CN106084001A - 一类阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用 - Google Patents

一类阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，是在基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN‑9的基础上进行氨基酸替换，获得一系列能够同时激活阿片和NPFF系统多种受体的多靶点多肽。通过体外cAMP功能鉴定、在体镇痛活性以及中枢副作用等药理学活性的鉴定，表明，该类多靶点多肽能同时激活阿片和神经肽FF受体，具有高效的镇痛活性且不会出现镇痛耐受现象，并且在体温、胃肠运动、心血管活性等方面表现出低副作用的优点。因此，该类多靶点多肽在制备临床镇痛药物方面具有很高的应用价值。

Description

一类阿片和神经肽FF受体的多靶点肽类分子及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一类同时激活阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽及其制备方法，本发明同时涉及该类多靶点多肽在制备高效、低副作用镇痛药物中的应用，属于生物化学的多肽药物领域。
背景技术
疼痛是一种复杂的生理心理活动。生理状态的疼痛可作为一种机体受到伤害的警告，但病理性的慢性疼痛或持续性的剧烈疼痛对机体来说是一种难以承受的折磨。所以镇痛是医务工作者面临的重要任务。临床上，阿片类镇痛药物例如吗啡、芬太尼等被广泛应用于治疗和缓解各种剧烈疼痛，比如手术后痛、癌痛等。但由于阿片类的镇痛药物能引起严重的耐受、成瘾、便秘和呼吸抑制等不良反应，而大大限制其临床应用范围。
近年来，多靶点阿片类分子的构建为研发全新的高效低副作用的阿片类镇痛药提供了新的思路。已有的研究表明，基于阿片与其它系统的配体而构建全新的多靶标药物，使其同时作用于多个作用位点，在发挥阿片镇痛活性的同时通过其他系统的调节作用来降低其副作用。比如，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物质（SP）而成功地设计构建了一类全新的杂合肽ESP7（Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2）（Proc. Nat. Acad. Sci.U.S.A. 2000, 97:7621）。
多肽是氨基酸以肽键连接在一起形成的化合物。多肽中氨基酸的缺失、增加、构型的改变或被替换，多肽序列中氨基酸侧链以及多肽C-或N-末端被化学基团修饰都会对多肽化合物原有的生物活性产生不可预知的改变。所以对多肽化合物进行氨基酸的修饰和替换以筛选出活性更高的化合物是多肽药物研发中非常重要的一个环节。
ZL201210098832.2公开了一种以高效阿片配体Biphalin和神经肽FF为化学模板，在保留阿片高效激动剂和神经肽FF“关键药效团”的基础上构建了全新的阿片/NPFF系统嵌合肽嵌合肽BN-9（Tyr-D.Ala-Gly-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2）。体内痛觉调节、耐受和胃肠运动等一系列的药理学实验表明：本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9表现出比吗啡更强的中枢镇痛活性，并具有无镇痛耐受、对胃肠运动影响小等优点，有效克服了阿片类镇痛药物普遍存在的耐受和便秘等副作用问题。但是该嵌合肽BN-9的镇痛作用强度和药效时间不够理想。
发明内容
本发明的主要目的是为了进一步提高阿片/NPFF系统嵌合肽BN-9的镇痛作用强度和药效时间，提供一类高效镇痛、低副作用的基于阿片与NPFF受体的多靶点多肽；
本发明的另一目的是提供上述多靶点多肽的合成方法；
本发明还有一个目的，就是通过提供上述多靶点多肽在受体激动、小鼠光热甩尾和模拟临床痛模型中的镇痛作用以及在镇痛耐受、心血管、胃肠运动和体温调节等方面的药理学活性，以期在镇痛药物制备中得到应用。
（一）基于阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽
本发明的多靶点多肽，是在基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9的基础上进行氨基酸替换或剪切的，获得一系列能够同时激活阿片和NPFF系统多种受体的多靶点多肽。其结构通式如下：
Xaa1-D-Ala-Gly- Xaa2- Xaa3-Pro-Gln- Arg- Phe-NH2
其中Xaa1为Tyr或NMe-Tyr；Xaa2为Phe或NMe-Phe；Xaa3为Gln、Gly、Leu、Met、D-Met、D-Leu或D-Ala。
Xaa1为NMe-Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Gln时，多靶点多肽标记为化合物1。
Xaa1为Tyr，Xaa2为NMe-Phe，Xaa3为Gln时，多靶点多肽标记为化合物2。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Gly时，多靶点多肽标记为化合物3。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Leu时，多靶点多肽标记为化合物4。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Met时，多靶点多肽标记为化合物5。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Met时，多靶点多肽标记为化合物6。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Leu时，多靶点多肽标记为化合物7。
Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Ala时，多靶点多肽标记为化合物8。
Xaa1为Tyr，Xaa2为NMe-Phe，Xaa3为Gly时，多靶点多肽标记为化合物9。
上述各化合物的氨基酸序列如表1所示：
（二）阿片和神经肽FF受体多靶点多肽的制备
本发明多靶点多肽的合成方法，包括以下工艺步骤：
. 多肽的合成
.树脂预处理：Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；最后加入DMF洗涤。
.脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入体积比为1 : 1 : 98的六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、DMF的混合溶液，搅拌反应5 min后抽干，重复3次；最后加入DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂。
. 氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护氨基酸Fmoc-AA-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加到步骤.所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤.的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
