CN106109441B - 一种天门冬酰胺酶微球及其制备方法 - Google Patents
一种天门冬酰胺酶微球及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物微球制备技术领域，公开了一种天门冬酰胺酶微球及其制备方法。所述制备方法为：将天门冬酰胺酶溶解于聚乙二醇，然后冷冻干燥，洗涤，得天门冬酰胺酶微粉；将聚乳酸‑乙醇酸共聚物溶于有机溶剂中，然后加入天门冬酰胺酶微粉，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；再将混悬液加入到聚乙烯醇水溶液中，搅拌乳化后用蒸馏水稀释，搅拌分散均匀，离心收集微球，所得微球经洗涤、冷冻干燥，得到天门冬酰胺酶微球。本发明采用部分无水法和对天门冬酰胺酶进行微粉化，得到粒径合适及包封率高的天门冬酰胺酶微球，并减少了微球的突释效应。
Description
技术领域
本发明属于药物微球制备技术领域，具体涉及一种天门冬酰胺酶微球及其制备方法。
背景技术
天门冬酰胺酶(别称天冬酰胺酶、门冬酰胺酶等，它的主要功能是水解天门冬酰胺为天门冬氨酸与氨，在动物、微生物、植物组织中广泛存在。动物体内的天门冬酰胺酶主要存在于哺乳动物和鸟类的肝、胰、肾、胃和脾中。
L-天冬酰胺被天门冬酰胺酶水解成天冬氨酸、氨，天冬酰胺是核酸合成的重要组成部分，一些肿瘤细胞缺乏天冬酷胺合成酶，抑制蛋白质的合成、细胞生长、分裂，最终导致肿瘤细胞程序性死亡。其他细胞则不受影响。在临床上常用于白血病的治疗。它与大部分其他化疗药物不同的是，天门冬酰胺酶可通过静脉注射、肌肉注射(或者皮下注射)给药而不必担心对周围组织的刺激与伤害。
天门冬酰胺酶是儿童急性淋巴细胞白血病诱导治疗中不可缺少的重要药物,但其毒副作用限制了该酶的临床应用。明确其各种毒副作用的机理及该酶的蛋白质结构，利用各种生物技术及基因工程，才能找到更好地降低其毒副作用的方法。随着生物技术的发展和应用，天门冬酰胺酶的毒副作用将会不断降低，天门冬酰胺酶的应用将会更安全、更广泛。
现有的天门冬酰胺酶多为粉针剂，微有吸湿性。吸湿后该酶容易失去生物活性。药物的靶向性差，该酶的粉针剂有过敏反应、胃肠道反应，恶心、呕吐、食欲不振、腹泻、腹部痉挛等，中枢神经系统毒性等毒副作用。
微球(micorspheres)的粒径在1～250μm之间，是包载了1种或多种药物的球形聚合物的新型复合药物制剂。微球在形成过程中，将药物或一定量的靶向诱导剂溶解或分散在聚合物材料基质的固体骨架结构中，当微球中包载了磁性粒子后，可使给药体系具有磁性，从而使药物的治疗具有靶向性。由于微球给药体系具有缓释、控释和靶向的性质，从20世纪70年代开始，研究发展与临床应用十分迅速。国外已经上市了几个这类剂型的药品，尽管在临床应用上有待完善，但是其出色的缓控释与靶向能力令人满意。
常用的微球载体材料有天然的(明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠等)、半合成的(改性壳聚糖、交联甲壳素、甲基纤维素、乙基纤维素等)、合成的(聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氰基丙烯酸烷酯等)高分子材料，其具备以下要求：化学性质稳定，不与药物或相关的辅助药物发生化学反应，不改变药物的药理作用；自身材料以及在体内的降解物应无毒、无刺激性；形成的微球骨架具有一定或较强的包载药物的能力；具有稳定的药物释放速度。
合成高分子可降解载体材料，可以被体内吸收，控释能力强，被国内外广泛应用。其特点在于无毒、成膜或成球性好，化学稳定性高，工艺可控性强，批间质量差异小，是微球制剂技术研究的重点。其中聚乳酸(poly lactic acid PLA)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid PLGA)的研究最为成熟，现在，它们已经应用于包载激素、化学合成药物、蛋白质和多肽、疫苗以及避孕药物等。
聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)易制备，重现性好，易溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)等有机溶剂；不溶于醇、酮、醚等有机溶剂，不溶于水。PLGA具有良好的生物降解性和生物相容性，安全稳定，其在体内的降解产物为乳酸和羟基乙酸，是人体的正常代谢物，可以被人体消化吸收，最终产物是二氧化碳和水。
制备PLGA微球的方法有无水法、复乳法、喷雾干燥法、低温喷雾提取法、缩聚法、熔融-挤出法等。目前最常用的方法是复乳法和无水法。用复乳法制备蛋白质微球的主要工艺过程是，将蛋白质的水溶液加入到聚合物的有机溶剂(常用二氯甲烷)中，超声或搅拌后制成初乳，将初乳转移到另一含乳化剂的水相中制成复乳，不断搅拌萃取有机溶剂，使高分子材料固化，收集微球、洗涤、冷冻干燥。这一过程的许多步骤可能会使蛋白质的结构发生改变，特别是在制备初乳时，由于蛋白质具有表面活性易吸附在油水界面上，可引起蛋白质的伸展、变性和不可逆的聚集。加之超声、搅拌等剧烈的条件，很容易导致蛋白质失活。日前解决这一问题主要的方法是加入各种类型的添加剂。添加剂的种类包括蛋白质、糖、多元醇、表面活性剂、无机盐等。
