ligando de aproximadamente 1:1 han sido
proporcionadas para la unión de Cu^{2+} a soportes
IDA-agarosa [véase, p. ej., Porath, J. and Belew,
M. Journal of Chromatography, 516 (1990) 333; y Jiang, W. and
Hearn, M.T.W. Analytical Biochemistry, 242 (1996) 45], los grados
observados de unión de aprox. el 70% son consistentes con aquellos
observados para varios soportes que incorporan ligandos
inmovilizados con solamente donantes de N o donantes de N en
combinación con donantes de O de tipo éter [véase, p. ej., Gros,
C., Rabiet, F., Denat, F., Brandès, S., Chollet, H. and Guilard, R.
Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions, (1996) 1209;
van Berkel, P.M., Driessen, W.L., Kodhaas, G.J.A.A., Reedijk, J.
and Sherrington, D.C. Journal of the Chemical Society., Chemical
Communications, (1995) 147; y Dudler, V., Lindoy, L.F., Sallin, D.
and Schlaepfer, C.W. Australian Journal of Chemistry, 40 (1987)
1557]. Una dependencia de la unión en el ión metálico para algunos
de estos sistemas inmovilizados ha sido tomada para reflejar
efectos diferenciales estéricos asociados a la red tridimensional
polimérica (véase van Berkel, P.M. et al. y Dudler, V. et
al. loc cit.). Tal impedimento estérico puede reducir la
capacidad de algunos sitios para unirse a ciertos iones metálicos
cuando se inducen cambios conformacionales desfavorables, o pueden
restringir el acceso de iones metálicos a sitios particulares. Para
los sorbentes proporcionados aquí, las proporciones reducidas de
Cu^{2+}:ligando en parte podrían también deberse a la formación de
especies CuL22+, donde los iones Cu^{2+} son intercalados entre
pares de anillos tacn de ligandos limítrofes (L) en la superficie
del gel (Esquema 12). Los grados relativamente altos de unión
conseguidos, no obstante, indican que las especies principales
pueden ser CuL^{2+} y Cu_{2}L^{2+} para los sorbentes
funcionalizados con tacn- y bis(tacn), respectivamente. Es
importante destacar que la absorción de iones Cu^{2+}, expresada
como un porcentaje de la extensión máxima de unión esperada de la
densidad de superficie del ligando, es prácticamente idéntica en
cualquier caso.
Para evaluar adicionalmente la idoneidad de los
nuevos sorbentes cargados con Cu^{2+} según la invención para el
uso en IMAC, se examinó la resistencia de los sistemas a la
lixiviación de los iones metálicos bajo una variedad de condiciones
de equilibrado diferentes para ser usadas en los últimos estudios
de unión de proteínas/péptidos. Después de lavar los soportes
cargados de iones metálicos con agua y 20 mM de tampón de acetato
(pH 5) para eliminar los iones metálicos poco enlazados, los
sorbentes fueron adicionalmente lavados con uno de los siguientes
medios: 20 mM de tampón de acetato, 20 mM de tampón de fosfato (pH
7), 20 mM de tampón de borato (pH 9), 200 mM de imidazol o 200 mM
de solución Na_{2}EDTA. Los resultados están presentados en el
Esquema 13. A excepción del medio de Na_{2}EDTA, se encontró que
ocurría una fuga de iones metálicos insignificante con estos
medios, confirmando la alta estabilidad de los complejos
inmovilizados. Un tratamiento prolongado con Na_{2}EDTA, no
obstante, condujo a la elución de más del 80% de los iones
Cu^{2+} inmovilizados.
Los datos de equilibrado de relevancia e
importancia para la presente descripción en lo que se refiere a los
aspectos de la presente invención están resumidos en la Tabla 8 y
Tabla 9, abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener información sobre el entorno de
coordinación de los iones Cu^{2+} inmovilizados en las
superficies de sorbente se registró la reflectancia difusa y los
espectros de ESR de los soportes cargados con Cu^{2+}. Los
espectros difusos de reflectancia mostraron cada uno una banda muy
ancha centrada a aprox. 640 nm en la región visible, similar a
aquella observada para los complejos de cobre(II) de los
ligandos bis(tacn) inmovilizados en solución e indicativos de
cobre(II) residiendo en un entorno de coordinación
octahédrica piramidal cuadrado o tetragonal distorsionado. Las
bandas de intensidad baja observadas a aprox. 1100 nm para los
complejos "libres" no fueron resueltas en los espectros difusos
de reflectancia de los geles. Los espectros de ESR de la banda X de
los geles cargados con Cu^{2+}, medidos a 77 K, mostraron una
señal fuerte a aprox. 3200 g en cada caso, típica de aquellos
encontrados para complejos de cobre(II) mononucleares con
espín nuclear 3/2. Tres de las cuatro señales previstas hiperfinas
fueron visibles, con la cuarta estando oculta bajo la línea g\perp
[véase Hathaway, B. J. En Comprehensive Coordination Chemistry;
Wilkinson, G., Gillard, R. D. and McCleverty, J. A. (Eds.),
Pergamon Press, Oxford, 1987, Vol. 5, p 533 ]. La señal para el gel
tacn fue bien resuelta. Aquellas para los geles bis(tacn)
fueron un poco más amplias, reflejando el hecho de que las dos
mitades del ligando se vuelven no equivalentes tras la
inmovilización en la superficie de gel. Por lo tanto se podría
proveer que los entornos de coordinación de los dos centros de
cobre(II) enlazados por cada ligando fueran ligeramente
diferentes. Los espectros de eritrosedimentación de los sorbentes
son muy similares a aquellos de los complejos "libres" de
cobre(II) con parámetros (g\parallel=2,24, g\perp =2,05 -
2,07, A\parallel= 170 x 10^{-4} cm^{-1}) característicos para
iones Cu^{2+} que residen en un entorno de coordinación
octahédrico SP o tetragonalmente distorsionado (véase Hathaway,
B.J., loc cit.). Las especies del complejo existentes en las
superficies de gel son en consecuencia similares en su naturaleza a
los complejos de cobre(II) formados por los ligandos en
solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la información proporcionada en la
introducción a la sección experimental (véase arriba), a
continuación se proporcionan detalles adicionales particularmente
con respecto a varios materiales, reactivos y procedimientos
empleados en relación con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocó Sepharose^{TM} CL-4B
(300 g) secado por succión, íntegramente lavado con agua (5 x 300
ml), en un matraz de fondo redondo y mezclado con 1 M de NaOH (300
ml) y NaBH_{4} (1,2 g) a temperatura ambiente durante 1 h mediante
un agitador mecánico superior. Luego se añadió epiclorohidrina (100
ml) y se agitó la suspensión durante otras 6 h. El gel resultante
epoxi-activado fue recogido por filtración de vacío
y lavado extensivamente con agua (5 x 300 ml), 20% de EtOH/agua (5
x 300 ml), y agua una vez más (5 x 300 ml). Se prepararon
soluciones de 75 mM de los ligandos [ligandos tacn y
bis(tacn) L^{etn}, L^{prop}, L^{but} L^{ox}, L^{m}x
y L^{px}] disolviendo cantidades de 3,75 mmol de las sales de
hidrobromuro de cada ligando en agua (40 ml), ajustando el pH a 11
con 6 M de NaOH, y luego aumentando hasta 50 ml con agua. Las
soluciones fueron añadidas a partes de 60 g del gel
epoxi-activado secado por succión, y las
suspensiones mezcladas a 60ºC durante 15 h usando un baño de agua
con agitación. Los geles resultantes funcionalizados fueron
recogidos por filtración de vacío, lavados con agua (5 x 200 ml),
50 mM de ácido acético/0,1 M de KNO_{3} (pH 4) (2 x 200 ml) y una
vez más con agua (5 x 200 ml). Los geles fueron almacenados a 4ºC
en 20% de EtOH/agua hasta lo requerido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se supsendió gel Sepharose CL-4B
secado por succión epoxi-activado (80 g) (preparado
como se ha descrito anteriormente) en una solución acuosa de
metilamina al 24%, y la mezcla fue agitada durante 15 h a 60ºC. El
gel aminado resultante fue luego filtrado por filtración de vacío y
lavado con agua (10 x 200 ml), 50 mM de ácido acético/0,1 M de
KNO_{3}/tampón pH 4 (4 x 100 ml) y una vez más con agua (10 x 200
ml). Una parte del gel aminado (15 g) fue apartada para el análisis
de nitrógeno. El resto fue lavado sucesivamente con tres partes de
100 ml de 5% trietilamina/agua, 20% de acetonitrilo/5% de
trietilamina/agua, 40% de acetonitrilo/5% de trietilamina/agua, 60%
de acetonitrilo/5% de trietilamina/agua, 80% de acetonitrilo/5% de
trietilamina/agua, 95% de acetonitrilo/5% de trietilamina, y
finalmente acetonitrilo (6 x 100 ml). El acetonitrilo fue luego
añadido al gel para dar una suspensión de volumen total de 170 ml.
