CN103987712B - 2’，3’-二脱氧-2’-α-氟-2’-β-C-甲基核苷和其前药 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是满足前述需要。因为大部分的抗HN核苷类是2’,3’-二脱氧核苷类，该类已被证明是用于磷酸化的激酶的极好底物。2ˊ,3ˊ-二脱氧-2,-a-氟-2ˊ-{3-C-甲基-核苷类可以被视为一种独特类型的2’,3’-二脱氧核苷类，该类是激酶的良好底物，因为氟模拟氢。它也可以被视为整合入HCV的RNA的核糖-核苷类，因为2ˊ-氟-a模拟2ˊ-a-OH基。

Description

2’，3’-二脱氧-2’-α-氟-2’-β-C-甲基核苷和其前药
相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2011年7月19日提交的美国临时专利申请序列号61/509,478的优先权，所述临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其前药，以及其用于治疗丙型肝炎病毒（HCV）感染的治疗用途。本发明还涉及用于制备本文公开的核苷的方法和中间体。
背景技术
丙型肝炎病毒（HCV）是正链RNA病毒。据估计，世界上有约1.7亿人感染HCV。直到2011年5月为止，已被美国FDA批准用于慢性HCV的治疗是以聚乙二醇化干扰素-α与利巴韦林（ribavirin）组合作为标准疗法（SOC）。不幸的是，这种治疗的功效有限，在基因型-1感染群体中反应率仅40-50%，而基因型-1在美国和中国是最普遍的基因型。在2011年5月，FDA批准将依斯维克（Incivek）（威尔泰克斯公司（Vertex））和维克待利斯（Victelis）（默克公司（Merck））与SOC组合用于治疗HCV感染。这些组合可使反应率提高到60%至70%。然而，其临床适用性因其包括抑郁、贫血以及皮疹的严重副作用而仍然有限。
已经鉴别出许多用于直接起作用的抗HCV剂的药物开发的潜在分子靶标，包括NS2-NS3自体蛋白酶、N3蛋白酶、N3解旋酶以及NS5B聚合酶。NS5BRNA依赖性RNA聚合酶（RdRp)是复制单链正义RNA基因组所必需的，并且这种酶已经在药物化学家中间引起了巨大的兴趣。针对HCV具活性的核苷是NS5BRdRp抑制剂。核苷必须转化为其相应的三磷酸酯，其在3'-端整合到病毒RNA中，以致以链终止剂形式使病毒RNA伸长停止。
一些核苷活性较弱，因为它们不能有效地被激酶磷酸化或者根本不是激酶的底物，而一些惰性核苷当以化学方式转化为其三磷酸酯时，变得在体外针对某些病毒的活性很强。核苷磷酸酯（核苷酸）本身不能非常经常地用作药物，因为它们在进入细胞中之前被膜核苷酸和其他水解酶脱磷酸化或者其极性太强而不能进入细胞中。为了提高核苷的生物活性，已经对其磷酸酯前药进行了研究，因为它们可潜在地绕开限速的第一步的磷酸化。最近，氨基磷酸酯前药途径已经证实是一种使生物惰性核苷转化为活性核苷单磷酸酯，从而绕开限速第一步的磷酸化的有效方法（药物化学杂志（J.Med.Chem.）,2007,50(22),5463-5470）。已经报导核苷氨基磷酸酯有效地将核苷5'-单磷酸酯递送到肝脏中（WO2008/121634；WO2008/082601以及WO2008/082602）。在最近几年中，已经有许多专利申请公开了利用氨基磷酸酯作为核苷前药来将核苷单磷酸酯递送到组织中，尤其是递送到肝脏中（US6455513、WO2009/052050、WO2008/121634、WO2008/0833101、WO2008/062206、WO2007/002931、WO2008/085508、WO2007/095269、WO2006/012078、WO2006/100439）。核苷单磷酸酯可以进一步磷酸化为二磷酸酯，并且接着成为生物活性三磷酸酯。因此，本发明同时研究了所合成核苷的磷酸酯前药。
已经鉴别出两类核苷或核苷酸，即2'位和4'位被修饰的核苷或核苷酸为抗HCV剂。其中有数种已经进展到各种临床试验阶段。有关R1626和NM-283的第II期临床试验已经分别由于其严重副作用而终止，包括GI毒性和贫血。其他五种候选物，即R7128（US7429572）、PSI-7977（US7964580）、PSI-938（WO/2009/152095）、IDX-184（WO/2008/082601）以及INX-189（WO/2010/081082）在体外和在临床试验中显示有前景的抗HCV功效和针对病毒耐药性的更高屏障性。
这些核苷和核苷酸充当HCVRdRp的非专性（non-obligate）链终止剂，因为它们都具有3'-OH。迄今为止尚未开发出抑制HCV复制的专性链终止剂，这也许是因为3'-羟基的存在是核糖核苷细胞内磷酸化的关键结构决定因素。
诸如FTC、2',3'-二脱氧核苷、2',3'-二脱氧-2',3'-二脱氢核苷之类的大多数有效的抗病毒核苷发挥其治疗HBV和HIV的作用，因为它们由于缺乏3'-OH而不能支持新合成的病毒聚核苷酸的伸长。2'-C-甲基核苷和4'-叠氮基核苷显示其抗HCV活性，这可能是由于其在2'位或4'位处的空间位阻，此会降低新合成的病毒聚核苷酸在3'-OH处发生链伸长的可能性。如果无3'-OH的核苷显示有效的抗HCV活性，那么它们将会充当病毒RNA的专性链终止剂。然而，无3'-OH的核糖核苷可能不是激酶磷酸化的良好底物（药物化学杂志（J.Med.Chem.）2004,47,5041）。一些小组研究了作为潜在抗HCV剂的3'-脱氧核苷和其磷酸酯前药（抗病毒化学和化疗（Antivir.Chem.Chemother.）2002,13,363；抗病毒研究（Antivir.Res.）2003,58,243；捷克斯洛伐克化学通讯藏书（Collet.Czech.Chem.Comm.）2006,71,991）。3'-脱氧-2'-C-甲基胞苷的抗HCV活性的丢失可能是因为其缺乏3'-OH，这导致不能有效地磷酸化这种核糖核苷（抗病毒研究（AntiviralRes.）2003,58,243；抗菌剂与化疗（Antimicrob.AgentsChemother.）2005,49,2050；抗菌剂与化疗（Antimicrob.AgentsChemother.）2007,51,2920）。