所述Fmoc-AA-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔量为1:2~1:5。所述Fmoc-AA-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2。
.肽链的延长
根据多肽化合物1-9的结构设计，从C端开始依次选择N-α-Fmoc保护的氨基酸，并将步骤. 所得脱除Fmoc保护基团的树脂按步骤.的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂。所用到的氨基酸有Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-NMe-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-NMe-Phe-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-D-Met-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH。
. 多肽从树脂上的切割
将步骤.iv所得肽树脂用DCM、MeOH交替洗，充分抽干溶剂后，加入切割剂（切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95 : 2.5 : 2.5的体积比混合形成的溶液），于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀；吸除上清液，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。
. 多肽的脱盐和纯化
以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得多靶点多肽产品。
上述合成的一系列多靶点多肽的化学表征结果如表2所示：
注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-100% 乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130 Prep C18，4.6 mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-80%乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130 Prep C18，4.6 mm×250mm。
（三）阿片和神经肽FF受体多靶点多肽的活性检测
1、体外cAMP功能检测实验
稳定表达Mu-、Delta-、Kappa-阿片受体以及NPFF1和NPFF2受体的HEK293细胞中，通过检测该类阿片与NPFF受体的多靶点多肽对Forskolin引起的细胞内环磷酸腺苷 (cAMP) 的积累的调节来检测它们对这五种受体的激动活性。
（1）cAMP功能检测实验方法
将稳定表达Mu-、Delta-、Kappa-阿片受体以及NPFF1和NPFF2受体的HEK293细胞以12万/孔的密度接种于24孔板中，于CO2培养箱中培养24小时。实验开始时，将细胞培养液置换为预热的含1 mM IBMX的无血清培养基，37 ℃孵育10 min。然后，每孔再加入不同浓度待测药物与5 μM forskolin（终浓度），37℃共孵育30 min。孵育结束后，将每孔中的溶液全部吸出，使用500 μL 0.2 M的盐酸，室温下孵育30 min以裂解细胞。裂解完成后，每孔加入10 μL10 M的NaOH 溶液以中和裂解液。将每孔中的溶液用移液枪吹打均匀后转移到离心管中，12000 rpm离心2 min。每管吸取50 μL的上清液至干净的离心管中，再加入100 μL 60 ug/μL的PKA，而空白对照组中加入100 μL TE cAMP缓冲液。以上离心管中每管再加入50 μL 0.5μCi [H3]cAMP，迅速混匀后，4 ℃孵育大于2小时。孵育结束后，每管再加入100 μL活性炭悬浮液，涡旋震荡均匀后冰浴放置1 min，5000 rpm离心4 min。每管吸取离心后的上清液200μL加入到24孔板中，每孔再加入700 μL闪烁液，之后用胶膜封闭24孔板，放置3小时后将其置于闪烁仪上测量。
（2）计算cAMP的抑制值
cAMP的抑制效应用药物对Forskolin诱导的胞内cAMP积累的抑制百分比 (% control)表示，% control = (Forskolin处理的cAMP含量-待测药物与Forskolin共处理的cAMP含量)/ (Forskolin处理的cAMP含量-溶剂处理的cAMP含量)。相关的% control数据用平均值±标准误（Means±S.E.M.）表示。药物剂量效应关系用非线性回归模型统计，利用统计软件GraphPad Prism 5.0版本，分别计算出该类阿片与NPFF受体的多靶点多肽对Forskolin引起的细胞内cAMP 的积累抑制的EC50值，实验结果见表3。
在稳定表达Mu-阿片受体的HEK293细胞系中，化合物1-9都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累。说明化合物1-9对Mu-阿片受体都具有激动活性。在稳定表达Kappa-阿片受体的HEK293细胞系中，除化合物7和化合物8外，其他化合物都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累。说明化合物1-6、9对Kappa阿片受体都具有激动活性。在稳定表达Delta-阿片受体的HEK293细胞系中，化合物1-9都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累，说明化合物1-9对Delta-阿片受体都具有激动活性。在稳定表达NPFF1受体的HEK293细胞系中，化合物1-5和化合物9都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累。说明化合物1-5和化合物9对NPFF2受体受体都具有激动活性。化合物6-8对NPFF2受体受体都具有弱的激动作用而无法测出其完整的量效曲线，无法计算出其EC50值。在稳定表达NPFF2受体的HEK293细胞系中，化合物1-9都能够剂量依赖地抑制forskolin引起的cAMP积累。说明化合物1-9对NPFF2受体都具有激动活性。化合物1-9对这5种受体在cAMP功能检测实验中的EC50值如表3所示。综上所述，化合物1-9对阿片和NPFF系统的多种受体都具有激动作用，是一类阿片和NPFF受体的多靶点多肽。
2、光热甩尾镇痛实验
通过侧脑室、鞘内以及腹腔注射药物后，利用小鼠光热甩尾实验进行在体痛觉调节活性的检测。
（1）给药方式