Se añadió una solución de
1,3,5-tris(bromometil)benceno (10 g,
28 mmol) en acetonitrilo (30 ml) y se agitó la mezcla rápidamente
durante 18 h a temperatura ambiente. El gel fue luego filtrado y
lavado con acetonitrilo (5 x 100 ml). Se añadió acetonitrilo al gel
para dar una suspensión de volumen total de 130 ml. Una solución de
la forma de base libre de tacn (6.5 g, 50 mmol) en acetonitrilo (40
ml) fue luego añadida, y la mezcla agitada enérgicamente durante 22
h a temperatura ambiente. El gel fue filtrado y lavado
sucesivamente con dos partes de 50 ml de acetonitrilo, 75% de
acetonitrilo/agua, 50% de acetonitrilo/agua, 25% de
acetonitrilo/agua, agua, 50 mM de ácido acético/0,1 M de
KNO_{3}/tampón pH 4, y una vez más con agua. El gel fue
almacenado a 4ºC en 20% de EtOH/agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Los geles funcionalizados fueron analizados para
el contenido de nitrógeno para determinar la extensión de
inmovilización del ligando. Para cada gel, aproximadamente 20 g de
material secado por succión fue suspendido en 20% de acetona/agua
(50 ml) durante 2 min. La mayoría del solvente fue luego eliminada
por filtración de vacío suave, teniendo cuidado de no permitir que
los geles se sequen (se ha descubierto que la desecación de los
geles en esta fase conduce a la agregación de los sorbentes). Los
geles fueron lavados con otra parte con 20% de acetona/agua
exactamente de la misma manera. Este procedimiento de lavado doble
fue repetido usando soluciones aumentando el contenido de acetona
(20% incrementos) hasta pasar los geles por acetona nítida. Los
geles fueron luego lavados una vez más con acetona (50 ml) antes de
ser íntegramente secados por succión y luego secados al vacío alto
durante 24 h. Los sorbentes secados fueron analizados por su
contenido de nitrógeno total usando el procedimiento Kjeldahl.
Carga de iones Cu^{2+} y Ni^{2+} sobre
sorbentes funcionalizados de Sepharose^{TM}
CL-4B. Partes de sorbentes (0,5 g) secados por
succión fueron añadidas a viales luminiscentes de 10 ml conteniendo
soluciones acuosas 50 mM del nitrato de metal apropiado (5 ml) y
mezclado por inversión durante 60ºC durante 1 h. Para la carga
Cu^{2+}, este procedimiento fue realizado como una serie de
realizaciones a temperatura ambiente durante períodos de tiempo
entre 0,5 h a 20 h para establecer la variación en la absorción de
Cu^{2+} con el tiempo. Los geles fueron luego recogidos por
filtración de vacío y lavados sucesivamente con agua (3 x 50 m), 20
mM de tampón NaOAc/1 m NaCl/pH 5 (2 x 25 ml) y agua (3 x 50 ml),
dejando 3 min de tiempo de equilibrado entre la adición de las
soluciones y su eliminación por filtración de vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
La carga (unión) a gran escala de iones
Cu^{2+} sobre los sorbentes funcionalizados fue conseguida
incubando porciones de 4 g de los geles secados por succión con 50
mM de Cu(NO_{3})_{2}.3H_{2}O (50 ml) en viales
luminiscentes de 50 ml a temperatura ambiente durante 30 min,
puesto que los experimentos de absorción preliminares (ejemplo 124;
véase arriba) han demostrado que son de una longitud de
tiempo suficiente. Los sorbentes cargados con iones metálicos
fueron luego recogidos por filtración de vacío, lavados con agua (5
x 100 ml) y suspendidos en 20 mM de tampón NaOAc/1 M NaCl/pH 5 (50
ml) durante 15 min. Los geles fueron filtrados, lavados con otra
parte alícuota (50 ml) del tampón pH 5 y luego con agua (3 x 100
ml), manteniendo un tiempo de equilibrado de lavado de 3 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Partes (0,5 g) de sorbentes secados por succión
cargados con Cu^{2+} fueron incubadas en viales luminiscentes de
20 ml a temperatura ambiente con las soluciones especificas abajo
(10 ml) para los tiempos específicos; los geles fueron luego
aislados por filtración de vacío antes de ser lavados con otra
alícuota de 20 mM de tampón Na_{2}HPO_{4}/1 M de NaCl/pH 7 (10
ml) y luego agua (3 X 50 ml), con 3 min de equilibrado entre
lavados.
- Soluciones:
- 1) 20 mM de tampón Na_{2}HPO_{4}/1 M de NaCl/pH 7, 10 min.
- \quad
- 2) 20 mM de Na_{2}B_{4}O_{7}/1 M de tampón NaCl/pH 9, 10 min.
- \quad
- 3) 200 mM de imidazol, 10 min.
- \quad
- 4) 200 mM de Na2EDTA, 30 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada muestra de sorbente cargado con ión
metálico, aproximadamente 0,5 g de material secado por succión fue
pasado en acetona nítida y secado a alto vacío usando el
procedimiento anteriormente descrito para los geles libres de ión
metálico. Aproximadamente 20 mg de sorbente seco fue luego pesado
con precisión en un vial luminiscente precintable de 20 ml y
digerido en 4 M de HCl (4 ml) a 50ºC durante 4 h con inversión
frecuente. La solución resultante marrón-amarillo
claro fue diluida con agua a un volumen de 8 ml y luego analizada
para el contenido de cobre por espectrofotometría de absorción
atómica. Para determinar el contenido de metal de los sorbentes en
cuanto al volumen de gel hinchado, el análisis fue repetido usando
partes alícuotas (1 ml) de suspensión de gel/agua al 50% (v/v),
preparada colocando los geles en agua y ajustando el volumen de
líquido sobre el gel para igualar el volumen del lecho.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de reflectancia difusos fueron
registrados usando muestras de gel que fueron secadas a alto vacío
según el procedimiento anteriormente descrito. Se registraron los
espectros de ESR usando muestras secadas por succión de geles que
fueron lavados con 20 mM de NaOAc/1 M de tampón NaCl/pH 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una mutagénesis dirigida (SDM) del
plásmido construido para expresar GST-NT1, como se
describe en el Ejemplo 86, para modificar el extremo
C-terminal de la secuencia que codifica GST para
conseguir un constructo de longitud completa. Un único cambio de
base fue introducido por SDM, que alteró el codón de parada (TAA),
de GST para codificar un residuo de lisina (codón AAA). La
eliminación de este codón de detención en el plásmido de expresión
de proteína de fusión GST recombinante (GST-NT1)
etiquetada en N-terminal en un plásmido de
expresión produjo un plásmido que puede utilizarse para expresar la
proteína de fusión GST recombinante etiquetada en
N-terminal, GST-NT1, donde la GST
es extendida C-terminalmente por los cuatro
aminoácidos
Lys-Ser-Asp-Leu,
respectivamente. Este plásmido de expresión resultante ha sido
denominado Glutationa S-transferasa de longitud
completa [GST(FL)], puesto que la restauración del residuo
de lisina C-terminal codifica la secuencia GST de
longitud completa más tres residuos C-terminales
adicionales que pueden ser derivados, por ejemplo, del vector
pGEX3XGST, que fue usado para crear el constructo original.
Los procedimientos SDM fueron realizados como se
perfila en el QuickChange ^{TM} Site-Directed
Mutagenesis kit Instruction Manual, Catalog # 200518, Revision
# 1000007, de Stratagene.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido de expresión que fue construido para
expresar la proteína de fusión GST GST-NT1
etiquetada en N-terminal como se describe en el
Ejemplo 86 fue usado como el molde de ADN. Los oligonucleótidos que
fueron usados para incorporar el cambio de base deseado, como se
indica por subrayado, fueron como sigue:
Oligonucleótido nº. 1: 5'
GGCGACCATCCTCCTAAATCGGATCTGTAAAAGC 3'
Oligonucleótido nº. 2: 5'
GCTTTTACAGATCCGATTTAGGAGGATGGTCGCC 3'
Aproximadamente 25 ng del molde de ADN
bicatenario fue añadido a una mezcla conteniendo 125 ng de
oligonucleótido nº. 1: 125 ng de oligonucleótido nº. 2, 5 \mul de
tampón de reacción 10 X y 1 \mul de dNTP. El volumen de la mezcla
reactiva fue ajustado a 50 \mul con H_{2}O doblemente destilada.
A esta mezcla se añadieron 2,5 U de Pfu Turbo ADN polimerasa, y la
mezcla reactiva fue cubierta con aceite mineral.
La mezcla reactiva fue luego colocada en un
termo-mezclador usando las condiciones siguientes:
(a) una fase de desnaturalización inicial a 95ºC durante 30 seg
seguida de (b) 12 ciclos a 95ºC durante 30 seg, (c) 55ºC durante 1
min luego (d) 68ºC durante 10 min. Al dejar de variar la
temperatura, la reacción fue retirada y enfriada en hielo durante 2
min. 10 U de la enzima de restricción Dpnl fue luego aplicada a la
reacción de amplificación, y la mezcla fue luego suave pero
íntegramente agitada. La mezcla fue luego centrifugada en un
microcentrifugador durante 1 min e inmediatamente incubada a 37ºC
durante 1 hora.
\vskip1.000000\baselineskip
5 \mul del ADN tratado con Dpnl de la reacción
precedente fue añadida a una alícuota de 50 \mul de células
Supercompetentes XL-1 Blue, y la mezcla fue
incubada en hielo durante 30 min. Esta mezcla fue luego pulsada con
calor durante 45 seg a 42ºC y luego enfriada en hielo durante 2
min. Después de la adición de 0,5 ml de medios SOC [5 ml de SOB
(triptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, 2.5 mM de NaCl y 625
\muM de KCl y sometido a autoclave) complementados con 5mM de
MgCl_{2}, 5 mM de MgSO_{4} y 20 mM de glucosa y pasado por un
filtro estéril], la reacción de transformación fue incubada a 37ºC
durante 1 hora. Diluciones diferentes de la mezcla de transformación
fueron colocadas en placas LB-Amp (triptona 10
extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l con agar 15 g/l añadido y
sometido a autoclave, luego complementado con ampicilina 100 mg/l).
Las placas fueron incubadas a 37ºC durante toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN del plásmido modificado fue aislado de
transformantes XL-1 Blue anteriormente descritos
usando técnicas estándares. La secuenciación del ADN del ADN del
plásmido aislado fue realizada como sigue: aproximadamente 200 ng
del ADN del plásmido modificado, 5 pmol de cebador y 6 \mul de
premezcla de terminador en un volumen de 15 \mul. Se prepararon
mezclas duplicadas de las reacciones anteriores, un grupo
conteniendo el
(a) cebador directo pTrc: 5'
TTGACAATTAATCATCCGGC 3' y el otro grupo conteniendo el
(b) cebador inverso pTrc 5'
CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG 3'.