用复乳法制备蛋白质PLGA微球主要的优点是工艺简单，且由于初乳乳滴的粒径较易控制，因此蛋白质在微球中较易分散均匀，制备的微球突释(微球在体内外刚开始数小时释放的药物量)较少。主要缺点是工艺过程对蛋白质活性影响较大。此外，由于复乳法制备微球需要两步乳化，因此工艺中的影响因素很多，包括内水相体积、油相体积、内水相和油相的比例，制备初乳和复乳的搅拌条件，蛋白质的浓度，搅拌装置等，所以工艺放大较为困难。使用复乳法制备微球一个最大的缺点就是引入了油水界面，形成的疏水界面通常会引起蛋白质的界面吸附，接着会导致其伸展和聚集。
为了改进复乳法的缺点，国外学者越来越多地使用了无水制备微球的方法，在这种方法中蛋白质以固体的形式分散在高分子材料的有机溶剂中从而避免了油水界面。这一策略的基本原理是脱水的蛋白质粉末在有机溶剂中惰性较强，限制了其构象的变动，在微球的制备过程中限制了外界因素对蛋白质结构的干扰，从而有效地维持了蛋白质的生物学活性。
部分无水法(S/O/W)制备微球工艺是完全无水和复乳法(W/O/W)之间存在的一个折中的方法。在这一方法当中，脱水的蛋白粉末混悬在溶有聚合物的有机溶剂中。这一混悬液在含有乳化剂的水溶液中乳化。微球在有机溶剂溶解和挥发过程中得到固化，最后洗涤、冷冻干燥。Cleland等报道了将rhGH和海藻糖或甘露醇一起冷冻干燥用S/O/W法制备的PLGA微球，从微球中释放的rhGH保持了各部分的活性。尽管在乳化过程中蛋白在有机溶剂存在的条件下遇到了水性环境，但是聚合物固化的时间非常短，没有导致蛋白的溶解和失活。用S/O/W法的一个主要问题是通常包被水溶性药物时包封率较低。这是由于在乳化过程中蛋白质从内水相溶解到了外油相。已有研究表明优化工艺条件可以减少蛋白的损失，主要是通过减小蛋白质的粒径来实现的。可以在乳化过程中，或通过在有机溶剂中加入可溶性添加剂来实现蛋白质的微粉化。这种方法可以将蛋白的包封率从不到20％提高到超过80％。S/O/W工艺存在的另一个问题是固相中添加剂的损失。因为添加剂一般分子量小(例如海藻糖)、水溶性好，它们可进入外水相而损失一部分，或在固化过程中从蛋白存在的固相中脱离而滞留在高分子材料中。这样，添加剂就不能在工艺过程中发挥稳定蛋白的作用，特别是最后的干燥过程。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种天门冬酰胺酶微球的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的天门冬酰胺酶微球。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将天门冬酰胺酶溶解于聚乙二醇(PEG)中，溶解后冷冻干燥，洗涤，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于有机溶剂中，然后加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到聚乙烯醇(PVA)水溶液中，搅拌乳化后用蒸馏水稀释，搅拌分散均匀，离心收集微球，所得微球经洗涤、冷冻干燥，得到天门冬酰胺酶微球。
优选地，步骤(1)中所述的聚乙二醇是指PEG400。
优选地，步骤(1)中所述的洗涤是指用二氯甲烷洗涤。
优选地，步骤(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量为14000～34000Da；更优选重均分子量为30000Da。
优选地，步骤(2)中所述有机溶剂是指二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)。
优选地，步骤(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物溶于有机溶剂的浓度为80～120mg/mL；更优选的浓度为120mg/mL。
优选地，步骤(2)中所述天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.3％～1.2％；更优选的质量百分比为0.6％。
优选地，步骤(3)中所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度为2.5％～5.0％。
优选地，步骤(3)中所述搅拌乳化的搅拌速度为1000～1600rpm；更优选的搅拌速度为1400rpm。
一种天门冬酰胺酶微球，通过上述方法制备得到。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明采用体内可生物降解的高分子材料PLGA将天门冬酰胺酶包被成微球，通过微球内部的孔道以及高分子材料的融蚀降解来调控天门冬酰胺酶在体内外的释放；可以提高药物的稳定性；防止药物失活；便于药物的存储与应用；使药物集中于靶区，提高疗效，降低毒副作用，具有非常广阔的应用前景。