小鼠的侧脑室给药需提前进行小鼠的侧脑室埋管手术，以保证药物注射位点的准确性。利用脑立体定位仪进行小鼠的侧脑室埋管。昆明系雄性小鼠，体重21 ± 2 g；脑立体定位仪为江湾I型。小鼠用戊巴比妥钠麻醉（i.p, 80 mg/kg小鼠体重）后，将小鼠头部手术区剪去毛发，置于脑立体定位仪上固定后，手术区用碘伏消毒，沿矢状缝切开头皮，露出颅骨，找到前囟位置。从前囟向后3 mm，向左/右1 mm，即为侧脑室的上方位置。自制不锈钢管（24-gauge的一段，上面接一小段PE-10管）按上述位置向下插入3 mm，即为侧脑室。一段不锈钢琴弦（28-gauge）插入到上述钢管中，以防止脑脊液外溢和外界杂物感染及堵塞钢管。用医科牙托粉和胶水固定钢管，凝固后，缝合伤口。手术后，小鼠恢复4天，第5天开始后续实验。实验中涉及到的手术器械、不锈钢管等均需在手术前消毒。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物，然后用1 μl 生理盐水冲洗钢管。
脊髓水平给药采用清醒小鼠鞘内注射法，具体操作参考Hylden和Wilcox已报道的方法（Eur. J. Pharmacol. 1980, 67: 313）。将25 μL微量进样器直接插入到L5和L6之间的蛛网膜下腔。蛛网膜被刺破时伴随着小鼠猛烈而明显的甩尾动作或者尾巴呈“S”形，生理盐水或药物以5 μl/10秒的速率注射至蛛网膜下腔中。
腹腔给药使用1 mL注射器直接注射，注射体积为10 μl/g体重。注射时，左手持小鼠使其腹部朝上，头低尾高。取腹中线的一侧,使注射器针孔向上，针尖以小于20度的方向刺入皮下，贴腹壁向小鼠头部方向稍推进针头，再以45度方向刺入腹腔，回抽确认没有刺入血管或肠道后缓慢推出药液。
（2）小鼠光热甩尾实验
使用昆明系雄性小鼠，利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响。环境温度控制在22 ± 1℃，实验动物可自由进食、饮水。给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后不同时间点的甩尾潜伏期。为防止烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期，甩尾时间超过10秒均以10秒来计。
（3）计算药物镇痛作用的MPE和ED50值
痛觉调节作用利用最大可能效应MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）=100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别以最大镇痛效应时间点的MPE（％）值计算出它们镇痛的ED50值和95%的置信区间。
侧脑室给药后对光热引起的急性痛的镇痛作用的ED50如表4所示，在小鼠甩尾模型中，所有这9种化合物侧脑室给药后都能对急性热痛产生显著地镇痛效果。除化合物1外，其它8种化合物的镇痛都低于1 nmol，尤其是化合物9的镇痛ED50值只有16.3 pmol，为BN-9（0.39 nmol, ZL201210098832.2）的23.9倍。
另外，我们进一步的研究了化合物9在脊髓和系统水平给药时的镇痛作用，结果如图1和图2所示。鞘内给化合物9对光热引起的急性痛能够产生剂量依赖地镇痛作用，其镇痛ED50值为1.33 pmol，并且在5 pmol时最大镇痛MPE值为94.7%，为BN-9（0.29 nmol,ZL201210098832.2）的218倍。腹腔给化合物9对光热引起的急性痛也能够产生剂量依赖地镇痛作用，其镇痛ED50值为26.58 mg/kg。
3、镇痛耐受实验
小鼠侧脑室连续八天注射药物，利用光热甩尾法检测它们的镇痛耐受现象，进一步探讨本发明所涉及的化合物在镇痛耐受方面的药理学活性。
（1）小鼠的痛觉耐受实验方法
昆明系雄性小鼠，侧脑室连续注射药物六天，每天注射一次，利用光热甩尾仪来检测药物连续注射对痛觉作用的影响。环境温度控制在22 ± 1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室连续6天注射检测药物，每次注射4 μl。第一天药物注射前测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。实验中记录第一天和第六天给药之后5、10、15、20、30 min的甩尾潜伏期。为防止小鼠尾巴烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期。
（2）耐受实验数据统计
实验数据用MPE（maximum possible effect）表示，MPE（%）=100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。药物的镇痛耐受作用利用相关药物最大镇痛效应时间点的MPE值来进行比较。MPE数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，小鼠六天镇痛作用的差异使用成对T检验进行统计， ***P < 0.001表示与第一天注射该药物的镇痛作用相比有显著性差异。实验结果如图3所示。
每组小鼠为7-10只，盐水组为空白对照组，侧脑室注射药物剂量分别为该药物的3倍ED50，而4 nmol吗啡能产生相当的镇痛作用。图3的实验数据表明，小鼠连续六天侧脑室注射盐水后，小鼠都不产生镇痛活性。与盐水对照组相比，第一天侧脑室注射化合物1-9和吗啡后都显著地延长了小鼠的甩尾潜伏期。小鼠连续侧脑室注射吗啡六天，其诱导的镇痛作用从第一天的86.97%降为36.15%，说明连续侧脑室注射吗啡能够显著地引起镇痛耐受。与吗啡相比，连续侧脑室注射化合物1-9六天后，其镇痛的MPE值与第一天相比没有明显的变化，说明化合物1-9都不产生镇痛耐受现象，可有效避免阿片类镇痛药物常见的耐受副作用。
4、化合物9在福尔马林模型痛中的镇痛作用
（1）小鼠福尔马林痛的检测方法
将小鼠放入透明的有机玻璃盒中（20 × 20 × 30 cm），适应环境10-15 min；下面放置倾斜30度的镜子，以便于观察小鼠的足部反应。适应结束后，小鼠侧脑室、鞘内或腹腔给药。给药5 min后，在小鼠右后脚掌的足趾皮下注射20 μL 5%的福尔马林溶液，迅速放回观察盒中。开始计时，分别记录小鼠注射福尔马林溶液后0-5 min及15-30 min内小鼠舔、咬、抖被注射足时间。
（2）福尔马林痛实验数据统计
实验数据用MPE（maximum possible effect）表示，MPE(%) = 100 × [(盐水组舔足时间－药物组舔足时间)/盐水组舔足时间]。相关的MPE数据用平均值±标准误（Means ±S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图4-6。
盐水组为空白对照组，每组动物数为8-9只。福尔马林痛第一相痛为化学刺激引起的急性痛，第二相为炎性疼痛。如图4-6所示，小鼠侧脑室、鞘内以及腹腔注射化合物9都能剂量依赖地抑制福尔马林诱导的第一相急性痛和第二相炎症痛，从而表明化合物9在治疗化学刺激痛和炎症痛方面具有潜在的应用价值。
ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPadPrism 5.0版本，分别以MPE(%)值计算出它们在侧脑室注射诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间。相关数据如表5所示。
表5的结果表明侧脑室注射化合物9的在福尔马林第一相痛和第二相痛中的镇痛ED50值分别为18.8 和103.4 pmol，而侧脑室注射BN-9在福尔马林痛第一相痛和第二相痛中的镇痛ED50值分别为0.12和1.14 nmol（Br J Pharmacol. 2016, doi: 10.1111/bph.13489）。根据福尔马林痛的ED50值可算出，化合物9在福尔马林痛第一相痛和第二相痛中的镇痛作用分别为BN-9的6.3倍和11.0倍。