2'-脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷在体外、在体内以及在临床中显示有效的抗HCV活性。然而，其3'-脱氧核苷类似物未曾在文献中作为有效的抗HCV剂而被报导过，并且相关专利申请（法马塞特公司（Pharmasset）：US7429572和WO/2010/075549；依德尼克斯公司（Idenix）：US7547704和US7608600；默克公司（Merck）：US7105499和US6777395）仅声称具有3'-OH的核苷为抗HCV剂，这可能是由于缺乏3'-脱氧核苷的成功实例。因此，需要开发作为有效抗HCV剂的3'-脱氧核苷类似物。
发明内容
进行本发明旨在满足上述需求。因为多数抗HIV核苷为2',3'-二脱氧核苷，其已经证实为激酶磷酸化的极佳底物。2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基-核苷可以视为作为激酶的良好底物的一种独特类别的2',3'-二脱氧核苷，因为氟模拟氢。其也可以视为核糖核苷而整合到HCV的RNA中，因为2'-氟-α模拟2'-α-OH基团。
我们合成了具有被修饰的鸟嘌呤碱基的2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其氨基磷酸酯前药，并且评估了其在复制子中的抗HCV活性。已发现，鸟苷的2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷类似物的氨基磷酸酯显示有效的抗HCV活性，而在体外无显著细胞毒性。因此，在一个方面中，本发明提供用于治疗人类HCV感染的2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其磷酸酯前药以及其组合物。在另一个方面中，本发明提供用于制备2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷的方法和中间体。
本发明涉及用于治疗人类HCV感染的2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其磷酸酯前药以及其组合物。本发明还涉及用于制备2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷的方法和中间体。
特别地，本发明提供一种式I化合物：
或其药学上可接受的前药、其盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体或多晶型形式、代谢物，
其中：
R1选自H、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或其稳定磷酸酯前药、酰基（R2CO）、R2OCO以及R2NHCO、RaRbNCO，其中：Ra和Rb独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、苯甲基、环状烷基、杂环基以及芳香杂环基团；RaRbN可以是氨基酸残基；Ra和Rb连同氮原子可以形成4元至7元环；
X2选自H、NH2以及卤素（I、Br、Cl、F）；
X6选自H、OH、OMe、OEt、SMe、烷氧基、芳氧基、环状烷氧基、烷基硫基、芳基硫基、环状烷基硫基、噻吩基、呋喃基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、环状烷基氨基以及环丙基氨基，其中所述二烷基氨基的二烷基部分连同所述氨基的氮原子一起可以任选地形成环，例如氮杂环丁烷；
上述所选化合物的氨基和/或羟基任选地受保护。
在另一个方面中，本发明提供用于治疗人类HCV感染的化合物和组合物。
在另一个方面中，本发明提供丙型肝炎病毒（HCV）的NS5B聚合酶的专性链终止剂。
在另一个方面中，本发明提供一种通过向患者单独地或与其他抗病毒剂组合投与有效量的本文公开的化合物来治疗HCV感染的方法。
在另一个方面中，本发明提供用于制备本文公开的化合物的方法和中间体。
附图说明
无
具体实施方式
本发明涉及用于治疗人类HCV感染的2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其磷酸酯前药以及其组合物。本发明还涉及用于制备2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷的方法和中间体。
在一个实施例中，本发明提供一种式I化合物：
或其药学上可接受的前药、其盐、溶剂合物、立体异构体、互变异构体或多晶型形式、代谢物，
其中：
R1选自H、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或其稳定磷酸酯前药、酰基（R2CO）、R2OCO以及R2NHCO、RaRbNCO，其中：Ra和Rb独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、苯甲基、环状烷基、杂环基以及芳香杂环基团；RaRbN可以是氨基酸残基；Ra和Rb连同氮原子一起可以形成4元至7元环；
X2选自H、NH2或卤素（I、Br、Cl、F）；
X6选自H、OH、OMe、OEt、SMe、烷氧基、芳氧基、环状烷氧基、烷基硫基、芳基硫基、环状烷基硫基、噻吩基、呋喃基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、环状烷基氨基、环丙基氨基，二烷基氨基的二烷基可以形成环，例如氮杂环丁烷；并且
