CN106083962B

CN106083962B - 一种具有环磷酰胺结构的化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN106083962B
Application number: CN201610402515.3A
Authority: CN
Inventors: 黄浩喜; 董研君; 刘冠锋; 吴鲜财; 杜振军; 陈垌珲; 李英富
Original assignee: CHENGDU BRILLIANT PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Chengdu Beite Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2036-06-08
Also published as: CN106083962A

Abstract

本发明公开了一种具有环磷酰胺结构的化合物，可用于治疗哺乳动物的丙型肝炎感染。本发明还公开了该化合物的制备方法，采用亚磷酸二苯酯为原料，引入磷原子，再通过脱保护基、自身环化而合成环磷酰胺结构。

Description

一种具有环磷酰胺结构的化合物及其制备方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种具有环磷酰胺结构的化合物及其制备方法。

背景技术

丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎、丙肝)是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎。丙肝病毒基因组含10个基因，编码膜蛋白E1与E2、核心蛋白、p7与非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构基因NS5B聚合酶是由1773个碱基编码成591个氨基酸构成。NS5B RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),负责HCV的RNA链的复制，有效抑制阻止了双链HCV RNA的形成，在病毒基因复制、丙肝病毒在宿主细胞中的增殖是绝对必需的，因而也是治疗HCV的药物靶标。

以病毒聚合酶为靶标的核苷类抑制剂都需要在感染细胞内经三磷酸化作用，生成活化形式而起效，即相继经核苷激酶、磷酸核苷激酶和二磷酸核苷激酶催化，生成三磷酸核苷而抑制聚合酶，导致基因的致死合成。所以核苷类药物需要经过体内活化。根据磷酸基团高电负性的特点,一方面是改善药物的转运以克服透膜性差的特点,另一方面利用磷酸基团极性大的特点引入到水溶性差的药物分子中改善药物溶解性。使得药物到达靶标后的浓度提升,药物稳定性更好，口服生物利用度有所提高。

目前第一个获得FDA批准上市的用于丙型肝炎全口服治疗丙肝方案的药物索非布韦是全球首个无需同时使用干扰素即可实现全口服治疗丙肝的药物，是目前唯一的以NS5B聚合酶为靶点的上市药物，被医学界视为治疗丙型肝炎的突破性药物。其主要作用机制是经体内酶代谢为活性成分三磷酸尿苷形式，通过抑制丙肝病毒RNA聚合酶NS5B发挥抗病毒作用，但在给药过程中，依然存在体内不稳定、易被代谢、生物利用度低(仅仅10％～20％)、剂量太大(400mg/天)、药代特性差等问题。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种具有环磷酰胺结构的化合物，可用于治疗哺乳动物的丙型肝炎感染。

本发明的第二目的在于提供上述具有环磷酰胺结构化合物的制备方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种通式(I)所示的具有环磷酰胺结构化合物：

或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，

其中，

式中R₁为R₂为氢原子。

进一步地，所述式(I)中，当R₁为时，R₂为

本发明式(I)所述具有环磷酰胺结构化合物，

当R₁为时，R₂为氢原子,所述式(I)化合物的合成路线如下：

进一步地，本发明式(I)所述具有环磷酰胺结构化合物，当R₁为时，R₂为所述式(I)的合成路线，如下：

本发明提供的具有环磷酰胺结构的化合物及其制备方法，具有以下有益效果：

(1)本发明提供的具有环磷酰胺结构的尿嘧啶核苷酸类化合物是RNA病毒复制的抑制剂，并且可以用作HCV NS5B聚合酶抑制剂、HCV复制的抑制剂以及用于治疗哺乳动物的丙型肝炎感染，具有广阔的应用前景。

(2)本发明所提供的制备具有环磷酰胺结构的尿嘧啶核苷酸类化合物的方法。本方法通过亚磷酸二苯酯为桥梁引入磷原子，最后通过自身环化的方法得到环磷酰胺，原料便宜易得，实验易操控，避免使用三氯氧磷为原料，生产过程更安全，具有显著的工业化优势。

具体实施方式

下面通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但本发明保护范围并不局限于这些实施例。凡基于上述技术思想，利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、替换、变更均属于本发明要求保护的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制作厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

本发明通过HNMR和LC-MS来确定化合物的结构。

HNMR测定是用Bruker 400(400MHz)spectrometer，1H化学位移以ppm单位给出，测定溶剂为氘代氯仿或者氘代DMSO，内标为四甲基硅烷，化学位移以ppm作为单位给出。