Las mezclas de reacción fueron aplicadas a un
termo-mezclador usando las condiciones siguientes:
(a) una fase de desnaturalización inicial a 96ºC durante 1 min,
luego 25 ciclos consistentes en (b) 96ºC durante 30 seg, (c) 45ºC
durante 15 seg y (d) 60ºC durante 4 min, respectivamente. Los
productos de extensión fueron recuperados mediante la realización
de una precipitación de etanol/acetato de sodio usando técnicas
estándares y los granulados fueron secados y sometidos a
secuenciación del ADN. Un clon conteniendo el plásmido deseado que
codifica GST(FL)-NT1 fue identificado y
verificado como correcto.
\vskip1.000000\baselineskip
Células de E. coli tratadas con cloruro
de rubidio, cepas JM105, BL21 y TOP10, fueron cada una
transformadas con aprox. 100 ng del plásmido de expresión
modificado, usando técnicas estándares. Diluciones diferentes de las
células transformadas fueron colocadas en placas
LB-Amp para la selección de células conteniendo el
plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 127, a excepción de que la
mutagénesis dirigida (SDM) del plásmido construido para expresar
GST-CT2, como se describe en el Ejemplo 88, fue
realizada para modificar el extremo C-terminal de la
secuencia que codifica GST.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 127, a excepción de que la
mutagénesis dirigida (SDM) del plásmido construido para expresar
GST-NT2, como se describe en el Ejemplo 89, fue
realizada para modificar el extremo C-terminal de la
secuencia que codifica GST.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de E. coli de la cepa JM105
fueron transformadas con el plásmido de expresión
GST(FL)-CT2, que se describe en el Ejemplo
128. Las células transformadas fueron propagadas en placas petri
conteniendo medio LB-Amp a 37ºC durante toda la
noche. Se inoculó un medio LB (triptona 10 g/l, extracto de
levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l y sometido a autoclave) complementado
con 100 \mug/ml de ampicilina con colonias individuales de las
placas petri e incubado a 37ºC con agitación durante toda la noche.
Se inocularon 500 ml de medio YT 2 X (triptona 16 g/l, extracto de
levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7,0 y sometido a autoclave)
complementado con 100 \mug/ml de ampicilina (2 X YTA) con una
dilución 1/100 de los cultivos dejados durante toda los noche y
luego incubado a 37ºC con agitación hasta que se alcanzó una
absorbencia a 600 nm (A_{600}) de 0,6-1,0. La
expresión genética fue inducida por la adición de IPTG a una
concentración final de 1 mM. Las células del cultivo fueron
recogidas 6-7 horas tras la inducción. Las células
fueron resuspendidas en 25 ml de 1 X PBS enfriado en hielo (140 mM
de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 1,8 mM de
KH_{2}PO_{4}, pH 7,3) y lisadas por sonicación. Después de la
granulación, el lisado celular fue recogido.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 130, a excepción de que las
células de E. coli de la cepa JM105 fueron transformadas con
el plásmido de expresión GST(FL)-NT1 como se
describe en el Ejemplo 127.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 130, a excepción de que las
células de E. coli de la cepa JM105 fueron transformadas con
el plásmido de expresión GST(FL)-NT2 que se
describe en el Ejemplo 129.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 130, a excepción de que las
células de E. coli de la cepa BL21 fueron transformadas con
el plásmido de expresión GST(FL)-CT2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 131, a excepción de que las
células de E. coli de la cepa BL21 fueron transformadas con
el plásmido de expresión GST(FL)-NT1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo que se describe en el Ejemplo 132, a excepción de que las
células de E. coli de la cepa BL21 fueron transformadas con
el plásmido de expresión GST(FL)-NT2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 130, excepto que las células
de E. coli de la Cepa TOP10 fueron transformadas con el
plásmido de expresión GST(FL)-CT2.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el Ejemplo 131, excepto que las células
de E. coli de la Cepa TOP10 fueron transformadas con el
plásmido de expresión GST(FL)-NT1.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 132, excepto que las células
de E. coli de la Cepa TOP10 fueron transformadas con el
plásmido de expresión GST(FL)-NT2.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión
GST(FL)-CT2 etiquetada en el
N-terminal GST(FL) expresada como se
describe en el ejemplo 128 (arriba) puede ser purificada por
métodos cromatográficos discontinuos o en columna esencialmente como
se describe en el ejemplo 93 usando sistemas inmovilizados de
Ni^{2+}-tacn, Cu^{2+}-tacn,
Ni^{2+}-dtne, Cu^{2+}-dtne,
Ni^{2+}-dtnp, Cu^{2+}-dtnp u
otros sistemas tris- o tetrakis-tacn macrocíclicos
quelatados de ión metálico como sorbente cromatográfico apropiado.
Cada columna fue incubada con tampón B (tampón B = tampón A
complementado con 10 mM de imidazol, pH 8,4; tampón A = 445 mM de
NaCl, 7,5 mM de Na_{2}HPO_{4} y 2,5 mM de
NaH_{2}PO_{4}.2H_{2}O, pH 7,2). Las columnas fueron cargadas
con 250 \mul del lisado bruto (que fue diluido 1 en 4 con tampón
B) por ml de gel. Las columnas fueron luego lavadas dos veces con
tampón B antes de la elución. Se usaron dos procedimientos de
elución: elución con Tampón 1 (Tampón 1 = Tampón A complementado
con 50 mM de imidazol, pH 9,7) seguido de una segunda elución con
200 mM de malonato de sodio, que fue ajustado a pH 8,0 con 10 M de
hidróxido de sodio. De forma alternativa, estas proteínas de fusión
GST pueden ser purificadas usando glutationa Sepharose^{TM} 4B
(GS4B). En este caso, se realizó la purificación discontinua como
se indica en el folleto de información GST Gene Fusion System, 3a
edn., Revision 1, de Pharmacia Biotech. Poco después se aplicaron
24 ml de lisado celular, como se describe en el ejemplo 130, a un
volumen de lecho de 0,75 ml de GS4B que fue lavado y equilibrado con
1 X PBS (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na_{2}HPO_{4},
1,8 mM de KH_{2}PO_{4}, pH 7,3). La mezcla resultante fue
incubada con rotación longitudinal durante aproximadamente 1 hora a
temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada a 500 X g durante
5 min. El sobrenadante fue recogido y el gel fue extensivamente
lavado con 1 X PBS. La proteína de fusión fue eluida con tampón de
elución (50 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM de
glutationa reducida).
El eluato fue recogido y luego aplicado a una
Econo-columna de 10 ml
(Bio-Rad^{TM}) para eliminar cualquier sal de
tampón o GS4B residual. El eluato fue incubado con 4,7 mM de ácido
etilenodiaminatetraacético (EDTA) durante 20 min a temperatura
ambiente y luego extensivamente dializado a 4ºC con un tampón (20
mM de fosfato sódico, 150 mM de NaCl, pH 6,9). Tras la diálisis la
proteína fue pasada a través de un filtro estéril de 0,45 pM
(Millipore^{TM}). Las concentraciones de proteína antes y después
de la filtración fueron determinadas utilizando el reactivo de
ácido biquinconínico (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL,
EEUU) usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. La
proteína de fusión purificada fue luego almacenada a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 131 fue purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 132 fue purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 133 fue purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 134 fue fraccionado con
la proteína purificada sin ser incubado con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 135 fue fraccionado con
la proteína purificada sin ser incubado con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 136 fue fraccionado con
la proteína purificada sin ser incubado con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 137 fue fraccionado con
la proteína purificada sin ser incubado con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 139, excepto que el lisado
celular bruto como se describe en el ejemplo 138 fue fraccionado
con la proteína purificada sin ser incubado con EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las masas moleculares de las proteínas de fusión
GST(FL)-CT2 etiquetadas en el
N-terminal dializadas purificadas, que habían sido
expresadas en varias cepas de células de E. coli y
purificadas como se describe en los ejemplos 139, 142 y 145, fueron
medidas por espectrometría de masas por Desorción/lonización en
matriz inducida por láser-Tiempo de vuelo
(MALDI-TOF-MS). El procedimiento de
purificación de las muestras de proteína no reducidas obtenidas de
la glutationa Sepharose^{TM} 4B (GS4B) proporcionaron valores
experimentales [M+H]^{+} superiores a las masas teóricas
moleculares previstas, consistente en las proteínas GST que habían
sido S-tioladas por la glutationa reducida (GSH)
durante la purificación de la glutationa, descrita en los ejemplos
136, 142 y 145. No obstante, la reducción de las muestras de
proteína por la adición de \beta-mercaptoetanol,
seguida de desalación, produjo valores experimentales
[M+H]^{+} que se correspondían a las masas teóricas
previstas. Por consiguiente, todas las muestras analizadas por
espectometría de masas MALDI-TOF fueron preparadas
de esta manera.
Las muestras de proteína que no fueron
previamente incubadas con 4,7 mM de EDTA fueron tratadas de esta
forma durante 20 min a temperatura ambiente. La proteína fue luego
incubada con \beta-mercaptoetanol (a una
concentración final de 50 mM) y luego desalada usando un C_{18}
ZipTip^{TM} (Millipore^{TM}) y almacenada a -20ºC hasta su
análisis. La muestra fue aplicada a una matriz ácida sinapínica
usando el método de cristal molido. Se registraron los espectros
usando una estación de trabajo de bioespectrometría
Voyager-DE STR. Las muestras fueron analizadas en
el modo linear de ión positivo con un potencial de aceleración de
25 kV, un tiempo de retardo del pulso de 250 ns, una puerta de masa
baja de 5KDa y una transconductancia del 85%. Se tomaron 100
disparos por espectro y se acumularon 5 espectros.
