CN106074677B - 一种防治皮肤病变老化的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治皮肤病变老化的中药组合物，其原料组成为：豨莶草提取物10‑15份，款冬花提取物15‑25份，甘草提取物5‑15份，当归提取物5‑15份；所述豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物是通过以下方法制备得到的：分别将豨莶草、款冬花、甘草和当归，用30～100％乙醇回流提取1～6次，每次溶剂用量为药材重量的1～15倍，每次提取时间为0.5～10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得。该中药组合物具有抗氧化应激和抗炎作用，并能上调人表皮HaCaT细胞中谷胱甘肽水平，抵抗砷诱导细胞毒性，抑制砷诱导的活性氧自由基形成，可用于制备防治皮肤损伤和炎症病变，延缓皮肤老化的药物或化妆品。

Description

一种防治皮肤病变老化的中药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治皮肤病变老化的中药组合物及其应用，具体涉及一种由豨莶草、款冬花、甘草、当归四种中药提取物组成的中药组合物，以及该中药组合物在制备防治皮肤损伤和炎症病变药物，以及延缓皮肤老化的化妆品中的应用。

背景技术

人体皮肤直接暴露于外界环境中，与大气中的污染物、臭氧、紫外线以及环境中有害成分直接接触，而易受到侵害和损伤。在我国快速工业化和现代化进程中，环境污染也日益严重，例如大气中碳硫氮氧化物(CO、SO₂、NO₂等)、重金属(铅、铬、砷等)、建筑矿物尘形成的雾霾，以及水和土壤污染，其中尤以大气污染危害最为严重和普遍。皮肤直接暴露于大气污染物中，易受到碳硫氮氧化物和重金属损伤，并诱发神经性皮炎、过敏性皮肤病、银屑病等皮肤组织病变。

外界因素诱发皮肤病变可能与氧化应激、病原微生物感染、免疫系统缺陷有关。由于大气污染物(例如重金属、碳硫氮氧化物)本身具有氧化性，或者能够催化细胞形成活性氧，造成细胞氧化还原失衡，激活细胞炎症反应，诱发DNA损伤和基因突变，引起细胞功能损伤并死亡；外源性或内源性活性氧激活炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞)，诱发炎症反应，炎症细胞释放活性氧加剧细胞损伤。因此，氧化应激和炎症反应可以彼此放大对方的作用，并加速皮肤组织损伤和病变。此外，氧化应激状态下，过量的活性氧自由基是皮肤老化的重要因素。因而，氧化应激和炎症反应在大气污染诱发皮肤病变和老化过程中发挥重要作用，抑制氧化应激和炎症反应是减少皮肤病变和老化的有效方法。

中药是中华民族的瑰宝，在我国有悠久的应用历史，为保障人民健康做出了中药贡献。中药治疗疾病的有效性是确凿的，但其作用机制仍值得研究。发明人构建了中药提取物库，并利用现代药理学和分子生物学技术，寻找中药新的功能和用途。其中，对具有氧化应激和炎症反应抑制活性中药进行了系统的研究，并发现了一系列具有抗氧化和抗炎活性中药提取物。

面对外界因素对人体皮肤的侵害，利用具有抑制氧化应激和炎症反应的中药，增强皮肤细胞自身防御能力，预防内源性活性氧、外源性有害物等毒机体的损伤，对于预防皮肤病变的发生和抑制皮肤老化具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治皮肤病变老化的中药组合物，该中药组合物具有抗氧化应激和抗炎作用，并能上调人表皮HaCaT细胞中谷胱甘肽水平，抵抗砷诱导细胞毒性，抑制砷诱导的活性氧自由基形成，可用于制备防治皮肤损伤和炎症病变，延缓皮肤老化的药物或化妆品。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明第一方面，提供一种防治皮肤病变老化的中药组合物，其原料组成为：

豨莶草提取物10-15份，款冬花提取物15-25份，甘草提取物5-15份，当归提取物5-15份。

本发明的防治皮肤病变老化的中药组合物，优选的原料组成为：

豨莶草提取物10份，款冬花提取物20份，甘草提取物10份，当归提取物10份。

上述中药组合物中，所述豨莶草提取物可以是从豨莶草中提取得到的浸膏，提取溶剂为醇类溶剂，例如甲醇或乙醇；提取方式为浸提、回流提取或渗漉提取；也可以是市售的豨莶草提取物产品。