(2)本发明采用部分无水法，在制初乳时避免了使用水，因而绕开了复乳法可能破坏蛋白质结构的主要阶段；第二步在水中进行乳化，又解决了无水法制备的微球难于洗涤的问题；
(3)本发明对天门冬酰胺酶进行微粉化(将天门冬酰胺酶溶解于聚乙二醇后冷冻干燥，成为高分散的乳化微粉)，减少了微球的突释效应。
附图说明
图1为本发明实施例5所得天门冬酰胺酶微球的体外释放试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将20mg天门冬酰胺酶溶解于100mL PEG400中，然后冷冻干燥，再经二氯甲烷洗涤去除PEG400，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，分别形成80mg/mL、100mg/mL和120mg/mL的溶液，然后分别加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉(天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.6％)，水浴搅拌条件下超声处理得到不同PLGA浓度的混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到50mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm转速下搅拌乳化10min后用600mL蒸馏水稀释，搅拌4h分散均匀，离心收集微球，所得微球经蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥24h，得到天门冬酰胺酶微球。
本实施例不同PLGA浓度下所得天门冬酰胺酶微球的平均粒径及包封率如表1所示。
表1
由表1结果可以看出，PLGA浓度增大，微球的平均粒径显著增大，包封率明显增加。
实施例2
(1)将20mg天门冬酰胺酶溶解于100mL PEG400中，然后冷冻干燥，再经二氯甲烷洗涤去除PEG400，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成100mg/mL的溶液，然后加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉(天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.6％)，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到50mL 3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，分别在1000rpm、1400rpm和1600rpm转速下搅拌乳化10min后用600mL蒸馏水稀释，搅拌4h分散均匀，离心收集微球，所得微球经蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥24h，得到天门冬酰胺酶微球。
本实施例不同乳化搅拌转速下所得天门冬酰胺酶微球的平均粒径及包封率如表2所示。
表2
表2结果表明，搅拌速度增大，微球的平均粒径显著减小，包封率有所降低。
实施例3
(1)将20mg天门冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷冻干燥，再经二氯甲烷洗涤去除PEG400，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成100mg/mL的溶液，然后分别加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉(天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比分别为0.3％、0.6％、1.2％)，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，在1000rpm转速下搅拌乳化10min后用600mL蒸馏水稀释，搅拌4h分散均匀，离心收集微球，所得微球经蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥24h，得到理论载药量分别为0.3％、0.6％和1.2％的天门冬酰胺酶微球。
本实施例不同理论载药量下所得天门冬酰胺酶微球的平均粒径及包封率如表3所示。
表3
表3结果表明理论载药量增加对微球的平均粒径影响不明显，包封率有所下降。
实施例4