上述所选化合物的氨基和/或羟基任选地受保护。
在第二实施例中，式I化合物的稳定磷酸酯前药选自式IIa-c的化合物：
其中：
X2和X6如上文所定义；
R3和R4独立地选自烷基、环状烷基、芳基以及苯甲基
其中：R2如上文所定义；
Ar是选自未被取代或被取代的芳香杂环和芳香族基团的芳基，包括但不限于苯基和萘基；
R5和R6独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、苯甲基、环状烷基、杂环基以及芳香杂环基团；R5和R6连同氮原子一起可以任选地形成4元至7元环；
R5R6N也可以是下式的氨基酸残基和氨基醇衍生物：
其中：
R2如上文所定义；
R7、R8、R9、R10以及R11独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、环状烷基、杂环基以及芳香杂环基团；并且
R7、R8以及R10、R11可独立地连同其所连接的碳原子一起形成3元至7元环。
在第三实施例中，式III化合物的稳定磷酸酯前药是式III的非对映异构体之一或混合物：
其中：Ar、R7、R8、R9、X2以及X6如上文所定义；并且
符号*表示手性中心。
在第四实施例中，式IIb或III化合物的稳定磷酸酯前药选自式Iva和IVb的非对映异构体化合物：
其中：Ar、R9、X2以及X6如上文所定义。
在第五实施例中，式IVa化合物的稳定磷酸酯前药选自下式的化合物：
治疗用途
在第六实施例中，提供2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷和其磷酸酯前药以及其组合物。还提供所述核苷和其磷酸酯前药以及其组合物用于治疗HCV感染的治疗用途。本文公开的化合物和其组合物可以单独地或与其他治疗有效药剂组合投与来用于治疗HCV感染。
定义
除非另有指示，否则当提及本文提供的化合物时，以下术语具有以下含义。
术语“酰基”或“O-连接的酯”包括下式的基团：烷基-CO或芳基-CO或环状烷基-CO。
如本文所用的术语“烷基”包括通常为C1至C20的饱和直链、支链或环状烃，并且具体来说包括甲基、CF3、CCl3、CFCl2、CF2Cl、乙基、CH2CF3、CF2CF3、丙基、异丙基、环丙基等。可以取代所述烷基的部分的非限制性实例选自由以下组成的群组：卤素（氟、氯、溴或碘）、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基等。
“烯基”包括单价烯烃不饱和烃基，在某一实施例中，具有至多11个碳原子，其可以是直链或支链的并且具有至少1个或1至2个烯烃不饱和位点。例示性烯基包括乙烯基（--CH=CH2）、正丙烯基（--CH2CH=CH2）、异丙烯基（--C(CH3)=CH2）、乙烯基以及被取代的乙烯基等。
“炔基”包括炔属不饱和烃基，在某些实施例中，具有至多约11个碳原子，其可以是直链或支链的并且具有至少1个或1至2个炔基不饱和位点。炔基的非限制性实例包括炔属乙炔基、炔丙基等。
如本文所用的术语“芳基”包括苯基、联苯基或萘基，并且优选地是苯基。所述术语包括被取代和未被取代的部分。芳基可以被任何所述部分取代，包括但不限于一个或多个选自由以下组成的群组的部分：卤素（氟、氯、溴或碘）、烷基、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酰基（sulfono）、硫酸根合基（sulfato）、膦酰基、磷酸酰氧基或膦酰氧基，其不受保护，或视需要受保护。
“环状烷基”或环烷基包括3-7元烃环，如环丙基。
“杂环”包括在环中具有1至3个杂原子（如O、S、N）的碳化合物的3-7元环。
“芳香杂环基团”包括含有1至3个杂原子（如O、S、N）的芳环，例如吡啶基、嘧啶基。
“烷氧基或烷基氧基”包括基团-OR，其中R为烷基。特定烷氧基包括正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基等。
“氨基”包括基团-NH2。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”分别包括具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
“卤素”或“卤基”包括氯（Cl）、溴（Br）、氟（F）或碘（I）。
“单烷基氨基”包括基团烷基-NHR'-，其中R'选自烷基或芳基。
“烷基硫基”包括基团-SR，其中R为烷基或芳基。
除非另有定义，否则如本文所用的术语“受保护”是指将一个基团添加到氧、氮或磷原子上，以防止其进一步反应或用于其他目的。多种多样的氧和氮保护基团是有机合成领域中的熟练技术人员所已知的。在下述方法中官能团的保护和去保护可以通过所属领域中通常已知的程序来进行（参见例如T.W.格林（T.W.Greene）及P.G.M.伍斯（P.G.M.Wuts）,“有机合成中的保护基团（ProtectingGroupsinOrganicSynthesis）”,第三版,威利出版社（Wiley）,1999），所述文献以引用的方式并入本文中。氧或氮的“保护基团”的实例包括但不限于酰基（例如乙酰基、甲酰基、苯甲酰基等）、碳酸酯基（例如ROC(O)-，其中R可以是被取代或未被取代的烷基、烯基、芳基、苯甲基等）、氨基甲酸酯基（例如RaRbN-C(O)-，其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基、芳基等）。氧和氮保护基团还可以包括未被取代或被取代的苯甲基、烯丙基、叔丁基或甲硅烷基，其可以容易地通过所属领域中所熟知的方法来去除。特别地，适合的氮保护基团例示如下：苯甲基-[Bn]、叔丁氧基羰基-[BOC]、叔丁基二甲基甲硅烷基-[TBDMS]等。
如本文所用的术语“离去基团”是指一个基团可以通过如置换的反应而被另一基团置换。适合的离去基团包括但不限于卤素（Cl、Br、I）和磺酸酯基（-OS(O)2-芳基（例如-OS(O)2Ph或-OS(O)2C6H4CH3-p）或-OS(O)2-烷基（例如-OS(O)2CH3或-OS(O)2CF3））等。