5、化合物9在醋酸扭体的内脏痛模型中的镇痛作用
（1）小鼠醋酸扭体实验的检测方法
将小鼠放入透明的有机玻璃盒中（20 × 20 × 30 cm），适应环境10-15 min；适应结束后，鞘内或腹腔注射化合物9给小鼠待检测药物。5 min后，小鼠腹腔注射10 ml/kg 0.6%的醋酸溶液。腹腔给醋酸溶液5 min后开始记录小鼠的扭体反应，记录10 min。小鼠出现躯干伸长扭曲、腹部内凹、臀部抬高，后肢伸张等特征性反应，记为一次扭体反应。
（2）醋酸扭体实验数据统计
实验数据用MPE（maximum possible effect）表示，MPE（%）=100×[（生理盐水组扭体数-药物组扭体数）／生理盐水组扭体数]。相关的MPE数据用平均值±标准误（Means ±S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图7-8。
盐水组为空白对照组，每组动物数为8-9只。如图7-8所示，小鼠鞘内和腹腔注射化合物9都能剂量依赖地对腹腔注射醋酸溶液诱导的内脏痛产生镇痛作用。说明化合物9在治疗内脏痛中具有潜在的应用价值。
ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPadPrism 5.0版本，分别以MPE（％）值计算出它们在侧脑室注射诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间。相关数据如表6所示：
6、化合物9在手术后痛模型中的镇痛作用
（1）小鼠手术后痛的检测方法
小鼠手术后痛主要使用电子Von Frey触痛仪检测，首先测定正常小鼠的基础痛阈值，然后将小鼠用异氟烷吸入麻醉。背部朝上，并将小鼠右后脚固定，用碘液消毒，距脚踝2 mm处用11号刀片切开5 mm的纵向切口，露出跖肌、血管和筋膜，用4-0的手术缝合线和小号缝合针将伤口缝合，涂上红霉素软膏。术后6 h测小鼠手术足的机械痛敏值，然后鞘内或腹腔给化合物9，记录给药之后不同时间点机械痛阈值。
（2）手术后痛的数据统计
实验数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P <0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图9-10。
ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。首先计算出最大镇痛效应MPE（maximum possible effect），MPE(%)=100×[（给药物后痛阈值-手术后痛敏值）/（基础痛阈值-手术后痛阈值）]。然后利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别以MPE(%)值计算出它鞘内和腹腔给药后诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间。
盐水组为空白对照组，每组动物数为8-9只。如图9-10所示，小鼠鞘内和腹腔注射化合物9都能剂量依赖地对小鼠手术后痛产生镇痛作用。化合物9鞘内和腹腔给药后对小鼠手术后痛镇痛的ED50值分别为 8.63 (6.70-11.11) pmol 和 26.15 (22.62-30.23) mg/kg。说明化合物9在治疗手术痛中具有潜在的应用价值。
7、化合物9在角叉藻多糖炎症痛模型中的镇痛作用
（1）小鼠角叉藻多糖诱导的炎症痛的检测方法
小鼠角叉藻多糖诱导的炎症痛主要使用热刺痛仪检测，首先测定正常小鼠的基础痛阈值。然后在小鼠足跖皮下注射20 μl 2%的Carrageenan溶液。24小时后测小鼠被注射足的热痛敏值，然后侧脑室或鞘内给化合物9，记录给药之后不同时间点热痛阈值。
（2）角叉藻多糖诱导的炎症痛的数据统计
实验数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P <0.001 表示药物处理组的热痛阈值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图11-12。
ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。首先计算出最大镇痛效应MPE（maximum possible effect），MPE（%）=100×[（给药物后痛阈值-注射足痛敏值）/（基础痛阈值-注射足痛敏值）]。然后利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别以MPE（％）值计算出它鞘内和腹腔给药后诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间。
盐水组为空白对照组，每组动物数为8-9只。如图11-12所示，小鼠侧脑室和鞘内注射化合物9都能剂量依赖地对小鼠交叉藻多糖诱导的炎症痛产生镇痛作用。其镇痛的ED50值分别为5.20 (2.06-13.10) pmol 和 2.98 (2.50-3.54) pmol。说明化合物9在治疗炎症痛中具有潜在的应用价值。
8、化合物9在神经痛模型中的镇痛作用
（1）小鼠CCI神经痛模型的检测方法
小鼠神经痛主要采用坐骨神经慢性压迫模型（CCI），检测方法使用热刺痛仪和电子VonFrey触痛仪同时检测热痛和机械痛，首先分别测定正常小鼠热痛和机械痛的基础痛阈值。然后用戊巴比妥钠麻醉（i.p, 80mg/kg小鼠体重）麻醉小鼠，俯卧位固定小鼠。暴露右侧坐骨神经，使用4-0铬制肠线环绕坐骨神经做3个轻度结扎环，间隔1 mm。结扎强度以右后小腿轻微颤抖为宜。手术后第10天，测定小鼠右后足的热痛敏值，然后鞘内给化合物9，记录给药之后不同时间点热痛阈值。手术后第11天，测定小鼠右后足的机械痛敏值，然后鞘内给化合物9，记录给药之后不同时间点热痛阈值。
（2）CCI小鼠神经痛的数据统计
实验数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P <0.001 表示药物处理组的热痛阈值或机械痛阈值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图13-14。
ED50值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。首先计算出最大镇痛效应MPE（maximum possible effect），MPE（%）=100×[（给药物后痛阈值-手术侧后足痛敏值）/（基础痛阈值-手术侧后足痛敏值）]。然后利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别以MPE(%)值计算出鞘内给药后诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间。
盐水组为空白对照组，每组动物数为8-9只。如图13所示，小鼠鞘内注射化合物9能剂量依赖地对坐骨神经慢性压迫诱导的神经痛模型中热痛敏产生镇痛作用。其镇痛的ED50值为 1.74 (1.38-2.20) pmol。如图14所示，小鼠鞘内注射化合物9能剂量依赖地对坐骨神经慢性压迫诱导的神经痛模型中机械痛敏产生镇痛作用。其镇痛的ED50值为 1.11 (0.63-1.96) pmol。说明化合物9在神经痛治疗中具有潜在的应用价值。
9、化合物9和吗啡在交叉藻多糖诱导的炎症痛中的镇痛耐受和交叉耐受的检测
