CN106132979B - 抗微生物肽树状聚体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树状聚体，其通过通式X‑(B2‑[Y2]s‑D1)2‑B1‑Z，其中X为(D2)4或(D3)8‑(B3‑[Y3]r‑D2)4或更高的类似物，Y为连接部分，Z为中心部分；每个B表示二氨基烷基羧酸部分；每个D是疏水氨基酸或阳离子氨基酸或由疏水氨基酸或阳离子氨基酸组成的二肽或三肽，该树状聚体用作药物。
Description
描述
革兰氏阴性铜绿假单胞菌(Pseudomonas.aeruginosa)是广泛分布在环境中的普通机会致病菌。铜绿假单胞菌通常与尿路感染、呼吸系统感染、血流感染以及严重烧伤患者和囊性纤维化患者的感染相关。在大面积烧伤患者中，铜绿假单胞菌甚至可以导致全身性感染。铜绿假单胞菌是医院获得性感染中死亡率的主要原因之一。这是由于对抗生素的高水平的获得性抗性和形成使对抗生素易感性降低的生物膜。因此，存在开发靶向革兰氏阴性菌(特别是铜绿假单胞菌)的新治疗剂的需求。
抗微生物肽(AMP)作为抵抗竞争性病原微生物的防御机制以所有生命形式生产。线性AMP是最大的群体，而单环和多环AMP可以在自然界中发现。所有AMP的共同特征是具有碱性氨基酸Lys或Arg的6-50个残基以及显著比例(至少30％)的疏水性残基。因此，AMP优选与带负电的细菌在两性离子哺乳动物膜上相互作用，并且疏水残基促进扩散入膜的疏水部分。甚至AMP具有诱导抗性的潜力，虽然该过程比传统抗生素慢很多。多数线性AMP具有抗病原性细菌、真菌、病毒、寄生虫以及甚至癌细胞的广谱活性，这使其成为作为新抗生素的优秀来源。潜在毒性、被蛋白酶快速降解、对pH变化敏感以及高生产成本是线性AMP的主要缺点。
另一类由多聚体抗微生物肽/树状聚体抗微生物肽组成。这些肽树状聚体被定义为具有连接至模板或核心基体的数个拷贝的肽单体的分支聚合物。在过去的30年中，开发了许多类型的那些多价肽树状聚体。主要在核心进行修饰，而连接的肽保持有效的天然存在的肽或其类似物。在20世纪80年代，引入了多抗原肽(MAPs)作为免疫原，该免疫原具有由作为分支单元并且提供高达第三代的树状聚体的Lys组成的核心(Tarn,J.P.等人；2002,Eur.J Biochem.,269,923-32)。
本发明人的课题组开发了具有新拓扑学的肽树状聚体。这些肽树状聚体是分支肽，所述分支肽具有作为分支点的二氨基酸如Lys以及在分支单元之间的一种、两种或三种氨基酸(AA)。这些肽树状聚体可通过固相肽合成容易地制备，并且它们易溶于水性介质中，而没有如通常发现的线性序列的聚集倾向。那些肽树状聚体显示出催化活性和生物活性，并且与线性类似物相比对蛋白酶解和水解非常稳定。
首次通过合成1111肽树状聚体(在分支赖氨酸之间的一种氨基酸)的珠的组合文库和筛选具有珠扩散测定(bead diffusion assay)活性来尝试对肽树状聚体作为抗微生物剂的研究(Stach,M.等人,2012.Med.Chem.Commun.,3(1),86)。枯草芽孢杆菌用作筛选细菌并揭示了数个命中序列(hit sequences)。命中序列和类似物的再合成提供了针对革兰氏阳性枯草芽孢杆菌(B.subtilis)非常有活性的化合物。然而，所有制备的化合物在MIC(最小抑菌浓度)为约20μg/mL时显示没有抗铜绿假单胞菌活性或仅有轻微的活性。用铜绿假单胞菌筛选相同文库揭示无命中序列。
本发明的目的是提供用于体外和体内的新的肽抗生素。该目的通过独立权利要求的主题实现。
本发明涉及一类新的抗微生物肽树状聚体(AMPD)(图1)，该抗微生物肽树状聚体在分支单元之间具有2或3个氨基酸。该肽树状聚体可以是第二代、第三代、第四代或第五代的，分支单元可以是Lys、Dap、Orn或Dab，并且分支单元之间的氨基酸是任何天然的或非天然的氨基酸。增加活性的基团(如疏水尾)可以连接至树状聚体的核心或N-末端。这样的肽树状聚体高度有效地抗包括临床分离株的革兰氏阴性铜绿假单胞菌、包括大肠杆菌(E.coli)和鲍氏不动杆菌(A.Baumannii)的其他革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus))。
术语和定义
从N-末端至C-末端给出氨基酸序列。本文提及的肽树状聚体的末端羧基可以是羧酸、羧酸盐(COO-)或酰胺(CONH2)基。
在本发明说明书的上下文中，烷基羧酸通过通式CH3(CH2)nCOOH描述，其中n是从6至22的值。在一些实施方式中，n选自6、7、8、9、10、11、12、14或16。
如不另外指明，以三字母代码(Stryer，生物化学，第三版，第21页)给出的序列位置是指天然存在的(蛋白原的(proteinogenic))L-氨基酸的对映异构体或非对映异构体。
在本发明说明书的上下文中，疏水性氨基酸是具有侧链而没有氢键供体或受体的任意α-氨基羧酸。疏水性氨基酸包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在本发明说明书的上下文中，包含阳离子侧链的氨基酸是具有包含化学官能团的侧链的α-氨基羧酸，所述化学官能团在生理pH下表现为阳离子。阳离子氨基酸包括但不限于精氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸和二氨基丁酸。
Dab是(L)-2,3-二氨基丁酸(CAS号：2643-66-5)。
(B)是(L)-2,3-二氨基丙酸(CAS号：4033-39-0)。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了用作药物的肽树状聚体。该树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)是分支部分；
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸。
也就是说，本发明的主题的树状聚体通过缩减的通式描述：
(([([([([D6 2B6[Y6]o]dD5)2B5[Y5]p]cD4)2B4[Y4]q]bD3)2B3[Y3]r]aD2)2B2[Y2]sD1)2B1-Z
其中，a、b、c和d可以为0或1(但如果a为1则b仅可为1，如果b为1则c仅可为1，且如果c为1则d仅可为1)。连接部分Y，如果存在，则通过其半胱氨酸侧链与通过如上式中所描述的酰胺键结合至D的乙酸部分的硫醚连接而连接至邻近的D，。在该示例性连接中，硫醚基中的硫源自Y的半胱氨酸侧链，并且酰胺键中的氨基源自C末端(从半胱氨酸残基的角度)相邻的D的N-末端氨基酸。
对于本发明的所有方面，分支部分B可以是任意双官能氨基酸，具体是任意双氨基酸，具体是双氨基取代的由通式CnH2n-1(NH2)2CO-描述的烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5。
在一些实施方式中，用作药物的肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)表示由通式：CnH2n-1(NH)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸。
在一些实施方式中，用作药物的肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1，其中o、p、q、r和s中的至少一个是1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)表示由通式：CnH2n-1(NH)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸。
在一些实施方式中，用作药物的肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)表示由通式：CnH2n-1(NH)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中至少一个D1、D2、D3、D4、D5和D6是三肽，其选自上文提及
的三肽，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸。
下面针对B的实施方式适用于本发明的所有方面。在一些实施方式中，B是氨基官能化的α-氨基酸，如赖氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丁酸和2,3-二氨基丙酸。在一些实施方式中，B是选自天然存在的氨基酸中的氨基酸。天然存在的氨基酸容易代谢为无毒代谢物，因此促进将树状聚体用于人类的管理审批。
在本发明的任意方面的某些实施方式中，肽树状聚体通过根据梅里菲尔德(Merrifield)的固相肽合成进行合成，通过将活性羧酸基团与在固相支撑物上生长的树状聚体的氨基偶联的肽来延伸树状聚体。在某些本发明的任意方面的这样的实施方式中，第一位Z通过Z上的氨基官能团与B1上的羧酸碳之间的酰胺键连接至B，并且D1、D2、D3、D4、D5、D6中的每一个通过B1、B2、B3、B4、B5、B6上的氨基氮与D1、D2、D3、D4、D5、D6的羧基末端氨基酸上的羧酸碳之间的酰胺键分别连接至其各自的结合配偶体(binding partner)B1、B2、B3、B4、B5、B6。
对于其中没有硫醚连接存在的实施方式，可以以简化的形式表达式子：
X-(B2-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-D2)4、
-(D4)16-(B4-D3)8-(B3-D2)4、
-(D5)32-(B5-D4)16-D3)8-(B3-D2)4或
-(D6)64-D5)32-(B5-D4)16-(B4-D3)8-(B3-D2)4。
在一些实施方式中，独立于任意其他D的每个D1、D2、D3、D4、D5和D6是二肽(CH、HC、CC或HH)或三肽(HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC)。
Z是中心部分，并且在用于制备本发明的树状聚体的固相化学方法中，Z是合成的起始点。许多不同的短肽已被实验性地采用，总体十分成功。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、DabA-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu、Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys(CONH2)。在一些实施方式中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Leu或Dab-Trp。在一些实施方式中，Z是Lys或Leu。在一些实施方式中，Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至烷基羧酸。在一些实施方式中，烷基羧酸连接至Z中包含的赖氨酸部分的ω-氨基侧链。在其他实施方式中，烷基羧酸连接至N-末端D。
在一些实施方式中，H选自亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一些实施方式中，C选自赖氨酸、精氨酸或(L)-2-3-二氨基丁酸。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义，并且Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸。
在一些实施方式中，n是4至22的数，具体为4至10，更具体为4至8。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys，Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至烷基羧酸。
在一些实施方式中，肽树状聚体的特征在于表1a中的式子：
表1a：
a.(KL)4-(K-KL)2-K-KL
b.(KL)4-(B-KL)2-B-KL
c.(RL)4-(B-RL)2-B-RL
d.(KKL)4-(K-KL)2K-KL
e.(DabW)4-(K-DabW)2-K-DabW
f.(DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
g.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
h.(RL)8-(K-RL)4(K-RL)2-K-RL
i.(LK)8-(K-LK)4-(K-LK)2-K-LK
j.(KY)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
k.(LA)8-(K-LK)4-(K-LA)2-K-KL
l.(KW)8-(K-KW)4-(K-KW)2-K-KW
m.(KF)8-(K-KF)4-(K-KF)2-K-KF
n.(KL)8-(B-KL)4-(B-KL)2-B-KL
o.(RL)8-(B-RL)4-(B-RL)2-B-RL
p.(LL)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-KK
q.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
r.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabL)2-K-DabW
s.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabW)2-K-DabW
t.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabL
u.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabA
v.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabA)2-K-DabW
w.(DabL)8-(K-DabA)4-(K-DabW)2-K-DabW
x.(KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
y.(KL)16-(K-KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
z.(KL)16-(K-KLCKL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
aa.(RL)8-(K-RLCRL)4-(K-RL)2-K-RL
bb.(KKL)4-(K-KKL)2-K-KKL
cc.(KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
dd.(LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ee.(KLL)8-(K-KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
ff.(LKL)8-(K-LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