LC-MS测定是用Agilent1290-6530液质联用仪，采用带有安捷伦喷射流技术的大气压电喷雾离子源。色谱条件是：色谱柱是Agilent C18(4.6mmx12.5mmx5um)，流速0.2ml/min，柱温30℃，检测波长254nm和214nm，进样量1ul，

梯度洗脱：A相：水；B相：乙腈

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	80	20
4	10	90
			5	80	20
8	80	20

薄层硅胶使用GF254硅胶板。

柱层析使用烟台黄海硅胶200-300目硅胶为载体。

术语

本发明所涉及的缩写具有如下所示的意义：DMSO表示二甲基亚砜；DMF表示N,N-二甲基甲酰胺；LDA表示二异丙基氨基锂；LHDMS表示二(三甲基硅基)氨基锂；LAH表示氢化铝锂；DCM表示二氯甲烷；TEA表示三乙胺；TFA表示三氟乙酸；THF表示四氢呋喃；EA表示乙酸乙酯；MeOH表示甲醇；DIEA表示N,N二异丙基乙胺，(BOC)₂O表示二碳酸二叔丁酯；DCC表示二环己基碳二亚胺；DMAP表示4-二甲氨基吡啶；Cbz表示苄氧羰基；Fomc表示笏甲氧羰基；Trt表示三苯甲基；Bn表示苄基；MTBK表示7-甲基-1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯；TBS表示叔丁基二甲基硅基；i-PrOH表示异丙醇；TBAF表示四丁基氟化铵；TBSCl表示叔丁基二甲基氯硅烷；Mim表示咪唑；Boc表示叔丁氧羰基；DBN表示1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯、DBU表示1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、MTBD表示7-甲基-1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯。

实施例1：1-((2S,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-3-甲基-5-(((2-氧-4-苯基-1,3,2-氧氮磷杂环已烷-2-基)氧)甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(1)的制备

具体合成步骤如下所示：

步骤1：1-((2S,3R,4R,5R)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧)-5-(((叔丁基二甲基硅基)氧)甲基)-3-氟-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(SF-2)的制备

在室温条件下，向1-((3R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(SF-1)(10.4g,40mmol)和咪唑(8.2g,120mmol)的DMF溶液(200mL)中慢慢滴加TBSCl(9.0g,60mmol)的DMF溶液(25mL)。反应体系于50℃搅拌6h，TLC显示反应完成后，冷至室温，加入水150mL萃灭反应，EA萃取(100mLx 4)。合并有机相用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸发得大约20g粗品目标化合物SF-2为白色固体，无需纯化直接进入下一步反应。

步骤2:1-((2S,3R,4R,5R)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧)-3-氟-5-(羟甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(SF-TBS)的制备

室温条件下，向上述1-((3R)-4-((叔丁基二甲基硅基)氧)-5-(((叔丁基二甲基硅基)氧)甲基)-3-氟-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(SF-2)粗品(约20g)的THF溶液(150mL)中滴加Cl₃CCOOH(19.5g,0.12mmol)的水溶液(5mL)。反应混合物在室温下搅拌过夜，TLC显示反应完成之后，加入水150mL萃灭反应，EA萃取(80mLx 4)。合并有机相用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸发后通过色谱法(DCM：MeOH＝50:1)纯化得到12.0g目标化合物，为白色固体，产率为80.0％。

1HNMR(400MHz,CDCl3)δ0.15(6H,s),0.90(9H,s),1.28-1.38(3H,m),2.06(1H,brs),3.81-3.84(1H,m),4.02-4.16(3H,m),5.75(1H,d,J＝8.0Hz),6.11(1H,d,J＝18.8Hz),7.85(1H,d,J＝8.0Hz),8.50(1H,brs).

步骤3:(3-羟基-1-苯丙基)甲酸叔丁醇(1b)的制备

在氮气保护冰浴条件下，向3-氨基-3-苯基-1-丙醇(1a)(3.02g,20mmol)和TEA(3.03g，30mmol)的THF混合溶液(15mL)中慢慢滴加(Boc)₂O(5.67g,26mmol)THF(10mL)。滴加完毕后撤去冰浴，反应混合物于室温搅拌12h，TLC显示原料反应完成以后，向反应体系用水(50ml)萃灭反应，并用乙酸乙酯(50ml×4)萃取，合并有机相并依次用稀1M HCl溶液洗涤(30ml×3)，饱和Na₂CO₃洗涤(50ml x2)，有机相用无水Na₂SO₄干燥，真空蒸发得4.5g目标化合物为白色固体，产率为90％。

1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ1.41(9H,s),1.75-1.88(2H,m),3.35-3.41(2H,m),4.55(1H,t,J＝5.0Hz),4.65-4.67(1H,m),7.24-7.42(5H,m).