所述款冬花提取物可以是从款冬花中提取得到的浸膏，提取溶剂为醇类溶剂，例如甲醇或乙醇；提取方式为浸提、回流提取或渗漉提取；也可以是市售的款冬花提取物产品。

所述甘草提取物可以是从甘草中提取得到的浸膏，提取溶剂为醇类溶剂，例如甲醇或乙醇；提取方式为浸提、回流提取或渗漉提取；也可以是市售的甘草提取物产品。

所述当归提取物可以是从当归中提取得到的浸膏，提取溶剂为醇类溶剂，例如甲醇或乙醇；提取方式为浸提、回流提取或渗漉提取；也可以是市售的当归提取物产品。

优选的，所述豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物是通过以下方法制备得到的：

分别将豨莶草、款冬花、甘草和当归，用30～100％乙醇(体积百分数)回流提取1～6次，每次溶剂用量为药材重量的1～15倍，每次提取时间为0.5～10小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物。

进一步优选的，上述中药提取物是通过以下方法制备得到的：

分别将豨莶草、款冬花、甘草和当归，50～95％乙醇回流提取2～4次，每次溶剂的用量为药材重量的3～7倍，每次提取时间为0.5～2小时；合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物。

中药的配伍讲究相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反，由于不同的中药之间存在不同的配伍关系，因此在使用两味以上中药时，必须有所选择，充分发挥药物之间相须相使的配伍关系，使产品的临床效果得到显著提高。

另一方面，中药成分复杂，一种药材中既有水溶性成分，又有油溶性或醇溶性成分，且有些活性成分在高温下容易失活，因此通过选择合适的提取方法和提取工艺对中药有效成分进行提取分离，可以最大限度的提取出有效成分并保证有效成分的活性，从而保证产品的临床效果。

本发明通过将多味中药的提取物进行配伍，药物之间共同发挥了抗氧化应激、炎症反应、以及对重金属砷引起的细胞毒性的保护作用，具有明显的增效作用，充分发挥了相须相使的配伍关系。而且各味中药均以含有其有效成分的提取物的形式入药，提高了组合物的治疗效果，缩短了药物的起效时间。

本发明还对上述中药组合物的作用机制进行了深入的研究，结果发现：豨莶草、款冬花、甘草和当归四种中药提取物均具有以下作用：

(1)激活II相解毒酶醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinone oxireductase，NQO]活性，上调人表皮细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平，并抑制活性氧自由基水平，具有抑制氧化应激作用；

(2)抑制炎症因子一氧化氮(NO)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNFα)的表达，具有抗炎作用。

将上述四种中药提取物按照本发明的配比制备成中药组合物，具有明显的协同增效作用，能够更好的发挥上述抗氧化应激和抗炎作用，并能上调人表皮HaCaT细胞中谷胱甘肽水平，抵抗砷诱导细胞毒性作用，抑制砷诱导的活性氧自由基形成。

本发明的防治皮肤病变老化的中药组合物中，各原料组分是一个有机的整体，缺一不可。发明人在研发过程中发现，减少上述组合物中的任何一种原料组分，或以具有相似药性的原料药对本发明中药组合物的原料组分进行替换，则中药组合物整体的作用效果显著降低；在本发明的组合物的基础上再增加其他的原料组分，组合物的整体效果并未有明显的改善，甚至有组合物的整体效果降低的情况出现。

上述中药组合物可直接将各原料组分混合均匀后使用，也可以按照其他方法制备。

上述中药组合物在制备防治皮肤损伤和炎症病变，延缓皮肤老化的药物制剂或化妆品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第二方面，提供一种防治皮肤损伤和炎症病变，延缓皮肤老化的药物制剂，由上述中药组合物和药学上可接受的辅料制备而成；或将上述中药组合物与其它对皮肤疾病有治疗或预防作用的药物混合，再添加或不添加药学上可接受的辅料制备而成。

上述药物制剂可以制成各种药物剂型，如软膏、霜剂、洗剂、粉剂、凝胶剂等。

所述药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料，优选为甘油、丁二醇、海藻糖、甜菜碱、淀粉、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。