“药学上可接受的盐”包括本文所提供的化合物的保留其生物性质并且无毒性或另外无不合乎药物使用要求的地方的任何盐。
如本文所用的术语“前药”是指当投与生物系统时由于自发化学反应、酶催化反应和/或代谢过程或各自的组合而产生生物活性化合物的任何化合物。使用连接至官能团（例如-OH、-NH2、-P(O)(NH)(OH)、-P(O)(OH)2）、与药物缔合、可在体内裂解的基团来形成标准前药。本发明中所述的前药是例示性的，但不受限于此，并且所属领域技术人员可以制备其他已知种类的前药。
术语“核苷”是指连接至糖的嘌呤或嘧啶碱基或其类似物，包括其杂环和碳环类似物。
术语“磷酸酯”是指-O-PO3 2-。
术语“氨基磷酸酯”是指-N(R)-PO3 2-，其中R为氢或基于碳的取代基。
术语“生物活性药物或药剂”是指产生生物效应的化学实体。在本发明中，生物活性剂是指核苷、核苷单磷酸酯、核苷二磷酸酯、核苷三磷酸酯。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”包括具有烷基取代基的芳基。术语芳烷基或芳基烷基包括具有芳基取代基的烷基。
术语“氨基酸”包括天然存在和合成的α-、β-、γ-或δ-氨基酸，并且包括但不限于蛋白质中所发现的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。在一个优选实施例中，氨基酸呈L-构型。或者，氨基酸可以是以下的衍生物：丙氨酰基、缬氨酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、脯氨酰基、苯基丙氨酰基、色氨酰基、甲硫氨酰基、甘氨酰基、色氨酰基、苏氨酰基、半胱氨酰基、酪氨酰基、天冬酰胺酰基、谷氨酰胺酰基、天冬氨酰基、谷氨酰基、赖氨酰基、精氨酰基、组氨酰基、β-丙氨酰基、β-缬氨酰基、β-亮氨酰基、β-异亮氨酰基、β-脯氨酰基、β-苯基丙氨酰基、β-色氨酰基、β-甲硫氨酰基、β-甘氨酰基、β-色氨酰基、β-苏氨酰基、β-半胱氨酰基、β-酪氨酰基、β-天冬酰胺酰基、β-谷氨酰胺酰基、β-天冬氨酰基、β-谷氨酰基、β-赖氨酰基、β-精氨酰基或β-组氨酰基。
如本文所用的术语“治疗剂”（therapeuticagent/therapeuticagents）是指可用于治疗或预防病症或其一种或多种症状的任何药剂。在某些实施例中，术语“治疗剂”包括本文提供的化合物。在一个实施例中，治疗剂是一种已知适用于或已经或目前正在被用于治疗或预防病症或其一种或多种症状的药剂。
“治疗有效量”包括当向受试者投与化合物或组合物用于治疗疾病时足以实现对所述疾病的这种治疗的量。
任何疾病或病症的“治疗”（Treating/treatment）在一个实施例中是指改善受试者中所存在的疾病或病症。在另一个实施例中，“治疗”包括改善至少一种可能难以被受试者辩别的身体参数。在又一个实施例中，“治疗”包括在身体上（例如稳定可辩别的症状）或生理上（例如稳定身体参数）或在这两个方面调节疾病或病症。在又一个实施例中，“治疗”包括延迟疾病或病症的发作。
化合物的制备
本文提供的化合物可以通过所属领域技术人员显而易见的任何方法来制备、分离或获得。例示性制备方法详细地描述于以下实例部分中。
2',3'-二脱氧-2'-α-氟-2'-β-C-甲基核苷的例示性制备图示于流程1和2中。化合物1是由1,2;5,6-二异次丙基（diisopropylidinyl）-D-甘露糖醇制备。化合物1与维蒂希试剂（Wittigreagent）反应得到化合物2，化合物2通过在Pd/C存在下氢化而转化为化合物3。用HCl在EtOH水溶液中处理化合物3，接着用TBDPSCl保护伯羟基，得到化合物4。用LiHMDS处理化合物4和(PhSO2)2NF在THF中的溶液，得到仅仅具有所要手性的化合物5。据报导，由于甲硅烷基氧基甲基体积庞大，因此氟从其对侧攻击烯醇化物中间体，从而产生单一α-氟化前体（有机化学杂志（J.Org.Chem.）1998,63,2161）。用TBAF使化合物5脱甲硅烷基化，接着用BzCl进行苯甲酰基化，得到化合物7。通过用还原剂（如Li(t-BuO)3AlH）还原化合物7获得关键中间体内半缩醛8。通过用Ph3P/CBr4处理化合物8使内半缩醛8转化为α-溴代糖9（流程2）。接着，使所述溴代糖在碱（如t-BuOK）存在下与6-氯-2-氨基嘌呤反应，从而选择性地得到β-核苷10。通过用MeONa在MeOH中处理化合物10获得最终的核苷11。
流程1.制备糖前体
反应条件：a）维蒂希反应；b）H2/Pd；c）i.HCl/EtOH/H2O，ii.TBDPSCl/咪唑；d）(PhSO2)2NF/LHMDS；e）TBAF；f）BzCl/pyr；g）Li(t-BuO)3AIH。
流程2.制备核苷类似物
反应条件：a）Ph3P/CBr4；b）t-BuOK/t-BuOH；c）NaOMe。
化合物11的制备也由具有3'-OH的核苷前体通过3'-脱氧来实现（流程3）。化合物12是根据专利申请（WO/2010/075550）中所公开的方法来制备。用NaOMe在MeOH中处理12，得到核苷13。用DMTrCl在吡啶中选择性保护化合物13，得到化合物14。用PhOCSCl在Et3N/DMAP存在下在ACN中处理14，接着用Bu3SnH/AIBN脱氧，从而在用TFA去保护后得到3'-脱氧核苷11。
流程3.制备3'-脱氧鸟苷类似物
R=DMTr反应条件：a.MeONa/MeOH；b.DMTrCl/Pyr.；c.PhOCSCl/Et3N/DMAP；
d.Bu3SnH/AIBN；e.TFA/CH2Cl2