gg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KKL
hh.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLL
ii.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLK
jj.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-LKL
kk.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
ll.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
mm.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
nn.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
oo.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
pp.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
qq.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
rr.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
ss.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
tt.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
uu.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
vv.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
ww.(CH3(CH2)4CO-KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
xx.(CH3(CH2)4CO-KL)4-(K-KL)2-K-KL
yy.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-LL
zz.(KK)8-(K-LL)4-(K-KK)2-K-LL
aaa.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
bbb.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
在一些实施方式中，化合物g和h被排除在清单外。
在一些实施方式中，表1a的清单进一步包括化合物
ccc.(KK)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
ddd.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-GSC
eee.(KK)8-(K-KK)4-(K-KK)2-K-GSC
fff.(KL)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
ggg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LL)2-K-GSC
hhh.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-GSC
iii.(KA)8-(K-KA)4-(K-KA)2-K-GSC
jjj.(KH)8-(K-KH)4-(K-KH)2-K-GSC
kkk.(RL)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
lll.(RL)8-(K-RL)4-(K-LL)2-K-GSC
mmm.(RL)8-(K-RL)4-(K-RL)2-K-GSC
在一些实施方式中，表1a的清单进一步包括化合物
nnn.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KL
ooo.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KL
ppp.(RF)4-(K-DabL)2-K-KL
qqq.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
rrr.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
sss.(RF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
在每个括号内，最左边的(N-末端)氨基酸是分支部分，最后一个除外。在给出的例子中，括号部分和Z部分之间的单个氨基酸是分支部分。
在某些实施方式中，根据本发明的该第一方面的用作药物的肽树状聚体，其特征在于烷基羧酸部分共价连接至Z和/或树状聚体的N-末端D，具体地通过通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸部分，更具体地其中n是4至22的数，甚至更具体地n是4、5、6、7、8、9、10、11、12、14或16。
在某些实施方式中，树状聚体以(同型)二聚体存在。例如通过Z中心部分的半胱氨酸残基连接两个树状聚体来实现二聚化。
在某些实施方式中，肽树状聚体用于细菌感染的预防和治疗。在某些实施方式中，所述细菌感染是由革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引起的，所述革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌包括但不限于铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌或大肠杆菌，或金黄色葡萄球菌，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA菌株)。
根据本发明的第二个方面，提供了通过如下通式描述的肽树状聚体：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)是分支部分；
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是(L)-2,3-二氨基丁酸。
在一些实施方式中，肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)表示由通式：CnH2n-1(NH)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5
-独立于任意其他D的每个D1、D2、D3、D4、D5和D6是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
其特征在于
-C是(L)-2,3-二氨基丁酸。
在一些实施方式中，肽树状聚体由如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B1、B2、B3、B4、B5和B6表示由通式：CnH2n-1(NH)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5
-独立于任意其他D的每个D1、D2、D3、D4、D5和D6是
iii.二肽CH、HC、CC或HH，或者
iv.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
其特征在于
-C是(L)-2,3-二氨基丁酸，并且D1、D2、D3、D4、D5和D6中的至少一个选自CH、HC、CC、HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC或CCC。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、DabA-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
Z是中心部分，并且在用于制备本发明的树状聚体的固相化学方法中，Z是合成的起始点。许多不同的短肽已被实验性地采用，总体十分成功。在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys(CONH2)。在一些实施方式中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Leu或Dab-Trp。在一些实施方式中，Z是Lys或Leu。
在一些实施方式中，H选自色氨酸、亮氨酸或丙氨酸。在一些实施方式中，C是(L)-2-3-二氨基丁酸。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义，并且Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸。
在一些实施方式中，n是4至22的数，具体是4至10，更具体是4至8。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys，Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至烷基羧酸。
根据本发明的第三个方面，肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s可以为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B(B1、B2、B3、B4、B5和B6)是分支部分；
-独立于任意其他D的每个D(D1、D2、D3、D4、D5和D6)是
i.氨基酸C或H
ii.二肽CH、HC、CC或HH，或者
iii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸，并且其中
其特征在于
-Z和/或N-末端D偶联至通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸部分，具体地其中n是6至22的数，更具体地n是6、7、8、9、10、11、12、14或16。
在一些实施方式中，肽树状聚体通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4、
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4、
-(D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4或
-(D6)64-(B6-[Y6]o-D5)32-(B5-[Y5]p-D4)16-(B4-[Y4]q-D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y(Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)是连接部分二肽H-Cys或CH-Cys或三肽H-Cys或CH-Cys，该连接部分通过如下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
-o、p、q、r和s为0或1；
-Z是中心部分；
-独立于任意其他B的每个B1、B2、B3、B4、B5和B6表示由通式：CnH2n-1(NH2)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，更具体地n为2、3、4或5；
-独立于任意其他D的每个D1、D2、D3、D4、D5和D6是
i.氨基酸C或H
ii.二肽CH、HC、CC或HH，
iii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，
其中
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，以及
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸
其特征在于
-Z和/或N末端D偶联至烷基羧酸。
在一些实施方式中，Z和/或N-末端D偶联至通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸部分，具体地其中n是6至22的数，更具体地n是6、7、8、9、10、11、12、14或16。
在一些实施方式中，n是4至22的数，具体是4至10，更具体是4至8。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、DabA-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu、Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys。
在一些实施方式中，Z是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，H和C具有上述定义的含义，并且Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸。
在一些实施方式中，n是4至22的数，具体为4至10，更具体为4至8。
在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys，Z通过Z上的氨基官能团与烷基羧酸上的羧基之间的酰胺键偶联至烷基羧酸。
Z是中心部分，并且在用于制备本发明的树状聚体的固相化学方法中，Z是合成的起始点。在一些实施方式中，Z是Lys-Leu-Lys(CONH2)。
在一些实施方式中，H选自亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。在一些实施方式中，C选自赖氨酸、精氨酸或(L)-2-3-二氨基丁酸。
在一些实施方式中，肽树状聚体的特征在于表1所示的式(不包括g和h)。
在本文中公开的本发明的任何方面的某些实施方式中，树状聚体完全或部分地由上文指定的氨基酸的D对映异构体组成。
无论在任何情况下对任何单个可分离的特征的替代方式，例如本文中作为“实施方式”陈述的D1、D2、D3、D4、D5或D6，B1、B2、B3、B4、B5或B6，或者Z或H，或者C中的任一个，要理解的是这样的替代方式可以自由组合以形成离散的本文公开的本发明的实施方式。
在一些实施方式中，肽树状聚体的特征在于表1b中的式子：
表1b：
a.(KL)4-(K-KL)2-K-KL
b.(KL)4-(B-KL)2-B-KL
c.(RL)4-(B-RL)2-B-RL
d.(KKL)4-(K-KL)2K-KL
e.(DabW)4-(K-DabW)2-K-DabW
f.(DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
g.(LK)8-(K-LK)4-(K-LK)2-K-LK
h.(KY)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