EM(计算值)：251.15；MS(ESI)m/e(M+1Na)+：274.14.

步骤4:3-叔丁氧甲酰氨基-3-苯丙基(((1-((2S,3R,4R,5R))-3-((叔丁基二甲硅基)氧)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)亚磷酸酯(1c)的制备：

N2保护下，室温向亚磷酸二苯酯(2.81g,12mmol)的吡啶(10ml)溶液中慢慢滴加3-羟基-1-苯基氨基甲酸叔丁酯(1b)(2.26g,9mmol)的吡啶溶液(10ml),反应体系升温至45℃并搅拌1h。待反应体系恢复至室温后，冰浴条件下向上述反应体系中慢慢滴加1-(3R)-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)-3-氟-5-羟甲基-3-呋喃-2-基)嘧啶－2，4(1H，3H)二酮(SF-1)的吡啶溶液，滴加完毕后，撤去冰浴，反应恢复至室温，搅拌12h，TLC显示原料反应完成以后，真空蒸发后通过色谱法(DCM：MeOH＝70：1～50:1)纯化得到1.0g目标化合物，产率为36.7％。

1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ0.13(6H,s),0.88(9H,s),1.20-1.35(12H,m),1.92-1.97(2H,m),3.93-4.22(5H,m),4.34-4.36(1H,m),4.60-4.62(1H,m),5.65-5.62(1H,m),6.02-6.06(1H,m),7.22-7.33(5H,m),7.49-7.56(2H,m),11.55(1H,s).

EM(计算值)：671.30；MS(ESI)m/e(M+1Na)+：694.26

步骤5:3-氨基-3-苯丙基(((2R,3R,4R,5S)-3-((叔丁基二甲硅基)氧)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)亚磷酸酯(1d)的制备

在室温条件下，向装有3-叔丁氧甲酰氨基-3-苯丙基(((1-((2S,3R,4R,5R))-3-((叔丁基二甲硅基)氧)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)亚磷酸酯(1c)(900mg,1.34mmol)的DCM(50mL)溶液中滴加入TFA(5mL)。反应混合物搅拌于室温3h，TLC显示原料反应完成以后，减压浓缩至干得白色油状化合物800mg，产率：100％，无需进一步纯化，直接进入下一步反应。

步骤6:1-((3R)-4-((叔丁基二甲硅基)氧)-3-氟-3-甲基-5-(((2-氧-4-苯基-1,3,2-氧氮磷杂环已烷-2-基)氧)甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(1e)的制备

在冰浴条件下，将上述得到的3-氨基-3-苯丙基(((2R,3R,4R,5S)-3-((叔丁基二甲硅基)氧)-5-(2,4-二氧-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)亚磷酸酯(1d)(800mg，约1.40mmol,粗品)溶于THF(50ml)中缓慢滴加到TEA(3.5mL),CCl4(5mL),i-PrOH(5mL),THF(50mL)的混合溶液中。反应混合物于室温反应1h，TLC显示反应完成后生成两个新点，为一对顺反异构体化合物。反应体系直接经真空蒸发后通过快速色谱法(DCM：MeOH＝100：1～50:1)分别得到350mg上点化合物1e-式1和320mg下点化合物1e-式2，二者均为白色固体，总产率为88％。

步骤7：1-((2S,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-3-甲基-5-(((2-氧-4-苯基-1,3,2-氧氮磷杂环已烷-2-基)氧)甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(1)的制备

1、化合物1-式1(顺式)的制备

室温下，向1e-式1(顺式)(350mg,0.6mmol)的THF(15mL)溶液中加入TBAF(471mg,1.8mmol)，反应混合物于室温下搅拌1h。TLC显示原料反应完成后,浓缩至干，经真空蒸发后直接通过反相色谱法(水：乙腈＝20：1～50：1)纯化得200mg目标化合物，为白色固体，收率78.4％。TBAF是四丁基氟化铵