（1）小鼠角叉藻多糖诱导的炎症痛镇痛耐受的检测方法
小鼠角叉藻多糖诱导的炎症痛主要使用热刺痛仪检测，首先测定正常小鼠的基础痛阈值。然后在小鼠足跖皮下注射20 μl 2%的Carrageenan溶液。24小时后测小鼠被注射足的热痛敏值，然后侧脑室给化合物9或吗啡，连续六天给药，第七天化合物9组给吗啡，吗啡组给化合物9。记录给药之后不同时间点热痛阈值。
（2）角叉藻多糖诱导的炎症痛的数据统计
实验数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）表示不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行数据的统计和分析，***P <0.001 表示药物处理组的热痛阈值与第一天之间存在显著性差异。实验结果见图15。
盐水组为空白对照组，每组动物数为10只。如图15所示，小鼠侧脑室连续注射吗啡从第四天开始镇痛作用显著减小，产生镇痛耐受。与吗啡相比，连续侧脑室注射化合物9六天后，其镇痛作用与第一天相比没有明显的变化，说明化合物9在角叉藻多糖诱导的炎症痛中也不会产生镇痛耐受现象。第七天，吗啡耐受的小鼠侧脑室给化合物9仍然产生与第一天给化合物9相当的镇痛作用；连续6天给化合物9的小鼠第七天侧脑室给吗啡同样产生与第一天相当的镇痛作用。表明化合物9在角叉藻多糖诱导的慢性炎症痛中不会产生镇痛耐受，另外化合物9和吗啡之间不存在交叉耐受现象。说明化合物9在阿片镇痛耐受的病人上可能仍具有高效的镇痛作用，在研发阿片镇痛药的替代镇痛药物中具有重要的应用价值。
10、化合物9对胃肠运动调节作用的检测
（1）小鼠的在体胃肠运动检测方法
昆明系雄性小鼠，体重26±2 g。在体胃肠运动检测选用常用的碳粉检测法。具体的实验过程为：胃肠运动实验前小鼠禁食16小时（禁食期间可随意饮水），然后脊髓注射药物，15分钟后将预先准备好的活性炭悬浮液（一种含5%活性炭和10%阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液）以每10克体重0.1 ml的体积经口灌注到胃。活性炭悬浮液灌注30分钟后，颈部脱臼处死动物，然后仔细地取出从幽门到盲肠的动物小肠。测量幽门到盲肠的小肠总长度以及活性炭悬浮液移动的最远距离。
（2）在体胃肠运动实验数据统计
胃肠运动实验结果用胃肠运动百分比来评价，每只小鼠的胃肠运动百分比通过活性炭悬浮液移动距离除以小肠总长度之后的百分比来计算。相关的数据用胃肠运动百分比的平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行数据统计和分析。实验结果如图16所示。
在图16中，生理盐水组为空白对照组，鞘内给化合物9的药物剂量为100、300和500pmol，每组小鼠数为8-9只。实验结果表明，空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为66.75%，鞘内注射100、300和500 pmol的化合物9的胃肠运动百分比分别为45.71%、31.40%和21.67%。只有300 pmol以上才会对胃肠运动产生显著的抑制作用。因此，在有效镇痛剂量范围内，化合物9无便秘的副作用。
11、化合物9心血管调节作用的检测
（1）大鼠血压的检测方法
Wistar 雄性大鼠，体重200-250 g。乌拉坦（1.3 g/kg）麻醉后，切开气管以防止窒息。分离股动脉，插入PE-10动脉插管，插入深度大约为2cm。动脉插管连接压力换能器PT-100，PT-100连接到生物机能实验BL-420F系统记录平均动脉压和脉动动脉压。将另外一段PE-10管从腰椎L4 - L5处插入，沿蛛网膜下腔向上插入3 cm到达脊椎T12 - L1处，用于鞘内给药。手术结束后，让大鼠恢复稳定30 min。然后鞘内给生理盐水或不同剂量的药物，药物剂量由小到大，每次给药间隔40 min以上。记录给药后大鼠血压的变化。
（2）大鼠血压调节数据统计
大鼠心血管调节实验结果用血压的改变值来表示，相关的数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-wayANOVA的Bonferroni检验）进行数据统计和分析。实验结果如图17所示。
在图17中，生理盐水组为空白对照组，鞘内给化合物9的药物剂量为1、3、10和30nmol每组大鼠数为5只(通过体重换算表换算为小鼠剂量分别为140、420、1400和4200pmol)。实验结果表明，与生理盐水组相比，鞘内注射1 nmol以上剂量的化合物9会产生显著的降血压的作用。但是此剂量远远大于镇痛剂量。因此，在有效镇痛剂量范围内，化合物9不会对心血管系统产生副作用。
12、化合物9体温调节作用的检测
（1）小鼠体温的检测方法
将小鼠用Rosow et al. (1980)描述的方式进行固定。环境温度控制在21±0.5℃，实验在上午10点至下午2点间进行。将连接在生物机能实验BL-420F系统中的温度传感器插入小鼠直肠2.5 cm处用来记录直肠温度。分别记录鞘内给药前及给药后10、20、30、40、50、60分钟的体温。
（2）小鼠体温数据统计
小鼠体温调节实验结果用基础体温和给药后体温的差值表示，相关的数据用平均值±标准误（Means ± S.E.M.）来表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行数据统计和分析。实验结果如图18所示。
在图18中，生理盐水组为空白对照组，鞘内给化合物9的药物剂量为100、300和500pmol每组小鼠数为9-14只。实验结果表明，与生理盐水组相比，只有鞘内注射500 pmol剂量的化合物9才会产生显著的降体温的作用。因此，在有效镇痛剂量范围内，化合物9在体温调节方面无明显作用。
综上所述，本发明多靶点多肽化合物1-9具有极强的中枢镇痛活性，并且全部都不会产生镇痛耐受的副作用。化合物9在急性热痛、化学刺激痛、内脏痛、手术后痛、炎症痛和神经痛等不同模型痛中均具有极强的镇痛作用。并且化合物9在有效镇痛剂量范围内，不产生便秘副作用，并对心血管和体温无明显的调节作用。因此，化合物9在高效、低副作用镇痛药物制备中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为小鼠鞘内注射化合物9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图2为小鼠腹腔注射化合物9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线；
图3为小鼠连续六天侧脑室注射化合物1-9所产生的镇痛作用的变化；
图4为小鼠侧脑室注射化合物9在福尔马林致痛小鼠中所产生镇痛作用；
图5为小鼠鞘内注射化合物9在福尔马林致痛小鼠中所产生镇痛作用；
图6为小鼠腹腔注射化合物9在福尔马林致痛小鼠中所产生镇痛作用；
图7为小鼠鞘内注射化合物9对腹腔注射醋酸溶液诱导的内脏痛的镇痛作用；
图8为小鼠腹腔注射化合物9对腹腔注射醋酸溶液诱导的内脏痛的镇痛作用；
图9为小鼠鞘内注射化合物9对术后疼痛的镇痛作用；
图10为小鼠腹腔化合物9对术后疼痛的镇痛作用；
图11为小鼠侧脑室注射化合物9对交叉藻多糖诱导的炎症痛的镇痛作用；
图12为小鼠鞘内注射化合物9对交叉藻多糖诱导的炎症痛的镇痛作用；
图13为小鼠鞘内注射化合物9对神经痛CCI模型热痛的镇痛作用；
图14为小鼠鞘内注射化合物9对神经痛CCI模型机械痛的镇痛作用；