i.(LA)8-(K-LK)4-(K-LA)2-K-KL
j.(KW)8-(K-KW)4-(K-KW)2-K-KW
k.(KF)8-(K-KF)4-(K-KF)2-K-KF
l.(KL)8-(B-KL)4-(B-KL)2-B-KL
m.(RL)8-(B-RL)4-(B-RL)2-B-RL
n.(LL)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-KK
o.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
p.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabL)2-K-DabW
q.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabW)2-K-DabW
r.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabL
s.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabA
t.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabA)2-K-DabW
u.(DabL)8-(K-DabA)4-(K-DabW)2-K-DabW
v.(KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
w.(KL)16-(K-KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
x.(KL)16-(K-KLCKL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
y.(RL)8-(K-RLCRL)4-(K-RL)2-K-RL
z.(KKL)4-(K-KKL)2-K-KKL
aa.(KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
bb.(LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
cc.(KLL)8-(K-KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
dd.(LKL)8-(K-LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ee.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KKL
ff.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLL
gg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLK
hh.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ii.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
jj.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
kk.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
ll.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
mm.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
nn.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
oo.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
pp.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
qq.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
rr.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
ss.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
tt.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
uu.(CH3(CH2)4CO-KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
vv.(CH3(CH2)4CO-KL)4-(K-KL)2-K-KL
ww.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-LL
xx.(KK)8-(K-LL)4-(K-KK)2-K-LL
yy.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
zz.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
在一些实施方式中，肽树状聚体的特征在于下式
a.(KL)4-(K-KL)2-K-KL
b.(KL)4-(B-KL)2-B-KL
c.(RL)4-(B-RL)2-B-RL
d.(KKL)4-(K-KL)2K-KL
e.(DabW)4-(K-DabW)2-K-DabW
f.(DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
g.(LK)8-(K-LK)4-(K-LK)2-K-LK
h.(KY)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
i.(LA)8-(K-LK)4-(K-LA)2-K-KL
j.(KW)8-(K-KW)4-(K-KW)2-K-KW
k.(KF)8-(K-KF)4-(K-KF)2-K-KF
l.(KL)8-(B-KL)4-(B-KL)2-B-KL
m.(RL)8-(B-RL)4-(B-RL)2-B-RL
n.(LL)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-KK
o.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
p.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabL)2-K-DabW
q.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabW)2-K-DabW
r.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabL
s.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabA
t.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabA)2-K-DabW
u.(DabL)8-(K-DabA)4-(K-DabW)2-K-DabW
v.(KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
w.(KL)16-(K-KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
x.(KL)16-(K-KLCKL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
y.(RL)8-(K-RLCRL)4-(K-RL)2-K-RL
z.(KKL)4-(K-KKL)2-K-KKL
aa.(KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
bb.(LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
cc.(KLL)8-(K-KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
dd.(LKL)8-(K-LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ee.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KKL
ff.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLL
gg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLK
hh.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ii.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
jj.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
kk.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
ll.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
mm.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
nn.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
oo.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
pp.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
qq.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
rr.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
ss.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
tt.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
uu.(CH3(CH2)4CO-KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
vv.(CH3(CH2)4CO-KL)4-(K-KL)2-K-KL
ww.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-LL
xx.(KK)8-(K-LL)4-(K-KK)2-K-LL
yy.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
zz.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
aaa.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KL
bbb.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KL
ccc.(RF)4-(K-DabL)2-K-KL
ddd.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
eee.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
fff.(RF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
通过下面的实施例和附图进一步阐述本发明，从中可以获得进一步的实施方式和优势。这些实施例旨在阐述本发明但不限制其范围。
附图说明
图1表示在分支点之间具有2个氨基酸的第三代(G3)肽树状聚体的拓扑学。
图2表示树状肽的固相肽合成(SPPS)。a.偶联：3eq/G Fmoc-氨基酸、3eq/G PyBOP或HOBt和5eq/G DIPEA或DIC，在NMP或DMF中。b.乙酰化：Ac2O/DCM(1:1，v/v)，1×15min。c.Fmoc-去保护：哌啶/DMF(1:4，v/v)，20min。d.裂解：TFA(94％)、TIS(5％)、H2O(1％)(Cys和Met自由肽)或TFA(94％)、TIS(1％)、H2O(2.5％)、EDT(2.5％)(包括Cys和/或Met的肽)。
图3表示通过低代肽树状聚体的硫代反应组装肽树状聚体
图4表示A为第三代AMPD MSt-112，以及B为具有连接至核心Lys的C12疏水尾的第二代AMPD MSt 263。带电氨基酸为黑色，疏水氨基酸为浅灰色，以及分支点为深灰色。
图5表示AMPD抗铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌的临床分离株的以μg/mL计的MIC值(以两次独立重复试验测得，MSt-261和MSt-265仅测试一次)。最大测量浓度为64μg/mL。
图6表示5(6)-羧基荧光素从磷脂酰甘油脂囊泡的漏出量。在50s处将肽树状聚体添加至缓冲液(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)中的脂囊泡溶液，并在300s处添加1.2％Triton X 100。使用I(t)＝(It-I0)/(I∞-I0)将荧光强度归一化为小数的发光强度I(t)，其中在添加肽树状聚体处I0＝It，在裂解饱和处I∞＝It。在不同肽浓度下的A活性AMPD MSt-112，B无活性的肽树状聚体MSt-113。
图7表示5(6)-羧基荧光素从磷脂酰胆碱脂囊泡的漏出量。在50s处将肽树状聚体添加至缓冲液(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)中的脂囊泡溶液，并在300s处添加1.2％Triton X 100。使用I(t)＝(It-I0)/(I∞-I0)将荧光强度归一化为小数的发光强度I(t)，其中在添加肽树状聚体处I0＝It，在裂解饱和处I∞＝It。在不同肽浓度下的A活性AMPD MSt-112，B无活性的肽树状聚体MSt-113。
图8表示MSt-260在不同浓度下诱导的5(6)-羧基荧光素的漏出量。在50s处将肽树状聚体添加至缓冲液(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)中的脂囊泡溶液，并在300s处添加1.2％Triton X 100。使用I(t)＝(It-I0)/(I∞-I0)将荧光强度归一化为小数的发光强度I(t)，其中在添加肽树状聚体处I0＝It，在裂解饱和处I∞＝It。A为磷脂酰甘油LUV，B为磷脂酰胆碱LUV。