2、化合物1-式2(反式)的制备

室温下，向1e-式2(反式)(320mg,0.56mmol)的THF(15mL)溶液中加入TBAF(445mg,1.7mmol)，反应混合物于室温下搅拌1h。TLC显示原料反应完成后,浓缩至干，经真空蒸发后直接通过反相色谱法(水：乙腈＝20：1～50：1)纯化得220mg目标化合物，为白色固体，收率86.3％。

实施例2-7：

实施例2-7是通过实施例1的合成路线，使用上述中间体2b、3b、4b、5b得到目标化合物，纯化都是通过反相制备得到的，反相制备条件如下：

1.分离溶剂：乙腈+水

2.分离条件：

B％(乙腈)	时间	流速(mL/min)
			5％	5min	20
5％-30％	15min	20
			30％-40％	15min	20
95％	5min	20

所用到的原料2a、3a、4a、5a通过下面的方法制备：

(1)xa-2的制备：

室温条件下，向起始原料芳基醛xa-1(1eq)的乙醇(约1.2mol/L)溶液中加入依次丙二酸二乙酯(1eq)、乙酸铵(1.5eq)。反应混合物在回流状态下开始反应，30分钟后有大量沉淀产生，继续回流过夜，TLC检测起始原料芳基醛消失。冷至室温，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤,真空干燥1h之后得到目标化合物，均为白色固体。

(2)xa的制备：

在冰浴氮气保护条件下，向AlLiH4(3eq)的THF溶液(约1.0mol/L)中慢慢滴加xa-2(1eq)的HTF溶液。之后撤去冰浴，反应体系在室温下搅拌过夜，TLC检测反应完成。于冰浴下慢慢滴加饱和NH4Cl溶液萃灭反应，EA萃取三次，合并有机相在无水Na2SO4下干燥，真空蒸发后通过快速色谱法(PE：EA＝40：1～3:1)得到目标化合物。

将上述方法制备的2a、3a、4a、5a，用Boc保护氨基得到中间体2b、3b、4b、5b,具体数据如下：

采用实施例1的制备方法，将中间体1a分别替换为2b、3b、4b、5b时，制备得到实施例2-5所示的目标化合物。

实施例6的目标化合物6，是用实施例5制备的目标化合物5经如下反应制备而得：

实施例7所示的目标化合物7，是用实施例5制备的目标化合物5与丙酸反应制备而得：

实施例2-7目标化合物的结构及参数如下：

测试例：本发明化合物对丙肝病毒基因型1b复制子抑制活性的测试

该方法用来测定本发明化合物以及索氟布韦对丙肝病毒基因型1b复制子活性的抑制作用。

一、实验材料：HCV-1b细胞、DMSO(二甲基亚砜)、NS5B聚合酶抑制剂GS-7977、FBS(胎牛血清)购自Sigma公司。

二、实验步骤：

1、对化合物用DMSO配制成10mM的母液进行5倍稀释，8个浓度点(起始浓度为50000nm)，双复孔，加入96孔板中，细胞培养液中的DMSO最终浓度为0.5％。

2、将HCV-1b细胞悬浮在含10％FBS的培养液中，以每孔8000个细胞的密度种到含有化合物的96孔板中,细胞在5％CO₂、37℃条件下培养3天。

3、荧光素酶法测定化合物及索氟布韦抗丙肝病毒基因型1b复制子活性，在步骤1所得不同浓度下，受试化合物对荧光素酶活性的抑制值进行计算。应用GraphPad Prism软件计算化合物的EC50。

表1本发明的化合物对丙肝病毒基因型1b复制子的活性

结论：本发明具有环磷酰胺结构的化合物对丙肝病毒基因型1b复制子的活性具有明显的抑制效果，且抑制效果比已经上市的索氟布韦好。

Claims

1.一种通式(I)所示的具有环磷酰胺结构的化合物：

或非对映异构体，其中，

当R₁为时，R₂为氢原子，

当R₁为时，R₂为氢原子。

2.一种制备根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物的方法，其特征在于，当R₁为时，R₂为氢原子,所述式(I)化合物的合成路线如下：

3.一种制备根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物的方法，其特征在于，当R₁为时，R₂为所述式(I)化合物的合成路线如下：

4.根据权利要求1所述通式(I)所示的具有环磷酰胺结构的化合物或非对映异构体，在制备治疗丙型肝炎病毒所引起的疾病的药物中的用途。