核苷11的氨基磷酸酯前药的制备由于在磷处新产生的手性中心而遵循文献方法（WO/2008/121634）以非对映异构体混合物形式来实现（流程4）。用1摩尔苯酚或醇和1摩尔Et3N在-78℃下处理POCl3，接着用1摩尔胺（或氨基酸酯）和1摩尔Et3N处理，得到一氯化磷。在N-甲基咪唑（NMI）存在下用新制备的氯化磷处理核苷11，分别得到核苷氨基磷酸酯17和18。
流程4.制备氨基磷酸酯前药
手性氨基磷酸酯前药的制备是通过手性试剂（如化合物21和23）与核苷反应来实现。举例来说，用氨基酸酯盐酸盐20和22（1mmol）和三乙胺（2mmol）在-78℃下处理二氯磷酸苯酯（1mmol），接着使所得中间体与五氟苯酚（1mmol）和三乙胺（1mmol）反应，从而分别在再结晶之后得到手性中间体异丙酯（21）和环戊酯（23）（流程5）。核苷11与手性试剂21和23在t-BuMgCl存在下反应，分别得到非对映异构体纯氨基磷酸酯24和25（流程6）。
流程5.制备手性氨基磷酸酯试剂
流程6.制备手性氨基磷酸酯前药
非对映异构体21和23可以通过分离来自再结晶的母液来获得。这些非对映异构体21和23分别可以用于制备非对映异构体24和25。
生物学评价
遵循专利方法（WO/2007/027248）评价本文公开的化合物的抗HCV活性和细胞毒性。
实例
以下实例说明本文提供的代表性化合物的合成。这些实例并非旨在，也不应将其理解为限制所要求保护的主题的范围。很显然，所要求保护的主题的范围可以不同于本文特定描述的其他方式来实施。所述主题的许多修改和变化鉴于本文中的教示是有可能的，并且因此属于所要求保护的主题的范畴内。
本文制备的氨基磷酸酯的产物由于磷新形成的手性中心而可以是非对映异构体之一或混合物，并且在生物分析中以一种物质或混合物形式来进行测试。
单一异构体可以通过HPLC分离来获得或由手性中间体制备。
核磁共振（NMR）光谱是用布鲁克高级光谱仪（Brukeradvance）II400MHz和瓦里安尤尼帝普拉斯光谱仪（VarianUnityPlus）400MHz在室温下记录，以四甲基硅烷作为内标。化学位移（δ）是以百万分率（ppm）形式报导，并且信号是以s（单峰）、d（双峰）、t（三重峰）、q（四重峰）、m（多重峰）或brs（宽单峰）形式来报导。
1.制备化合物3
在室温下向（乙氧羰基次乙基）三膦（2.0g，5.5mmol）于无水CH2Cl2（10mL）中的溶液中逐滴添加2,3-异亚丙基-D-甘油醛（0.94g，7.2mmol）于CH2Cl2（3mL）中的溶液。在室温下搅拌混合物过夜。将反应混合物浓缩至干燥，用轻质石油醚（50mL）稀释，并且在室温下保持2h。通过过滤来去除所沉淀的氧化三苯基膦并且将滤液浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱法（0-5%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到化合物2（0.83g，70%）（碳水化合物研究（CarbohydrateRes.）1983,115,250）。δH(CDC13):δ1.30(t,J=6.8Hz,3H),1.41(s,3H),1.45(s,3H),1.89(d,J=1.2Hz),3.63(t,J=8.0Hz,1H),4.14(m,3H),4.86(m,1H),6.69(dd,J=1.6,8.0Hz)ppm。
向化合物2（0.8g，3.7mmol）于MeOH（20mL）中的溶液中添加Pd/C（100mg，10%），并且在球形大烧瓶（balloon）中在H2下搅拌混合物5h。过滤混合物，并且将滤液浓缩至干燥，得到呈非对映异构体混合物形式的化合物3（0.80g，100%）。
2.制备化合物4（4'和4"）
向化合物3（20g，92mmol）于EOH（100mL）和H2O（20mL）中的溶液中添加浓HCl（37%，3mL），并且将溶液在回流下加热5h。去除溶剂并且将残余物与吡啶（2×50mL）一起共蒸发，接着溶解于吡啶（100mL）中。向溶液中添加CH2Cl2（200mL），然后添加叔丁基二苯基氯硅烷（37.9g，138mmol）。将所得混合物在室温下搅拌20h。将溶剂蒸发至干燥并且将残余物与甲苯一起共蒸发两次。将残余物溶解于EtOAc（300mL）中，并且用盐水洗涤混合物并经Na2SO4干燥。去除溶剂并且通过硅胶柱（0-30%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到非对映异构体混合物（4,27.2g，80%），通过硅胶柱色谱法对其进行分离，从而得到个别异构体。极性较小的异构体：δH(CDCl3):δ1.01(s,9H),1.28(d,J=7.6Hz,3H),2.44(m,1H),2.84(m,1H),3.66(dd,J=3.6,11.6Hz,1H),3.85(dd,J=3.6,11.6Hz,1H),4.54(m,1H),7.65,7.42(mm,10H)。极性较大的异构体：δH(CDCl3):1.05(s,9H),1.29(d,J=6.8Hz,3H),1.85(m,1H),2.39(m,1H),2.70(m,1H),2.72(,dd,J=4.0,11.2Hz,1H),3.85(dd,J=3.6,11.6Hz,1H),4.45(m,1H),7.41-7.66(m,10H)。
4（4'和4"）的混合物可以直接用于接下来的氟化，而无需分离。
3.制备化合物5
在-78℃下向化合物4（3.68g，10mmol）和N-氟二苯磺酰亚胺（4.73g，15mmol）于THF（50mL）的溶液中逐滴添加1MLHMDS的THF溶液（20mmol，20mL）并且在-78℃下再将溶液搅拌2h，并且接着在室温下搅拌1h。用NH4C1水溶液淬灭反应溶液并且用盐水洗涤有机溶液并经Na2SO4干燥。去除溶剂并且通过硅胶柱色谱法（0-20%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到化合物5（2.72g，71%）。δH(CDC13):δ1.05(s,9H),1.66(d,J=22.4Hz,3H),2.44(m,2H),3.70(dd,J=3.6,12.0Hz,1H),3.95(dd,J=3.6,12.0Hz,1H),4.72(m,1H),7.43-7.65(mm,10H)。19F(CDCl3):147ppm。