GST(FL)-CT2 tiene una
masa molecular teórica de 28.007,3 Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-CT2 que había sido expresada en
células de E. Coli de la cepa JM105, como se describe en el
ejemplo 139, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 28,006 \pm 5,57 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-CT2 que había sido expresada en
células de E. Coli de la cepa BL21, como se describe en el
ejemplo 142, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 28.008,10 \pm 5,29 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-CT2 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa TOP10, como se describe en el
ejemplo 145, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 28.003,00 \pm 3,46 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 148, con las excepciones
siguientes: GST(FL)-NT1 tiene una masa
molecular teórica de 27.965,3 Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-NT1 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa JM105, como se describe en el
ejemplo 140, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 27.953,00 \pm 2,65 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína que estaba
intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-NT1 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa BL21, como se describe en el
ejemplo 143, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 27.951,00 \pm 4,36 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-NT1 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa TOP10, como se describe en el
ejemplo 146, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 27.954,67 \pm 6,66 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento usado fue esencialmente el
mismo como se describe en el ejemplo 148, con las excepciones
siguientes: GST(FL)-NT2 tiene una masa
molecular teórica de 28.218,6 Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-NT2 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa JM105, como se describe en el
ejemplo 141, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 28.208,00 \pm 8,44 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de
GST(FL)-NT2 que había sido expresada en las
células de E. Coli de la cepa BL21, como se describe en el
ejemplo 144, mostraron un único pico que tuvo un valor promedio
[M+H]^{+} de 28.214,33 \pm 5,86 Dalton. Los datos
experimentales fueron consistentes con la proteína intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros de la espectometría de masas MALDI
de GST(FL)-NT2 que había sido expresada en
las células de E. Coli de la cepa TOP10, como se describe en
el ejemplo 147, mostraron:
- (a)
- un pico mayor (100% intensidad) que tuvo un valor promedio [M+H]^{+} de 28.213,83 \pm 6,05 Dalton;
- (b)
- un pico menor (25% intensidad relativa) que tuvo un valor promedio [M+H]^{+} de 27.815,83 \pm 8,04 Dalton;
- (c)
- un pico menor (13% intensidad relativa) que tuvo un valor promedio [M+H]^{+} de 26.301,0 \pm 6,90 Dalton.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos experimentales fueron consistentes con
la muestra purificada que contenía predominantemente la proteína
intacta y cantidades pequeñas de la proteína que había sido
truncada en el N-terminal por los primeros 3 y los
primeros 15 residuos, respectivamente. Estas especies corresponden a
las formas truncadas de GST(FL)-NT2 carente
de los siguientes aminoácidos N terminales indicados en
cursiva:
- Pico menor
- MKH{}\hskip0.3cm^{1} TNIHQDQHNHFHR - - - - -[GST]
- \quad
- Esta especie tiene una masa molecular teórica de 27.822,11 Dalton
\vskip1.000000\baselineskip
- Pico menor
- MKHTNIHQDQHNHFH{}\hskip0.3cm^{1} R - - - - -[GST]
- \quad
- Esta especie tiene una masa molecular teórica de 26.312,55 Dalton
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima de disociación del
N-terminal dipeptidil-peptidasa I
[DAP-1 (E.C. 3.4.14.1); obtenible de, por ej.,
Aldrich-Sigma, St Louis, MO, E.E.U.U., o Unizyme
Laboratories, Hørsholm, Dinamarca] (10 U/ml) fue activada añadiendo
un volumen igual de DTT (20 mM) e incubando la mezcla durante
4-6 min a temperatura ambiente. La mezcla reactiva
de digestión contenía 50 \mug de la proteína etiquetada en el
N-terminal GST(FL)-CT2
expresada en células de E. Coli de la cepa JM105, como se
describe en el ejemplo 139, y 12,5 mU de la DAP-1
activada. La mezcla reactiva fue ajustada a un volumen de 70 \mul
por la adición del tampón en el que se suspendió la proteína (20 mM
de fosfato sódico, 150 mM de NaCl, pH 6,9). La mezcla reactiva de
digestión fue luego incubada a 37ºC en un baño de agua durante
períodos de tiempo desde 5 min hasta aproximadamente 23 horas.
Al finalizar el período de incubación se retiró
una parte alícuota de la mezcla reactiva de digestión con
DAP-1 y se detuvo la reacción añadiendo tampón de
carga SDS (reducción). La muestra fue calentada a 100ºC durante 90
seg y luego almacenada a -20º para su posterior análisis en gel de
SDS-poliacrilamida.
Además, al finalizar el periodo de incubación,
se retiró una segunda parte alícuota de la mezcla reactiva de
digestión con DAP-1 y se incubó con
guanidina-HCl (añadida a una concentración final de
1 M) durante 5 min a temp. ambiente para parar la reacción de
digestión. Esta mezcla fue luego adicionalmente preparada, como se
describe en el ejemplo 148, para su análisis posterior por
espectometría de masas MALDI-TOF. Al poco tiempo,
esto implicó la adición de \beta-mercaptoetanol
(hasta una concentración final de 50 mM) a la mezcla reactiva de
digestión detenida que fue luego incubada durante 15 min a temp.
ambiente antes de ser desalada usando un C_{18} ZipTip^{TM} y
luego almacenada a -20ºC.
Para valorar la muestra de proteína en el
momento de la digestión con DAP-1 y para servir de
control negativo para ésta, también se preparó una muestra de la
proteína no digerida (es decir, no tratada con
DAP-1), GST(FL)-CT2, como se
describe en el ejemplo 139, para medir posteriormente la masa
molecular por espectometría de masas MALDI-TOF.
Esto implicó complementar la muestra de proteína con
\beta-mercaptoetanol (hasta una concentración
final de 50 mM) antes de que fuera desalada usando un C_{18}
ZipTip^{TM}. La muestra fue luego almacenada a -20ºC hasta su
posterior análisis por espectometría de masas
MALDI-TOF.
Una muestra de la proteína no digerida (es
decir, no tratada con DAP-1),
GST(FL)-CT2, como se describe en el ejemplo
139, fue también complementada con tampón de carga SDS (reducción)
y calentada a 100ºC durante 90 seg antes de ser almacenada a -20ºC
para su posterior análisis en gel de
SDS-poliacrilamida.
El procedimiento fue esencialmente el mismo como
se describe en el ejemplo 151, con las excepciones siguientes:
La proteína de fusión GST(FL) purificada
etiquetada en el N-terminal
GST(FL)-NT1, que había sido expresada en
células de E. Coli de la cepa JM105, como se describe en el
ejemplo 140, fue adicionalmente dializada en el tampón (20 mM de
acetato sódico, 150 mM de NaCl, pH 5,5). Tras la diálisis, se
determinó la concentración de proteína utilizando el reactivo de
ácido biquinconínico (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL,
E.E.U.U.) usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. La
mezcla reactiva de digestión DAP-1 fue incubada
durante períodos de tiempo desde 5 min hasta aproximadamente 24
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento para la digestión con
DAP-1 de la proteína de fusión
GST(FL)-NT2 etiquetada en el
N-terminal GST(FL) fue esencialmente el mismo
como se describe en el ejemplo 151, con las excepciones
siguientes:
La proteína de fusión
GST(FL)-NT2 etiquetada en el
N-terminal GST(FL) purificada, que había
sido expresada en células de E. Coli de la cepa JM105, como
se describe en el ejemplo 141, fue adicionalmente dializada en el
tampón (20 mM de fosfato sódico, 150 mM de NaCl, pH 6,3). Tras la
diálisis se determinó la concentración de proteína utilizando el
reactivo de ácido biquinconínico (BCA) (Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL, E.E.U.U.) usando albúmina de suero bovino (BSA) como
estándar. La mezcla reactiva de digestión fue incubada durante
períodos de tiempo desde 5 min hasta aproximadamente 24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató la GST(FL)-CT2
con DAP-1, las condiciones de la reacción de
digestión siendo como se describe en el ejemplo 151. Al final del
tiempo de incubación que varió de 5 min hasta aproximadamente 23
horas, se retiró una parte alícuota de la reacción de digestión y
se incubó con guanidina-HCl (añadida a una
concentración final de 1 M) durante 5 min a temp. ambiente para
parar la reacción de digestión. Esta mezcla fue luego
adicionalmente preparada como se describe en el ejemplo 148, para
su análisis posterior por espectometría de masas
MALDI-TOF. Al poco tiempo esto implicó la adición de
\beta-mercaptoetanol (hasta una concentración
final de 50 mM) a la mezcla reactiva de digestión detenida, que fue
luego incubada durante 15 min a temp. ambiente antes de ser desalada
usando un C_{18} ZipTip^{TM}, y luego se almacenó a -20ºC.
También se preparó una muestra de la proteína
GST(FL)-CT2 no digerida (es decir, no
tratada con DAP-1), como se describe en el ejemplo
139, en el momento de la digestión con DAP-1 y para
su posterior medición de masa molecular por espectometría de masas
MALDI-TOF, para valorar la muestra de proteína en
el momento de la digestión y para servir de control negativo para
ésta. Como ya se ha descrito anteriormente en el ejemplo 151, esto
implicó complementar la muestra de proteína con
\beta-mercaptoetanol (hasta una concentración
final de 50 mM) antes de ser desalada usando un C_{18}
ZipTip^{TM}. La muestra fue luego almacenada a -20ºC hasta su
posterior análisis por espectometría de masas
MALDI-TOF.
Las muestras mencionadas arriba fueron
analizadas por espectometría de masas MALDI-TOF.
