CN106124650A - 一种电子烟雾中氨基酸的检测方法 - Google Patents

一种电子烟雾中氨基酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电子烟雾中氨基酸的检测方法，该方法包括：用剑桥滤片捕集电子烟雾中的氨基酸，电子烟抽吸后，将收集完电子烟雾样品的剑桥滤片取出，加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色谱‑串联质谱仪进行测定，内标法定量。本发明采用同位素稀释内标法定量避免了分析过程中基质效应的影响；本发明采用直接进样，可快速、准确检测出卷烟主流烟气中17种氨基酸的含量，且重复性和回收率好，适用于工业中大批量样品的分析。

Description

一种电子烟雾中氨基酸的检测方法
技术领域
本发明属于理化检验技术领域，具体涉及电子烟雾中氨基酸含量的测定方法。
背景技术
氨基酸是构成生物体蛋白质最基本的物质，是生物体内不可缺少的成分之一。它不仅具有多种生理功能，还可作为呈味剂和营养源而广泛应用于食品添加剂中。
如今，许多电子烟烟液研发单位已经不再刻意追求传统卷烟的口感，而是赋予其特殊的口味或功能，电子烟烟液中添加的植物提取物、香精香料等都富含各种氨基酸，并通过电子烟的抽吸过程进入人体，以满足机体新陈代谢的需要。
但目前以电子烟雾中氨基酸为研究对象的检测方法未见公开报道，为准确把握电子烟雾中氨基酸的释放量，并更好地控制电子烟的质量和品质，建立电子烟雾中氨基酸的测定方法意义重大。
发明内容
本发明弥补了现有分析技术的不足，提供了一种电子烟雾中氨基酸含量的测定方法。
本发明提供了一种电子烟雾中氨基酸的检测方法，该方法包括：用剑桥滤片捕集电子烟雾中的氨基酸，电子烟抽吸后，将收集完电子烟雾样品的剑桥滤片取出，加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，内标法定量。
本发明提供的一种电子烟雾中氨基酸含量的测定方法的优选技术方案为：
①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.01-0.1mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
②配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1-0,5μmol/mL的内标溶液；
③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0,01-0.05μmol/mL，胱氨酸的浓度为0,01-0.05μmol/mL；
④电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，用剑桥滤片捕集电子烟雾；
⑤样品前处理及分析：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
本发明提供的一种电子烟雾中氨基酸含量的测定方法的更优选技术方案为：
①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
②配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1μmol/mL的内标溶液；
③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025μmol/mL，胱氨酸的浓度为0.0125μmol/mL；
④电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，用剑桥滤片捕集电子烟雾；
⑤样品前处理及分析：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
进一步地，在步骤④中，规定的抽吸条件是抽吸曲线为方波，抽吸容量55.0mL，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s；
进一步地，在步骤④中，每个电子烟样品用剑桥滤片捕集30-80口电子烟雾；优选为50口电子烟雾；
进一步地，在步骤⑤中，内标溶液和萃取液的加入量分别为50-150μL和30-100mL；优选内标溶液和萃取液的加入量分别为100μL和50mL。
进一步地，在步骤⑤中，超声萃取的时间为10-60min，功率为200-500W；优选超声萃取的时间为30min，功率为300W。
进一步地，在步骤⑤中，水相滤膜为1.2-0.22μm醋酸纤维素滤膜；优选0.22μm醋酸纤维素滤膜。。
进一步地，在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mm×4.6mm×5μm；
进样量5μL；
柱温为30℃；
流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：
进一步地，在步骤⑤和⑥中，质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气10psi，干燥温度600℃；各化合物的特征离子及参数分别为：
本发明的有益效果是：
本发明使用的仪器和设备均为实验室常规分析设备，发明方法易于推广，检测成本低；
本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难，也克服了基质效应的影响；
本发明首次提出了采用高效液相色谱-串联质谱联用仪测定电子烟雾中17种氨基酸的分析方法，方法分析速度快，重复性和回收率好，适用于工业中大批量样品的分析。
附图说明
图1是甘氨酸的提取离子流图；
图2是丙氨酸的提取离子流图；