图9表示以两次独立重复试验测量活性肽树状聚体和无活性肽树状聚体的细胞活力。将铜绿假单胞菌与肽树状聚体(25μg/mL)温育，在37℃温育0、1、3、6、8、24个小时。在添加WST-8和温育之后，在450nm处测量吸光度。
图10表示硫醚连接的示例性树状聚体的结构。
实施例
首先，合成具有不同代、分支单元和电荷疏水比的各种化合物的文库以获得对构效关系(SAR)的了解。发现在具有带电氨基酸的每一代中，在从肽的C-末端开始的第二位具有带电并疏水的氨基酸对于高活性是有利的。
合成并测试具有疏水链的AMPD的文库。链长为C6至C24的羧酸连接至在分支单元之间具有KL基序的第二代和第三代AMPD的核心中引入的额外的Lys(图4)。具有疏水侧链的第二代和第三代AMPD(MSt-260-MSt-267)似乎是测试的抗铜绿假单胞菌(包括对常见抗生素具有抗性的临床分离株)最有效的结构。虽然将疏水侧链添加至第三代AMPD导致溶血活性增加，但是它们在溶血作用发生之前在低浓度下远远更有活性。
使肽树状聚体的活性与一级或二级结构相关的实验显示活性化合物和无活性化合物的二级结构是相似的并且确切是无规卷曲。然而当与疏水环境接触时，活性化合物趋于展开。5(6)-羧基荧光素从带负电荷的脂囊泡而非中性脂囊泡的漏出表明电荷在活性中的作用。具有疏水侧链和不具有疏水侧链的AMPD的动力学证实了当脂质连接至肽树状聚体时杀灭更快。
材料和试剂
所有试剂、盐、缓冲液购买自Aldrich、Fluka、Acros Organics、TCI Europe或Dr.Grogg Chemie AG。PyBOP、氨基酸和它们的衍生物购买自Advanced ChemTech(美国)、Novabiochem(瑞士)、IRIS Biotech(德国)、PolyPeptide(法国)、吉尔生化(上海)。使用氨基酸作为以下衍生物：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-D-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Dap(Fmoc)-OH、Fmoc-D-Dap(Fmoc)-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、4-(Fmoc)-氨基甲基苯甲酸(AMBA)、Fmoc-γ-Abu-OH(GABA)。Tental Gel S NH2(装载：0.32mmol/g)和Tenta Gel SRAM(装载：0.22-0.26mmol/g)树脂购买自Rapp Polymere(德国)。5(6)-羧基荧光素(CF)购买自Sigma。蛋磷脂酰胆碱(EPC)，蛋磷脂酰甘油(EPG)和用于制备囊泡的微型挤出机来自Avanti Polar Lipids。肽树状聚体的合成在配备有聚乙烯熔块、特氟龙活塞和塞子的聚丙烯注射器中进行。分析RP-UHPLC在使用Dionex 
RSLC 120C18柱(2.2μm，
3.0×50mm，流速1.2ml·min-1)的Dionex ULTIMATE 3000快速分离LC系统(ULTIMATE-3000RS二极管阵列检测器)中进行。通过在214nm处的UV吸光度检测化合物。数据记录和处理通过Dionex Chromeleon管理系统6.80版本(分析型RP-HPLC)完成。制备型RP-HPLC通过使用Dr.Maisch Gmbh Reprospher柱(C18-DE，100×30mm，5μm，孔径
流速40mL·min-1)的Waters Prep LC2489色谱系统进行。通过在214nm处的UV吸光度检测化合物。RP-HPLC用HPLC级乙腈和mQ-去离子水进行。洗脱液为：A含0.1％TFA的H2O；B H2O/MeCN(50:50)；C含0.1％TFA的H2O/MeCN(10:90)；D含0.1％TFA的H2O/MeCN(40:60)。MS谱、氨基酸分析和DOSY-NMR测量分别由伯尔尼大学化学与生物化学系的质谱、蛋白质分析和NMR服务提供。如不另有说明，产量通过定量氨基酸分析(AAA)确定。荧光测量在装备了搅拌器和温度控制器的荧光分光光度计(Cary Eclipse，Varian)中进行(在25℃下测量，除非另有说明)。
树状聚体合成
没有修饰的肽树状聚体
将树脂(Tenta Gel S RAM)在8mL CH2Cl2中膨胀，并且用20％哌啶在DMF中的溶液将树脂的Fmoc-保护基团移除(2×10min)。对进一步的偶联，将树脂与受保护的氨基酸中的一种(3eq/G，G＝代)在PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)(3eq/G)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(5eq/G)的存在下在约8mL NMP中酰化。氨基酸、衍生物或二氨基酸偶联1h(G0)、2h(G1)、3h(G2)、4h(G3)。使用2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS)或氯醌测试检查反应的完成。如果珠子是红色(脯氨酸为棕色)，则存在一些游离氨基，以及树脂测试是阳性的。如果珠子是无色的，则不再存在游离氨基，以及树脂测试是阴性的。在阳性测试之后重复偶联。未反应的肽链的加帽用乙酸酐和CH2Cl2(1:1v/v)的溶液进行15min。每次偶联后，将每个注射器中的树脂去保护(20％哌啶的DMF溶液，2×10min)，然后进行TNBS或氯醌测试(测试必须是阳性)，然后加入下一个受保护的氨基酸。在合成结束时，末端氨基酸用Ac2O/CH2Cl2(1:1)乙酰化20min或不乙酰化。用MeOH洗涤两次树脂并在真空下干燥，然后使用TFA/TIS/H2O(94:5:1)在4.5h期间进行裂解。对于含半胱氨酸和甲硫氨酸的肽，裂解条件为TFA/TIS/H2O/EDT(94/1/2.5/2.5v/v/v/v)。在过滤后，用50mL冰冷的叔丁基甲基醚(TBME)使肽沉淀，以4400rpm离心15min，并用TBME洗涤两次。对于粗肽的纯化，将其溶解于A(100％mQ-H2O，0.1％TFA)中，经过制备型RP-HPLC并在冷冻干燥后以TFA盐的形式获得。除非没有提及，用于分析型HPLC的梯度是A/D＝100/0至0/100，2.2min，1.2mL·min-1。
具有连接至Lys侧链的羧酸的肽树状聚体
根据“没有修饰的肽树状聚体”进行合成。Fmoc-Lys(Alloc)-OH首先连接至树脂。在最后的Fmoc-基团去保护之前，在干燥条件下用溶解于5mL干DCM和25当量的PhSiH3的0.25当量的Pd(PPh3)4作为催化剂移除Alloc保护基团。重复两次该步骤并在两次重复之间用2×干DCM洗涤树脂。在第二轮后，将树脂用DCM洗涤1h，通过用TNBS测试来测试游离氨基以检查去保护。如果测试是红色的，则羧酸(5当量)首先与HOBt(5当量)、DIC(5当量)和DIPEA(3当量)溶解于添加至树脂中的NMP/DCM(1/1v/v)中，并搅拌3-4小时。在用3×NMP、MeOH、DCM洗涤后，重复与羧酸的偶联，所述羧酸与HATU(5当量)和DIPEA(3当量)溶解于DMF/DCM(1/1v/v)过夜。在洗涤3×NMP、MeOH、DCM和通过TNBS测试检查游离胺基(无色)之后，完成最后的Fmoc-基团的去保护，然后如在“无修饰的肽树状聚体”中的描述裂解并纯化。
使用硫醚连接策略的肽树状聚体的合成
硫醚连接
根据上文给出的程序合成核心肽和臂肽。在来自固相的核心肽的裂解和纯化前，N-末端用氯乙酸酐(每个游离N-末端10.0当量)在5mL DCM中的溶液氯乙酰化两次15min。用NMP、MeOH和DCM洗涤树脂(各三次)。
在典型的实验中，在5ml指定的玻璃烧瓶中制备核心肽(含有氯乙酰基的序列，1.0当量)和KI(20.0当量)在DMF/H2O(1/1，v/v)(300μL)中的溶液。用氩在10min过程中将混合物脱气。在第二个5ml指定的玻璃烧瓶中制备(没有溶剂)臂肽(含有Cys的序列，核心序列中每个氯乙酰基1.5当量)，并且用氩/真空将烧瓶脱气3次。使用气密注射器将核心肽溶液转移至含有臂肽的玻璃烧瓶中。加入DIPEA(55.0当量)并在室温下搅拌。反应之后进行分析型RP-HPLC(用气密的10μL注射器采集的1.0μL反应混合物+100μL溶剂A)。完成后(通常是过夜)，通过添加5mL溶剂A猝灭反应，过滤并通过制备型RP-HPLC纯化。通过氨基酸分析校正产量。
使用上文描述的一般过程由起始材料CCS-2(ClAcKL)4(KKL)2KKLNH2和CCS-5(KL)2KKLCNH2获得CCS-20(KL)8(KKLCxKL)4(KKL)2KKLNH2，制备型RP-HPLC纯化之后为白色泡沫固体(11.2mg，1.82μmol，73％)。分析型RP-HPLC：tR＝1.51min(A/D＝100/0至0/100，2.2min.，λ＝214nm)。MS(ESI+):C290H556N80O53S4理论值/实测值6140.28/6140.3[M]+，6240.46/6239[M+2K+Na]+。“x”表示半胱氨酸侧链与通过酰胺键结合至C-末端相邻的氨基酸的N-末端的乙酸部分的硫醚连接。
氨基酸分析
在N2真空下用含有0.1％苯酚(v/v)的6M HCl在115℃下水解样品22h(Chang,J.-Y.and Knecht,R.,1992,Anal.Biochem.,197,52-58)。游离氨基酸与异硫氰酸苯酯(PITC)偶联，并且通过RP-HPLC，使用有自动注射系统的Dionex
HPLC系统，在Nova PackC18柱(4μm，3.9mm×150mm，水)上分析产生的苯氨基硫甲酰基(PTC)氨基酸(Bidlingmeyer,B.A.等人,1984,Journal of Chromatography B,336,93-104)。相应的乙酸铵缓冲液替换0.14M乙酸钠缓冲液，pH 6.3。如果Cys涉及到硫醚桥，那么其作为羧甲基Cys(CMCys)被检测到。另外的Cys在水解期间被破坏。由于水解，Trp不能通过该方法被检测到，并且Asn/Gln与Asp/Glu分别具有相同的保留时间。Phe和Dap也在相同的保留时间洗脱。在该分析中，检测到的丝氨酸的量通常显著低于理论上期望的量。根据由该方法获得的肽的含量校正所有产量、MIC(最小抑菌浓度)、MBC(最小杀菌浓度)和MHC(最小溶血浓度)。
生物学测定
用于抗微生物肽I的液体培养基微稀释法
测定了抗枯草芽孢杆菌(BR151菌株)、大肠杆菌(DH5α菌株)和铜绿假单胞菌(PA01菌株)的抗微生物活性。微稀释液体培养基法用于测定最小抑菌浓度(MIC)。细菌菌落在LB培养基中在37℃过夜生长。通过测量在600nm处的吸光度将浓度定量，并稀释至OD600＝0.1(1×108CFU/mL)。将样品制备为在水中1mg/mL的储备溶液，并在96孔微量滴定板(Cornstar，聚丙烯，未处理的)中用营养LB以2/3连续稀释。将样品溶液(50μL)与稀释的OD600nm为0.001的细菌悬液(50μL)混合。这样获得了最终希望的接种浓度5×105CFU/mL。将板在37℃下温育直至生长符合要求(18-24h)。对每个测试，板的两列保持为无菌对照(SC，仅液体培养基)和生长对照(GC，细菌接种的液体培养基，无抗生素)。将10μL MTT溶液(0.1％的水溶液)添加至每个孔。最小抑菌浓度定义(MIC)为抑制测试细菌在肉眼下可见生长的抗微生物物质(肽树状聚体)的最低浓度。对微生物学研究，使用线性肽LysTyrLysLysAlaLeuLysLysLeuAlaLysLeuLeu(SEQ ID No.1)作为参考。
用于抗微生物肽II的液体培养基微稀释法
测定抗铜绿假单胞菌PA01(WT)、铜绿假单胞菌PT1482(A-)、PT1485(A-B-)、PT1149(A-B-C-algC)、PT331(Z61)(LPS突变体)、铜绿假单胞PEJ2.6、PEJ9.1、ZEM1.A、ZEM9.A(来自日内瓦大学/大学医疗中心的临床分离株)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia/B.ceno)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus/S.Aureus，MRSA株)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii/A.baum)(来自日内瓦大学/大学医疗中心的临床分离株)的抗微生物活性。为测定最小抑菌浓度(MIC)，使用微稀释液体培养基法。细菌菌落在MH培养基中在37℃过夜生长。将样品制备为在水中8mg/mL的储备溶液，用300μL MH培养基稀释为32、64、128或256μg/mL的初始浓度，添加至96孔微量滴定板(TPP，未处理的)的第一孔并以1/2连续稀释。通过测量在600nm处的吸光度将细菌浓度定量，并用MH培养基稀释至OD600＝0.022。将样品溶液(150μL)与4μL稀释的最终接种量为约5×105CFU的细菌悬液混合。将板在37℃下温育直至生长符合要求(约18h)。对每个测试，板的两列保持为无菌对照(SC，仅液体培养基)和生长对照(GC，细菌接种物的液体培养基，无抗生素)。最小抑菌浓度(MIC)定义为抑制测试细菌在肉眼下可见生长的抗微生物物质(肽树状聚体)的最低浓度。对微生物学研究，使用多粘菌素作为参考。
溶血测定
为测定最小溶血浓度(MHC)，制备8mg/mL肽树状聚体在水中的储备溶液，将在96孔板(Cornstar或Nunc，聚苯乙烯，未处理的)中并且50μL用50μL PBS(pH 7.4)以1/2连续稀释。通过将来自友好捐助者的1.5mL全血以3000rpm离心15min获得人红细胞(hRBC)。弃去血浆并在15mL离心管(falcon tube)中将沉淀物重悬至5mL PBS。重复洗涤三次，并将剩余的沉淀物以hRBC终浓度为5％重悬于10mL PBS中。将hRBC悬液(50μL)添加至每个孔，并且将板在室温下温育4小时。通过在温育阶段后对孔的肉眼观察测定最小溶血浓度(MHC)终止点。每个板上的对照包括空白培养基对照(50μl PBS+50μl的hRBC悬液)和溶血活性对照(mQ去离子水50μL+50μL hRBC悬液)。
初步抗性发展测定
每天测定化合物对于枯草芽孢杆菌的MIC，测量15天，使用来自其中化合物浓度是二分之一的MIC值(1/2MIC孔)的孔的细胞进行测定。对每种化合物，将来自前面的MIC测定板的1/2MIC孔的细菌重悬于LB液体培养基中，在37℃下温育2至4小时，并测定OD600。然后，在LB液体培养基中将重悬液稀释至5×105个细胞/mL(OD600＝0.1，然后稀释1:100倍获得OD600＝0.001)，用于再次测定那些细胞之前已暴露的相同化合物的MIC。一式两份进行所有MIC的测定。
体内研究
动物：在毒性实验中使用4-6周龄雄性威斯塔(wistar)大鼠(重量范围200-500g)。大鼠获得自Zentrale
Bern(伯尔尼大学临床研究部)，并且每4只一笼。每个实验组包括2只大鼠。
of Kanton Bern,Schweiz审查并核准动物的所有步骤、护理和操作，并且与伯尔尼大学临床研究部Hugues Abriel教授的课题组合作执行。
处理：用4％异氟烷和1L/min氧在引导室将大鼠麻醉。当大鼠入睡时，将它们转移至临床覆盖巾上，并通过面罩用1至2％异氟烷和0.8L/min氧将其麻醉。用温水使尾巴温暖并用70％乙醇消毒。对尾静脉的静脉注射(i.v.)包括单次剂量的2mg/kg大鼠的AMPD于500μL PBS中。在注射之前，将每只大鼠单独称重并确定准确的剂量。监测所有大鼠的存活和行为两天，包括未注射和注射500μL PBS的对照组。