Cada muestra fue aplicada a una matriz ácida sinapínica usando el
método de cristal molido. Se registraron los espectros usando una
estación de trabajo de bioespectrometría Voyager-DE
STR. Se analizaron las muestras en modo linear de ión positivo con
un potencial de aceleración de 25 kV, un tiempo de retardo del
pulso de 250 ns, una puerta de masa baja de 5 kDa y una
transconductancia del 85%. Se tomaron 100 disparos por espectro y se
acumularon 5 espectros.
Los espectros son mostrados en la Fig. 53. El
espectro para la proteína de fusión
GST(FL)-CT2 no tratada con
DAP-1, es decir el control negativo, muestra un
único pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de
28.013 \pm 3,21 Dalton; por comparación con la masa molecular
teórica isotópica de GST(FL)-CT2 (28.007,3
Dalton) la masa observada es consistente con la proteína
GST(FL)-CT2 intacta. El espectro para la
GST(FL)-CT2 digerida con
DAP-1 (marcado 2) muestra una masa molecular
disminuida después del tratamiento de la proteína de fusión con
DAP-1 durante 2 horas.
\newpage
El espectro 2 muestra un pico mayor (2a) con un
valor promedio [M+H]^{+} de 26,154 \pm 6 Dalton, y un
pico menor (2b) con un valor promedio [M+H]^{+} de 25,931
7,51 Dalton. Estas especies corresponden a las formas truncadas de
GST(FL)-CT2 carentes de los aminoácidos del
N-terminal indicados en cursiva:
- Pico (2a)
- MKHQHQHQHQHQHQ^{1}VDQMSP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 26.156,3 Dalton)
\vskip1.000000\baselineskip
- Pico (2b)
- MKHQHQHQHQHQHQVD^{1}QMSP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 25.942,1 Dalton)
donde ^{1}V y ^{1}Q
corresponden al residuo de aminoácido de N-terminal
de las variantes truncadas de GST(FL)-CT2
después de la digestión con DAP-1. Basado en la
especificidad aparente de DAP-1, ocurren otras
disociaciones hasta la posición de detención de
DAP-1 ^{1}SP
- - - - - -[GST], donde ^{1}S es el
residuo de aminoácido de
N-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue esencialmente el mismo como
se describe en el ejemplo 154, con las excepciones siguientes:
Se trató la GST(FL)-NT1
con DAP-1, las condiciones de la reacción de
digestión siendo como se describe en el ejemplo 152. La mezcla
reactiva de digestión fue incubada durante períodos de tiempo que
varió desde 5 min hasta aproximadamente 24 horas.
También se preparó una muestra de la proteína
GST(FL)-NT1 no digerida (es decir no tratada
con DAP-1, como se describe en el ejemplo 140, en el
momento de la digestión con DAP-1.
Los espectros son mostrados en la Fig. 54. El
espectro para la GST(FL)-NT1 no tratada con
DAP-1, es decir, el control negativo, muestra un
único pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de
27.972 \pm 3,51 Dalton; por comparación con la masa molecular
prevista teórica de 27.965,3 Dalton para
GST(FL)-NT1 la masa observada es consistente
con la proteína intacta. El espectro para la
GST(FL)-NT1 digerida con
DAP-1 (2 hr) (marcado 2) muestras una masa
molecular disminuida después del tratamiento con
DAP-1.
El espectro 2 muestra un pico mayor (2a) con un
valor promedio [M+H]^{+} de 26.659 \pm 6,81 Dalton.
También muestra un pico menor (2b) con un valor promedio
[M+H]^{+} de 25.934 \pm 3,21 Dalton, y otro pico menor
(2c) con un valor promedio [M+H]^{+} de 25.680 \pm 6,03
Dalton. Estas especies corresponden a las formas truncadas de
GST(FL)-NT1 carentes de los siguientes
aminoácidos en el N-terminal indicados en
cursiva:
- Pico (2a)
- MKHHHNSWDH^{1}DINRVDQMSP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 26.654,9 Dalton)
\vskip1.000000\baselineskip
- Pico (2b)
- MKHHHNSWDHDINRVD^{1}QMSP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 25.942,1 Dalton)
\vskip1.000000\baselineskip
- Pico (2c)
- MKHHHNSINDHDINRVDQM^{1}SP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 25.682,80 Dalton)
donde ^{1}D ..., ^{1}Q ..... y
^{1}S ..... corresponden al residuo de aminoácido
N-terminal de las variantes truncadas de
GST(FL)-NT1 después de la digestión con
DAP-1. Basado en la especificidad aparente de
DAP-1, se produjo la disociación hasta la posición
de detención de DAP-1 'SP [GST]. También se
evidencian picos subsidiarios en el espectro correspondientes a los
aductos de ácido sinapínico (de masa molecular adicional de 224,2
Da) y \beta-mercaptoetanol (PM
78,.13).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue esencialmente el mismo como
se describe en el ejemplo 154, con las excepciones siguientes:
Se trató GST(FL)-NT2 con
DAP-1, las condiciones de la reacción de digestión
siendo como se describe en el ejemplo 153. La mezcla reactiva de
digestión fue incubada durante períodos de tiempo que variaron desde
5 min hasta aproximadamente 24 horas.
También se preparó una muestra de la proteína
GST(FL)-NT2 no digerida (es decir, no
tratada con DAP-1), como se describe en el ejemplo
141, en el momento de la digestión con DAP-1.
Los espectros son mostrados en la Fig. 55. El
espectro para la GST(FL)-NT2 no tratada con
DAP-1, es decir, el control negativo, muestra un
único pico (marcado 1) que tiene un valor [M+H]^{+} de
28.223 \pm 2,89 Dalton; por comparación con la masa molecular
prevista teórica de 28.218,6 Dalton para
GST(FL)-NT2 la masa observada es consistente
con la proteína intacta. El espectro para la
GST(FL)-NT2 digerida con
DAP-1 (2 hr) (marcado 2) muestras una masa
molecular disminuida después del tratamiento con
DAP-1.
El espectro 2 muestra un pico mayor (2a) con un
valor promedio [M+H]^{+} de 25.910 \pm 9,16 Dalton, y un
pico menor (2b) con un valor promedio [M+H]^{+} de 25.648
\pm 12,86 Dalton. Estas especies corresponden a las formas
truncadas de GST(FL)-NT2 carente de los
aminoácidos del N-terminal como se indica en
cursiva:
- Pico (2a)
- MKHTNIHQDQHNHFHRVD^{1}QMSP - - - - - -[GST]
- \quad
- (esta especie tiene una masa molecular teórica de 25.942,1 Dalton)
\vskip1.000000\baselineskip
- Pico (2b)
- MKHTNIHQDQHNHFHRVDQM^{1}SP - - - - - -[GST]
- \quad
- Esta especie tiene una masa molecular teórica de 25.682,8 Dalton.
dónde ^{1}Q ..... y ^{1}S .....
corresponden al residuo de aminoácido de N-terminal
de las variantes truncadas de GST(FL)-NT2
después de la digestión con DAP-1. Basado en la
especificidad aparente de DAP-1, se produjo la
disociación hasta la posición de detención de DAP-1
^{1}SP
- - - - - -[GST].
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron partes alícuotas de la varias
proteínas de fusión glutationa S-transferasa de
longitud completa recombinantes etiquetadas en el
N-terminal, antes y después de la digestión con
DAP-1 con tampón de carga SDS (reducción) y se
calentaron durante 90 segundos a 100ºC, como se describe en los
ejemplos 151, 152 y 153. Luego se cargaron las muestras sobre un
gel de SDS-poliacrilamida al 18% y se hicieron
fluir por un periodo de tiempo apropiado. Se cargaron 0,4 pi de las
proteínas no digeridas (es decir, no tratadas con
DAP-1) 0,6 \mul de las mezclas de reacción de
digestión con DAP y 8 \mul del marcador de peso molecular
[BenchMark Protein Ladder (Gibco BRL)] sobre el gel. Para visualizar
las bandas se tiñió el gel con plata. El gel coloreado es mostrado
en la Fig. 56.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una mezcla reactiva de digestión con
DAP-1, el procedimiento siendo esencialmente tal y
como se describe en los ejemplos 92 y 152. En resumen,
DAP-1 [EC 3.4.14.1] (10 U/ml) fue activado añadiendo
un volumen igual de DTT (20 mM) e incubando la mezcla durante
4-6 min a temperatura ambiente. La mezcla reactiva
de digestión contenía 50 \mug de la proteína etiquetada en el
N-terminal GST(FL)-NT1
expresada en células de E. Coli de la cepa JM105, como se
describe en los ejemplos 140 y 152, y 12,5 mU del
DAP-1 activado. La mezcla reactiva fue ajustada a
un volumen de 70 \mul por la adición del tampón donde la proteína
fue suspendida (20 mM de acetato sódico, 150 mM de NaCl, pH 5,5). La
mezcla reactiva de digestión fue luego incubada a 37ºC en un baño
de agua durante aproximadamente 24 horas.
También se preparó una mezcla reactiva de
control negativo no tratada con DAP-1. El
procedimiento fue esencialmente como se ha descrito anteriormente,
excepto que DAP-1 fue omitido.