图15为小鼠侧脑室注射化合物9和吗啡在交叉藻多糖诱导的炎症痛中的镇痛耐受和交叉耐受；
图16为小鼠鞘内注射化合物9对胃肠运动的作用；
图17为小鼠鞘内注射化合物9对心血管系统的调节作用；
图18为小鼠鞘内注射化合物9对体温调节系统的调节作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明中多靶点多肽1-9的合成方法。
仪器：高效液相色谱仪（HPLC）为Waters公司的Delta 600；分析柱：XBridge TM BEH 130Prep C18，4.6 mm×250mm；制备柱：XBridge TM BEH 130 Prep C18，19 mm×250mm。质谱仪为Mariner ESI-TOF MS, Applied Biosystems, CA。手动固相多肽合成仪，由本实验室设计后由玻璃工制作（合成仪的设计原理具体参考Chen WC和White PD所编的《Fmoc solid phasepeptide synthesis》中第14页图4，并在其基础上作了部分改进，即用以机械搅拌方式替代鼓氮气法，从而达到反应溶液充分混合的目的）。试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin（1%DVB，200 ~400 mesh，取代值S = 0.43 mol/g resin），购自天津南开和成公司。N -α-Fmoc保护的氨基酸（Fmoc-Aa/Boc-Aa）、N -羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N ,N ,N' , N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）、二异丙基乙胺（DIEA）和三异丙基硅烷（TIS）购自吉尔生化（上海）有限公司。茚三酮为上海试剂三厂产品。二氯甲烷（DCM）、N ,N -二甲基甲酰胺（DMF）、六氢吡啶（哌啶）、甲醇（MeOH）和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸（TFA）、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。
实施例一、 化合物1的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶、DBU、DMF的混合溶液（三者的体积比为1:1:98），搅拌5 min后抽干，重复3次后抽干。最后加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复4次，得到脱除Fmoc基团保护的树脂样品。
（3）茚检：按以下顺序加入试管中：树脂样品、0.1 ml试剂①、0.2ml试剂②、0.1 ml试剂③，沸水浴3-10 min后观察。溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全。用于茚检的三种试剂的配方为：试剂① 80 g苯酚/20ml乙醇；试剂② 2.0 ml的0.001 M氰化钾（水）/ 98ml吡啶；试剂③ 5 g 茚三酮/100 ml乙醇。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍摩尔量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-NMe-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂NMe-Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂NMe-Tyr(tBu)- D-Ala- Gly-Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末201.6mg，产率为69.4%。
（7）粗肽的脱盐和纯化；将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得纯化的化合物1样品，其纯度为99.5%，其合成的总产率为22.81 %。质谱和色谱分析检测结果如表2所示。
实施例二、化合物2的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-NMe-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- NMe- Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- NMe-Phe- Gln(Trt)- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末273.1mg，产率为81.0%。
（7）脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130 Prep C18，19mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得纯化的化合物的2样品，纯度为95.65%，合成的总产率分别为10.8 %。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例三、化合物3的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍摩尔量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala-Gly- Phe- Gly- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）化合物3的肽链从树脂上的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe- Gly- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末297.9 mg，产率为95.5%。
（7）化合物3的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得纯化的化合物3样品，纯度为96.06%，合成的总产率分别为16.06 %。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例四、化合物4的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala-Gly- Phe- Leu- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链从树脂上的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly-Phe- Leu- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末181.5 mg，产率为64.2%。