本发明第三方面，提供一种防治皮肤损伤和炎症病变，延缓皮肤老化的化妆品，由上述中药组合物和化妆品用辅料制备而成。

优选的，所述化妆品用辅料选自卡波姆、聚山梨酯、月桂酸钠、硬脂酸镁、微晶纤维素中的一种或多种。

优选的，所述化妆品的产品形式为：面膜、护肤霜、护肤膏、护肤水、护肤粉或护肤凝胶。

本发明的有益效果：

本发明的中药组合物能够抗氧化应激和炎症反应，以及对重金属砷引起的细胞毒性也具有保护作用。本发明还对该中药组合物的作用机制进行了深入的研究，结果表明，该中药组合物能够激活II相解毒酶NQO1(具有与抗氧化物酶相同调控机制)活性，通过增加细胞内谷胱甘肽的水平，增强人表皮细胞清除自由基的能力；还能够抑制炎症因子的释放，发挥抗炎作用。

附图说明

图1：NQO1诱导活性试验表明四种中药提取物对能够诱导hepa 1c1c7细胞II相解毒酶NQO1的表达并增强其活性，图中的中药提取物浓度单位为μg/mL,萝卜硫素2.0μM为阳性对照。

图2：NO抑制试验表明豨莶草提取物和甘草提取物能够抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中NO的生成，图中的中药提取物浓度单位为μg/mL,N-3,4-tridhydroxy-benzamide(didox)100μM为阳性对照。

图3：中药组合物能够增加人表皮HaCaT细胞内谷胱甘肽水平，图中萝卜硫素2.5μM为阳性对照，中药组合物浓度分别为：12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL。

图4：中药组合物能够降低砷(As)诱导的细胞毒性,图中中药组合物浓度为25μg/mL。

图5：中药组合物能够抑制砷(As)诱导的细胞活性氧自由基的形成，图中中药组合物浓度为25μg/mL。

图6：中药组合物能够能够抑制炎症因子IL-8、TNFα、IL-10的释放(*p<0.05),图中中药组合物浓度为12.5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：防治皮肤病变老化的中药组合物的制备

1.豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物的制备：

(1)豨莶草提取物：

取豨莶草200g，粉碎，用75％乙醇(体积分数)800mL，回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥，即得。

(2)款冬花提取物：

取款冬花200g，粉碎，用70％乙醇(体积分数)1000mL，回流提取2次，每次0.5小时，合并提取液，浓缩干燥，即得。

(3)甘草提取物：

取甘草200g，粉碎，75％乙醇(体积分数)1000mL，回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥，即得。

(4)当归提取物：

取当归200g，粉碎，60％乙醇(体积分数)800mL，回流提取2次，每次0.5小时，合并提取液，浓缩干燥，即得。

2.称取上述四种中药提取物，重量分别为豨莶草提取物1.0克，款冬花提取物2.0克，甘草提取物1.0克，当归提取物1.0克，混匀，粉碎成细粉，即得中药组合物。

实施例2：防治皮肤病变老化的中药组合物的制备

1.豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物的制备方法同实施例1。

2.称取上述四种中药提取物，重量分别为豨莶草提取物1.0克，款冬花提取物2.5克，甘草提取物0.5克，当归提取物1.5克，混匀，粉碎成细粉，即得中药组合物。

实施例3：防治皮肤病变老化的中药组合物的制备

1.豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物的制备方法同实施例1。

2.称取上述四种中药提取物，重量分别为豨莶草提取物1.5克，款冬花提取物1.5克，甘草提取物0.5克，当归提取物0.5克，混匀，粉碎成细粉，即得中药组合物。

实施例4：防治皮肤病变老化的软膏剂的制备

将中药组合物(实施例1制备)5g，溶于环糊精溶液，并充分搅拌3-5小时，得水相；取羊毛脂40g，凡士林20g，蜂蜡5g，充分混匀，加热至70度，充分溶解，得油相。将水相和油相在70度，充分混匀，并分装，即得。

实施例5：防治皮肤病变老化的护肤凝胶的制备

将卡波姆2克、0.5g聚山梨酯、100mL水混合均匀，加入中药组合物(实施例1制备)5g，充分混匀，并分装，即得。

试验例1：豨莶草、款冬花、甘草、当归提取物的QR诱导活性评价

1.试验方法：

(1)小鼠肝癌细胞hepa 1c1c细胞系的培养

小鼠肝癌细胞hepa 1c1c细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用含10％胎牛血清(FBS)的MEM培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)NQO诱导活性试验

将hepa 1c1c细胞接种于96孔板上，24小时后加入不同浓度的四种中药提取物(实施例1制备)，处理24小时，采用0.8％洋地黄皂苷溶液裂解细胞，加入检测液(1.0mL 0.5M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，15mg牛血清白蛋白，6mg MTT，150μL吐温-20,150μL150mM D-葡萄糖-6-磷酸，15μL7.5mM黄素腺嘌呤二核苷酸，27μL 50mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20μL 50mM甲萘醌)，630nm测定光强度。