Al terminar el periodo de incubación se evaluó
la actividad de ambas reacciones. Un ensayo fiable de la actividad
funcional GST es el ensayo CDNB
(1-cloro-2,4-dinitrobenzeno)
donde GST cataliza la derivatización de CDNB con glutationa; este
complejo puede ser controlado por mediciones de la densidad óptica
a una longitud de onda de 340 nm. Este ensayo fue realizado como se
indica en el folleto de información GST Gene Fusion System, 3ª edn.,
Revision 1, de Pharmacia Biotech. Poco después se añadieron 10
\mul de una dilución de 1 en 100 de cada una de las mezclas de
reacción antes y después de la digestión con DAP-1
a 100 \mul de mezcla reactiva de ensayo conteniendo 100 mM de
KH_{2}PO_{4}, pH 6,5, 1 mM de
1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
(CDNB) y 1 mM de glutationa reducida en una cubeta, y la
absorbencia a 340 nm fue medida durante 5 min en intervalos de 1
minuto. Las mezclas de reacción antes y después de la digestión con
DAP-1 conteniendo
GST(FL)-NT1 exhibieron una actividad GST
funcional determinada por este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento fue esencialmente el mismo que
el que se describe en el ejemplo 158, con las excepciones
siguientes:
La mezcla reactiva de la digestión contenía 50
\mug de la proteína etiquetada en el N-terminal
GST(FL)-NT2 expresada en células de E.
Coli de la cepa JM1 05, como se describe en los Ejemplos 141 y
153, y 12,5 mU del DAP-1 activado. La mezcla
reactiva fue ajustada a un volumen de 70 \mu, por la adición del
tampón donde la proteína fue suspendida (20 mM de fosfato sódico,
150 mM de NaCl, pH 6,3). La mezcla reactiva de digestión fue luego
incubada a 37ºC en un baño de agua durante aproximadamente 12
horas.
También se preparó una mezcla reactiva de
control negativo no tratada con DAP-1. El
procedimiento fue esencialmente tal y como se ha descrito
anteriormente, excepto que el DAP fue omitido.
Las mezclas de reacción antes y después de la
digestión con DAP-1 conteniendo
GST(FL)-NT2 exhibieron una actividad GST
funcional determinada por este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó el lisado celular bruto (CCL)
obtenido a partir de la expresión a gran escala de glutationa
S-Transferasa (GST) fusionada en el
N-terminal para los siguientes varios marcadores de
afinidad: hexa-histidina (GST-CT1),
repeticiones His-Gln alternas
(GST-CT2), nuevo marcador 1
(GST-NT1) y NT2 (GST-NT2), tal como
se describe en el Ejemplo 91, por procedimientos de elución
isocrática mono-fase. Se aplicó el lisado celular
bruto a ambas columnas Ni^{2+}-tacn y
Cu^{2+}-tacn. Cada columna (Econo columnas de 10
ml, Bio-Rad ^{TM}) tenía un volumen de lecho de
0,5 ml, y fue equilibrada con tampón Al [tampón Al = tampón A (20 mM
tampón de fosfato, 500 mM de NaCl, pH 8) + 10 mM de imidazol, pH
8]. Las columnas fueron cargadas con 5 ml de muestra conteniendo
0,5 ml (CCL) + 4,5 ml de tampón Al. Después de haber pasado la
muestra a través de la columna, la columna fue lavada con tampón Al
(5 ml). Un segundo lavado (5 ml) fue realizado usando el tampón A2
(tampón A2 = tampón A + 20 mM de imidazol, pH 8). La elución fue
realizada aplicando a las columnas volúmenes de 3 X 1 ml de tampón
de elución (BA + 500 mM de imidazol, pH 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Partes alícuotas de la primera fracción de
elución recogidas de la elución socrática mono-fase
de varias proteínas de fusión GST etiquetadas en el
N-terminal de las que cada una fue aplicada a
columnas de Ni^{2+}-tacn y
Cu^{2+}-tacn tal como se describe en el Ejemplo
160 fueron mezcladas con tampón de carga SDS (reducción) y
calentadas durante 90 segundos a 100ºC. Las muestras fueron luego
cargadas sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 15% y
se dejaron fluir durante un periodo de tiempo apropiado. 16 \mul
de las fracciones de elución y 2 \mul de marcador de peso
molecular [Benchmark protein ladder (Gibco, BRL)] fueron cargados
sobre el gel. Para visualizar las bandas se tiñeron los geles con
plata. El gel teñido es mostrado en la Fig. 57.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión etiquetada en el
N-terminal
NT2-VD-hGH, es decir
MKHTNIHQDQHNHFHRVD-hGH, fue expresada en una botella
de agitación de 1 litro usando un constructo de plásmido producido
esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 127. El granulado
fue recogido y lavado con agua. El granulado de 250 ml fue luego
lisado en tampón de lisis (20 ml 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, 500 mM
de NaCl, pH 8) por adición de 250 \mul de lisozima (30 mg/ml) y
1,25 \mul de Benzonase. La suspensión fue dejada durante 1 hora a
5ºC seguida de centrifugado. El sobrenadante fue recogido y diluido
con 80 ml de tampón de lisis, y fue luego introducido en una
columna de Ni^{2+}-tacn inmovilizada de 15 ml a
una velocidad de 3 ml/min, seguido de 150 ml de tampón. La columna
fue luego lavada con 150 ml de tampón de lisis con un contenido de
tampón de elución al 2% (20 mM de Na_{2}HPO_{4}, 500 mM de
NaCl, 500 ml de imidazol, pH 8), y luego con 150 ml de tampón de
lisis con un contenido de tampón de elución al 4%. Luego se realizó
la elución en gradientes usando un tampón de elución del 4% al 100%
sobre un volumen total de 75 ml, seguido de una elución con 75 ml de
tampón de elución al 100%.
Las fracciones eluidas conteniendo el producto
deseado fueron identificadas por electroforesis, y fueron agrupadas
y desaladas contra 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, 150 mM de NaCl, pH
6,3, seguido de un calentamiento a 37ºC. Se añadió
DAP-1 activado (125 \mul de DAP-1
+ 25 \mul 100 mM DTT, incubado durante 5 minutos a temperatura
ambiente) a las fracciones desaladas, y el pH del medio fue luego
variado varias veces entre aproximadamente 6,3 y 5,1 durante un
periodo de 270 minutos. Luego se dejó el medio a 5ºC y a un pH de 5
durante el fin de semana. El grupo dividido fue luego centrifugado
y el sobrenadante fue recogido, ajustado a pH 8 e introducido en
una columna de Ni^{2+}-tacn inmovilizada de 1 ml.
La columna fue luego eluida esencialmente como se ha descrito
anteriormente a un caudal de 0,18 ml/min, y se recogió la hGH
conteniendo el pico. Se analizaron las muestras seleccionadas por
SDS-PAGE y transferencia Western como se muestra en
el Esquema 14 abajo.
Además, varias muestras fueron analizadas por
espectrometría de masas MALDI-TOF con una exactitud
estimada de 50 Dalton, y se determinó que la masa molecular del
producto marcado aislado era de 24.444 Dalton (valor teórico 24.402
Dalton). Después de la ruptura y de una segunda elución en la
columna de Ni^{2+}-tacn, se determinó una masa
molecular de 22.156 Dalton (valor teórico 24.125 Dalton). Se obtuvo
una masa molecular de 22.147 Dalton para una muestra de hGH
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión etiquetada en el
N-terminal
CT2-VD-hGH, es decir
MKHQHQHQHQHQHQVD-HGH, fue expresada en una botella
de agitación de 1 litro usando un constructo de plásmido producido
esencialmente tal y como se describe en el Ejemplo 127. El
granulado fue recogido y lavado con agua. El granulado de 250 ml
fue luego lisado en tampón de tisis tal y como se describe en el
Ejemplo 162. La suspensión fue dejada durante 1 hora a 5ºC seguido
de centrifugado. El sobrenadante fue recogido, y la mitad fue
diluida con 40 ml de tampón de tisis e introducida en una columna
de Ni^{2+}-tacn inmovilizada de 5 ml a razón de 1
ml/min, seguido de 20 ml de tampón. La columna fue luego lavada con
50 ml de tampón de tisis con un contenido de tampón de elución al 2%
(20 mM de Na_{2}HPO_{4}, 500 mM de NaCl, 500 ml de imidazol, pH
8) y 50 ml de tampón de tisis con un contenido de tampón de elución
al 4%. Luego se realizó la elución en gradientes usando de 4% a
100% de tampón de elución sobre un volumen total de 25 ml, seguido
de una elución con 25 ml de tampón de elución al 100%.
Se identificaron fracciones eluidas conteniendo
el producto marcado deseado por electroforesis, y fueron agrupadas
y desaladas con tampón de lisis. La agrupación desalada fue diluida
5x con tampón de lisis e introducida en una columna de
Cu^{2+}-tacn de 5 ml. Los tampones de elución y
las velocidades fueron tales como se han descrito anteriormente
para la columna Ni^{2+}-tacn. Asimismo, las
fracciones respectivas conteniendo el producto de hGH etiquetado
fueron agrupadas y desaladas.
Las muestras seleccionadas fueron analizadas por
SDS-PAGE como se muestra en el Esquema 15 más
abajo.
Los resultados demostraron que se consiguió una
reducción sustancial en el contenido del material hGH no
relacionado usando las dos columnas M^{2+}-tacn
diferentes sucesivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
SULKOWSKI, E. Trends in
Biotechnology, 1985, vol. 3, 1-6
[0003].
PORATH, J.; CARLSSON, I.;
OLSSON, I.; BELFRAGE, G. Nature, 1975,
vol. 258, 598-599 [0003].
KAGEDAL, L. Protein Purification. VCH
Publishers 1989, 227-251 [0003] [0004]
[0006].
ZACHARIOU, M.; HEARN, M. T. W.
Biochemistry, 1996, vol. 35, 202-211
[0003].
WONG, J. W.; ALBRIGHT, R. L.;
WANG, N. H. L. Separation and Purification Methods,
1991, vol. 20, 49-57 [0004].
ZACHARIOU, M.; TRAVERSO, I.;
SPICCIA, L.; HEARN, M.T.W. Journal of Physical
Chemistry, 1996, vol. 100, 12680-12690
[0004].
ZAWISTOWSKA, U.; SANGSTER, K.;
ZAWISTOWSKI, J.; LANGSTAFF, J.; FRIESSEN, A.