（7）粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到纯化的化合物4样品，纯度为99.15%，合成的总产率分别为38.6%。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例五、化合物5的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala-Gly- Phe- Met- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe-Met- Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。化合物5的粗肽粉末为311.8 mg，产率为93.3%。
（7）粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得纯化的化合物5样品，纯度为99.33%，合成的总产率分别为54.39%。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例六、化合物6的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe- D-Met - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe-D-Met - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末165.9 mg，产率为57.7%。
（7） 粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得纯化的化合物6样品，纯度为99.18%，合成的总产率分别为28.62%。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例七、化合物7的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe- D-Leu - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-Pro-Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末172.6 mg，产率为61.1%。
（7）粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到纯化的化合物7样品，纯度为99.79%，合成的总产率分别为33.48%。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例八、化合物8的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg取代值为0.43 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Phe-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe- D-Ala - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin。
（6）肽链的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- Phe-D-Ala - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Phe-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末177.4 mg，产率为65.2%。
（7）粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到纯化的化合物8样品，纯度为98.78%，合成的总产率分别为35.36%。质谱和色谱分析检测结果见表2。
实施例九、化合物9的合成
（1）树脂预处理：称取600 mg 取代值为0.5 mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。
（2）脱除Fmoc基团保护：同实施例一。
（3）茚检：同实施例一。
（4）氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐以1:1:1的摩尔比完全溶解于DMF中，再加入Fmoc-Ala-OH两倍量的二异丙基乙胺（DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂（Fmoc-Phe-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔比为1:2.5）加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。按照步骤（2）脱除Fmoc保护基团，再按照步骤（3）茚检，溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全，得脱除Fmoc保护基团的肽树脂。
（5）肽链的延伸：将步骤（4）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（4）的工艺依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc- Gly -OH、Fmoc-NMe-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH的缩合，得到肽树脂Tyr(tBu)-D-Ala- Gly- NMe-Phe- Gly - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Ala-Resin。
（6）肽链从的切割：肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，tBu、Trt和Pbf保护基团在切割剂TFA的酸性条件下可脱除，因此，最后无需脱除直接进行切割。按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽树脂Tyr(tBu)- D-Ala- Gly- NMe-Phe- Gly - Pro- Gln(Trt)- Arg(Pbf)- Ala-Resin置于反应器中，加入切割剂（由TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的体积比混合而成，每克肽树脂加入18ml的切割剂），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末308.5mg，产率为97.51%。
（7）粗肽的脱盐和纯化：将全部粗产物分批溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm），流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥。再用反相向高效液相色谱（HPLC）C18柱（XBridge TM BEH 130Prep C18，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到纯化的化合物9样品，纯度为97.49%，合成的总产率分别为32.28%。质谱和色谱分析检测结果见表2。

Claims (12)

1.一类阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，其结构通式如下：