4.制备化合物7
向化合物5（3.86g，10mmol）于THF（30mL）中的溶液中添加TBAF（1.5eq）并且将溶液在室温下搅拌3h。去除溶剂并且将残余物与吡啶（2×10mL）一起共蒸发。将残余物溶解于吡啶（10mL）和CH2Cl2（20mL）中。向溶液中添加BzCl（1.5eq）并且将溶液在室温下搅拌3h。添加水（5mL）并且将混合物用CH2Cl2（2×50mL）萃取。有机溶液经Na2SO4干燥。去除溶剂并且将残余物与甲苯（2×50mL）一起共蒸发。通过硅胶柱色谱法（0-30%EtOAc/己烷）纯化所得残余物，得到呈单一化合物形式的化合物7。δH(CDCl3):δ1.68(d,J=22.4Hz,3H),2.12(m,1H),2.72(m,1H),4.44(dd,J=5.6,12.4Hz.1H),4.61(dd,J=3.2,12.4Hz,1H),5.00(m,1H),7.48,7.58,8.02(mmm,5H)。δF(CDC13):149(m)。m/z:253[M+H]+。
5.制备内半缩醛8
向化合物7（2.52g，10mmol）于THF（50mL）的溶液中逐滴添加LiAl(t-BuO)3H的THF溶液（1M，11mmol，11mL）并且将溶液在-30℃下搅拌2h。用NH4C1溶液淬灭反应。用EtOAc（200mL）萃取混合物并且用盐水洗涤有机溶液，并且经Na2SO4干燥。去除溶剂并且通过硅胶柱色谱法（己烷0-50%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到化合物8（2.3g，92%）。
6.制备嘌呤核苷10
向三苯基膦（3.66g，14mmol）于THF（100mL）的溶液中添加内半缩醛8（2.54g，10mmol）并且将溶液在-20℃下搅拌15min。在-20℃下在30min内逐份添加CBr4（4.97g，15mmol）。在CBr4添加完成后，在-20℃下再将反应混合物搅拌20min，接着使其穿过硅胶垫。将滤液蒸发至干燥，得到作为主要产物的1-溴-α-糖9。
在N2下向2-氨基-6-氯嘌呤（4.22g，25mmol）于t-BuOH（100mL）的悬浮液中逐份添加t-BuOK（2.8g，25mmol）。再将混合物在室温下搅拌30min。在室温下向反应混合物中添加以上所制备的α-溴代糖9和无水ACN（80mL）。经2h将混合物加热到50℃并且在室温下搅拌20h。用NH4Cl水溶液淬灭反应。通过经硅藻土过滤来去除悬浮固体。通过添加6NHCl直到pH为7.0来中和滤液。将混合物浓缩至干燥并且通过硅胶柱色谱法（0-80%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到产物β-核苷13。
7.制备化合物11
向化合物10（4.06g，10mmol）于MeOH（100mL）的溶液中添加NaOMe（于MeOH中25%MeOH溶液，30mmol）并且将溶液在室温下搅拌24h。蒸发溶剂并且通过硅胶柱色谱法（0-15%MeOH/CH2Cl2）纯化残余物，得到化合物11（2.5g，84%）。δH(CD3OD):1.20(d,J=21.6Hz,3H),2.24(m,1H),2.47(m,1H),3.76(dd,J=3.2,12.8Hz,1H),4.01(dd,J=3.2,12.8Hz,1H),4.48(m,1H),6.15(d,J=16.8Hz,1H),8.32(s,1H)。m/z:298[M+H]+。
8.通过核苷前体的3'-脱氧来制备化合物11（流程3）
向化合物12（5.26g，10mmol）于MeOH（100mL）的溶液中添加NaOMe（于MeOH中25%，45mmol）并且将溶液在室温下搅拌24h。蒸发溶剂并且通过硅胶柱色谱法（0-15%MeOH/CH2Cl2）纯化残余物，得到化合物13（2.9g，93%）。
向2'-脱氧-2'-氟-α-2'-C-甲基核苷13（1.57g，5mmol）于吡啶（20mL）的溶液中逐份添加DMTrCl（2.88g，7.5mmol）并且将溶液在0℃下搅拌2h。添加水（10mL）并且将混合物用EtOAc（2×100mL）萃取。用盐水洗涤有机溶液并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂至干燥并且将残余物与甲苯一起共蒸发两次。将残余物溶解于吡啶（20mL）中。向溶液中添加DMAP（1.8g，15mmol）和三乙胺（1.52g，15mmol），接着添加PhOCSCl（2.59g，15mmol），并且将溶液在0℃下搅拌1h，并且在室温下搅拌16h。添加EtOAc（200mL）并且将混合物用盐水洗涤并经Na2SO4干燥。去除溶剂并且将残余物溶解于无水甲苯（20mL）中。用N2使溶液起泡5min。向溶液中添加Bu3SnH（10eq）和AIBN（1mmol），并且将溶液在100℃下加热8h。在减压下蒸发溶剂至干燥。将残余物溶解于CH2Cl2（100mL）中并且添加TFA（2mL）。将溶液在室温下搅拌3h。添加氢氧化铵将溶液中和到pH7。将混合物浓缩至干燥并且通过硅胶柱色谱法（0-10%MeOH/CH2Cl2）纯化残余物，得到3'-脱氧核苷11（总产率50-70%）。
9.制备氨基磷酸酯17