D. Cereal Chemistry, 1988, vol. 65,
5413-5418 [0004].
WEERANSINGHE, K. M.; SCULLY, M.
F.; KADDER, V. V. Biochimica Biophysica Acta,
1985, vol. 839, 57-65 [0004].
Metalloproteins -Chemical Properties and
Biological Effects Bioactive Molecules Kodansha Ltd 1988.
18-45 [0004].
HOCHULI, E.; BANNWARTH, W.;
DÖBELI, H.; STUBER, D. Bio/Technology,
1988, vol. 6, 1321-1324 [0004].
ZACHARIOU, M.; TRAVERSO, I.;
SPICCIA, L.; HEARN, M.T.W. Journal of Physical
Chemistry, 1996, vol. 100, 12680-12690
[0005].
PORATH, J. Trends in Analytical
Chemistry, 1988, vol. 7, 254-256
[0005].
MANTOVAARA, T.; PERTOFZ, H.;
PORATH, J. Biotechnology Applied Biochemistry,
1989, vol. 11, 564-569 [0005].
ZACHARIOU, M.; TRAVERSO, I.;
HEARN, M. T. W. Journal of Chromatography,
1993, vol. 646, 107-115 [0005].
CHAOUK, H.; MIDDLETON S.;
JACKSON W.R.; HEARN, M.T.W. International Journal
of BioChromatography, 1997, vol. 2,
153-190 [0005].
CHAOUK, H.; HEARN, M.T.W.
Journal of Biochemical and Biophysical Research Methods,
1999, vol. 39, 161-177 [0005].
HOCHULI, E.; BANNWARTH, W.;
DOBELI, H.; GENTZ, R.; STUBER, D.
Bio/Technology, 1988, vol. 6,
1321-1325 [0005].
HIDAKA Y.; PARK, H.;
INOUYE, M. FEBS Letters, 1997, vol. 400,
238-242 [0005].
PORATH, J. Protein Expression &
Purification, 1992, vol. 3, 263-281
[0005].
OSWALD, T.; HORNBOSTEL, G.;
RINAS, U.; ANSPACH, F.B. Biotechnology Applied
Biochemistry, 1997, vol. 25, 109-115
[0006].
ZACHARIOU, M.; TRAVERSO, I.;
SPICCIA, L.; HEARN, M.T.W. Analytical
Chemistry, 1996, vol. 69, 813-822
[0006].
S.F.A. KETTLE. Coordination Chemistry
Thomas Nelson and Sons Ltd. 1969. 48-49
[0054].
NOZAKI; TANFORD. J. Biol. Chem.,
1963, vol. 238, 4074-4081 [0057].
J. BIOL. CHEM., 1970, vol. 245,
1648-1652 [0057].
EISENBERG, D.; WEISS, R.M.;
TERWILLIGER, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1984, vol. 81, 140-144 [0057].
RICHARDS, F.M. Annual Reviews of
Biophysics and Bioengineering, 1977, vol. 6,
151-176 [0057].
WILCE, M.C.J.; AGUILAR, M.I.;
HEARN, M.T.W. Anal. Chem., 1995, vol. 67,
1210-1219 [0057].
WOOD, D.W.; DERBYSHIRE, V.;
WU, W.; CHARTRAIN, M.; BELFORT, M.
BELFORT, G. Biotechnology Progress, 2000, vol.
16, 1055-1063 [0060].
WOOD, D.W.; WU, W.;
BELFORT, G.; DERBYSHIRE, V.; BELFORT, M.
Nature Biotechnology, 1999, vol. 17,
889-892 [0060].
J.E. RICHMAN; T.J. ATKINS.
Journal of the American Chemical Society, 1974, vol.
96, 2268- [0089].
J.E. RICHMAN; W.F. OETTLE; T.J.
ATKINS Organic Synthesis, 1978, vol. 58, 86
[0089].
WIEGHARDT et al. Inorg. Chem.,
1985, vol. 24, 1230 [0090].
SESSLER et al. Inorganic
Chemistry, 1990, vol. 29, 4143 [0090].
ZHANG et al. Inorganic Chemistry,
1995, vol. 34, 2883 [0090].
GRAHAM et al. Inorganic Chemistry,
1997, vol. 36, 6366 [0091].
FARRUGIA, L.J.; LOVATT, P.A.;
PEACOCK, R.D. Journal of the Chemical Society, Dalton
Transactions, 1997, 911-912 [0091].
SPICCIA et al. Journal of the Chemical
Society, Dalton Transactions, 1997, 1092 [0091].
GRAHAM et al. Inorganic Chemistry,
2000, vol. 39, 1092 [0091].
BARRETT, A.J. Biochemical Journal,
1980, vol. 187, 909-912 [0158].
ANASTATI, A.; BROWN, M.A.;
KEMBHAVI, A.A.; NICKLIN, M.J.H.; SAYERS, C.A.;
SUNTER, D.C.; BARRETT, A.J. Biochemical
Journal, 1983, vol. 211, 129-138
[0158].
LAW, R.H.P.; ROWLEY, M.J.;
MACKAY, I.R.; CORNER, B. Journal of
Biotechnology, 1998, vol. 61, 57-68
[0168].
PAPAKONSTANTINOU, T.; LAW, R.H.P.;
GARDINER, P.; ROWLEY, M.J.; MACKAY, I.
Enzyme and Microbial Technology, 2000, vol. 26,
645-652 [0168].
PAPAKONSTANTINOU, T.; LAW, R.H.P.;
GARDINER, P.; ROWLEY, M.J; MACKAY, I.
Enzyme and Microbial Technology, 2000, vol. 26,
645-652 [0168].
Booklet GST Gene Fusion System [0214].
YANG, R.; ZOMPA, L.J. Inorganic
Chemistry, 1976, vol. 15, 1499 [0266].
MURPHY, L.J.; ZOMPA, L.J.
Inorganic Chemistry, 1979, vol. 18, 3278 [0266].
PORATH, J.; BELEW, M. Journal
of Chromatography, 1990, vol. 516, 333 [0268].
JIANG, W.; HEARN, M.T.W.
Analytical Biochemistry, 1996, vol. 242, 45
[0268].
GROS, C.; RABIET, F.;
DENAT, F.; BRANDÉS, S.; CHOLLET, H.;
GUILARD, R. Journal of the Chemical Society, Dalton
Transactions, 1996, 1209 [0268].
VAN BERKEL, P.M.; DRIESSEN, W.L.;
KODHAAS, G.J.A.A.; REEDIJK, J.; SHERRINGTON,
D.C. Journal of the Chemical Society, Chemical
Communications, 1995, 147 [0268].
DUDLER, V.; LINDOY, L.F.;
SALLIN, D.; SCHLAEPFER, C.W. Australian Journal of
Chemistry, 1987, vol. 40, 1557 [0268].
B. DASGUPTA; C. KATZ; T.
ISRAEL; M. WATSON; L.J. ZOMPA. Inorg. Chim.
Acta, 1999, vol. 292, 172-[0270].
R. YANG; L. J. ZOMPA. Inorg.
Chem., 1976, vol. 15, 1499 [0270].
M. ZACHARIOU; I. TRAVERSO; L.
SPICCIA; M. T. W. HEARN J. Phys. Chem.,
1996, vol. 100, 12680 [0270].
A. HULANICKI; T. KRAWCZYK.
Anal. Chim. Acta, 1984, vol. 158, 343 [0270].
G. ARENA; V. CUCINOTTA. Inorg.
Chim. Acta, 1981, vol. 52, 275 [0270].
L. ANDEREGG. Hely. Chim. Acta,
1964, vol. 47, 1801 [0270].
D. SANNA; I. BODI; S.
BOUHSINA; G. MICERA Dalton Trans, 1999,
3275 [0270].
G. ANDEREGG Pure & Appl.
Chem., 1982, vol. 54, 2693 [0270].
H. IRVING; M. MILES. J. Chem.
Soc. (A), 1966, 727 [0270].
HATHAWAY, B. J. Comprehensive
Coordination Chemistry Pergamon Press 1987, vol. 5, 533
[0271].
Gene Fusion System [0301] [0353].
Claims (34)
Hide Dependent
translated from
Claims (34)
Hide Dependent
translated from
1. Sustrato de polímero funcionalizado con una
funcionalidad de coordinación de ión metálico de la fórmula general
(I)
donde n es 1, 2 ó
3;
- \quad
- cada uno de a, b y c en cada anillo de triazacicloalcano, independientemente uno del otro e independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano, es 1, 2 ó 3;
- \quad
- uno o ambos átomos de hidrógeno de cada grupo -CH_{2}- en cada anillo de triazacicloalcano independientemente el uno del otro e independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano puede opcional e independientemente ser sustituido por un sustituyente;
- \quad
- el átomo de hidrógeno de cada grupo -NH- en cada anillo de triazacicloalcano independientemente el uno del otro e independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano puede opcionalmente ser sustituido por un sustituyente;
- \quad
- cuando n es 1, R es un grupo bifuncional, dicho grupo bifuncional comprendiendo opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos;
- \quad
- cuando n es 2 ó 3, R es un grupo (n+1)-funcional, dicho grupo (n+1)-funcional comprendiendo opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos; y
- \quad
- X es un grupo enlazador/separador.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Sustrato de polímero funcionalizado según la
reivindicación 1, donde el sustituyente opcional que substituye un
átomo de hidrógeno en un grupo -CH_{2}- del anillo es
seleccionado del grupo consistente en grupos alquilos inferiores
sustituidos opcionalmente y grupos arilo sustituidos opcionalmente,
el(los) sustituyente(s) opcional(es) en dicho
grupo alquilo inferior o grupo arilo comprendiendo opcionalmente
uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos.