Xaa1-D-Ala-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2
其中Xaa1为Tyr或NMe-Tyr；Xaa2为Phe或NMe-Phe；Xaa3为Gln、Gly、Leu、Met、D-Met、D-Leu或D-Ala。
2.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，Xaa1为NMe-Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Gln时，多靶点多肽的序列为NMe-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
3.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物2：Xaa1为Tyr，Xaa2为NMe-Phe，Xaa3为Gln时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-NMe-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
4.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物3：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Gly时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Gly- Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
5.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物4：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Leu时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
6.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物5：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为Met时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
7.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物6：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Met时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Met-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
8.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物7：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Leu时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu -Pro-Gln- Arg-Phe-NH2。
9.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物8：Xaa1为Tyr，Xaa2为Phe，Xaa3为D-Ala时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Ala-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
10.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽，化合物9：Xaa1为Tyr，Xaa2为NMe-Phe，Xaa3为Gly时，序列为Tyr-D-Ala-Gly-NMe-Phe-Gly-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2。
11.根据权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽的合成方法，包括以下工艺步骤：
. 多肽的合成
.树脂预处理：Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；最后加入DMF洗涤；
.脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入体积比为1:1:98的六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、DMF的混合溶液，搅拌反应5 min后抽干，重复3次；最后加入DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；
. 氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护氨基酸Fmoc-AA-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加到步骤.所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤.的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；
Fmoc-AA-OH与脱除Fmoc基团保护的树脂的摩尔量为1:2~1:5；
N-α-Fmoc保护氨基酸Fmoc-AA-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐及二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2；
.肽链的延长
根据多肽的结构设计，从C端开始依次选择N-α-Fmoc保护的氨基酸，并将步骤. 所得脱除Fmoc保护基团的树脂按步骤.的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂；
.肽链从树脂上的切割：将步骤.iv所得肽树脂用DCM、MeOH交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀；吸除上清液，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末；
切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95 : 2.5 : 2.5的体积比混合形成的溶液；切割剂的加入量为每克肽树脂加入18ml的切割剂；
. 多肽的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到多靶点多肽产品。
12.权利要求1所述阿片和神经肽FF受体的多靶点多肽在制备高效、低副作用镇痛药物中的应用。
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