WST-8细胞活性测定
测定抗铜绿假单胞菌(PA01菌株)的细胞活性。细菌菌落在LB培养基中在37℃下过夜生长。通过测量在600nm处的吸光度将浓度定量，并稀释至OD600＝0.1(1×108CFU/mL)。将样品制备为在水中1mg/mL的储备溶液，并在96孔微量滴定板(TPP，未处理的)中用LB稀释至50μg/mL的浓度。将样品溶液(50μL)与稀释的OD600nm为0.001的细菌悬液(50μL)混合。这样获得了最终希望的接种浓度5×105CFU/mL。将板在37℃下温育1、3、6、8和24小时。在单独的板上测定每个时间点。对每个测试，板的两列保持为无菌对照(SC，仅液体培养基)和生长对照(GC，具有细菌接种物的液体培养基，无抗生素)。在温育后，将15μL WST-8工作溶液(3.31mg/mL WST-8(Ochem公司)，0.074mg/mL PES(吩嗪乙基硫酸盐))添加至每孔，并且在37℃下温育细胞直至GC具有期望值。在反应发生后，在450nm处读取最终吸光度。对于计算，GC的值设定为100％细胞活性，并且阴性对照(无细菌，SC)的值设置为0％细胞活性。使用这两个值生成校准曲线。
含血清的肽和肽树状聚体的蛋白水解稳定性
肽和肽树状聚体制备为200μM在PBS中的储备溶液。以14000rpm离心25％人血清(用DMEM稀释)15min以移除脂质，并且将上清液收集并在37℃下温育15min。在将50μL测试的肽或肽树状聚体添加至50μL血清时开始蛋白水解，并且在37℃摇动。最终肽浓度为100μM。反应混合物在添加冰冷的10％三氯乙酸(TCA)以沉淀血清蛋白后0、1、6、24h分析。以14000rpm离心15min后收集每个样品的上清液并用真空浓缩机蒸发。在将固体溶解于100μLmQ-H2O后，通过RP-UPLC(流速：1.2mL/min.梯度：A/D＝100/0至0/100，于7.5min内)分析。通过使用Chromeleon软件整合在214nm处的吸光度以计算剩余的肽和肽树状聚体的转换率。
在细菌的存在下检测肽
肽和肽树状聚体制备为200μM在水中的储备溶液。细菌菌落在LB培养基中在37℃下过夜生长。通过测量在600nm处的吸光度将浓度定量，并稀释至OD600＝0.2。在将50μL测试的肽或肽树状聚体添加至50μL细菌悬液时开始降解并在37℃下摇动。最终肽浓度为100μM，以及最终细菌浓度为OD600＝0.1(1×108CFU/mL)。通过在5min内加热至95℃，然后以14000rpm离心15min后的0、1、6、9、24h分析反应混合物。收集50μL每个样品的上清液，并且添加A以获得50μM的浓度。在通过RP-UPLC(流速：1.2mL/min，梯度：A/D＝100/0至0/100，7.5min内)分析样品前，添加5μL的4-羟基苯甲酸(标准品)。通过使用Chromeleon软件整合在214nm处的吸光度以计算剩余的肽和肽树状聚体的转换率。
脂囊泡实验
制备：通过在旋转蒸发器(室温)上蒸发25mg蛋PC或蛋PG在1mL 1/1的MeOH/CHCl3中的溶液制备薄脂质膜，然后在真空中过夜。获得的膜用1mL缓冲液(50mM CF，10mM TIRS，10mM NaCl，pH 7.4)水合30min，通过聚碳酸酯膜(孔径100nm)经历冻融循环(7×)和挤出(15×)。通过凝胶过滤(Sephadex G-50)(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)移除囊泡外组分。最终条件：约2.5mM蛋PC或蛋PG；内部：50mM CF，10mM TIRS，10mM NaCl，pH 7.4；外部：10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4。
实验：用缓冲液(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)稀释蛋PC或蛋PG储备溶液(37.5μL)，并置于恒温荧光比色皿(25℃)中，并轻轻搅拌(比色皿的总体积为约3000μL；最终脂质浓度为约31.25μM)。在t＝50s时添加终浓度为1、5、7.5、10、15、20、25、30μg/mL的20μL在缓冲液(10mM TRIS，107mM NaCl，pH 7.4)中的肽树状聚体，以及在t＝300s时添加1.2％trition X-100(30μL，0.012％终浓度)之后，在λem＝517nm(λex＝492nm)处检测随时间变化的CF流出量。使用I(t)＝(It-I0)/(I∞-I0)将荧光强度归一化为小数的发光强度I(t)，其中添加肽树状聚体时I0＝It，裂解饱和时I∞＝It。
结果与讨论
在分支单元之间具有一个、两个或三个氨基酸的抗微生物肽树状聚体(AMPD)的设计和合成
为确定具有抗微生物作用的树状聚体，将线性抗微生物肽的共同特征引入树状支架中(图1)。选择阳离子氨基酸如Lys和Arg以在肽树状聚体上产生电荷，挑选Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp和Ala作为用于建立两亲性的疏水性对应部分(hydrophobic counterpart)。
使用标准Fmoc-SPPS(Merrifield,R.等人,1963,Am.Chem.Soc.,85,2149-2154；Kent,S.B.等人,2009,Chem.Soc.Rev.,38,338-51)在Rink-Amide树脂上合成78种肽树状聚体(53种正常的，18种具有醇链，7种为G4和G5，此外2种为线性肽，6种二聚体)的文库(图2)。对于在核心具有疏水尾的AMPD，放置另外的具有Alloc作为在侧链中的垂直保护基团的Lys作为合成中的第一个氨基酸。在用0.25当量的Pd(PPh3)4和25当量的PhSiH3进行Alloc-去保护(Grieco,P.等人,2001,J.Peptide Res.,57,250-256)后，将6至24个碳原子的不同的碳侧链在经典的在DMF中的HATU/DIPEA或在NMP中的HOBt/DIC/DIPEA的偶联条件下作为羧酸连接。肽树状聚体的伴随的酸性裂解和侧链去保护在最后的Fmoc-去保护，然后RP-HPLC纯化后发生。表2至表7展示了对于分支单元之间不同代和数目的氨基酸的所有合成的具有非常良好(44-10％)至良好(10-1％)的收率的AMPD。收率相当于来自HPLC和合成的纯部分的收率并且纯化不是最优化的。第三代肽树状聚体的结构式和具有连接的烷基链的第二代的结构式显示于图4中。
对下面给出的所有表格，给出从N末端至C末端的肽树状聚体序列。用单字母码表示氨基酸，大写字母表示L-对映异构体，小写字母表示D-对映异构体。Dab是L-2,3-二氨基丁酸，B是L-2,3-二氨基丙酸。分支二氨基酸以斜体给出。如果没有另外说明，所有肽是在C-末端的羧酰胺(CONH2)。其中给出产量/收率，这涉及作为TFA盐的RP-HPLC纯化产物。
MIC(最小抑菌浓度)值和MHC(最小溶血浓度，以人红细胞(hRBC)测定)值以μg/mL给出。当没有观察到可检测到的溶血活性时，最后的测量浓度用于治疗指数的计算。TI(治疗指数)＝MHC(μg/ml)/MIC的几何平均数(μg/ml)。值越大表明抗微生物特异性越大。
表2：第三代AMPD的氨基酸序列、产量和MS分析
第一个AMPD系列由第三代肽树状聚体组成。最初，通常将以天然抗微生物肽存在的氨基酸引入树状结构中。在第一轮中，Lys或Arg用在Lys分支之间的疏水性氨基酸Leu、Ala、Trp、Phe、Tyr替换。为产生更大的刚性，使用更小的分支单元B(L-2,3-二氨基丙酸)。在第二种设计中，电荷和疏水性集中在核心或在外层中。肽树状聚体是不具有定义明确的二级结构的非常有柔韧性的分子。对于关于生理条件的机械性研究和更大的稳定性，将四种有希望的序列合成为所有D-对映异构体。不仅为了改变不同氨基酸的正电荷，而且为了了解侧链的长度是否影响活性，用仅具有两个亚甲基的Dab(L-2,3-二氨基丁酸)替换在侧链中具有四个亚甲基的Lys。
表3展示第二代AMPD的氨基酸序列、产量和MS分析
为了覆盖更大范围的结构，制备了第二代肽树状聚体。它们的合成更容易并且更快速，并且这导致了更高的产量。第二代AMPD MSt-146、MSt-138、MSt-139、MSt-119、MSt-176和MSt-201持有与它们的第三代类似物相同的特征，但仅具有一半的分子量。还制备可第四代和第五代肽树状聚体和第二代肽树状聚体以探索其他结构的可能性(表4和5)。
由于肽树状聚体的SPPS被限制为达到第三代的珠，通过使用已发表的方法(Uhlich,N.A.等人Org.Biomol.Chem.2011,9,7084)的收敛方法合成第四代和第五代AMPD。因此，用在N-末端的氯乙酰基制备第二代和第三代肽树状聚体。在硫醚连接中，那些肽树状聚体和在C-末端具有另外的半胱氨酸的第一代或第二代肽树状聚体偶联以形成具有良好产量的第四代和第五代AMPD(表4)。
表4：通过硫醚连接策略制备的第四代和第五代AMPD
nd＝未检测到；x表示具有乙酸部分的半胱氨酸侧链的硫醚连接，该乙酸部分通过酰胺键连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端。
表5：通过通过半胱氨酸(C)的同源二聚化制备的在分支单元之间具有两个氨基酸的肽树状聚体二聚体
表6：在分支之间具有1个氨基酸的第三代AMPD
表7：在分支之间具有2个和3个氨基酸的第二代和第三代AMPD
表8：线性AMP的氨基酸序列、产量和MS分析
此外，通过二硫键的形成使引入半胱氨酸残基的第一代或第二代肽树状聚体二聚化，以使同源二聚体获得良好的产量(表5)。
在最后的方法中，生成1111(MSt-147、MSt-148、MSt-149)、3333(MIS-02、MIS-03、MIS-04、MIS-06、MIS-08)、2233(YGO-008、YGO-009、YGO-010、YGO-11)AMPD以更好地理解在分支之间的氨基酸数目的影响，并产生更有刚性或更有柔韧性的AMPD。1111系列具有相同的拓扑学，然而与前面描述的抗革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌而不抗革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌活性的1111AMPD具有不同的氨基酸组成。制备两种线性序列作为参照，具有交替的电荷/疏水性基序的MSt-117，以及如与MSt-112中相同的氨基酸分布和文献中描述的抗铜绿假单胞菌活性的RHe-9。
表9：具有疏水侧链的第三代AMPD的氨基酸序列、产量和MS分析
Cn表示酰胺化至核心中的Lys的侧链氨基或偶联至Lys的最后主链胺的Cn-脂肪酸
通过将疏水性烷基链(天然抗微生物肽中的重复单元)连接至第二代和第三代肽树状聚体进一步修饰AMPD的结构。固相肽合成可以容易地延伸至在核心处将烷基链的一个拷贝或多个拷贝连接至N-末端。使用具有6、8、10、12、16、18和24个碳原子的烷基链的羧酸。总共制备了18种具有疏水性烷基链的AMPD。
AMPD的抗人病原体铜绿假单胞菌的活性和它们对人红细胞(hRBC)的毒性
在液体培养基稀释测定中测试所有肽的抗铜绿假单胞菌PAO1的活性(Wiegand,I.等人,2008,Nat.Protoc.,3,163-75；临床与实验室标准协会文件M7-A7第7版)以确定MIC(最小抑菌浓度)值。在96孔微量滴定板中用于营养LB以2/3连续稀释肽树状聚体的储备溶液。细菌在37℃下在营养LB中过夜生长。在稀释后，将细菌添加至肽中并在37℃下温育过夜(18至24小时)。所有合成的第3代AMPD的MIC值的范围为与多粘菌素(2μg/mL)和妥布霉素(0.5μg/mL)相似的范围的高活性(2μg/mL)至活性(14μg/mL)的范围(表10)。最有效的序列包括在每一代中交替的带电荷的氨基酸(Lys、Arg、Dab)和疏水的氨基酸(Leu、Trp、Phe)。如果疏水氨基酸是从C端开始数的第一个，并且带电荷氨基酸在第二位，则在分支单元之间的氨基酸的位置似乎是最优的。作为另外的疏水氨基酸引入的Ala降低了活性(MSt-120)。带电荷氨基酸的性质在活性上不具有大的影响，但是比较活性的改变与疏水氨基酸的改变，得到的趋势是Leu最好，然后是Trp和Phe，而带有Tyr则活性显著降低。将分支单元从Lys改变至更具有刚性的Dap(2,3-二氨基丁酸)没有显著降低活性。当在树状聚体上的电荷从疏水氨基酸分离使得外层或核心部分均带电荷时，活性显著减少。并且，在分支单元之间组装带电荷的或疏水的部分导致活性的丢失，而改变L-氨基酸为D-氨基酸维持活性，得到这样的假设，即作用机理不应是受体介导的。用天然氨基酸、非天然氨基酸和D-氨基酸制备非常有效的AMPD，并且他们所有都证实了非常良好的活性。
表10：第三代AMPD的MIC、MHC和TI值
为了测试第三代AMPD是否可用作新抗生素，测试了它们对人红细胞(hRBC)的溶血活性(表10)。最小溶血浓度(MHC)值范围为1μg/mL至非常高的900μg/mL。对MHC值的最大影响似乎是带电荷氨基酸的性质。明显地，具有Lys或Dap的肽与具有Arg的肽相比具有更低的溶血性。疏水氨基酸Leu、Trp、Tyr或Ala与彼此相比对MHC不具有大的影响，并且MHC值仍然比它们的MIC值高很多。
TI(治疗指数＝MHC(μg/ml)/MIC(μg/ml))是比较不同AMPD彼此之间的有用的工具。TI越高，AMPD的活性越高且毒性越小。因此，他们对于进一步开发、机械学研究和作为潜在的抗菌剂是非常有利的。具有最高的TI的AMPD和由此最具有潜能的肽是MSt-112、MSt-114、MSt-136、MSt-200、MSt-203并且他们将被进一步评价和讨论。这里的焦点应该放在具有天然氨基酸的肽树状聚体，由于它们应该具有总体较低的毒性作用。
根据第三代AMPD发现的最佳基序合成第二代AMPD，并评价第二代AMPD的MIC和MHC。如前面所描述的，总的来说，带电荷氨基酸从Lys至Dab或Arg的改变没有发现对于活性的显著区别，但是从Lys至Arg至Dab的改变，MHC降低了。此外，通过分支单元从Lys至Dap的改变，没有看到相关的改变。Leu或Trp替换为Tyr或Ala导致活性的损失。有趣的是，可能由于在分子中带正电荷的残基数目更少，第二代AMPD的MHC值与它们的第三代类似物相比高很多，这提供了更高的TI值。因此，它们是用于进一步开发和研究的有前途的候选者，尤其因为它们的更容易从SPPS获得而导致更高的产量。
为了完全理解代次的效果，也测试了在K分支MSt-112和MSt-146之间具有KL基序的有效序列的第一代和第零代(二肽)AMPD类似物的MIC和MHC。这两种肽具有低溶血活性但是没有抗铜绿假单胞菌的活性(表11)。
表11：第二代AMPD的MIC、MHC和TI
通过硫醚连接合成的第四代和第五代AMPD具有比第二代和第三代类似物稍微低的抗铜绿假单胞菌活性(表12)。由于它们更大的大小，溶解hRBC的效力相当高，因此TI相对低。有趣的是，Arg变体具有更低活性和更高的溶血性，这显示了与第三代AMPD相同的效果。
表12：在通过硫醚连接制备的分支之间具有2个氨基酸的第四代和第五代AMPD的MIC、MHC和TI值
x表示具有乙酸部分的半胱氨酸侧链的硫醚连接，该乙酸部分通过酰胺键连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端。