3. Sustrato de polímero funcionalizado según la
reivindicación 1 ó 2, donde el sustituyente opcional que sustituye
el átomo de hidrógeno en un grupo -NH- del anillo es seleccionado
del grupo consistente en grupos alquilos inferiores sustituidos
opcionalmente y grupos arilo sustituidos opcionalmente,
el(los) sustituyente(s) opcional(es) en dicho
grupo alquilo inferior o grupo arilo comprendiendo opcionalmente
uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos.
4. Sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho
polímero es sustancialmente insoluble en agua.
5. Sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho
polímero es seleccionado del grupo consistente en: polisacáridos y
derivados de los mismos; polialquilenoglicoles y derivados de los
mismos; alcoholes de polivinilo y derivados de los mismos;
poliacrilamidas; sílices modificados en superficie; y óxidos
metálicos modificados en superficie.
6. Sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicho
polímero es seleccionado del grupo consistente en: agarosa y
derivados de ésta; dextrano y derivados del mismo; y celulosa y
derivados de la misma.
7. Sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho
sustrato de polímero es una agarosa;
n es 1, 2 ó 3;
a, b y c en cada anillo de triazacicloalcano es
2;
cuando n es 1, R es seleccionado del grupo
consistente en:
-[CH_{2}]_{m}-, donde m es 2, 3 ó
4,
y derivados sustituidos de los
mismos;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando n es 2, R es seleccionado del grupo
consistente en:
y derivados sustituidos de los
mismos;
\vskip1.000000\baselineskip
cuando n es 3, R es seleccionado del grupo
consistente en:
y derivados sustituidos de los
mismos;
y X es un grupo derivable de epiclorohidrina por
reacción de la misma con agarosa, y reacción posterior del producto
resultante con un grupo -NH- del anillo de triazacicloalcano que se
enlaza a X.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-7,
comprendiendo además un ión metálico coordinado a por lo menos uno
de los grupos ligandos triazacicloalcano en dicha funcionalidad.
9. Sustrato de polímero funcionalizado según la
reivindicación 8, donde dicho ión de metal coordinado es un ión de
metal bivalente o trivalente.
10. Sustrato de polímero funcionalizado según
la reivindicación 9, donde dicho ión metálico es seleccionado del
grupo consistente en Ca^{2+}, Mg^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+},
Ni^{2+}, Mn^{2+}, Co^{2+}, Fe^{3+} y Cr^{3+}
11. Proceso para preparar un sustrato de
polímero funcionalizado según la reivindicación 1, que incluye las
etapas de:
- \quad
- selección de un sustrato de polímero que tiene un grupo reactivo funcional capaz de experimentar una primera reacción con un primer grupo funcional de un reactivo bifuncional que tiene un primer y un segundo grupo funcional,
- \quad
- dicha primera reacción dando como resultado la formación de un enlace covalente entre dicho sustrato de polímero y dicho reactivo bifuncional,
- \quad
- dicho segundo grupo funcional del reactivo covalentemente enlazado resultante siendo posteriormente capaz de experimentar una segunda reacción con un grupo reactivo funcional presente en una especie de la fórmula general (II):
- \quad
- donde n, a, b, c y R son tal y como se define en la reivindicación 1;
- \quad
- uno o ambos átomos de hidrógeno de cada grupo -CH_{2}- en cada anillo de triazacicloalcano independientemente el uno del otro e independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano puede opcional e independientemente ser sustituido con un sustituyente, dicho sustituyente opcional comprendiendo opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos;
- \quad
- el átomo de hidrógeno de cada grupo -NH- en cada anillo de triazacicloalcano con la excepción de H*, independientemente el uno del otro e independientemente de cualquier otro anillo de triazacicloalcano puede opcionalmente ser sustituido con un sustituyente, dicho sustituyente opcional comprendiendo opcionalmente uno o más átomos donantes de coordinación de iones metálicos;
- \quad
- dicha segunda reacción dando como resultado la formación de un enlace covalente entre dichas especies de la fórmula general (II) y dicho reactivo covalentemente enlazado;
- \quad
- reacción de dicho sustrato de polímero con dicho reactivo bifuncional; y
- \quad
- reacción de dicho reactivo resultante covalentemente enlazado con dichas especies de la fórmula general (II).
\vskip1.000000\baselineskip
12. Proceso según la reivindicación 11, donde
el sustituyente opcional que sustituye un átomo de hidrógeno en un
grupo -CH_{2}- del anillo es seleccionado del grupo consistente
en: grupos alquilos inferiores sustituidos opcionalmente; y grupos
arilos sustituidos opcionalmente.
13. Proceso según la reivindicación 11 ó 12,
donde el sustituyente opcional que sustituye el átomo de hidrógeno
en un grupo -NH- del anillo es seleccionado del grupo consistente
en: grupos alquilos inferiores sustituidos opcionalmente; y grupos
arilos sustituidos opcionalmente.
14. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 11-13, donde dicho polímero es
sustancialmente insoluble en agua.
15. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 11-14, donde dicho polímero es
seleccionado del grupo consistente en: polisacáridos y derivados de
los mismos; polialquilenoglicoles y derivados de los mismos;
alcoholes de polivinilo y derivados de los mismos; poliacrilamidas;
sílices modificados en superficie y óxidos metálicos modificados en
superficie.
\newpage
16. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 11-15, donde dicho polímero es
seleccionado del grupo consistente en: agarosa y derivados de la
misma; dextrano y derivados del mismo; y celulosa y derivados de la
misma.
17. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 11-16, donde dicho sustrato de
polímero es una agarosa;
- \quad
- n, a, b, c y R son tal y como se define en la reivindicación 7; y dicho reactivo bifuncional es epiclorohidrina.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Proceso según la reivindicación 17, donde
un agente reductor es incorporado en la mezcla reactiva haciendo
reaccionar dicho sustrato de polímero con dicho reactivo
bifuncional.
19. Proceso según la reivindicación 18, donde
dicho agente reductor es borohidruro de sodio.
20. Sustrato de polímero funcionalizado
obtenible por un proceso según cualquiera de las reivindicaciones
11-19.
21. Proceso para preparar un sustrato de
polímero funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones
1-7 ó 20 y comprendiendo además un ión metálico
coordinado en por lo menos uno de los grupos ligandos de
triazacicloalcano en dicha funcionalidad, el proceso comprendiendo
la puesta en contacto del sustrato de polímero funcionalizado según
cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 20 con una
solución acuosa de una sal orgánica o inorgánica de dicho ión
metálico.
22. Sustrato de polímero funcional conteniendo
un ión metálico obtenible por un proceso según la reivindicación
21.
23. Método para purificar una proteína de
interés, el método comprendiendo las etapas de:
- \quad
- puesta en contacto de una muestra de proteína conteniendo un polipéptido comprendiendo dicha proteína de interés, y que además contiene otras proteínas, dicho polipéptido siendo una proteína de fusión comprendiendo dicha molécula de proteína de interés fusionada en su terminal amino o terminal carboxi en por lo menos un oligopeptido conteniendo histidina comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en:
- HHHNSWDHDINR
- (SEC. ID nº. 1)
- HTNIHQDQHNHFHR
- (SEC. ID nº. 2)
- HAMLDRAHDHGTR
- (SEC. ID nº. 3)
- SLHEHHSGDNLR
- (SEC. ID nº. 4)
- THYNAVHSHNTLQ
- (SEC. ID nº. 5)
- DIHHWTDHLQSST
- (SEC. ID nº. 6)
- LYNHYSHTAHVNHL
- (SEC. ID nº. 7)
- \quad
- con un sustrato de polímero funcionalizado según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 ó 21 en condiciones en las cuales dicho polipéptido se enlaza a dicho sustrato de polímero funcionalizado conteniendo un ión metálico para formar un complejo con éste;
- \quad
- lavado del complejo con una solución tampón para eliminar dichas otras proteínas; y
- \quad
- elución del polipéptido enlazado del complejo lavado.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Método según la reivindicación 23,
comprendiendo además una fase donde dicho oligopéptido con histidina
es separado de dicho polipéptido.
25. Método según la reivindicación 24, donde
dicho oligopéptido es separado de dicho polipéptido por medios
enzimáticos.
26. Método según la reivindicación 25, donde
una aminopeptidasa, tal como una dipeptidilaminopeptidasa, es
empleada para disociar dicho oligopéptido de dicho polipéptido.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23-26, donde la secuencia de
aminoácidos de dicho oligopeptido con histidina tiene una extensión
N-terminal comprendiendo la secuencia de
aminoácidos, Met-Xaa, donde Xaa es un residuo de
aminoácido distinto de un residuo de prolina.
\newpage
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23-26, donde la secuencia de
aminoácidos de dicho oligopeptido con histidina tiene una extensión
N-terminal comprendiendo una secuencia de
aminoácidos teniendo como mucho diez residuos de aminoácidos.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23-28, donde el terminal amino y
el terminal carboxi de la secuencia de aminoácidos de dicho
oligopeptido con histidina son cada uno fusionados con una molécula
de proteína de interés.
30. Método según la reivindicación 29, donde la
secuencia de aminoácidos de dicho oligopeptido con histidina es
flanqueada por sitios de disociación seleccionados del grupo
consistente en sitios de disociación enzimática y química.
31. Método según la reivindicación 29 ó 30,
donde dichas dos moléculas de proteína de interés son moléculas de
la misma proteína.
32. Método según la reivindicación 29 ó 30,
donde dichas dos moléculas de proteína de interés son
diferentes.
33. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23-32, donde dicho polipéptido es
obtenible cultivando una célula huésped comprendiendo un constructo
de polinucleótido codificante de dicho polipéptido en un medio de
crecimiento apropiado en condiciones que permiten la expresión de
dicho polipéptido, y recuperación de dicho polipéptido del medio de
cultivo.
34. Método según la reivindicación 33, donde
dicha célula huésped es una cepa de Escherichia coli.