图3是丝氨酸的提取离子流图；
图4是脯氨酸的提取离子流图；
图5是缬氨酸的提取离子流图；
图6是苏氨酸的提取离子流图；
图7是异亮氨酸和亮氨酸的提取离子流图；
图8是天冬氨酸的提取离子流图；
图9是内标(亮氨酸-d3)的提取离子流图；
图10是赖氨酸的提取离子流图；
图11是谷氨酸的提取离子流图；
图12是蛋氨酸的提取离子流图；
图13是组氨酸的提取离子流图；
图14是苯丙氨酸的提取离子流图；
图15是精氨酸的提取离子流图；
图16是酪氨酸的提取离子流图；
图17是胱氨酸的提取离子流图。
具体实施方式
为便于更好的理解本发明，本发明结合具体的实施例进一步说明：
实施例1
仪器与试剂、材料：美国AB SCIEX 5500LC-MS/MS；美国Agilent 1290HPLC；Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱(150mm×4.6mm,粒径5μm)，0.22μm微孔过滤膜，超声清洗器；超纯水(18MΩ)，乙腈(色谱纯，百灵威化学试剂公司),17种氨基酸混标。
萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1μmol/mL的内标溶液；
配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025μmol/mL，胱氨酸的浓度为0.0125μmol/mL；
电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，即抽吸曲线为方波，抽吸容量55.0mL，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s，每个电子烟样品用剑桥滤片捕集50口电子烟雾；
样品前处理：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入100μL内标溶液和50mL萃取液，超声(功率为300W)萃取30min，取上层清液经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
高效液相色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mm×4.6mm×5μm；
进样量5μL；
柱温为30℃；
流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序如表1所示：
表1高效液相色谱梯度洗脱条件
质谱条件：质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气20psi，干燥温度600℃；各化合物的特征离子及参数如表2所示：
表2 17种氨基酸及内标的特征离子及参数
标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限如表3所示。
表3 17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限
精密度：为了考察方法的精密度，以某电子烟样品进行5次日内重复实验，测定结果表明17种氨基酸日内测定结果的相对标准偏差在1.04％～6.39％之间，表明方法的日内精密度良好。同时，对样品进行了5天日间重复实验，测定结果表明17种氨基酸日间测定结果的相对标准偏差在1.39％～8.56％之间，结果表明该方法的日间重复性良好。
回收率：采用样品加标法对某电子烟样品在高、中、低三个含量水平上进行了回收率的测定，结果表明，17种氨基酸的平均回收率的结果在93.1％-99.8％之间，回收率较高，满足分析要求。
实际样品的测定：采用本发明建立的方法测定了7款电子烟雾中的氨基酸(表4),电子烟雾中氨基酸的含量范围为1.2-31.4ng/口。
表4电子烟雾中氨基酸的检测结果(ng/口)
化合物 1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#
脯氨酸 23.0 N.D. N.D. 26.1 N.D. 11.2 31.4
丙氨酸 3.5 5.2 7.9 5.2 N.D. N.D. 3.7
精氨酸 N.D. N.D. N.D. 2.0 N.D. N.D. N.D.
胱氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
组氨酸 1.2 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
蛋氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
苯丙氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
丝氨酸 1.7 N.D. N.D. 1.2 1.7 N.D. 1.7
苏氨酸 13.8 26.6 24.0 18.3 25.3 19.0 5.6
酪氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
缬氨酸 1.7 N.D. N.D. 1.1 N.D. N.D. 1.9
甘氨酸 N.D. 1.9 1.8 N.D. 1.5 N.D. 1.6
天冬氨酸 12.0 13.2 8.1 13.7 3.7 4.5 12.9
谷氨酸 3.0 N.D. N.D. 2.7 N.D. 2.3 2.7
赖氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
亮氨酸 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
异亮氨酸 2.9 1.9 1.7 1.6 2.0 1.9 N.D.