2.试验结果：

如图1所示，四种中药提取物均能够激活hepa 1c1c7细胞中NQO1活性，其诱导活性强度分别为豨莶草1.91倍(200μg/mL)，款冬花2.38(50μg/mL)，甘草2.19倍(200μg/mL)，当归1.41倍(200μg/mL)，阳性对照药物萝卜硫素(2.0μM)是空白对照组的1.7倍。上述结果表明，四种中药提取物能够激活II相脱毒酶，对人体细胞具有保护作用。

试验例2：豨莶草、款冬花、甘草、当归提取物的NO生成抑制活性评价

1.试验方法：

(1)小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系的培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)NO抑制活性实验

小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板，加入LPS和不同浓度四种提取物(实施例1制备)，处理24h，取细胞培养液，按1:1(V/V)加入格丽斯(Griess)试剂，显色后570nm测定吸光度。配置NaNO₂标准溶液，绘制标准曲线并计算培养液中NO浓度，计算抑制率。

2.试验结果：

如图2所示，豨莶草和甘草提取物能够抑制NO的生成，在200μg/mL浓度下，其抑制率分别为54.9％和82.9％。上述结果表明，豨莶草和甘草提取物具有抗炎活性。

试验例3：本发明的中药组合物对细胞内谷胱甘肽水平的调节作用评价

1.试验方法：

(1)人正常表皮HaCaT细胞的培养

人正常表皮HaCaT细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用1640培养基，并向其中加入10％胎牛血清(FBS)，5％谷氨酰胺，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)细胞内谷胱甘肽含量的测定

将HaCaT细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入不同浓度的中药组合物(中药组合物为实施例1制备)处理24小时，PBS洗涤2次，加入0.5mL 50mM磷酸钠和1mM EDTA缓冲液收细胞，超声1min，10000g离心15分钟，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。

2.试验结果：

如图3所示，中药组合物能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。

试验例4：本发明的中药组合物抑制砷(As)对人表皮HaCaT细胞的毒性的作用评价

1.试验方法：

MTT法测定中药组合物对砷(As)诱导的细胞毒性的保护作用，具体如下：

将HaCaT细胞接种于96孔板上，加入不同浓度待测提取物处理16小时，然后加入不同浓度的砷和待测浓度中药组合物(中药组合物为实施例1制备)处理48小时，加入MTT 3小时后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。

2.试验结果：

如图4所示，采用中药组合物(中药组合物为实施例1制备)预处理细胞16小时，然后加入20μM、40μM的砷和中药组合物(25μg/mL)处理细胞48小时，结果表明中药组合物对HaCaT细胞具有保护作用，能够抑制砷诱导的细胞毒性。中药组合物处理组的细胞生存率明显高于未加药物处理组。结果证明，中药组合物能够抑制致癌物砷诱导的毒性。

试验例5：本发明的中药组合物抑制砷(As)诱导的细胞活性氧自由基的形成的作用评价

1.试验方法：

将HaCaT细胞接种于35mm培养皿，贴壁后加入砷或中药组合物(中药组合物为实施例1制备)处理24h，加入含10μg/ml DCF培养基孵育1h，PBS洗涤，收集细胞，采用流式细胞仪(激发光488nm；发射光530nm)测定细胞内活性氧水平。

2.试验结果：

如图5所示，采用中药组合物与砷共处理24小时，能够显著抑制细胞内砷诱导的活性氧形成。

试验例6：本发明的中药组合物抑制炎症因子IL-8、TNFα、IL-10的释放的作用评价

1.试验方法：

(1)小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系的培养

与实施例1同。

(2)酶联免疫吸附测定法检测炎症因子IL-8、TNFα、IL-10水平

将RAW264.7细胞接种于96孔板上，24小时后加入不同浓度的中药组合物(中药组合物为实施例1制备)，处理24小时，分别采用IL-8、TNFα、IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒检测炎症因子，450nm测定吸光度并计算待测炎症因子浓度。