在-78℃下向三氯氧磷（3.07g，20mmol）于THF（40mL）的溶液中添加2'-甲基苯甲基醇（2.44g，20mmol）和三乙胺（2.02g，20mmol）于THF（10mL）的溶液，并且将混合物在-78℃下搅拌3h。在-78℃下向所得混合物中添加苯甲基胺（2.14g，20mmol）和三乙胺（2.02g，20mmol）于THF（10mL）的溶液，并且将混合物在-78℃下搅拌1h，接着在室温下搅拌过夜。在真空下去除THF并且过滤残余物，并且用乙醚（50mL）洗涤。蒸发滤液和洗液，得到粗一氯化物，将其溶解于CH2Cl2（10mL）中以用于下一反应，而无需进一步纯化。向核苷11（1.49g，5mmol）于CH2Cl2（40mL）中的悬浮液中添加N-甲基咪唑（NMI，5mL）并且在冰浴中冷却混合物。向溶液中添加上述一氯化物的溶液并且将所得溶液在冰浴中搅拌3h。添加水（5mL）并且将混合物用EtOAc（2×200mL）萃取。用0.5NHC1溶液、NaHCO3水溶液、盐水洗涤有机溶液并经Na2SO4干燥。在真空下去除溶剂并且通过硅胶色谱法（0-8%MeOH/CH2Cl2）纯化残余物，得到化合物17（1.25g，43.9%）。δH(CDC13):1.18,1.22(dd,J=21.6Hz,3H),2.2-2.8(m,5H),3.18(m,1H),4.0-4.2(m,6H),4.60(m,2H),5.10(m,2H),5.16,5.28(ss,1H),6.00(dd,J=17.6Hz,1H),7.10(m,9H),7.70(s,1H)。m/z:571[M+H]+。
10.制备氨基磷酸酯18
由L-丙氨酰基甲酯，应用关于17所用的类似反应来得到化合物18。δH(CD3OD):1.20,1.40(mm,6H),2.20-2.80(m,2H),3.59(m,1H),3.68,3.69(ss,3H),4.06,4.26(ss,3H),4.29(m,1H),4.62(m,1H),4.74(m,1H),5.11,5.30(ss,2H),6.00(dd,J=17.6Hz,1H),7.25(m,5H),7.66,7.73(ss,1H)。m/z:539[M+H]+。
11.制备手性磷试剂21
在-78℃下向PhOPOCl2（19，6.14g，40mmol）于CH2C12（80mL）中的溶液中添加L-丙氨酰基异丙酯盐酸盐（20，6.7g，40mmol），接着添加Et3N（80mmol）于CH2C12（10mL）中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。向混合物中添加五氟苯酚（7.36g，40mmol）和Et3N（80mmol）于CH2C12（10mL）的溶液并且将混合物在室温下搅拌4h。过滤并且用CH2C12洗涤滤饼。蒸发滤液并且将残余物溶解于EtOAc（200mL）中。用NaHCO3水溶液、盐水洗涤溶液并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂并且通过硅胶柱色谱法（5-50%EtOAc/己烷）纯化残余物，得到化合物21的非对映异构体混合物。使混合物从EtOAc-己烷中再结晶，得到单一异构体21（25-40%产率）。δH(CDCl3):m/z:539[M+H]+。
12.制备手性磷试剂23
由L-丙氨酰基环戊酯盐酸盐22，应用关于21所用的类似反应来得到化合物23。δH(CDC13):m/z:539[M+H]+。
13.制备手性氨基磷酸酯前药24
向试剂21（1.36g，3.0mmol）和嘌呤核苷11（0.594g，2.0mmol）于THF（50mL）的混合物中添加t-BuMgCl溶液（1MTHF溶液，6mmol）并且将混合物在室温下搅拌2h。添加EtOAc（200mL）并且用盐水洗涤混合物并经Na2SO4干燥。去除溶剂并且通过硅胶柱色谱法（5%MeOH/CH2C12）纯化残余物，得到呈白色泡沫的化合物24（60-80%产率），m/z:539[M+H]+。
14.制备手性氨基磷酸酯前药25
由手性试剂23，应用关于24所用的类似反应来得到化合物25。δH(400MHz,CDC13):7.66(s,1H),7.15-7.35(m,5H),5.96(d,J=17.6Hz,1H),5.33(brs,2H),5.14(m,1H),4.80(m,1H),4.61(m,1H),4.27(m,1H),4.06(s,3H),3.97(m,1H),3.62(t,J=10.4Hz,1H),2.80(m,1H),2.20(m,1H),1.80(m,2H),1.60(m,8H),1.34(d,J=6.8Hz,3H),1.20(d,J=22.0Hz,3H)。m/z:539[M+H]+。31P(CDCl3):4.288ppm。
15.HCV复制子分析
可在以下两种生物分析中测试例示性化合物的抗HCV活性和毒性：基于细胞的HCV复制子分析和细胞毒性分析（WO2007/027248）。
I.抗HCV分析
使用含有复制HCV亚基因组基因型1b复制子加上荧光素酶报告基因（luc-ubi-neo）的人肝癌细胞系（Huh-7）来评估化合物的抗HCV活性。在这一分析中，荧光素酶信号水平与病毒RNA复制直接相关。在补充有10%胎牛血清和0.5mg/ml遗传霉素（Geneticin）（G418）的DMEM培养基中培养HCV复制子-报告细胞系（NK/luc-ubi-neo）。使细胞维持在亚汇合（subconfluent）状态以确保高水平的HCV复制子RNA合成。
为评估化合物的抗病毒活性，制备浓度在0.14至300μM范围内的连续稀释液。将稀释的化合物转移到96孔板中，接着添加复制子细胞（每孔6000个细胞）。将细胞与化合物一起培育48h，在此之后测量荧光素酶活性。荧光素酶信号减弱反映在被处理细胞中HCV复制子RNA减少并且用于确定EC50值（使荧光素酶活性降低50%的浓度）。
II.细胞毒性分析
使用稳定地整合到染色体中的携带荧光素酶报告基因（由HIVLTR启动子驱动）的Huh-7细胞系来分析所选化合物的细胞毒性效应。使这一细胞系（LTR-luc）维持在具有10%FBS的DMEM培养基中。细胞毒性分析的设计类似于HCV复制子分析的设计。在被处理细胞中荧光素酶活性的降低与测试化合物的细胞毒性效应相关并且用于计算CC50值（抑制细胞生长达50%的浓度）。
所选化合物的生物学结果概括于表1中。
表1.例示性化合物在复制子分析（基因型1b）中的活性