也针对铜绿假单胞菌筛选了容易获得的第一代和第二代二聚体(表13)。在分支之间具有两个氨基酸，它们或者与第二代和第三代AMPD具有相同的活性(CCS-3)，或者具有稍低的活性(CCS-5、CCS-19、CCS-18)。
表13：在分支之间具有2个氨基酸的肽树状聚体二聚体的氨基酸序列、产量和MS分析(通过通过半胱氨酸C的同源二聚化制备)
前面描述的1111第三代AMPD具有抗枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的活性，但是不抗铜绿假单胞菌。在来自2222第三代AMPD的成功基序后，设计了新的1111第三代AMPD，并且用液体培养基稀释测定测试了新的1111第三代AMPD以及测定了它们的溶血活性。仅MSt-147(序列：(L)8(KK)4(KL)2(KK))在MIC为12μg/mL时显示了活性和非常低的溶血作用(1937μg/mL；TI>160)
减少分支单元之间的氨基酸的数目没有产生更有活性的AMPD，在对更有活性的AMPD的研究中测试了数目从2个氨基酸增加至3个氨基酸。针对抗铜绿假单胞菌，测试了4种3333第二代AMPD，2种3333第三代AMPD和4种在替换位置具有KL基序的2233第三代AMPD。所有序列均显示与2222第二代和第三代AMPD一样良好的活性，除了在分支之间具有非常高的Lys含量的MIS-03和在分支点之间分隔开的具有非常高的Lys含量的MIS-05。那些AMPD具有相当高的溶血值，导致相当的TI。MIS-06和MIS-08的3333第三代AMPD由于其高疏水性而具有高度溶血性。
表14：在分支之间具有2个和3个氨基酸的第三代AMPD的MIC、MHC和TI值
将疏水性碳侧链连接至在K分支之间具有KL基序的第二代AMPD(MSt-260:C6，MSt-261:C8，MSt-262:C10，MSt-263:C12，MSt-286:C18，MSt-287:C24)和第三代AMPD(MSt-263:C6，MSt-265:C8，MSt-266:C10，MSt-267:C12，MSt-301:C16，MSt-284C18，MSt-285:C24)结果是C6-C12侧链为高活性的序列，C16-C24侧链活性较低(表15)。第二代AMPD MSt-260-MSt-263提供了高MHC值，即使溶血性随碳侧链增长而增加。将不同的羧酸连接在MSt-264-MSt-267中提供了相当低的MHC值，伴随相同的效果即溶血性随碳侧链增长而增加。MSt-302、MSt-286、MSt-287、MSt-301、MSt-284、MSt-285显示了在低浓度下全部溶血，因此具有低TI。将C6或C12羧酸锚定于第二代和第三代AMPD(MSt-288、MSt-290)的N-末端，因此引入4个或8个拷贝的碳链，保持了具有C6碳链的AMPD的活性但是失去了C12类似物的活性。
在核心具有C6-C12碳侧链的第三代AMPD，特别是具有相似TI值的第二代类似物非常适合于进一步测试突变体、临床分离株和机械学研究。
表15：具有疏水侧链的第三代AMPD的MIC、MHC和TI值
抗枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的AMPD的活性
测试AMPD文库的抗枯草芽孢杆菌BR151(一种革兰氏阳性菌)和抗大肠杆菌DH5α(另一种革兰氏阴性菌)的抗微生物活性以覆盖更广谱的不同细菌。第三代AMPD抗枯草芽孢杆菌的MIC均是相当不错的，活性范围为1-10μg/mL，而MSt-179效率较低(表16)。因此没有建立显著的SAR，但是明显地疏水氨基酸Ala和Tyr似乎在减少活性上具有显著影响。如果第三代AMPD用于抗大肠杆菌，它们在效率上显示了与铜绿假单胞菌相同的趋势(表10)，但一些肽MSt-199、MSt-114、MSt-120的活性相当低。
表16：第三代AMPD的MIC、MHC和TI值
第二代AMPD既对枯草芽孢杆菌没有活性也对大肠杆菌没有活性，而它们对铜绿假单胞菌是非常有效的(表11)。一种序列，具有Dab和Trp作为氨基酸的MSt-176似乎是例外。具有色氨酸的第二代AMPD也具有抗枯草芽孢杆菌的活性，表明非常疏水的氨基酸对抗革兰氏阳性菌的活性的可能功能。此外，16μg/mL和20μg/mL的MSt-139和MSt-119似乎是稍微有效的。
表17：第二代AMPD的MIC、MHC和TI值
更大的第四代和第五代肽树状聚体的抗枯草芽孢杆菌和大肠杆菌活性比第二代肽树状聚体大许多，但是与第三代类似物在相同的范围内(表18)。由于低MHC值，它们的TI低于第三代AMPD。二聚体的MIC数据在表19中。
表18：通过硫醚连接制备的在分支之间具有2个氨基酸的第四代和第五代AMPD的MIC、MHC和TI值
x表示具有乙酸部分的半胱氨酸侧链的硫醚连接，该乙酸部分通过酰胺键连接至C-末端相邻的氨基酸的N-末端。
表19：在分支之间具有2个氨基酸的肽树状聚体二聚体(通过经由半胱氨酸C的同源二聚化制备)的氨基酸序列、产量和MS分析
前面报道的1111第三代AMPD在2-5μg/mL的浓度下有抗枯草芽孢杆菌活性。具有相同拓扑学但仅Lys和Leu在不同位置的MSt-148和MSt-149仍然有活性但有效性较低(表20)。虽然他们是容易并且快速合成的，并具有良好的收率，这使它们成为用于大规模生产的理想的肽，但目前为止它们没有显示与其他肽树状聚体相同的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的潜力。
表20：1111第三代AMPD(在分支之间具有1个氨基酸)的MIC和TI值
除了MIS-05以外，3333第二代和第三代AMPD MIS-02、MIS-03、MIS-04、MIS-06和MIS-08(表21)的抗枯草芽孢杆菌均是非常有效的，0.5至6μg/mL具有活性，甚至好于抗铜绿假单胞菌。除了MIS-04以外，它们均非常溶血，因此它们的TI是非常低的。总的来说，MIS-04将是用于进一步对革兰氏阳性菌进行开发和研究的良好的候选物。2233第三代AMPD(YGO-008、YGO-009、YGO-010、YGO-011)仅对大肠杆菌进行了测试，但在2-3μg/mL显示了优异的活性(表21)，其与铜绿假单胞菌在相同的范围内(表14)。
表21：在分支之间具有2个和3个氨基酸的第三代AMPD的MIC、MHC和TI值
选作比较原因的两种线性肽MSt-117和RHe-9，显示对于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的活性与铜绿假单胞菌具有相同的趋势(表12)。MSt-117的有效性比第三代AMPD低得多，并且是非常溶血的。RHe-9对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均是高度有效的，并且不溶血，导致了与第三代AMPD相当的TI。
表22：线性AMP的MIC、MHC和TI值
在表23中，列出了抗枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的在肽树状聚体C-末端具有疏水碳侧链的第二代和第三代AMPD。所有序列对两种细菌均是非常有效的，MIC1为6μg/mL。仅有少数例外如在N-末端具有C6碳链的MSt-260、具有C16碳链的MSt-302和MSt-301、具有C24碳链的MSt-285和MSt-287，均是高度疏水的且对铜绿假单胞菌不是很有效(表15)。然而，仍有非常有效的AMPD如MSt-261、MSt-262、MSt-263、MSt-264、MSt-265、MSt-266、MSt-267、MSt-284、MSt-286、MSt-288、MSt-290，它们越溶血则获得的疏水性越多，导致更低的TI(表23)，但在有效的情况下仍然高于100。因此MSt-261、MSt-262、MSt-263、MSt-264、MSt-265、MSt-266、MSt-267针对所有三种测试的细菌非常有效并具有极大潜力的AMPD。
表23：具有1个、4个或8个疏水侧链的第二代和第三代AMPD的MIC和TI值
表24：具有/不具有C10烷基羧酸链的G2AMPD在MH培养基中和在人血清的存在下抗PAO1的结果—不具有烷基羧酸链的G2在MH中是没有活性的，虽然在LB中显示了活性；
表25：在MH培养基中包含Dab的化合物和不具有DAB的化合物的抗PAO1的MIC值。结果是一式三份进行的完成的两个独立实验(MH培养基，12-18h)
表26：在MH培养基中包含Dab的化合物和不具有DAB的化合物的抗铜绿假单胞菌MDR临床分离株、金黄色葡萄球菌和鲍氏不动杆菌的MIC值。结果是一式三份完成的两个独立实验(MH培养基，12-18h)
表27：G3KL抗铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌的耐药株的MIC值
表28：G3KL抗数种耐药病原体的MIC值
AMPD抗临床铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌分离株的最小抑菌浓度和抗性分析
测试了10种最有希望的化合物(图5)的抗铜绿假单胞菌的4个临床分离株(ZEM9.A、ZEM1.A、PEJ2.6、PEJ9.1)、金黄色葡萄球菌的一个临床分离株(COL，MRSA参考株)和一个鲍氏不动杆菌株的有效性。对于在日内瓦的实验，将肽树状聚体和参考化合物(多粘菌素)溶解于PBS中，并用穆勒-欣顿(Müller-Hinton)(MH)液体培养基两倍稀释进行测定。
针对4个铜绿假单胞菌临床分离株所测试的所有AMPD显示活性低于20μg/mL，仅具有Arg而不是Lys的第三代树状聚体(MSt-242)抗铜绿假单胞菌ZEM9.A的活性稍微更高。那些临床分离株耐某些广泛使用的抗生素如亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、甲氧苄氨嘧啶和磺胺类，因此拥有作为替代品的巨大潜能。那些AMPD在6-19μg/mL显示抗鲍氏不动杆菌(另一种病原性革兰氏阴性菌)的活性。金黄色葡萄球菌(一种革兰氏阳性菌)一旦产生抗性会是成问题的，金黄色葡萄球菌也被包括在测定中，并且第二代AMPD MSt-176、MSt-263和第三代AMPD MSt-242具有低于20μg/mL的活性。
AMPD在人血清中的稳定性
前面将肽树状聚体描述为与其线性类似物相比蛋白水解非常稳定的化合物。因为它们的分支点裂解位点是不易接近于蛋白酶的。分支单元之间的氨基酸的数量对更好的稳定性也是重要的。
将肽与人血清(之前用DMEM稀释)混合至100μM的最终肽浓度以确定AMPD对蛋白酶的稳定性，并且在37℃下温育0、1、6或24个小时。在用TCA沉淀蛋白质之后，通过分析型RP-UPLC分析溶液。在24小时的时间内，AMPD MSt-112和MSt-181的信号保持恒定，因此，没有或仅有少量的蛋白水解发生。然而线性肽RHe-9(SEQ ID 1)的信号完全消失，说明这种肽在24小时内全部蛋白水解。有趣的是，所有L-对映异构体MSt-112具有与所有D-对映异构体MSt-181相同表现，表明所有L-对映异构体AMPD已经足够稳定，并且可以避免所有D-对映异构体的可能毒性。同样检查了AMPD MSt-114、MSt-136、MSt-138、MSt-139、MSt-140和MSt-176的稳定性。MSt-136、MSt-138和MSt-139在24小时内是稳定的，然而肽树状聚体MSt-114和MSt-139显示一些但不完全的降解。与具有非天然构建模块的肽相比，仅具有天然L-氨基酸的肽树状聚体在人血清中的稳定性在治疗剂的开发上表现出显著的优势。
证实AMPD的稳定性的另一个实验是将肽与铜绿假单胞菌PAO1的细菌悬液温育。细菌在LB中生长过夜并稀释至OD600＝0.2。在将肽添加至浓度为100μM后，将样品在37℃下温育0、1、6、9、24个小时。将悬液加热至95℃5分钟并离心之后，使溶液经过UPLC，通过使用Chromeleon软件分析剩余的肽。分析显示甚至在24小时后，细菌悬液没有降解AMPD MSt-112、MSt-114、MSt-136、MSt-138、MSt-139、MSt-140、MSt-176和MSt-181，而RHe-9(SEQ ID1)在9小时后不能检测到。
AMPD与作为真核生物和原核生物细胞膜的模型系统的单层大囊泡(LUV)的相互作用
细菌膜含有相对大量的暴露的阴离子脂质，而植物和动物的膜的外叶主要由不带净电荷的脂质组成。磷脂囊泡可以模仿这样的膜的电荷组成。制备由具有PC(磷脂酰胆碱)或带负电荷的PG(磷脂酰甘油)的中性磷脂组成的单层大囊泡(LUV)以封装5(6)-羧基荧光素(CF)。用AMPD MSt-112、MSt-114、MSt-176和MSt-181和在不同肽浓度下无活性的肽树状聚体MSt-138、MSt-139处理这些LUV。在50s时将活性第三代AMPD MSt-112添加至来自磷脂酰甘油的LUV溶液中，导致荧光增加。MSt-112的浓度越高，CF的漏出量越高(图6A)。使用对磷脂酰甘油LUV无活性的MSt-113显示甚至在100μg/mL没有立即增加，并且随着时间推进仅有一些可忽略的漏出量(图6B)。所有其他活性AMPD(MSt-114、MSt-176和MSt-181)和多粘菌素(已知的膜破坏剂)在添加肽时显示了相同的CF的立即漏出量。MSt-138和妥布霉素(干扰细菌中蛋白质的生物合成的抗生素)和MSt-113一样没有显示CF的释放，而MSt-139释放CF但在相同浓度下不如活性AMPD那么多。总体上，活性AMPD与带负电的膜相互作用并释放CF。因此，膜透化作用和破坏作用似乎很可能，而无活性肽没有或部分干扰LUV的脂质。
如果MSt-112经过来自磷脂酰胆碱的LUV溶液，那么甚至在与MIC值相比非常高的浓度下也没有释放CF(图7A)。所有其他活性AMPD和多粘菌素以同样的方式表现，而比其他(表11)溶血性多得多的MSt-176(非常疏水的第二代肽)引发了CF释放。MSt-113(图7B)、MSt-138和MSt-139以及妥布霉素显示了没有CF释放的相同表现。
如果将碳侧链引入第二代AMPD(MSt-260、MSt-261、MSt-262、MSt-263)或第三代AMPD(MSt-264、MSt-265、MSt-266、MSt-267)，在将肽树状聚体在50s时在不同的浓度下以与MSt-112相同的方式添加至磷脂酰甘油LUV溶液后，CF立即泄漏(图8A中针对MSt-260显示的)。仅有的区别在于在不同的浓度下，第二代AMPD和第三代AMPD的强度。随着代数添加，在相同浓度下的荧光增加就更高。因此，所有那些AMPD与带负电的模型膜相互作用，破坏膜的完整性，使CF泄漏。如果使用磷脂酰胆碱(没有净电荷的模型膜)，CF释放仅在高肽树状聚体浓度下可观察到(图8B的MSt-260)，随着疏水侧链中的碳原子数目的增加，CF泄漏的强度更高。这与hRBC的裂解一致，其中长碳链诱导在低浓度下的溶血。
杀灭动力学
为了确定AMPD的杀灭动力学，在与AMPD温育后，测量随时间变化的活细菌的数量。使用WST-8测定以检测活细胞(Roehm,N.W.等人,1991,J.Immunol.Methods,142,257-265；Chang,J.-Y.等人,1991Anal.Biochem,197,52-58)。所以，在测量与或细菌成比例的甲