2.试验结果：

如图6所示，采用中药组合物与LPS共处理24小时，中药组合物能够显著抑制LPS诱导的炎症因子IL-8、TNFα和IL-10的形成，表明中药组合物据有抗炎活性。

试验例总结：

本发明采用小鼠hepa 1c1c7肝癌细胞系，评价了豨莶草、款冬花、甘草、当归四种中药提取物对II相脱毒酶NQO1的诱导作用，结果表明四种中药提取物具有上调NQO1活性，即四种中药提取物均有抑制氧化应激的作用(图1)。

采用小鼠RAW 264.7巨噬细胞，评价了豨莶草、款冬花、甘草、当归提取物对炎症因子NO的抑制作用，结果表明豨莶草提取物和甘草提取物能够抑制NO水平，即豨莶草提取物和甘草提取物具有抑制炎症反应的作用(图2)。

采用人表皮HaCaT细胞，评价了该中药组合物对人HaCaT细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平的影响，结果表明中药组合物能够上调细胞内谷胱甘肽含量，增强细胞内还原能力和清除活性氧能力(图3)。

选择重金属砷诱导的细胞毒性模型，评价该中药组合物对人表皮HaCaT细胞的保护作用。(1)经中药组合物处理后，HaCaT细胞生存率显著高于未加药处理组，证明该中药组合物能够抑制砷诱导的细胞毒性(图4)；(2)经该中药组合物处理后，砷诱导的HaCaT细胞活性氧自由基水平降低(图5)。上述结果表明该中药组合物可用于外界因素(如大气污染物、臭氧、紫外线、重金属等因素)诱发的皮肤疾病的预防和治疗。

采用小鼠RAW 264.7巨噬细胞，评价了该中药组合物的抗炎作用。结果表明，该中药组合物能够抑制炎症因子IL-6、TNFα、IL-10的释放(图6)，即中药提取物具有抗炎作用，可用于皮肤炎症的预防和治疗。

对比例1：

本发明人在研发过程中对具有相近药性的多味原料药进行了配伍关系的考察和药效的研究，结果发现，即使某几味原料药之间的药性相似，但与其他不同的原料药配伍使用后，其药效效果差别显著。例如：将实施例1的药物配方中的豨莶草提取物替换为具有相似功效的防风草提取物；将款冬花提取物替换为紫菀提取物。

对比例2：

中药组合物中各原料药的药量是标识药力的，即使方剂的药物组成相同，但若药物的用量各不相同，其药力则有大小之分，配伍关系则有君臣佐使之变，从而其功主治则各有所异。本发明人在研发过程中对中药组合物中的各个原料的含量进行了考察和药效的研究，结果发现，不合适的原料配比关系，其药效效果差别显著。例如：将实施例1中豨莶草提取物的用量调整为3.0克，款冬花提取物的用量调整为1.0克，甘草提取物的用量调整为3.0克，当归提取物的用量调整为0.1克，并按实施例1的方法制备。

采用人表皮HaCaT细胞，评价实施例1和对比例1、对比例2的中药组合物对人HaCaT细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平的影响，结果表明：实施例1制备的中药组合物与对比例1和对比例2相比，能够显著上调细胞内谷胱甘肽含量，增强细胞内还原能力和清除活性氧能力。

选择重金属砷诱导的细胞毒性模型，评价实施例1和对比例1、对比例2的中药组合物对人表皮HaCaT细胞的保护作用，结果表明：经实施例1制备的中药组合物处理后，HaCaT细胞生存率显著高于对比例1和对比例2。

采用小鼠RAW 264.7巨噬细胞，评价实施例1和对比例1、对比例2的中药组合物的抗炎作用。结果表明，该实施例1的中药组合物对炎症因子IL-6、TNFα、IL-10释放的抑制能力明显高于对比例1和对比例2。

说明本发明的组合物符合中药的配伍关系，各组分之间具有协同促进作用，并非是具有相似药性的原料药的简单替换和组合；本发明的组合物中各原料药的用量也并非是常规的调整所能得到的，本发明的中药组方中，各原料药材的用量配比是根据其药材特性、君臣佐使配伍等各种考虑因素决定的，对于中药组合物的整体药效起到非常重要的作用。

安全性试验：

1.皮肤刺激试验：

取健康家兔12只，给药前24h将家兔背部脊柱两侧毛剪去。随机分为两组，每组6只。试验时将一组动物去毛区的毛皮以消毒砂纸磨损，并用消毒针头划成小“井”形至渗血作为破损皮肤组，另一组为完好皮肤组。在左侧涂本发明实施例5所制备的护肤凝胶约1g，右侧涂赋形剂约1g作对照。给药后覆盖保鲜薄膜，胶布固定，保持药物与皮肤接触4h，然后以温水洗去残留药物。每天给药2次，连续2周。完好皮肤组以同样方法给药。末次去除药物后1、24、48和72h观察并记录涂抹部位有无红斑和水肿及恢复情况，按《中药、天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则》评价本发明的药物组合物连续给药对完整与破损皮肤的刺激强度、刺激反应的恢复情况和时间，并与对照组比较。