(1)将20mg天门冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷冻干燥，再经二氯甲烷洗涤去除PEG400，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将平均分子量分别为14000Da和34000Da的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，分别形成100mg/mL和120mg/mL的溶液，然后分别加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉(天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.6％)，水浴搅拌条件下超声处理得到不同PLGA分子量及浓度的混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm转速下搅拌乳化10min后用600mL蒸馏水稀释，搅拌4h分散均匀，离心收集微球，所得微球经蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥24h，得到天门冬酰胺酶微球。
本实施例不同PLGA分子量及浓度下所得天门冬酰胺酶微球的平均粒径及包封率如表4所示。
表4
表4结果表明在相同条件下PLGA的平均分子量越大所制备的微球的粒径也相应增加，且微球的比表面积减小，提高了包封率。
实施例5
(1)将20mg天门冬酰胺酶溶解于200mL PEG400中，然后冷冻干燥，再经二氯甲烷洗涤去除PEG400，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将平均分子量为30000Da的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷中，形成120mg/mL的溶液，然后加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉(天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.6％)，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到60mL3％wt.的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，1000rpm转速下搅拌乳化10min后用600mL蒸馏水稀释，搅拌4h分散均匀，离心收集微球，所得微球经蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥24h，得到天门冬酰胺酶微球。
将本实施例所得天门冬酰胺酶微球进行体外释放试验，并与天门冬酰胺酶未进行微粉化所得微球进行对比，结果如图1所示。由图1结果可以看出，本发明对天门冬酰胺酶进行微粉化(将天门冬酰胺酶溶解于聚乙二醇后冷冻干燥，成为高分散的乳化微粉)，减少了微球的突释效应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)将天门冬酰胺酶溶解于聚乙二醇中，然后冷冻干燥，用二氯甲烷洗涤，得天门冬酰胺酶微粉；
(2)将聚乳酸-乙醇酸共聚物溶于有机溶剂中，然后加入步骤(1)所得天门冬酰胺酶微粉，水浴搅拌条件下超声处理得到混悬液；
(3)将步骤(2)所得混悬液加入到聚乙烯醇水溶液中，搅拌乳化后用蒸馏水稀释，搅拌分散均匀，离心收集微球，所得微球经洗涤、冷冻干燥，得到天门冬酰胺酶微球。
2.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的聚乙二醇是指PEG400。
3.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量为14000～34000Da。
4.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述有机溶剂是指二氯甲烷、二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
5.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述聚乳酸-乙醇酸共聚物溶于有机溶剂的浓度为80～120mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述天门冬酰胺酶微粉与聚乳酸-乙醇酸共聚物的质量百分比为0.3％～1.2％。
7.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度为2.5％～5.0％。
8.根据权利要求1所述的一种天门冬酰胺酶微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述搅拌乳化的搅拌速度为1000～1600rpm。
9.一种天门冬酰胺酶微球，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。
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