在450nm处的吸光度之前，使铜绿假单胞菌与25μg/mL浓度的AMPD或无活性肽树状聚体温育0、1、3、6、8和24个小时。图9显示在24小时内细菌的存活率。在添加肽树状聚体后，所有AMPD(MSt-112、MSt-176、MSt-181)直接显示了相同的表现，其中至少60％的细菌仍然存活。大多数AMPD需要3小时以完全杀灭。与马上杀灭铜绿假单胞菌的参考物质多粘菌素和妥布霉素相比，AMPD似乎起作用更慢。正如预期，在24小时后，无活性的肽树状聚体MSt-138和MSt-139不能降低细菌的量。相当有效的AMPD MSt-114的性能区别于其他AMPD。仅在24小时后，几乎所有细菌被杀灭。
将在核心中具有C8(MSt-261和MSt-263)或C12(MSt-265和MSt-267)碳侧链的第二代和第三代AMPD与MSt-112比较揭示了不同的表现；在添加后60％的细菌立即被杀灭，并且在一小时后，数目已经降至0。因此，连接碳侧链似乎改变了杀灭动力学。该测定给出了AMPD杀灭动力学的第一指征但更多的实验是必要的以确定体外杀灭所需的时间。
抗性测定
为了初步估计对AMPD可以出现抗性有多快，MIC连续重复15天并每天测定。在通常的液体培养基稀释测定中获得MIC值之后，来自1/2MIC的孔中的细菌(枯草芽孢杆菌)温育2至5个小时，并重复稀释测定。在15天内实现这个过程，并且比较每天的MIC。在MIC增加的情况下，指示对AMPD的抗性。在这个试验中，非常有效的MSt-112、MSt-176、MSt-181在15天内的MIC值没有显著改变，而低效的MSt-114、MSt-139、MSt-140显示在5至10天后活性已经丢失。
AMPD毒性-用大鼠进行的初步体内实验
使用化合物MSt-112(具有KL基序的第三代AMPD)、MSt-181(它的D-对映异构体类似物)、MSt-242(具有RL基序的第三代AMPD)和在第三代中有Tyr而不是Lys的MSt-114，用雄性威斯塔大鼠进行体内实验以评价它们的毒性。由于这些化合物的至少高于它们的活性10倍的高效力和高MHC值，而选择了这些化合物。将每种化合物(浓度为2mg/kg)通过静脉注射施用于两只大鼠的尾静脉以观察AMPD是否是良好耐受的或可以引起不良作用。使用的浓度大约为MIC的5至10倍。没有观察到明显的作用，并且在注射AMPD MSt-112和MSt-242后大鼠行为正常。注射AMPD MSt-114和MSt-181导致四肢稍微有点蓝，大约5分钟后消退。大鼠的行为是正常的。监测大鼠2天显示它们的行为没有异常并且存活率为100％。注射了500μL PBS或没有注射的对照大鼠也在两天期间显示出正常的行为并具有100％的存活率。因此，似乎大鼠很好地耐受AMPD，而没有可见的副作用甚至伤亡。
结论
在筛选抗病原性革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌的78种化合物的肽树状聚体的文库之后，可以发现具有高活性和低红细胞溶血性的数种树状聚体。一些是第二代肽树状聚体(MSt-138、MSt-139、MSt-176)，其他是第三代肽树状聚体(MSt-112、MSt-181、MSt-242)。另外的抗革兰氏阴性菌大肠杆菌和抗革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的筛选揭示了MSt-176、MSt-112、MSt-181和MSt-242更广泛的功效。在进一步的显示对常见抗生素的抗性的铜绿假单胞菌的临床分离株的研究中，第二代AMPD MSt-176和第三代AMPD MSt-112、MSt-181和MSt-242也是有效的。它们对于抗革兰氏阴性菌鲍氏不动杆菌显示一些活性。
将范围在C6至C12的烷基链连接至第二代AMPD的核心，产生了具有更广谱的抗菌剂。这些序列也对鲍氏不动杆菌和医院耐药株有效。最好的化合物的活性在与常用作诊所中的最后资源的非常有效的多粘菌素相同的范围内。当与其他肽化合物相比时，AMPD的优势是它们对hRBC的低毒性，被蛋白酶降解缓慢以及仅天然氨基酸的存在。收集的证据也指向了作用的方式，其中细胞膜破坏，细胞溶解，细菌死亡。铜绿假单胞菌突变体、LUV和杀灭动力学的实验指向细胞膜破坏，其中LPS结构不阻碍肽树状聚体。因此，用AMPD处理不太可能会导致抗性的快速发展。
我们的新类别的抗微生物剂，即在分支单元之间具有2个或3个氨基酸的AMPD是易于以高产量合成并在体外抗人病原体高效的无毒性的、稳定系统。活性序列可以是具有或不具有烷基链的第三代、第二代。可以在固体支持物上仅使用一个纯化步骤制备肽树状聚体，或可以在溶液中从两种低代树状聚体(见ccs-20)组装肽树状聚体，以非常良好的产量提供第三代树状聚体。结构可塑性是我们的肽树状聚体在线性或环状配偶体中没有发现的独特特性，并给予了关于进一步优化以获得具有希望的药代动力学的化合物的优势。体外实验描述了目前设置用于体内实验的框架，体内实验会是跟进发展基于肽树状聚体的治疗剂的目标的步骤。
研究了在人血清(在MH培养基中的30％血清)中存在的抗微生物活性，并且G3KL显示保持在MH培养基中观察到的低MIC。测量了蛋白水解稳定性并且与在MH培养基中非常有活性但由于蛋白水解降解而在血清中丧失活性的线性序列相比，G3KL显示在血清中相当稳定。
用G3KL研究了大量多药耐药性病原体。树状聚体对不依赖于抗性机制测试的几乎所有铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌的菌株是非常有效的。还确定了G3KL的MBC，显示树状聚体具有杀菌性，MBC值与MIC相同或非常接近MIC。在延长暴露后，树状聚体对人细胞是没有毒性的。
在核心G2KLC10中具有脂质侧链C10(CO(CH2)8CH3)的第二代肽树状聚体和类似物也被发现抗铜绿假单胞菌(PA)非常具有活性。具体地，鉴定了三种新的抗包括临床分离株的PA非常有活性的化合物。另外，一种G2C10AMPD显示了良好的抗MRSA活性。虽然第二代树状聚体小于第三代树状聚体(G2KL有17个氨基酸残基，以及G3KL有37个氨基酸残基)，具有脂质链的G2树状聚体在血清的存在下有活性并在血清中显示了良好的稳定性(见G2KLC10和TNS-122)。
Claims (30)
1.一种肽树状聚体，其中，其通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4或
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y2和Y3是连接部分二肽H-Cys或三肽CH-Cys，该连接部分通过下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
在Y中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸；
其中硫原子属于半胱氨酸，并且氨基构成D中相邻的氨基酸的N-末端，其中所述半胱氨酸的C-末端是羧酰胺，
-r和s为0或1；
-Z是二肽CH，或者是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，在Z中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸；
-独立于任意其他B的每个B1、B2和B3表示由通式：CnH2n-1(NH2)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，
-独立于任意其他D的每个D1、D2和D3是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，在D中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸，
所述肽树状聚体用作药物。
2.根据权利要求1所述的肽树状聚体，其中，n为2、3、4或5。
3.根据权利要求1所述的肽树状聚体，其中
a.B1、B2和B3独立地选自赖氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸和2,3-二氨基丁酸；
b.H选自亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；和/或
c.C选自赖氨酸、精氨酸或2,3-二氨基丁酸。
4.根据权利要求3所述的肽树状聚体，其中，Z是三肽HCH。
5.根据权利要求1或2所述的肽树状聚体，其中，其中Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、Dab-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu、Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
6.根据权利要求5所述的肽树状聚体，其中，Z选自Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Lys-Leu-Lys。
7.一种肽树状聚体，其特征在于下式中的任一个：
a.(KL)4-(K-KL)2-K-KL
b.(KL)4-(B-KL)2-B-KL
c.(RL)4-(B-RL)2-B-RL
d.(KKL)4-(K-KL)2K-KL
e.(DabW)4-(K-DabW)2-K-DabW
f.(DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
g.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
h.(RL)8-(K-RL)4(K-RL)2-K-RL
i.(LK)8-(K-LK)4-(K-LK)2-K-LK
j.(KY)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
k.(LA)8-(K-LK)4-(K-LA)2-K-KL
l.(KW)8-(K-KW)4-(K-KW)2-K-KW
m.(KF)8-(K-KF)4-(K-KF)2-K-KF
n.(KL)8-(B-KL)4-(B-KL)2-B-KL
o.(RL)8-(B-RL)4-(B-RL)2-B-RL
p.(LL)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-KK
q.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
r.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabL)2-K-DabW
s.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabW)2-K-DabW
t.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabL
u.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabA
v.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabA)2-K-DabW
w.(DabL)8-(K-DabA)4-(K-DabW)2-K-DabW
x.(KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
aa.(RL)8-(K-RLCRL)4-(K-RL)2-K-RL
bb.(KKL)4-(K-KKL)2-K-KKL
cc.(KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
dd.(LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ee.(KLL)8-(K-KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
ff.(LKL)8-(K-LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
gg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KKL
hh.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLL
ii.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLK
jj.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-LKL
kk.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
ll.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
mm.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
nn.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
oo.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
pp.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
qq.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
rr.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
ss.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
tt.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
uu.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
vv.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
ww.(CH3(CH2)4CO-KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
xx.(CH3(CH2)4CO-KL)4-(K-KL)2-K-KL
yy.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-LL
zz.(KK)8-(K-LL)4-(K-KK)2-K-LL
aaa.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
bbb.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
ccc.(KK)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
ddd.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-GSC
eee.(KK)8-(K-KK)4-(K-KK)2-K-GSC
fff.(KL)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
ggg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LL)2-K-GSC