2.皮肤过敏性试验：

取健康豚鼠40只，雌雄各半，按体重随机分为4组，每组10只，实验前24h各动物左侧背部脱毛约3cm×3cm。给药组动物分别涂以本发明实施例5所制备的护肤凝胶，每鼠0.5g；空白对照组涂以赋形剂，每鼠0.5g；阳性药物对照组涂以l％2,4-二硝基氯苯，每鼠0.2ml，然后均以食用保鲜薄膜包敷，用胶布固定，持续4h。第7天和第14天各组分别用同法重复给药1次。第27天将各豚鼠右侧背部去毛约3cm×3cm，24h后，第1、2、3组动物右侧去毛区分别涂以冰辛软膏1g、赋形剂1g和0.1％2，4-二硝基氯苯0.2ml。6h后用温水洗去药物，即刻观察，然后于24、48、72h再次观察皮肤过敏反应情况，同时观察动物有无哮喘、站立不稳等全身性过敏反应。按《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光变态反应)研究的技术指导原则》评价各组动物皮肤过敏反应分值和湿疹康凝胶的致敏强度，并计算致敏发生率(致敏率为出现过敏反应的动物比率)。

皮肤刺激性试验和过敏性试验结果表明：本发明实施例5所制备的护肤凝胶对动物皮肤无刺激性，试验动物无红肿、水肿或过敏现象，说明本发明的组合物使用安全，无毒副作用。

典型病例：

病例1：李某，女，30岁，皮肤粗糙、毛孔粗大、肤色不均，经李某知情并同意，试用本发明实施例4制备的软膏剂，使用30天后，李某的皮肤状况得到了明显的改善，肤色不均的情况消失，皮肤弹性有了明显的提高；试用过程中未出现皮肤过敏等不适症状。

病例2：徐某，女，51岁，皮肤粗糙，皱纹较多，并存在皮肤起屑的情况，经徐某知情并同意，试用本发明实施例5制备的护肤凝胶，使用90天后，徐某的皮肤状况得到了明显的改善，皱纹减少变浅，皮肤起屑的情况基本消失；试用过程中未出现皮肤过敏等不适症状。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种防治皮肤病变老化的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物用于抑制砷诱导的细胞毒性，所述中药组合物的原料组成为：

豨莶草提取物10份，款冬花提取物20份，甘草提取物10份，当归提取物10份；

所述豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物是通过以下方法制备得到的：分别将豨莶草、款冬花、甘草和当归，用体积百分数50～95％乙醇回流提取2～4次，每次溶剂的用量为药材重量的3～7倍，每次提取时间为0.5～2小时；

合并提取液，过滤，回收乙醇，进行浓缩、干燥，即得豨莶草提取物、款冬花提取物、甘草提取物和当归提取物。

2.如权利要求1所述防治皮肤病变老化的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物中各原料的制备方法如下：

所述豨莶草提取物：取豨莶草200g，粉碎，用体积分数75％的乙醇800mL，回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥，即得；

所述款冬花提取物：取款冬花200g，粉碎，用体积分数为70％的乙醇1000mL，回流提取2次，每次0.5小时，合并提取液，浓缩干燥，即得；

所述甘草提取物：取甘草200g，粉碎，用体积分数为75％的乙醇1000mL，回流提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩干燥，即得；

所述当归提取物：取当归200g，粉碎，用体积分数为60％的乙醇800mL，回流提取2次，每次0.5小时，合并提取液，浓缩干燥，即得；

称取上述四种中药提取物，重量分别为豨莶草提取物1.0克，款冬花提取物2.0克，甘草提取物1.0克，当归提取物1.0克，混匀，粉碎成细粉，即得中药组合物。

3.如权利要求1或2所述的中药组合物在制备以下药物制剂或化妆品中的应用；

1)增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力；

2)抑制致癌物砷诱导的毒性；

3)抑制细胞内砷诱导的活性氧形成；

4)抑制LPS诱导的炎症因子IL-6、TNFα和IL-10的形成。

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