化合物 EC50（μM） CC50（μM）
11 >100 >100
17 <1 52.2
18 <1 >100
25 0.58 >100
EC50为抑制HCV达50%的药物浓度。
CC50为抑制细胞生长达50%的药物浓度。
表1中概括的所选核苷前药的抗HCV活性的结果表明这些核苷磷酸酯前药17、18以及25显示有效的抗HCV活性，而无显著细胞毒性，这保证了对研发作为抗HCV剂的本文公开的新颖核苷或其前药的进一步研究。
优选实施例的前述实例和描述应理解为说明性的，而不是限制如由权利要求书所界定的本发明。正如将容易认识到的那样，可以在不背离如权利要求书中所述的本发明的情况下利用上述特征的许多变化和组合。所有此类变化均意在包括于以下权利要求书的范围内。在此所引用的所有参考资料均以全文引用的方式并入。

Claims (15)

1.一种式(I)化合物：
或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，
所述药学上可接受的前药选自下式的化合物：
其中：
R1选自H、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯；
X2选自H、NH2以及卤素；并且
X6选自H、-OH、-OMe、-OEt、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基、芳氧基、环烷氧基、烷基硫基、芳基硫基、环烷基硫基，其中所述羟基任选地受保护；
R3和R4独立地选自烷基、环烷基、芳基、苯甲基以及由下式表征的取代基：
其中，R2选自烷基或环烷基；
Ar为芳基；
R5和R6独立地选自烷基、芳基、苯甲基、环烷基；
或者R5R6N选自下式的氨基酸残基或氨基醇衍生物：
其中，R2如上定义；
R7、R8、R9、R10以及R11各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基；式Ⅲ中当R8为甲基时，R7还可以是H；
所述烷基为C1至C20的饱和直链、支链；烯基为有至多11个碳原子，直链或支链的并且具有至少1个烯烃不饱和位点；炔基为具有至多11个碳原子，直链或支链的并且具有至少1个炔基不饱和位点；芳基为苯基、联苯基或萘基；环烷基为3-7元烃环。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其中X2为NH2，X6为-OH或-OMe。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其选自下式化合物：
4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其中：
X6选自H、-OH、-OMe、-OEt、-SMe；
所述卤素选自I、Br、Cl、F。
5.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其选自下式的前药的非对映异构体或其混合物：
其中，X6为-OH或-OMe，X2为NH2，Ar为苯基，R7为H，R8为-Me，R9为异丙基或环丙基。
6.如权利要求1或5所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其选自下式的前药或其非对映异构体：
其中Ar、R9、X2以及X6如权利要求1或5中所定义。
7.如权利要求1或5所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其选自下式的前药或其非对映异构体：
其中Ar和R9分别如相应的权利要求1或5中所定义。
8.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体，其选自下式化合物：
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体和药学上可接受的载剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其进一步包含第二种或更多种抗HCV剂。
11.权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体或者权利要求9所述的药物组合物在制备治疗丙型肝炎病毒感染药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其进一步使用有效量的第二种或更多种抗HCV剂。
13.一种制备如权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体的方法，其包含：
a.使用(PhSO2)NF或其他氟化试剂在碱存在下，通过下式的内酯化合物的立体专一性氟化：
来制备下式的5位受保护的2-氟-α-2-C-甲基-内酯化合物：
b.用还原试剂还原所述5位受保护的2-氟-α-2-C-甲基-内酯，得到下式的5位受保护的2-氟-α-2-C-甲基-l-α-内半缩醛化合物：
c.以立体选择性方式使所述5位受保护的2-氟-α-2-C-甲基-l-α-内半缩醛化合物转化为下式的包含离去基团L的α-中间体：
d.使所述1-L-α-中间体与嘌呤或被修饰的嘌呤在碱存在下反应，从而以立体选择性方式产生下式的β-核苷化合物：
其中Pg是H或保护基团。
14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤c所述离去基团L为Br。
15.一种适用于制备如权利要求1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的前药、盐、立体异构体或互变异构体的中间体，其选自下式化合物：
其中Pg是H或保护基团，并且L是离去基团。
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