hhh.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-GSC
iii.(KA)8-(K-KA)4-(K-KA)2-K-GSC
jjj.(KH)8-(K-KH)4-(K-KH)2-K-GSC
kkk.(RL)8-(K-LL)4-(K-LL)2-K-GSC
lll.(RL)8-(K-RL)4-(K-LL)2-K-GSC
mmm.(RL)8-(K-RL)4-(K-RL)2-K-GSC
nnn.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KL
ooo.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KL
ppp.(RF)4-(K-DabL)2-K-KL
qqq.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
rrr.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3；或
sss.(RF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3，
其中B是(L)-2,3-二氨基丙酸，
其用作药物。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的肽树状聚体，其中所述树状聚体的Z偶联至烷基羧酸部分。
9.根据权利要求8所述的肽树状聚体，其中所述烷基羧酸部分为通过通式CH3(CH2)nCO-描述的烷基羧酸部分，其中n为4至22的数。
10.根据权利要求1至3以及7中任一项所述的肽树状聚体，其中，其用于预防或治疗细菌感染。
11.根据权利要求1至3以及7中任一项所述的肽树状聚体，其中，其用于预防或治疗革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌感染。
12.根据权利要求1至3以及7中任一项所述的肽树状聚体，其中，其用于预防或治疗铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌或大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
13.根据权利要求1至3以及7中任一项所述的肽树状聚体，其中，其用于预防或治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌即MRSA菌株感染。
14.一种肽树状聚体，其通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4或
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
-独立于任意其他Y的每个Y2和Y3是连接部分二肽H-Cys或三肽CH-Cys，该连接部分通过下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
在Y中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸
其中硫原子属于半胱氨酸，并且氨基构成D中相邻的氨基酸的N-末端，其中所述半胱氨酸的C-末端是羧酰胺，
-r和s可以为0或1；
-Z是二肽CH，或者是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，在Z中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸；
-独立于任意其他B的每个B1、B2和B3表示由通式：CnH2n-1(NH2)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，
-独立于任意其他D的每个D1、D2和D3是
i.二肽CH、HC、CC或HH，或者
ii.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC，在D中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是(L)-2,3-二氨基丁酸。
15.根据权利要求14所述的肽树状聚体，其中，n为2、3、4或5。
16.根据权利要求14所述的肽树状聚体，其中，B1、B2和B3独立地选自赖氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸和2,3-二氨基丁酸。
17.根据权利要求14所述的肽树状聚体，其中，Z是三肽HCH。
18.根据权利要求14所述的肽树状聚体，其中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、Dab-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu、Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
19.根据权利要求18所述的肽树状聚体，其中，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp或Lys-Leu-Lys。
20.一种肽树状聚体，其通过如下通式描述：
X-(B2-[Y2]s-D1)2-B1-Z，其中
-X是
-(D2)4或
-(D3)8-(B3-[Y3]r-D2)4，
并且其中
独立于任意其他Y的每个Y2和Y3是连接部分二肽H-Cys或三肽CH-Cys，该连接部分通过下式例示的硫醚部分连接至D中C-末端相邻的氨基酸的N-末端：
在Y中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸；
其中硫原子属于半胱氨酸，氨基构成D中相邻的氨基酸的N-末端，其中所述半胱氨酸的C-末端是羧酰胺，
-r和s为0或1；
-Z是二肽CH，或者是三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC；在Z中，H是包含疏水侧链的任意氨基酸，C是包含阳离子侧链的任意氨基酸；
-独立于任意其他B的每个B1、B2和B3表示由通式：CnH2n-1(NH2)2CO-描述的二氨基烷基羧酸部分，其中n为2至10的数，
-独立于任意其他D的每个D1、D2和D3是
iv.氨基酸C或H
v.二肽CH、HC、CC或HH
vi.三肽HCH、HHC、CHH、CCH、CHC、HCC、HHH或CCC
在D中，
-H是包含疏水侧链的任意氨基酸，
-C是包含阳离子侧链的任意氨基酸，
其特征在于
-Z偶联至烷基羧酸。
21.根据权利要求20所述的肽树状聚体，其中，n为2、3、4或5。
22.根据权利要求20所述的肽树状聚体，其中，所述烷基羧酸部分通过通式CH3(CH2)nCO-描述，其中n为6至22的数。
23.根据权利要求20所述的肽树状聚体，其中，
a.B1、B2和B3独立地选自赖氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸和2,3-二氨基丁酸；
b.H选自亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；和/或
c.C选自赖氨酸、精氨酸或2,3-二氨基丁酸。
24.根据权利要求20所述的肽树状聚体，其中，Z是三肽HCH。
25.根据权利要求20所述的肽树状聚体，其特征在于，Z是Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp、Dab-Leu、Leu-Lys、Lys-Trp、Lys-Phe、Lys-Lys、Leu-Leu、Dab-Ala、Lys-Lys-Leu、Lys-Leu-Leu、Leu-Lys-Leu、Lys-Leu-Lys、Orn-Leu、Orn-Phe、Arg-Phe或Gly-Ser-Cys。
26.根据权利要求25所述的肽树状聚体，其特征在于，Z选自Lys-Leu、Arg-Leu、Dab-Trp和Lys-Leu-Lys。
27.根据权利要求7所述的肽树状聚体，其特征在于下式：
a.(KL)4-(K-KL)2-K-KL
b.(KL)4-(B-KL)2-B-KL
c.(RL)4-(B-RL)2-B-RL
d.(KKL)4-(K-KL)2K-KL
e.(DabW)4-(K-DabW)2-K-DabW
f.(DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
g.(LK)8-(K-LK)4-(K-LK)2-K-LK
h.(KY)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
i.(LA)8-(K-LK)4-(K-LA)2-K-KL
j.(KW)8-(K-KW)4-(K-KW)2-K-KW
k.(KF)8-(K-KF)4-(K-KF)2-K-KF
l.(KL)8-(B-KL)4-(B-KL)2-B-KL
m.(RL)8-(B-RL)4-(B-RL)2-B-RL
n.(LL)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-KK
o.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabL)2-K-DabL
p.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabL)2-K-DabW
q.(DabL)8-(K-DabL)4-(K-DabW)2-K-DabW
r.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabL
s.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabW)2-K-DabA
t.(DabL)8-(K-DabW)4-(K-DabA)2-K-DabW
u.(DabL)8-(K-DabA)4-(K-DabW)2-K-DabW
v.(KL)8-(K-KLCKL)4-(K-KL)2-K-KL
y.(RL)8-(K-RLCRL)4-(K-RL)2-K-RL
z.(KKL)4-(K-KKL)2-K-KKL
aa.(KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
bb.(LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
cc.(KLL)8-(K-KLL)4-(K-KLL)2-K-KLL
dd.(LKL)8-(K-LKL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ee.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KKL
ff.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLL
gg.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-KLK
hh.(KL)8-(K-KL)4-(K-LKL)2-K-LKL
ii.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
jj.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
kk.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
ll.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
mm.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)4CH3
nn.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)6CH3
oo.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
pp.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)10CH3
qq.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
rr.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
ss.(KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
tt.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)16CH3
uu.(CH3(CH2)4CO-KL)8-(K-KL)4-(K-KL)2-K-KL
vv.(CH3(CH2)4CO-KL)4-(K-KL)2-K-KL
ww.(KK)8-(K-KK)4-(K-LL)2-K-LL
xx.(KK)8-(K-LL)4-(K-KK)2-K-LL
yy.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)14CH3
zz.(KL)4-(K-KL)2-K-KLK-(CO(CH2)22CH3
aaa.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KL
bbb.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KL
ccc.(RF)4-(K-DabL)2-K-KL
ddd.(OrnF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3
eee.(OrnL)4-(K-DabF)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3；或
fff.(RF)4-(K-DabL)2-K-KLK-(CO(CH2)8CH3，
其中B是(L)-2,3-二氨基丙酸。
28.如权利要求1或20中任一项所述的肽树状聚体，其中，
H是包含疏水性侧链的(D)-或(L)-氨基酸，其选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，并且
C是包含阳离子侧链的(D)-或(L)-氨基酸、其选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、组氨酸。
29.如权利要求14所述的肽树状聚体，其中，
H是包含疏水性侧链的(D)-或(L)-氨基酸，其选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
30.如权利要求1、14或20中任一项所述的肽树状聚体，其特征在于，Z通过Z上的氨基官能团与B1上的羧酸碳之间的酰胺键连接至B1，并且D1、D2和D3中的每一个通过B1、B2和B3上的氨基氮与D1、D2和D3的羧酸碳之间的酰胺键连接至其各自的结合配偶体B1、B2和B3。
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