Claims (15)

1.一种电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
用剑桥滤片捕集电子烟雾中的氨基酸，电子烟抽吸后，将收集完电子烟雾样品的剑桥滤片取出，加入内标后，采用稀盐酸溶液进行超声萃取，过滤膜后进入高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，内标法定量。
2.根据权利要求1所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.01-0.1mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
②配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1-0,5μmol/mL的内标溶液；
③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0,01-0.05μmol/mL，胱氨酸的浓度为0,01-0.05μmol/mL；
④电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，用剑桥滤片捕集电子烟雾；
⑤样品前处理及分析：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
3.根据权利要求1所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
②配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1μmol/mL的内标溶液；
③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025μmol/mL，胱氨酸的浓度为0.0125μmol/mL；
④电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，用剑桥滤片捕集电子烟雾；
⑤样品前处理及分析：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
4.根据权利要求3所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤④中，规定的抽吸条件是抽吸曲线为方波，抽吸容量55.0mL，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s。
5.根据权利要求3所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤④中，每个电子烟样品用剑桥滤片捕集30-80口电子烟雾。
6.根据权利要求5所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤④中，每个电子烟样品用剑桥滤片捕集50口电子烟雾。
7.根据权利要求3所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，内标溶液和萃取液的加入量分别为50-150μL和30-100mL。
8.根据权利要求7所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，内标溶液和萃取液的加入量分别为100μL和50mL。
9.根据权利要求3所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，超声萃取的时间为10-60min，功率为200-500W。
10.根据权利要求9所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，超声萃取的时间为30min，功率为300W。
11.根据权利要求3所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，水相滤膜为1.2-0.22μm醋酸纤维素滤膜。
12.根据权利要求11所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤中，水相滤膜为0.22μm醋酸纤维素滤膜。
13.根据权利要求1-12中任一所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mm×4.6mm×5μm；
进样量5μL；
柱温为30℃；
流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：
14.根据权利要求1-12中任一所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于：在步骤⑤和⑥中，质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气10psi，干燥温度600℃；各化合物的特征离子及参数分别为：
15.根据权利要求1所述的电子烟雾中氨基酸的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
①萃取液的制备：用浓盐酸配制0.05mol/L的稀HCl溶液，作为萃取液；
②配制内标溶液：称取一定量亮氨酸-d3，用萃取液配制浓度为0.1μmol/mL的内标溶液；
③配制混合标准溶液：用萃取液为溶剂，将17种氨基酸混标配成不同系列浓度的标准溶液，脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸的浓度为0.025μmol/mL，胱氨酸的浓度为0.0125μmol/mL；
④电子烟的抽吸：将电子烟样品用吸烟机按照规定的抽吸条件进行抽吸，用剑桥滤片捕集电子烟雾；
⑤样品前处理及分析：电子烟抽吸后，取下剑桥滤片并放入三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液，超声萃取，取上层清液经水相滤膜过滤后，供LC-MS/MS测定；
⑥标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.02ml、0.05ml、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL，各加入内标溶液100μL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得6级工作标准溶液；对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得17种氨基酸的标准曲线；
⑦数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量；
在步骤④中，抽吸容量55.0mL，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s；每个电子烟样品用剑桥滤片捕集50口电子烟雾；
在步骤⑤中，内标溶液和萃取液的加入量分别为100μL和50mL；超声萃取的时间为30min，功率为300W；水相滤膜为0.22μm醋酸纤维素滤膜；
在步骤⑤和⑥中，高效液相色谱条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色谱柱，柱参数为150mm×4.6mm×5μm；
进样量5μL；
柱温为30℃；
流速为0.4mL/min，梯度洗脱程序为：
在步骤⑤和⑥中，质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正离子扫描方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：电喷雾电压5000V；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气10psi，干燥温度600℃；各化合物的特征离子及参数分别为：
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